CN108753712B - 一种脂肪干细胞提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪干细胞提取方法，包括脂肪组织的采集，用表面活性剂对其处理，再用脂肪组织保护剂处理，接种培养等步骤，其中所用的表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3份、卵磷脂1份、聚山梨酯0.1份和PBS溶液98.6份；所用的脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.2份、还原型谷胱苷肽0.05份、人血白蛋白2份、组氨酸1份、山梨酸0.025份、VC 0.5份和混合糖电解质注射液96.2份。该脂肪干细胞提取方法可有效解决脂肪干细胞在提取过程中由于脂肪油滴的存在导致细胞贴壁率低和细胞提取率低的问题。

Description

一种脂肪干细胞提取方法
技术领域
本发明涉及脂肪干细胞提取技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞提取方法。
背景技术
脂肪源性干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是一类可以自我更新、繁殖的干细胞，具有一般干细胞的多向分化潜能和稳定的体外多代增殖能力。不仅能在不同诱导因子的作用下分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等，而且还能分泌大量的、多类型的细胞因子及促进血管生成因子和凋亡因子，并能通过旁分泌作用于成纤维细胞，促进其分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，可发挥抗炎、抗氧化、抗衰老、损伤修复等作用。脂肪组织储量丰富且获取简便，且无伦理争议，是组织工程研究中理想的种子细胞来源之一。
目前脂肪源干细胞的提取方式多采用机械法和酶消化、组织贴壁培养法，酶消化法和机械法等操作过程较繁琐，酶消化法消化时间长，消化后所得脂肪血管基质碎片(stromal vascular fraction，SVF)成分复杂；组织贴壁法操作步骤少，实验处理时间短，且不加入外源胶原酶、细胞因子等，成本较低，但在操作过程中脂肪油滴阻碍细胞贴壁，很难保证组织块全部贴壁，且换液时容易漂浮，细胞提取率不高。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种脂肪干细胞提取方法，通过本发明提供的脂肪干细胞提取方法可有效解决脂肪干细胞在提取过程中由于脂肪油滴的存在导致细胞贴壁率低和细胞提取率低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2))将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后离心；
所述表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3-0.5份、卵磷脂0.5-2.5份、聚山梨酯0.1-0.2份和PBS溶液99.1-99.8份；
(3)取步骤(2)离心后所得的上层脂肪组织，用等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后离心；
所述脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.1-0.3份、还原型谷胱苷肽0.01-0.1份、人血白蛋白1-5份、组氨酸0.5-1份、山梨酸0.02-0.03份、 Vc 0.1-1份和混合糖电解质注射液93.5-98.5份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，进行培养；
(5)每隔3-5天更换培养液，待细胞长至培养瓶的30％-80％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶1-2次，然后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
进一步地，步骤(2)中所用的表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉5500.3份、卵磷脂1份、聚山梨酯0.1份和PBS溶液98.6份。
进一步地，步骤(2)中离心转速为1800-2200rpm，离心时间为4-6min。
进一步地，步骤(3)中所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.2份、还原型谷胱苷肽0.05份、人血白蛋白2份、组氨酸1份、山梨酸0.025 份、Vc 0.5份和混合糖电解质注射液96.2份。
进一步地，步骤(3)中离心转速为1800-2200rpm，离心时间为4-6min。
进一步地，步骤(4)中的培养条件为37℃、5％二氧化碳浓度。
进一步地，步骤(5)中每隔4天更换培养液，待细胞长至培养瓶的60％-70％时，弃去脂肪组织。
采取上述方案所产生的有益效果为：
1、本发明提取方法，操作简便，分离过程中不使用胶原酶，避免了异种污染；培养时向其中加入了表面活性剂，可有效去除脂肪组织中的油滴，解决脂肪组织贴壁培养时细胞贴壁率低的问题；还加入了细胞保护液，可减少脂肪组织在离心过程中的损伤，使分离出的脂肪干细胞具有较高的增殖分化潜能，提高脂肪干细胞的提取量和提取效率。
2、提取时所用的表面活性剂由羟乙基淀粉550、卵磷脂和聚山梨酯组成，羟乙基淀粉550是从支链淀粉衍生出来的，其生理和化学特性是由羟乙基的平均分子量决定，平均分子量越大对红细胞的凝聚作用越强，羟乙基淀粉550可有效提高红细胞的沉降速度，使红细胞与其他细胞分离，卵磷脂和聚山梨酯为表面活性剂，能够去除脂肪中的油滴，提高细胞贴壁率，羟乙基淀粉550与卵磷脂和聚山梨酯合用，可有效去除脂肪组织中的杂质，使脂肪细胞能够充分贴壁生长。
