CN101919379A - 一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 - Google Patents
一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101919379A CN101919379A CN2010102464197A CN201010246419A CN101919379A CN 101919379 A CN101919379 A CN 101919379A CN 2010102464197 A CN2010102464197 A CN 2010102464197A CN 201010246419 A CN201010246419 A CN 201010246419A CN 101919379 A CN101919379 A CN 101919379A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cell
- stem cells
- freezing
- stock solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于长期冻存间充质干细胞的冻存液及其制备方法以及其用途，特别是脐带间充质干细胞。主要采用一种新的胎牛血清替代品，即来源于脐带血的血浆，用其制备的冻存液冻存间充质干细胞，可以长期保护间充质干细胞免受冷冻伤害，复苏后活力可以达到传统冻存液长期冻存的效果，并且避免了间充质干细胞在冷冻保存过程中接触异种动物源血清，使间充质干细胞的临床应用安全性更进了一步。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液及其制备方法。
技术背景
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，其在骨髓、胎盘、脐带、羊膜、肌肉、胎儿肝脏、脐血等组织中广泛存在，因其具有取材方便、体外扩增简单迅速等优点，在临床治疗中具有广阔的应用前景。间充质干细胞不仅具有多向分化的能力，还具有支持造血、调节免疫等作用，国内外已将间充质干细胞应用于大量动物试验及临床试验的研究中。间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，扩增后的干细胞有时需要被冻存起来，以备于科研及临床随时复苏使用。而现有的细胞冻存常规技术是使用二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、细胞培养基按照一定的比例构成细胞冻存液，通常使用10％DMSO、10％-90％胎牛血清、其余份额由细胞培养基补足，采用现有技术的细胞冻存液长期冻存间充质干细胞，复苏后细胞活力好，可以满足科研及临床应用的需要。
现有技术的缺点在于其冻存液中所使用的胎牛血清大多源于进口，进口血清价格昂贵，而且欧洲多国发生疯牛病，进口胎牛血清的应用也受到了一定的限制。随着人们对细胞冻存液的深入研究，还发现冻存液中添加的胎牛血清浓度与间充质干细胞的冻存效果呈正相关，有研究表明长期与胎牛血清接触的间充质干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致间充质干细胞移植后成功率降低以及不良反应的发生。
因此，在间充质干细胞长期冻存液中去除胎牛血清而以一些更加安全的试剂取而代之无疑在间充质干细胞临床应用的安全性方面又迈进了一步。目前有一种间充质干细胞冻存液，其中不含有胎牛血清，而是用人血白蛋白代替，但是其保存间充质干细胞活性的时间短，不适宜间充质干细胞的长期冻存。
发明内容
针对现有技术的不足，发明人发现了一种新的胎牛血清替代品，即来源于脐带血的血浆，用其制备的冻存液冻存间充质干细胞，可以长期保护间充质干细胞免受冷冻伤害，复苏后活力可以达到传统冻存液长期冻存的效果。本发明采用以下技术方案：
一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其包括以下步骤：
1)将脐带血置于无菌离心管中，在1000rpm-1200rpm条件下离心15-18分钟；
2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g-4200g条件下离心18-20分钟，上清即为冻存用脐血浆；
3)取二甲基亚砜与上述冻存用脐血浆按体积比1∶9比例混合均匀，即得间充质干细胞冻存液。该冻存液可用于间充质干细胞冻存。
所述的间充质干细胞优选为脐带间充质干细胞，进一步的可优选为人脐带间充质干细胞。
本发明还特别包括利用上述方法制备的间充质干细胞冻存液。
附图说明
图1：脐带间充质干细胞冻存复苏后流式细胞仪细胞表型检测结果。
技术效果
1、本发明冻存液中使用脐带血来源的血浆替代胎牛血清，脐带血来源丰富、采集方法简单，脐血浆制备方法简单易行，用其替代胎牛血清冻存间充质干细胞，避免了细胞在冻存过程中接触异种动物血清，并且降低了细胞冻存成本，细胞冻存效果与传统冻存方法无异。
2、间充质干细胞冻存液中含有胎牛血清最大的弊端在于间充质干细胞与其长期接触会对胎牛血清产生内吞，从而引起细胞某些蛋白表达的变化，应用于人体后可能出现某些异种蛋白引起的免疫反应，本发明采用脐带血浆，避免了上述不良反应。
具体实施方式
1、脐血浆的制备
(1)将含有质量比2.5％枸橼酸钠(可不含，不影响本发明的技术效果)的脐带血置于50ml无菌离心管中，在1000rpm条件下离心15分钟；
(2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，去除血小板，上清即为冻存用脐血浆。
2、间充质干细胞冻存液的制备
I液：取DMSO(二甲基亚砜，购自SIGMA)与上述脐血浆按体积比1∶9比例混合均匀，置于4℃下备用；
II液：取DMSO(二甲基亚砜)与胎牛血清(购自GIBCO)按体积比1∶9比例混合均匀，置于4℃下备用。
3、脐带间充质干细胞的冻存及复苏后活力的检测
(1)收集培养的脐带间充质干细胞，离心后分别用上述I液、II液重悬脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为1×106/ml；
(2)将上述干细胞先后在4℃条件下放置30分钟，-20℃放置2小时，-80℃放置16-18小时，然后置于液氮中长期保存一年；
(3)从液氮中取出冻存间充质干细胞的小管置于37℃-40℃水浴中，迅速摇晃至溶解，加入DMEM培养基中，在1500rpm下离心10分钟，弃上清；
(4)DMEM培养基重悬脐带间充质干细胞，台盼兰染色计数细胞活性率(表1)。
细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％
结果：镜下观察两组复苏后的脐带间充质干细胞，大小均匀，细胞轮廓清晰完整，折光度好；利用脐血浆制备的冻存液长期冻存脐带间充质干细胞后，细胞活力好，与胎牛血清配制的冻存液冻存细胞效果无差别。
4、脐带间充质干细胞复苏后细胞表型的检测
将复苏后的细胞以FITC标记的CD45、CD90、CD146(BD公司，美国)，PE标记的CD105、CD34(BD公司，美国)及HLA-DR(BD公司，美国)进行流式细胞仪检测。
