CN112251397B

CN112251397B - 一种新生猪胰岛细胞培养方法

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Publication number: CN112251397B
Application number: CN202011191695.8A
Authority: CN
Inventors: 王维; 李桑; 谷星石; 王佳; 方倩
Original assignee: Hunan Xeno Life Science Co ltd
Current assignee: Hunan Xeno Life Science Co ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112251397A

Abstract

本发明公开了一种医用级新生猪胰岛细胞培养方法。采用三阶段培养方式提高新生猪胰岛细胞得率同时促进胰岛细胞成熟；通过使用Ham's F10培养基在缺氧条件下制备猪间充质干细胞条件培养基，有利于胰岛细胞营养供给，并有效改善细胞在低温状态下的损伤；通过低温(4℃)和高浓度的牛磺酸，降低细胞代谢，减少细胞凋亡。

Description

一种新生猪胰岛细胞培养方法

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种可用于临床异种移植的新生猪细胞培养方法。

背景技术

国际糖尿病联盟(IDF)官网(http：//www.diabetesatlas.org/)，发布了最新的全球糖尿病地图(IDF Diabetes Atlas)(第9版)。根据最新报告，2019年全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病(每11个人中就有1人为糖尿病患者)；预计到2030年，糖尿病患者会达到5.784亿；预计到2045年，糖尿病患者会达到7.002亿。通过注射胰岛素和口服药物治疗糖尿病的方式只能控制糖尿病高血糖，不能彻底根治糖尿病。而糖尿病并发症需要耗费十几万至几百万费用进行治疗，20％糖尿病并发症患者家庭无法承受巨额医疗费用，故放弃治疗而导致患者死亡。解决糖尿病等重大疾病的治疗问题、有效减少国家在这一领域的治疗支出，已经成为国家的重大战略问题。而猪胰岛细胞异种移植是现阶段最有希望治愈1型糖尿病的治疗方案。

新生猪胰岛细胞在提取后，需要经过一段时间的培养成熟，方能进行异种移植。目前，国际上普遍使用的猪胰岛培养方案为Ham's F10培养基+10％猪血清再加入其他细胞因子，37℃，5％CO₂条件下培养≥7天(Ma X et al.,2018；Lopez-Avalos MD et al.,2001)。但此方法具有以下缺点：①需要的新生猪数量多：新生猪胰岛细胞团在体外培养时无法扩增，细胞数量会随着时间的推移大量减少，若按照每位病人移植500,000IEQ猪胰岛细胞计算，每头新生猪最后得到约15,000IEQ胰岛细胞，则最少需要34只新生猪；②操作繁琐，工作量大：此方法需隔天换液，15cm不贴壁细胞培养皿只能培养10,000IEQ胰岛细胞，由于细胞数量是逐步减少，所以起始细胞数量约需2,000,000IEQ，每隔1日需为200皿细胞换液，人力成本过高；③试剂耗材成本高，污染风险高：临床级试剂耗材成本普遍高出科研级成本，且对微生物污染安全检测更为严苛，频繁的换液会增加此类风险，增加生产成本。因此，需要一种能减少细胞损耗，保障胰岛细胞生物学功能，保证生物安全性的新型培养方式，才能真正为移植患者减少医疗成本，让更多的患者能够享受移植异种带来的福音。

发明内容

本发明的目的是提供一种医用新生猪胰岛细胞培养方案，能有效减缓细胞损耗，保障胰岛细胞胰岛素释放功能同时保证其生物安全性，减少企业生产成本，为患者减轻医疗费用。

一种新生猪胰岛细胞培养方法，包括以下步骤：

(1)先在37℃修复培养；

(2)然后在0-8℃低温培养，优选2-6℃，进一步优选4℃；

(3)最后在37℃培养。

所述的培养方法，

步骤(2)培养3～9d，优选5-9d，进一步优选5-7d。

所述的培养方法，步骤(1)修复培养12-48h，优选12-24h，进一步优选24h；步骤(3)培养12-24h，优选24h。

所述的培养方法，步骤(1)和(3)是在5％CO₂条件下进行。

所述的培养方法，步骤(1)采用：胰岛细胞普通培养基；优选：Ham's F10培养基或者1640培养基中添加10％-15％猪血清，优选添加10％猪血清。

所述的培养方法，步骤(2)采用的培养基为EGM-2培养基中添加10％-30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5％-15％人血白蛋白、5％-15％猪血清、15mM-30mM牛磺酸，优选添加30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5％人血白蛋白、10％猪血清和20mM牛磺酸。