3、细胞保护液由海藻糖、还原型谷胱苷肽、人血白蛋白、组氨酸、山梨醇和Vc组成，海藻糖是一种自然界中广泛存在的非还原性双糖，无毒副作用，化学性质十分稳定，除了具有低聚糖的一般特性，还有独特的生物学特性，在严酷环境下可保护生物体的组织和大分子的功能和活性，其具有以下活性：1)稳定生物膜和蛋白质的结构；2)保护生物体免受热和干燥的损伤；3)保护生物体免受缺氧的损伤；海藻糖可保护哺乳动物细胞免受缺氧的损伤；人血白蛋白可作为稳定剂和保护剂作用，并且是细胞培养基的重要成分，具有较强的保护作用，能够促进细胞增长，延长细胞存活时间，并可作为氮源为细胞提供营养，人血白蛋白可与海藻糖协同作用，增强海藻糖对细胞的保护作用，避免细胞受到损伤；
还原型谷胱苷肽属于负氢离子类物质，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，本品能激活多种酶，且能激活细胞内的自由基清除系统，促进糖、脂肪及蛋白质的代谢，从而能够使细胞保持较佳的状态，组织保护剂中添加还原型谷胱苷肽可在保护脂肪干细胞的同时，促进细胞代谢，使细胞维持生物活性；组氨酸具有抗氧化功能，是生命机体的重要物质基础，山梨醇具有提高脂肪干细胞提取成功率的作用，Vc可帮助脂肪细胞维持各种过氧化物酶的活性，防止氧自由基对细胞膜和细胞器造成损伤，还原型谷胱苷肽、组氨酸、山梨醇和Vc可协同作用，对于保护脂肪干细胞，避免其受到外界损伤起到关键作用。
具体实施方式
实施例1
一种脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2)将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后于1800rpm的离心机内离心4min；
所用表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3份、卵磷脂0.5 份、聚山梨酯0.1份和PBS溶液99.1份；
(3)取步骤(2)离心后的上层脂肪组织，与等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后于1800rpm的离心机内离心4min；
所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.1份、还原型谷胱苷肽0.01份、人血白蛋白1份、组氨酸0.5份、山梨酸0.02份、VC 0.1份和混合糖电解质注射液93.5份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，每瓶2-3ml，置于37℃、5％二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱中培养；
(5)每隔3天更换培养液，待细胞长至培养瓶的30％-40％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶1次，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化 2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
实施例2
一种脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2)将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后于2200rpm的离心机内离心6min；
所用表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.5份、卵磷脂2.5 份、聚山梨酯0.2份和PBS溶液99.8份；
(3)取步骤(2)离心后的上层脂肪组织，与等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后于2200rpm的离心机内离心6min；
所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.3份、还原型谷胱苷肽0.1份、人血白蛋白5份、组氨酸1份、山梨酸0.03份、Vc 1份和混合糖电解质注射液99份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，每瓶2-3ml，置于37℃、5％二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱中培养；
(5)每隔5天更换培养液，待细胞长至培养瓶的70％-80％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶2次，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化 2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
实施例3
一种脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2)将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后于2000rpm的离心机内离心5min；
所用表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3份、卵磷脂1 份、聚山梨酯0.1份和PBS溶液98.6份；
(3)取步骤(2)离心后的上层脂肪组织，与等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后于2000rpm的离心机内离心5min；
所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.2份、还原型谷胱苷肽0.05份、人血白蛋白2份、组氨酸1份、山梨酸0.025份、Vc 0.5份和混合糖电解质注射液96.2份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，每瓶2-3ml，置于37℃、5％二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱中培养；
(5)每隔4天更换培养液，待细胞长至培养瓶的60％-70％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶2次，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化 2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