结果：本发明冻存液长期冻存的脐带间充质干细胞高表达CD90、CD105、CD146，不表达CD45、CD34、及HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征(如图1)。
Claims (6)
1.一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将脐带血置于无菌离心管中，在1000rpm-1200rpm条件下离心15-18分钟；
2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g-4200g条件下离心18-20分钟，上清即为冻存用脐血浆；
3)取二甲基亚砜与上述冻存用脐血浆按体积比1∶9比例混合均匀，即得间充质干细胞冻存液。
2.如权利要求1所述的方法制备的间充质干细胞冻存液。
3.如权利要求2所述的间充质干细胞冻存液的用途，其特征在于用于间充质干细胞长期冻存。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
5.如权利要求2所述的冻存液，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102464197A CN101919379A (zh) | 2010-08-06 | 2010-08-06 | 一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102464197A CN101919379A (zh) | 2010-08-06 | 2010-08-06 | 一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101919379A true CN101919379A (zh) | 2010-12-22 |
Family
ID=43334824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102464197A Pending CN101919379A (zh) | 2010-08-06 | 2010-08-06 | 一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101919379A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
| CN103518702A (zh) * | 2012-07-02 | 2014-01-22 | 复旦大学 | 一种冻存细胞的方法 |
| CN104222069A (zh) * | 2014-08-27 | 2014-12-24 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 红系祖细胞冻存液及其应用 |
| CN104472474A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人脂肪间充质干细胞冻存液 |
| CN107006453A (zh) * | 2017-06-07 | 2017-08-04 | 湖南惠益森细胞基因工程有限公司 | 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法 |
| CN116889228A (zh) * | 2023-07-12 | 2023-10-17 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的冻存方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030232432A1 (en) * | 2002-04-09 | 2003-12-18 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the peparation thereof |
-
2010
- 2010-08-06 CN CN2010102464197A patent/CN101919379A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030232432A1 (en) * | 2002-04-09 | 2003-12-18 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the peparation thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 叶欣等: "人脐血清代替牛血清体外培养脐血树突状细胞", 《中国输血杂志》, vol. 17, no. 5, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 317 - 319 * |
| 孙海梅等: "不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异", 《中国临床康复》, vol. 10, no. 45, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 51 - 53 * |
| 陈信义等: "《恶性淋巴瘤的中西医结合治疗对策》", 31 December 2008, article "十三、脐血造血细胞及其应用", pages: 221 * |
| 陈汝光等: "不同冻存保护剂对脐血造血细胞生物学特性的影响", 《中华血液学杂志》, vol. 21, no. 8, 31 December 2000 (2000-12-31), pages 412 - 413 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103518702A (zh) * | 2012-07-02 | 2014-01-22 | 复旦大学 | 一种冻存细胞的方法 |
| CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
| CN103352026B (zh) * | 2013-07-24 | 2016-08-10 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
| CN104222069A (zh) * | 2014-08-27 | 2014-12-24 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 红系祖细胞冻存液及其应用 |
| CN104222069B (zh) * | 2014-08-27 | 2016-06-29 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 红系祖细胞冻存液及其应用 |
| CN104472474A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人脂肪间充质干细胞冻存液 |
