CN104472474A - 一种人脂肪间充质干细胞冻存液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了一种干细胞的冻存液，具体是公开了一种人脂肪间充质干细胞冻存液。本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液由人血浆和和二甲基亚砜组成。本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液不含有非人源的血清或蛋白质，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。实验表明，与常规细胞冻存液相比，本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液，冻存细胞之后活率显著提高，并保持良好的干细胞特性，可以用于人脂肪干细胞的长期保存及应用。

Description

一种人脂肪间充质干细胞冻存液

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及干细胞的冻存液，尤其是人脂肪间充质干细胞冻存液。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，医学界称为“万用细胞”。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotentstem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotentstem cell)(专能干细胞)。

脂肪间充质干细胞(Adipose Mesenchymal Stem Cells,ADSC)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。目前已发现间充质干细胞可以治疗包括人体神经系统、免疫系统、消化系统、运动系统等系统的80多种疾病，间充质干细胞在人体抗衰老方面的研究也已取得重大突破并已进行应用尝试。有专家预测，间充质干细胞抗衰老技术的广泛应用，将使人类的寿命在2050年普遍达到120岁以上。间充质干细胞作为重要的再生医学资源在疾病治疗和人体抗衰老的应用领域有非常重要的使用价值。

干细胞具有潜在的医用价值以及应用价值，而细胞保存技术是实现这些潜在价值的基础。干细胞储存是指将干细胞从不同的人体组织中分离培养出来后，再经过检测鉴定，然后将保存，以便于在临床需要时可以将干细胞用于给病人回输，达到治疗疾病的目的。目前常用的细胞保存方法有培养和冻存两种方式。其中培养保存，耗时耗力，程序繁琐，在培养的过程中，特别是长期继代培养时，细胞容易发生变异，细胞特性丧失，失去保存的价值。而细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，保存其细胞特性，这样保存的成本较低，可以在需要时将细胞复苏培养，同时也避免了培养保存中因细胞污染而导致的细胞损失。

细胞冻存液(或称为细胞冷冻保护剂)是细胞冻存时必须使用的一种溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以及二甲基亚砜(dimathylsulfoxide,DMSO)等物质组成的。但胎牛血清属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存人脂肪间充质干细胞。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种人脂肪间充质干细胞冻存液，由人血浆和二甲基亚砜组成。

在一些实施方案中，所述的人脂肪间充质干细胞冻存液中所述人血浆与二甲基亚砜的体积比为9:1。

进一步的，在一些优选的实施方案中，所述的人脂肪间充质干细胞冻存液中所述人血浆为人自体血浆。

人自体血浆是指由脂肪间充质干细胞存储者本人的静脉血制备成的血浆。本发明采用人自体血浆与二甲基亚砜混合进行细胞冻存，一方面可以在一定程度上降低细胞冻存的成本，另一方面可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

本发明还提供了一种冻存人脂肪间充质干细胞的方法，人脂肪间充质干细胞与上述人脂肪间充质干细胞冻存液混合后超低温冻存。

在一些实施方案中，所述超低温冻存为-80℃超低温冰箱2～3d后转移至液氮中保存。

在一些具体实施例中，分别采用常规的细胞冻存液(FBS+DMSO)和本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，一个月后进行细胞复苏，检测细胞活性和细胞状态。考察本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液对于人脂肪间充质干细胞的冻存性能的影响。结果显示，与常规的细胞冻存液相比本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液，在细胞冻存过程中对细胞损伤作用较小，细胞活率较高。采用本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，复苏后细胞生长形态更接近冻存前脂肪间充质干细胞的生长形态，复苏后细胞数量更接近冻存前脂肪间充质干细胞的细胞数量，且对细胞表面标记物的表达没有影响

本发明还提供了一种人脂肪间充质干细胞的冻存试剂盒，包含上述人脂肪间充质干细胞冻存液。

本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液由人血浆和和二甲基亚砜组成，不含有非人源的血清或蛋白质，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。实验表明，与常规细胞冻存液相比，本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液，冻存细胞之后活率显著提高，并保持良好的干细胞特性，可以用于人脂肪干细胞的长期保存及应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1实施例5冻存前人脂肪间充质干细胞生长形态(培养三天)图，其中a放大倍数为40倍，b放大倍数为100倍；

图2实施例5以本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，复苏后的细胞生长形态图，其中a、b为复苏后24h细胞生长形态图，c、d为复苏后48h细胞生长形态图，e、f为复苏后72h细胞生长形态图，g、h为复苏后96h细胞生长形态图，i、j为复苏后120h细胞生长形态图；a、c、e、g、i放大倍数为40倍，b、d、f、h、j放大倍数为100倍；

图3实施例5以常规细胞冻存液冻存细胞冻存细胞，复苏后的细胞生长形态图，其中a、b为复苏后24h细胞生长形态图，c、d为复苏后48h细胞生长形态图，e、f为复苏后72h细胞生长形态图，g、h为复苏后96h细胞生长形态图，i、j为复苏后120h细胞生长形态图；a、c、e、g、i放大倍数为40倍，b、d、f、h、j放大倍数为100倍；

图4实施例5不同冻存液冻存之后复苏的人脂肪间充质干细胞生长曲线，其中示冻存前人脂肪间充质干细胞，人脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，常规细胞冻存液冻存细胞；

图5实施例5冻存前人脂肪干细胞各细胞表面标记物的检测结果图，其中a、b、c为阴性对照图，d为样本细胞大小及复杂程度分布图，e为HLA-DR及CD59表达情况图，f为HLA-DR阴性表达及CD59阳性表达的细胞在CD45及CD90的表达情况图；