对比例1
一种脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2)将采集的脂肪组织与等体积的无菌生理盐水充分混匀后于2000rpm的离心机内离心5min；
(3)重复步骤(2)操作1次；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，每瓶2-3ml，置于37℃、5％二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱中培养；
(5)每隔4天更换培养液，待细胞长至培养瓶的60％-70％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶2次，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化 2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
对比例2
一种脂肪干细胞培养方法，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2)将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后于2000rpm的离心机内离心5min；
所用表面活性剂包括以下重量份的组分：卵磷脂1份、聚山梨酯0.1份和 PBS溶液98.6份；
(3)取步骤(2)离心后的上层脂肪组织，与等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后于2000rpm的离心机内离心5min；
所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.2份、组氨酸1份、山梨酸0.025份、Vc 0.5份和混合糖电解质注射液96.2份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，每瓶2-3ml，置于37℃、5％二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱中培养；
(5)每隔4天更换培养液，待细胞长至培养瓶的60％-70％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶2次，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化 2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
实验例
为了避免随机性，分别对实施例1-3和对比例1-2的培养方法进行三组实验，分别对培养前后的脂肪干细胞进行统计，记录P0代和P3代的细胞数量，计算出细胞的成活率，详见表1；取实施例1-3和对比例1-2的P3代细胞，检测其主要表面标志物CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，其中CD73、CD90、CD105表达量应≥95％，CD11b、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR表达量≤2％，详见表2。
表1：
Figure BDA0001718786960000081
Figure BDA0001718786960000091
由表可知，按照实施例1-3的方法培养出的脂肪干细胞成活率相对较高，尤其是按照实施例3的方法培养出的脂肪干细胞，成活率最高。
表2：
Figure BDA0001718786960000092
Figure BDA0001718786960000101
由表可知，按照实施例1-3的方法提取所得的细胞流式表型等均稳定，能够满足临床应用需求。

Claims (3)

1.一种脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集人体脂肪组织；
(2))将采集的脂肪组织与等体积的表面活性剂充分混匀后离心，离心转速为1800-2200rpm，离心时间为4-6min；
所述表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3-0.5份、卵磷脂0.5-2.5份、聚山梨酯0.1-0.2份和PBS溶液99.1-99.8份；
(3)取步骤(2)离心后所得的上层脂肪组织，用等体积的脂肪组织保护剂充分混匀后离心，离心转速为1800-2200rpm，离心时间为4-6min；
所述脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.1-0.3份、还原型谷胱苷肽0.01-0.1份、人血白蛋白1-5份、组氨酸0.5-1份、山梨酸0.02-0.03份、Vc 0.1-1份和混合糖电解质注射液93.5-98.5份；
(4)将步骤(3)离心后所得的脂肪组织接种于培养瓶中，进行培养，培养条件为37℃、5％二氧化碳浓度；
(5)每隔4天更换培养液，待细胞长至培养瓶的60-70％时，弃去脂肪组织，并用生理盐水清洗培养瓶1-2次，然后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化2-3min；
(6)取消化后的细胞，按照5000-8000个/cm2的接种比例进行传代扩增培养至P3代，待细胞长至培养瓶的80％-90％时，收集细胞，制得脂肪干细胞。
2.如权利要求1所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，步骤(2)中所用的表面活性剂包括以下重量份的组分：羟乙基淀粉550 0.3份、卵磷脂1份、聚山梨酯0.1份和PBS溶液98.6份。
3.如权利要求1所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，步骤(3)中所用脂肪组织保护剂包括以下重量份的组分：海藻糖0.2份、还原型谷胱苷肽0.05份、人血白蛋白2份、组氨酸1份、山梨酸0.025份、VC 0.5份和混合糖电解质注射液96.2份。
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