所述的培养方法，步骤(3)采用的培养基为EGM-2培养基中添加5％-15％猪血清、10％-30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基，优选添加10％猪血清、30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基。

所述的培养方法，所述的缺氧猪间充质干细胞条件培养基是采用猪骨髓来源间充质干细胞，使用Ham's F10培养基，在37℃，1％-10％O₂，缺氧培养24-48小时收集的上清液，优选1％O₂，缺氧培养48小时；

进一步优选：每皿加入8-15mL Ham's F10培养基培养，收集其上清，过滤即得。

所述的培养方法，所述的缺氧猪间充质干细胞条件培养基用A-MEM培养基中添加10％-20％猪血清，优选10％猪血清，在贴壁培养皿中传代培养至少至第3-5代，优选至少3代，当细胞生长汇合度达到90％以上后，弃上清液，用生理盐水洗涤细胞至少2-3次；使用Ham's F10培养基，在37℃，1％-10％O₂缺氧培养24-48小时收集的上清液，0.22μm过滤器过滤即得。

所述的培养方法，步骤(2)的低温培养方式是将新生猪胰岛细胞置于离心管(优选50mL离心管)或者不含透气膜的不贴壁细胞培养瓶(优选75cm²不贴壁细胞培养瓶)中，加入50-70％容积的培养基，培养密度为1,000-2,000IEQ/mL，优选1000IEQ/mL，拧紧管盖或瓶盖且横向放置。

本发明发现如果是用培养皿或者有透气性的细胞培养瓶，在4℃冰箱放置>1天，pH会偏碱性(pH≥8.0)，这个pH值对细胞生长是有害的，因此，采用离心管或者不带透气膜的细胞培养瓶，由于它们是一个密闭的结构，所以能够很好的避免该问题。而将离心管或培养瓶横向放置，能够增加细胞与空气、营养物质的接触面积，避免细胞因缺氧或缺乏营养而凋亡、坏死。

本发明的有益效果：(以下数据来源于大量试验结果，并具有统计学意义)：

在同等培养时间下，本发明培养的新生猪胰岛细胞回收率要高于传统方法培养的胰岛细胞回收率(至少高1倍)，细胞团包膜完整，活率高。可为临床移植减少一半所需新生猪数量。

本发明的三阶段培养体系细胞只需换2次液便可进行临床移植，大量减少操作，降低临床微生物污染的风险。

本发明能够显著解决新生猪胰岛细胞供应量不足的问题，如一批新生猪供体有限的情况下，可以通过本发明长时间的培养保证胰岛细胞高活率、高回收率和功能(SI值)，等待下一批新生猪供体胰岛细胞培养成熟后汇总，就可以满足移植的用量。如果采用传统方法，当培养时间延长，则无法保证胰岛细胞的活率、回收率和功能(SI值)。