| CN107006453A (zh) * | 2017-06-07 | 2017-08-04 | 湖南惠益森细胞基因工程有限公司 | 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法 |
| CN116889228A (zh) * | 2023-07-12 | 2023-10-17 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的冻存方法 |
| CN116889228B (zh) * | 2023-07-12 | 2024-01-26 | 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的冻存方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Iacono et al. | Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid, umbilical cord blood and Wharton's jelly in the horse | |
| CN106982821A (zh) | 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途 | |
| Marquez-Curtis et al. | Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: biological, clinical and cryopreservation aspects | |
| CN103404509B (zh) | 一种细胞保存液、其制备方法和应用 | |
| TW200902718A (en) | Procurement, isolation, and cryopreservation of endometrial/menstrual cells | |
| ES2364878T3 (es) | Células madre de tipo blastómero totipotenciales no embrionarias y procedimientos de las mismas. | |
| EP3560334A1 (en) | Cell freezing medium for clinical use | |
| CN101919379A (zh) | 一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液 | |
| CN101919378B (zh) | 一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液 | |
| CN101922048B (zh) | 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法 | |
| CN109481466B (zh) | 使用胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的方法和细胞制剂 | |
| Badowski et al. | Mixed effects of long-term frozen storage on cord tissue stem cells | |
| Fu et al. | Beneficial effect of human umbilical cord‑derived mesenchymal stem cells on an endotoxin‑induced rat model of preeclampsia | |
| CN109652366B (zh) | 用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂 | |
| CN105534848A (zh) | 一种化妆品或药物组合物及其用途 | |
| WO2014053418A2 (en) | Method for obtaining mesenchymal stem cells and use thereof | |
| WO2020130800A1 (en) | Stem cell conditioned media | |
| CN103263440A (zh) | 从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法 | |
| CN106434557A (zh) | 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法 | |
| Sultana et al. | Current status of canine umbilical cord blood‐derived mesenchymal stem cells in veterinary medicine | |
| CN104711226A (zh) | 一种胎盘造血干细胞的制备方法 | |
| CN109646458B (zh) | 使用胎盘间充质干细胞制剂治疗硬化病的方法 | |
| CN107372464B (zh) | 一种维持间充质干细胞活性的运输保存液与制备方法 | |
| CN106479969A (zh) | 使用hla‑g阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法 | |
| CN109845727A (zh) | 经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Huang Yuxiang Inventor after: Gao Hong Inventor after: Wang Li Inventor after: Hu Jianxia Inventor after: Zhang Xuefeng Inventor after: Zhang Meirong Inventor before: Wei Sili Inventor before: Gao Hong Inventor before: Wang Li Inventor before: Hu Jianxia Inventor before: Zhang Xuefeng Inventor before: Zhang Meirong |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WEI SILI GAO HONG WANG LI HU JIANXIA ZHANG XUEFENG ZHANG MEIRONG TO: HUANGYUXIANG GAO HONG WANG LI HU JIANXIA ZHANG XUEFENG ZHANG MEIRONG |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20101222 |