CN115197893A - 一种胰岛细胞培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胰岛细胞培养基，它是含有如下各浓度添加剂的CMRL 1066培养基：BSA 5～10mg/mL、青链霉素1～5％w/w、IBMX 0.01～0.05mg/mL。本发明培养基可成功提高胰岛细胞收获率和胰岛细胞质量，使用方便、成本低，具有推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种胰岛细胞培养基及其应用。
背景技术
糖尿病是一种复杂的慢性疾病，涉及遗传、环境等多种因素。世卫组织的糖尿病病因学分型体系将其主要分为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其它特殊类型糖尿病。其中，1型糖尿病患者是由于自身免疫性导致胰岛β细胞被破坏，导致胰岛素绝对缺乏，血糖不可控升高。
1型糖尿病患者占全球糖尿病病例的5％～10％，且发病率在不断增加，但目前尚无完全治愈的有效措施。其在发病初期就需要胰岛素治疗，且需要终生注射胰岛素替代体内缺乏的胰岛素来控制血糖。而1型糖尿病患者到了病程后期，发展为脆性糖尿病，即使严格进行饮食控制和强化胰岛素治疗也无法理想地控制血糖，亦不能完全阻止糖尿病并发症的发生以及使用胰岛素期间可能产生的不良反应，对患者健康造成极大危害。
因此，人类供体胰岛移植被认为最可能治愈重型1型糖尿病的手段，但是由于供体器官的短缺，异种移植能够有效的弥补人类器官不足这一问题，但是移植排斥反应是异种移植过程中首先要解决的问题，在移植免疫的研究中，由于小鼠繁殖速度快，体积小，成本低，所以在异种移植研究中小鼠是一种较为合适的模型，通过对小鼠胰岛的分离制备、体外培养、质量评估和胰岛移植，可以为糖尿病机制和治疗研究提供有利的工具。
目前的小鼠胰岛细胞培养体系是从动物体中取出胰腺分离胰岛细胞，并将其培养于含10％～20％胎牛血清的1640培养基中，在培养基内维持其生长并诱导其定向分化的过程，培养后的胰岛细胞用于同系小鼠的肾包膜、眼前房等部位的移植。目前现存的问题主要是：小鼠胰岛细胞在培养过程中死亡率较高。在提高小鼠胰岛细胞收获率方面，胰岛细胞富集(如专利CN 108130307A)、分离纯化的方法(CN 103013907A)技术已很成熟，但通过这些方法技术提高小鼠胰岛细胞收获效率步骤繁琐、复杂。
目前尚未见到通过对小鼠胰岛细胞培养基的改良，实现胰岛细胞收获效率提高的报道。而且，目前对胰岛β细胞培养的条件本身也存在诸多争议，例如Stange等人主张使用无血清培养基加入50μmol/L的IBMX培养，而Josefsen等人则主张加用10％的胎牛血清的培养基进行培养。培养基中的葡萄糖含量、生长因子等添加剂的使用，对细胞培养结果影响复杂，现有的诸多培养基培养得到的胰岛细胞收获率、质量仍不尽如人意，制约了对胰岛细胞培养、移植的进一步研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过对胰岛细胞培养基的改良，实现胰岛细胞收获率、质量提高的方案。
本发明提供了一种胰岛细胞培养基，它是含有如下各浓度添加剂的CMRL 1066培养基：
BSA 5～10mg/mL、青链霉素1～5％w/w、IBMX 0.01～0.05mg/mL。
进一步地，它是含有如下各浓度添加剂的CMRL 1066培养基：
BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL。
进一步地，它还含有如下任意一种或多种添加剂：
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺8～12mmol/L、尼克酰胺1～5mg/mL。
更进一步地，上述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为10mmol/L，尼克酰胺的浓度为1.22mg/mL。
进一步地，上述培养基由如下组分组成：
BSA 5～10mg/mL、青链霉素1～5％w/w、IBMX 0.01～0.05mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺8～12mmol/L、尼克酰胺1～5mg/mL，其余为CMRL 1066培养基。
更进一步地，上述培养基由如下组分组成：
BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺10mmol/L、尼克酰胺1.22mg/mL，其余为CMRL 1066培养基。
本发明还提供了上述的培养基在胰岛细胞培养体外培养试剂中的应用。
进一步地，上述胰岛细胞是小鼠、大鼠、猪或人胰岛细胞。
更进一步地，上述胰岛细胞是小鼠胰岛细胞。
本发明的有益效果：相比于目前培养胰岛细胞需要通过富集、分离纯化等复杂的方法来提高胰岛细胞收获率的方案，本发明通过对胰岛细胞培养基的改良，创造性地使用CMRL 1066培养基替换常用的RPMI 1640培养基作为基础培养基，添加特定种类用量的添加剂，成功提高了胰岛细胞收获率和胰岛细胞质量(活力)，使用方便、成本低，具有推广应用价值。
本发明术语：BSA：牛血清白蛋白；IBMX：磷酸酯酶抑制剂：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为DTZ染色胰岛细胞显微镜观察结果。
图2为FD-PI染色胰岛细胞荧光倒置显微镜观察结果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明培养基