本发明优势总结如下：

1、大大降低了猪胰岛细胞细胞损耗，减少了异种移植所需新生猪数量；

2、极大的简化了培养操作，长时间低温培养过程无需换液，保证其生物安全性；

3、降低了生产成本，节约了大量换液所需试剂耗材，降低了人工成本；

4、相同培养时间，胰岛细胞团破碎减少，细胞团包膜完整，更适于临床移植。

附图说明

图1为三阶段培养方案流程示意图；

图2为传统培养与本发明三阶段培养细胞回收率；

图2中采用1+N+1的三阶段培养，即第一阶段培养一天，第二阶段培养N天，第三阶段培养1天；1+N+1的总和代表总培养天数与X轴，即横坐标的天数是相对应的；

图3为传统培养与本发明三阶段培养细胞形态变化(100×)200μm标尺；

图4为不同修复培养时间共计培养9天猪胰岛回收率；

图5为不同修复培养时间胰岛细胞形态变化(100×)200μm标尺；

图6为不同修复培养时间胰岛细胞AO/EB染色结果(100×)400μm标尺；

图7为不同修复培养时间共计培养9天胰岛细胞活率；

图8为不同修复培养时间共计培养9天胰岛β细胞含量；

图9为不同修复培养时间共计培养9天胰岛葡萄糖释放SI值；

图10为本发明1+N+1，N为3、5、7、9天，探索不同低温培养天数对胰岛细胞活率影响；

图10中柱状从左到右依次为N＝3,5,7,9；

图11为本发明1+N+1，N为3、5、7、9天，探索不同低温培养天数对胰岛细胞葡萄糖释放SI值；

图11中柱状从左到右依次为N＝3,5,7,9；

图12为不同低温培养密度共计培养9天猪胰岛细胞回收率；

图12中柱状从左到右依次为1000,2500,5000,10000IEQ/mL,；

图13为不同浓度牛磺酸共计培养11天猪胰岛细胞回收率；

图13中柱状从左到右依次为0,5,10,20mM taurine；

图14为不同条件制备缺氧猪间充质干细胞条件培养基共计培养11天猪胰岛细胞回收率；

图15为之前发明专利与本发明培养基在“1+7+1”培养后回收率对比；

图16为之前发明专利与本发明培养基在“1+7+1”培养后活率对比；

图17为之前发明专利与本发明培养基在“1+7+1”培养后功能(SI值)对比。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

材料与试剂：Ham's F10培养基、EGM-2培养基、A-MEM培养基、牛磺酸、人血白蛋白、猪血清、双硫腙(DTZ)、AO/EB染料、葡萄糖注射液、IBMX、生理盐水、15cm不贴壁细胞培养皿、50mL离心管。

缺氧猪间充质干细胞条件培养基制备：

用A-MEM培养基添加10％猪血清在15cm贴壁培养皿中传代培养至第5代，当细胞生长汇合度达到90％以上后，弃上清液，用生理盐水洗涤细胞2次。每皿加入10mL Ham's F10培养基，37℃，1％O₂，培养48小时，收集其上清，0.22μm过滤器过滤即为缺氧猪间充质干细胞条件培养基。

实施例1、本发明新生猪胰岛细胞培养试验

本发明针对已分离的新生猪胰岛细胞进行“1+N+1”纯化培养：(1)分离提取后的新生猪胰岛细胞在普通培养基(Ham's F10培养基中添加10％猪血清)中，37℃，5％CO₂，培养1天；收集细胞，弃上清；(2)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5％人血白蛋白、10％猪血清、20mM牛磺酸，4℃，培养3天、5天、7天、9天；收集细胞，弃上清；(3)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加10％猪血清、30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基，37℃，5％CO₂培养24小时。计数并做相关检测。

实施例2

本发明针对已分离的新生猪胰岛细胞进行“3+N+1”纯化培养：(1)分离提取后的新生猪胰岛细胞在普通培养基(Ham's F10培养基中添加10％猪血清)中，37℃，5％CO₂，培养3天；收集细胞，弃上清；(2)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5％人血白蛋白、10％猪血清、20mM牛磺酸，4℃，培养1天、3天、5天；收集细胞，弃上清，(3)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加10％猪血清、30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基，37℃，5％CO₂培养24小时。计数并做相关检测。

实施例3

本发明针对已分离的新生猪胰岛细胞进行“5+N+1”纯化培养：(1)分离提取后的新生猪胰岛细胞在普通培养基中(Ham's F10培养基中添加10％猪血清)，37℃，5％CO₂，培养5天；收集细胞，弃上清；(2)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5％人血白蛋白、10％猪血清、20mM牛磺酸，4℃，培养1天、3天；收集细胞，弃上清；(3)加入培养基：包含EGM-2培养基中添加10％猪血清、30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基，37℃，5％CO₂培养24小时。计数并做相关检测。