图6实施例5常规细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，复苏48h后各细胞表面标记物的检测结果图，a、b、c为阴性对照图，d为样本细胞大小及复杂程度分布图，e为HLA-DR及CD59表达情况图，f为HLA-DR阴性表达及CD59阳性表达的细胞在CD45及CD90的表达情况图；

图7实施例5人脂肪间充质干细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，复苏48h后各细胞表面标记物的检测结果图，其中a、b、c为阴性对照图，d为样本细胞大小及复杂程度分布图，e为HLA-DR及CD59表达情况图，f为HLA-DR阴性表达及CD59阳性表达的细胞在CD45及CD90的表达情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。其中所述I型胶原酶购自买的Gibco公司。

实施例1、人脂肪间充质干细胞原代分离培养与传代培养

将抽脂得到的脂肪组织用PBS洗涤至澄清，在洗涤干净的脂肪组织中加入同等体积的已预热的0.5％I型胶原酶。将混合物转移至恒温空气摇床中，37℃、100rpm消化50min。待脂肪组织块呈黏稠且细小的颗粒状后，1500r/min离心5min。小心去除上层杂液，留5mL悬液于底部，加入适量PBS稀释胶原酶的作用。1500r/min再次离心5min，收集细胞。用完全培养基重悬细胞，以1×10⁵个/mL的密度接种10cm的培养皿中，每皿添加100μL的1μg/mL上皮生长因子(EGF)。将细胞移至CO₂培养箱中，培养48h后进行换液，去除未贴壁的血细胞和其他杂质。每2～3d换一次完全培养基，待细胞生长至80％～90％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。

实施例2、自体血浆的制备

抽取人自体静脉血50mL于抗凝血采血管中，将其转移至50mL离心管中，2000r/min水平离心15min，吸取上清液备用，即为自体血浆。

实施例3、细胞冻存液配制

按表1所示配方配制冻存细胞的细胞冻存液。其中

实施例4、收集细胞并冻存

取P2代人脂肪间充质干细胞，将细胞重悬混匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中离心去除上清液，收集细胞沉淀。加入1.5mL实施例3配制好的人脂肪间充质干细胞冻存液重悬后加入2mL细胞冻存管中，并控制细胞数量为1×10⁶个/mL。迅速将细胞冻存管转移至已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱2～3d后，将细胞冻存管转移至液氮保存。

实施例5、细胞冻存液对人脂肪间充质干细胞冻存性能的影响

收集实施例1制得的P2代人脂肪间充质干细胞，将细胞重悬混匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中离心去除上清液，收集细胞沉淀。分别加入1.5mL实施例3配制好的两种冻存液重悬后加入2mL细胞冻存管中，并控制细胞数量为1×10⁶个/mL。迅速将细胞冻存管转移至已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱2～3d后，将细胞冻存管转移至液氮保存。一个月后进行细胞复苏，检测细胞活性和细胞状态。以常规的细胞冻存液(FBS+DMSO)作为实验对照组，比较本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液对于人脂肪间充质干细胞的冻存性能。

1、细胞活性检测

将保存于液氮的细胞取出，转移至37℃水浴锅中迅速解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的10mL完全培养基中。轻轻吹打混匀后，取0.5mL细胞悬液进行细胞计数和活性检测。实验结果如表2。

表2二种不同的细胞冻存液冻存前后细胞数量和活性比较

由表1中数据可以得出，与常规的细胞冻存液相比本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液，在细胞冻存过程中对细胞损伤作用较小，细胞活率较高。表明本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液。

2、细胞形态比较

将不同冻存液冻存之后复苏的细胞进行培养，并在倒置显微镜下连续观察两组细胞的生长形态7d，并拍照。结果如图1-3所示。

由图1-3可见，与常规的细胞冻存液相比，采用本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，复苏后细胞生长形态更接近冻存前脂肪间充质干细胞的生长形态，表明本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液更有利于脂肪间充质干细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。

3、细胞生长曲线绘制

分别将以不同冻存液冻存之后复苏的人脂肪间充质干细胞以1×105个细胞每孔接种于6孔板中，每天统计细胞数量结果如表3，7d后绘制不同组别的生长曲线，如图4。

表3不同冻存液冻存之后复苏的人脂肪间充质干细胞的生长细胞数

由表3及图4结果可见，与常规的细胞冻存液相比，采用本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存人脂肪间充质干细胞，复苏后细胞数量更接近冻存前脂肪间充质干细胞的细胞数量，表明本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液可以更好的保持细胞冻存复苏后的细胞活性。

4、细胞表面标记物检测

取冻存前的脂肪干细胞，以及不同冻存液冻存之后复苏48h的细胞，通过流式细胞仪检测其表面标志物CD45、CD59、CD90、HLA-DR等的表达情况。结果如图5-7。

由图5-7结果可见，检测结果表明，采用本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，复苏后的脂肪间充质干细胞表达干细胞典型的表面标记物，与冻存前脂肪间充质干细胞，无显著性差异。表明本发明所述人脂肪间充质干细胞冻存液对脂肪间充质干细胞的冻存不会影响细胞表面标记物的表达。

Claims (6)

1.一种人脂肪间充质干细胞冻存液，由人血浆和二甲基亚砜组成。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞冻存液，所述人血浆与二甲基亚砜的体积比为9:1。

3.根据权利要求1或2所述的人脂肪间充质干细胞冻存液，所述人血浆为人自体血浆。

4.一种冻存人脂肪间充质干细胞的方法，人脂肪间充质干细胞与权利要求1所述人脂肪间充质干细胞冻存液混合后超低温冻存。

5.根据权利要求4所述的方法，所述超低温冻存为-80℃超低温冰箱2～3d后转移至液氮中保存。

6.一种人脂肪间充质干细胞的冻存试剂盒，包含权利要求1所述人脂肪间充质干细胞冻存液。