在CMRL 1066培养基基础上添加：BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺10mmol/L、尼克酰胺1.22mg/mL。
(以下简称培养基B)
对比例1、
纯CMRL 1066培养基(简称A培养基)。
对比例2、
在CMRL 1640培养基基础上添加：BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺10mmol/L、尼克酰胺1.22mg/mL。
(以下简称培养基C)
对比例3、
在CMRL 1640培养基基础上添加：FBS 20％w/w、IBMX 0.01mg/mL、青链霉素1％w/w、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺10mmol/mL、尼克酰胺1.22mg/mL(简称D培养基)
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明培养基与纯CMRL 1066培养基、以PRIM 1640培养基为基础培养基的培养基培养胰岛细胞的效果对比
1、培养方法：在无菌环境下将分离纯化的胰岛细胞混悬液加实施例1、对比例1、对比例2的培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养，制备的细胞在第一天刚换培养基后，此后隔天换一次，在第2、6、14天通过双硫腙(DTZ)染色法，在体式显微镜下观测胰岛细胞的纯度；在14天时通过(FD-PI)染色在荧光倒置显微镜下观察胰岛细胞的活率。
胰岛细胞鉴定：收集纯化胰岛细胞，取样行DTZ染色后体式纤维镜下计数并观察纯化后胰岛细胞团的形态，计算纯度(纯度＝(DTZ染色阳性的胰岛个数/细胞团总数)*100％)
纯化后胰岛细胞的活力测定：将胰岛制备物与FD-PI储备液混合避光孵育3min在荧光倒置显微镜下观察，胰岛活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光，胰岛细胞活率用胰岛活细胞占所有胰岛细胞总数的百分比表示。
2、实验结果：
结果如表1、图1、图2所示，图1中同一批小鼠胰岛细胞在A、B、C、D四种培养基培养过程中第2、6、14天培养基B的胰岛细胞纯度较其他三组更高，DTZ显示胰岛细胞团外表光滑、完整，胰岛团块更加紧密结实。从图2的FD-PI染色结果看，培养基B的胰岛细胞活性较好，中心和外周细胞死亡均较少，活性是65％以上，胰岛细胞生长状态良好。
表1四种培养基的胰岛细胞纯度和活率
以上结果说明，本发明以CMRL 1066培养基作为基础培养基，添加特定种类用量的添加剂，成功提高了胰岛细胞收获率和胰岛细胞质量，使用方便、成本低，具有推广应用价值。
Claims (9)
1.一种胰岛细胞培养基，其特征在于，它是含有如下各浓度添加剂的CMRL 1066培养基：
BSA 5～10mg/mL、青链霉素1～5％w/w、IBMX 0.01～0.05mg/mL。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，它是含有如下各浓度添加剂的CMRL 1066培养基：
BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，它还含有如下任意一种或多种添加剂：
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺8～12mmol/L、尼克酰胺1～5mg/mL。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为10mmol/L，尼克酰胺的浓度为1.22mg/mL。
5.如权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，它由如下组分组成：
BSA 5～10mg/mL、青链霉素1～5％w/w、IBMX 0.01～0.05mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺8～12mmol/L、尼克酰胺1～5mg/mL，其余为CMRL 1066培养基。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，它由如下组分组成：
BSA 5mg/mL、青链霉素1％w/w、IBMX 0.01mg/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺10mmol/L、尼克酰胺1.22mg/mL，其余为CMRL 1066培养基。
7.权利要求1～6任一项所述的培养基在胰岛细胞培养体外培养试剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述胰岛细胞是小鼠、大鼠、猪或人胰岛细胞。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胰岛细胞是小鼠胰岛细胞。
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| CN110438064A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-11-12 | 上海长海医院 | 一种改良型人胰岛细胞培养基的制备及其应用 |
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