实施例4、“1+N+1”培养方式与传统培养方式比较

以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，将新生猪胰岛细胞平均分成2组，一组进行“1+N+1”(N为培养3天、5天和7天)方式培养，另一组进行传统方式培养。传统方式的培养过程为使用普通胰岛培养基(Ham's F10培养基+10％猪血清)37℃，5％CO₂，培养，分别于第1天、第3天、第5天、第7天和第9天进行换液处理。每次换液后进行计数并做相关检测。

实施例5、以实施例1培养的细胞(即本发明1+N+1天的三阶段培养方法)进行如下实验检测和结果：

1、DTZ染色观察猪胰岛细胞的形态、数目及纯度

将10mg DTZ溶于10ml的二甲基亚砜(DMSO)中，用0.22μm的孔径滤膜过滤除菌后分装储存于-20℃冰箱内。常规染色时，每1mL胰岛细胞悬液与10μL的DTZ储存液混合，于37℃孵育10分钟后镜检，胰岛细胞被染成猩红色后观察细胞的形态。

胰岛纯度＝DTZ染色阳性的胰岛细胞团数/细胞团总数×100％

2、活率检测：取1500-2000IEQ胰岛细胞团胰酶消化为单个细胞，AnnexinV/PI试剂盒染色，染色后通过流式细胞仪对活细胞和死细胞计数。

3、β细胞活力检测：取1500-2000IEQ胰岛细胞胰酶消化为单个细胞，NEWPORTGREEN特异染β细胞，过流式细胞仪检测β细胞含量。

4、胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能

分别提取6000IEQ的细胞悬液1,000rpm，离心1分钟，弃上清，用含2.5mM低糖培养液洗涤两次并孵化细胞于37℃、5％CO₂培养箱1小时，取出细胞悬液1,000rpm，离心1分钟，弃上清，每组胰岛细胞平均分成2份，每份再分成3个平行孔，分别加入2mL含2.5mM低糖培养液(Hyclone培养基)及2mL含25mM高糖培养液(Hyclone培养基)于6孔培养皿内，放入37℃、5％CO₂培养箱内再培养2小时后，离心取上清液，通过化学发光法来检测胰岛素含量。计算葡萄糖刺激指数(SI)。SI>1.8代表胰岛细胞的功能良好。

葡萄糖刺激指数(Stimulation index，SI)＝25mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量/2.5mM葡萄糖培养时的胰岛素释放量

实施例6、低温培养密度筛选

以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，在低温培养时将平均细胞分成1,000IEQ/mL、2,500IEQ/mL、5,000IEQ/mL和10,000IEQ/mL 4个密度分别低温培养7天。完成“1+7+1”培养方式后，计数并做相关检测。

实施例7、低温培养时采用的牛磺酸浓度筛选

以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，在低温培养时将牛磺酸的浓度分为0mM、5mM、10mM和20mM 4组分别低温培养9天，完成“1+9+1”培养方式后，计数并做相关检测。

实施例8、间充质干细胞条件培养基基础培基筛选

以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，将猪胰岛细胞平均分成2组，一组使用由Ham's F10培养基制备的缺氧猪间充质干细胞条件培养基，另一种使用A-MEM培养基制备的缺氧猪间充质干细胞条件培养基。完成“1+9+1”培养方式后，计数并做相关检测。

结果：

本发明与传统的培养方式比较，培养7天即“1+5+1”胰岛细胞回收率是传统培养回收率的3倍，培养9天即“1+7+1”胰岛细胞回收率是传统培养细胞(对照组)回收率的7倍(见图2)。传统培养方式第7天细胞团包膜开始松散，细胞团体积变小，第9天细胞松散，出现较多的单细胞，胰岛单细胞不能发挥胰岛细胞调节血糖的作用。而低温培养的方式能够有效的改善细胞状态，减缓细胞凋亡(见图3)。

从胰腺中分离的猪胰岛细胞，由于受到机械力和酶的损伤，结构松散，细胞团无包膜，需要在37℃中修复培养，直至重新产生包膜。本发明对胰岛细胞团修复时间进行了探索，当胰岛体外共计培养9天时，若修复培养1天后立刻进行低温培养7天，再复温培养1天，胰岛细胞回收率约为58.6％；若修复培养3天后立刻进行低温培养5天，再复温培养1天，胰岛细胞回收率约为42.9％；若修复培养5天后立刻进行低温培养3天，再复温培养1天，胰岛细胞回收率约为22.5％(见图4)。对比不同修复时间培养方案，发现越早进入低温培养，胰岛细胞的状态越好，体外长时间37℃培养胰岛细胞，细胞膜的包膜越差，细胞开始出现“黑渣子”——中心坏死现象(见图5、6)。根据流式结果检测发现修复培养1天后立刻进行低温培养7天，再复温培养1天，胰岛细胞活率明显要高于其他组(见图7)，而β细胞含量并未发生明显改变(见图8)，其体外功能检测SI值均>1.8，表明胰岛细胞对葡萄糖刺激能正常释放胰岛素(见图9)。

本发明1+N+1模式下，探索不同低温培养天数对胰岛细胞的影响，低温3、5、7、9天后，细胞活率没有明显改变(见图10)，均超过90％，低温培养第5天，胰岛细胞葡萄糖释放SI值高于培养3天，尤其是从第7天-第9天更高(见图11)。

不同密度胰岛细胞进行低温(4℃)培养发现，胰岛细胞修复培养1天后立刻进行低温培养7天，再复温培养1天，1,000IEQ/mL培养密度细胞回收率可达59％以上；2,500IEQ/mL培养密度细胞回收率约为39％；5,000IEQ/mL培养密度细胞回收率约为22％；10,000IEQ/mL培养密度细胞回收率约为19％。因此，1,000IEQ/mL培养密度最适用于低温培养阶段(见图12)。

采用1+9+1的模式，低温培养时，对比添加20mM牛磺酸的培养基和不添加牛磺酸的培养基发现，牛磺酸可以提高胰岛细胞回收率约10％，含有5mM牛磺酸培养基，胰岛回收率约为24％；含有10mM牛磺酸培养基，胰岛回收率约为22％；两者的回收率均低于含有20mM牛磺酸培养基的胰岛回收率，但未见其显著性差异(见图13)。

采用1+9+1的模式，对比Ham's F10培养基和A-MEM培养基制备的缺氧猪间充质干细胞条件培养基对胰岛回收率的影响，发现用Ham's F10培养基制备的条件培养基胰岛回收率约为22.5％，用A-MEM培养基制备的条件培养基胰岛回收率约为17％(见图14)。证明Ham's F10培养基比A-MEM培养基更适合制备对胰岛细胞有利的条件培养基。

对比例1：

以本发明实施例1为准，其他组分相同的情况下，在37℃培养1天后，将新生猪胰岛细胞平均分成2组，一组使用由本发明培养基(EGM-2培养基+30％缺氧猪间充质干细胞条件培养基+5％人血白蛋白+10％猪血清+20mM牛磺酸)，另一组使用专利201811610661.0《一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法》中的保存液(基本培养基+30％间充质干细胞条件培养基+20％人血白蛋白+3mMβ-氨基乙磺酸+1％二甲基亚砜+5mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸+1uMSD-282+5mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸+0.5mM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，基本培养基是在F10培养基中添加10％猪血清、5mM谷氨酰胺、5mM尼克酰胺、30mM甘露醇、1mM半胱氨酸、0.1mM维生素C，此配方保存液运用到本发明对比例1中效果优于该专利中描述的其他配方保存液)，4℃培养7天，37℃培养1天。计数并做相关检测。

结果：对比本发明培养基和专利201811610661.0《一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法》中保存液在“1+7+1”培养方案中的猪胰岛回收率、活率和体外功能(SI值)，发现两者回收率在60％左右，未见明显差异(见图15)；对比活率发现，本发明经“1+7+1”培养后，活率超过90％，而专利201811610661.0活率约为78％(见图16)，而根据目前胰岛细胞移植要求，细胞活率需≥90％才符合移植标准；对比体外功能，本发明的SI值约为3.0，专利的SI值约为2.6(见图17)，这在胰岛细胞培养技术领域是非常显著的改进，证明本发明的培养基对胰岛活率和功能的保护作用要显著优于专利201811610661.0《一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法》中的保存液。因为专利201811610661.0主要目的是为了解决短期(≤5天)运输过程细胞损伤的问题，但专利201811610661.0没有有效解决满足胰岛细胞移植要求的问题，因此该专利的培养液只能称之为低温保存液，不适合于移植细胞的培养，而本发明的培养基不仅为了延长培养时间，更重要的是同时保证培养的胰岛细胞符合移植的标准。

Claims

1.一种新生猪胰岛细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）先在37℃修复培养；

（2）然后在0-8℃低温培养；

（3）最后在37℃培养。

步骤（1）修复培养12-48h，步骤（3）培养12-24h；步骤（2）培养3-9d；

步骤（2）采用的培养基为EGM-2培养基中添加10%-30% 缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5%-15% 人血白蛋白、5%-15% 猪血清、15mM-30mM牛磺酸。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）低温培养温度为2-6℃。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）低温培养温度为4℃。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）培养5-9d。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）培养5-7d。

6.根据权利要求1-5任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）修复培养12-24h；步骤（3）培养24h。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）修复培养24h。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）和（3）是在5%CO₂条件下进行。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）采用胰岛细胞普通培养基。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）采用Ham's F10培养基或者1640培养基中添加10%-15%猪血清。

11.根据权利要求10所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）采用1640培养基中添加10%猪血清。

12.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，

步骤（2）采用的培养基为EGM-2培养基中添加30% 缺氧猪间充质干细胞条件培养基、5%人血白蛋白、10% 猪血清和20mM牛磺酸。

13.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）采用的培养基为EGM-2培养基中添加5%-15% 猪血清、10%-30% 缺氧猪间充质干细胞条件培养基。

14.根据权利要求13所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）采用的培养基为EGM-2培养基中添加10% 猪血清、30% 缺氧猪间充质干细胞条件培养基。

15.根据权利要求1、12、13、14任一项所述的培养方法，其特征在于，

所述的缺氧猪间充质干细胞条件培养基是采用猪骨髓来源间充质干细胞，使用Ham'sF10培养基，在37℃，1% -10%O₂，缺氧培养24-48小时收集的上清液，缺氧培养48小时。

16.根据权利要求15所述的培养方法，其特征在于，

每皿加入8-15mL Ham's F10培养基培养，收集其上清，过滤即得。

17.根据权利要求15所述的培养方法，其特征在于，

所述的缺氧猪间充质干细胞条件培养基用A-MEM培养基中添加10% -20%猪血清，在贴壁培养皿中传代培养至少至第3-5代，当细胞生长汇合度达到90%以上后，弃上清液，用生理盐水洗涤细胞至少2-3次；使用Ham's F10培养基，在37℃，1% -10%O₂缺氧培养24-48小时收集的上清液，0.22μm过滤器过滤即得。

18.根据权利要求17所述的培养方法，其特征在于，所述的缺氧猪间充质干细胞条件培养基用A-MEM培养基中添加10%猪血清，在贴壁培养皿中传代培养至少3代。

19.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）的低温培养方式是将新生猪胰岛细胞置于离心管或者不含透气膜的不贴壁细胞培养瓶中，加入50-70%容积的培养基，培养密度为1,000-2,000 IEQ/mL，拧紧管盖或瓶盖且横向放置。

20.根据权利要求19所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）的培养密度为1000IEQ/mL。