CN116889228A - 一种脐带间充质干细胞的冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法。本发明首次是通过抑制脐带间充质干细胞中的凋亡因子Caspase‑9的活性，进而延缓和减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，提高冻存复苏率。经证实，本发明提供的Caspase‑9的单克隆抗体具备良好的结合活性和特异性，以含有Caspase‑9单克隆抗体的冻存保护剂可以有效提升冻存细胞的复苏活性，减少因冻存过程中因为环境变化而激发的凋亡刺激，延长细胞的冻存时间。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞冻存技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞的冻存方法。
背景技术
间充质干细胞是来源于中胚层的一类多能干细胞，最早从骨髓中分离得到，因其易于在体外扩增，无致瘤性，在免疫调节及组织再生方面显示出强大的临床应用前景。MSCs主要有两个特征：自我更新和分化潜能；同时它还可分泌一些重要的细胞因子，表达特异性受体，能够被基因修饰，从而改变其自然行为的分子易感性。因此，MSCs日益受到人们的关注。许多学者先后从人脐带华通氏胶、脐带血管周围组织中通过不同方法分别分离获得类似细胞。与骨髓间充质干细胞相比，脐带具有来源广泛、采集容易，且能够变废为宝的特点。
虽然脐带间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、对供者无伤害，不受伦理、法律的限制、分化能力更强、免疫原性更低等诸多有点，使得其在上述疾病的治疗方面表现出了可观的临床前景，但是在临床技术成熟前所面临的问题还有很多。因脐带间充质干细胞绝对值偏低，限制了其在临床的应用。所以如何改进培养方法、提高培养成功率特别是冷冻保存的方法是急需解决的问题。
目前临床使用的MSCs大多就是经体外培养、低温保存后的。细胞冻存过程中导致的损伤一般是由细胞在冷冻过程中脱水、氧自由基产生和细胞凋亡酶如caspase的激活所致。Caspase家族成员是凋亡级联反应的重要效应蛋白酶，抑制Caspase表达能改善多种细胞冻存后的存活率。使用Caspase抑制剂zVAD-fmk对干细胞进行冻存，发现具有较好的冻存效果。但是目前的研究中，Caspase抑制剂的种类还不够丰富，可供选择的类型还不够多，而且zVAD-fmk本身对于细胞并不是完全没有活性的影响，使得研究Capase抑制剂变得迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法。所述方法是采用包含Caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂进行脐带间充质干细胞冻存，结果显示在该冻存保护剂下，脐带间充质干细胞的凋亡速度和凋亡数量呈现显著性下降，更有利于脐带间充质干细胞的长期冻存。
具体而言，本发明首先提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)分离得到的脐带间充质干细胞；
2)配置包含Caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂；
3)将步骤1)中分离的得到的脐带间充质干细胞溶解于步骤2)配置的冻存保护剂，轻轻的摇晃混匀；将冻存管依次置于4℃30min、-20℃2h、-80℃12h，并最后放置于液氮中进行冷冻保存。
优选地，步骤1)中包括如下步骤：
a)在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌含双抗(50-100u/ml青霉素+50-100u/ml链霉素)的PBS充分洗涤，切成2～3cm小段之后，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，只留血管周围的华通胶物质，用锋利的剪刀剪成小块；
b)使用0.1-0.2％的透明质酸酶和0.2-0.5％的膜蛋白酶依次消化，37℃10-30分钟；
c)向消化液中加入等体积0.01-0.02％乙二胺四乙酸磷酸盐溶液，37℃摇床振荡10-20分钟；
d)振荡结束后，采用100-200目滤网过滤，收集滤过液，将收集的滤过液以1000g离心5-10分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗2-3次，即获得脐带间充质干细胞；
优选地，步骤2)中所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ IDNO:2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示；
进一步优选地，所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，所述CDR-H1-3的序列如SEQ ID NO.4-6所示，轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，所述CDR-L1-3的序列如SEQ ID NO.7-9所示；
优选地，步骤2)的配置方法为依次称取10-20％Caspase-9单克隆抗体、10-20％海藻糖、1-5％羧甲基纤维素钠溶液、10-15％二甲基亚砜，并采用低糖DMEM培养基清溶解混匀，即可得到冻存保护剂。
优选地，步骤3)中细胞与冻存保护剂的体积比为1:5-10；
另一方面，本发明还提供了所述冻存保护剂在制备脐带间充质干细胞冻干粉中的用途。
另一方面，本发明还提供了一种Caspase-9单克隆抗体，其特征在于重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，本发明还提供了所述Caspase-9单克隆抗体在制备脐带间充质干细胞冻存保护剂中的用途。
本发明的优点如下：1)本发明首次提供了针对Caspase-9的单克隆抗体，该抗体具备良好的结合活性和特异性，能有效抑制细胞中的Caspase-9蛋白的活性，抑制细胞凋亡，延长细胞的冻存周期。经实验验证，以含有Caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂可以有效提升脐带间充质干细胞的冻存复苏活率，减少因冻存过程中因为环境变化而激发的凋亡刺激，延长细胞的冻存时间。
2)尤其是，经过长期的冻存试验后，本发明的脐带间充质干细胞仍具备超高的冻存复苏率，脐带间充质干细胞的凋亡速度和凋亡数量呈现显著性下降，更有利于脐带间充质干细胞的长期冻存。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1Caspase-9单克隆抗体的制备
根据Caspase-9的氨基酸序列(GenPept：NP_001264983.1)，分析其相应的主要活性结合表位，综合筛选获高活性的抗原表位作为免疫原制备单克隆抗体。经筛选获得的抗原表位序列为igsggfgdve qkdhgfevas tspedespgs npepdatpfq(SEQ ID NO.1)。
人工合成SEQ ID NO.1的编码序列，并将其用于构建原核表达质粒pET-N-GST-PreScission(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号D2916)，在大肠杆菌DH5α中表达N端含有GST标签的Caspase-9重组蛋白。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化，再经PreScission进行酶切除去GST标签，并收集Caspase-9短肽。经SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定，确认为目标蛋白Caspase-9截短肽表达正确，将蛋白浓度调整为10mg/mL备用。
按照10μg重组蛋白/只小鼠的剂量对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；首次免疫后第14天采用同样方法加强免疫一次；二免后第14天进行第三次免疫注射，方法与剂量同二免。三免后第10天对小鼠断尾采血，用间接ELISA方法监测血清抗体效价。当抗体水平达到要求后，于三免第14天后，选择效价最高的免疫小鼠，用纯的抗原液尾静脉加强免疫，3天后无菌采取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合制备得到杂交瘤细胞。取杂交瘤细胞株的培养上清，采用IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。
经过三轮免疫后，最终获得了Caspase-9单克隆抗体高表达单克隆细胞株，命名为5G-9。将单克隆细胞扩增后进行腹水制备纯化抗体，经试剂盒鉴定，所述Caspase-9单克隆抗体重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，所述CDR-H1-3的序列如SEQ ID NO.4-6所示，所述轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，所述CDR-L1-3的序列如SEQ ID NO.7-9所示。
采用非竞争ELISA方法检测Caspase-9单克隆抗体对SEQ ID NO.1多肽的亲和力。将SEQ ID NO.1多肽进行10倍稀释至0.01μg/mL，使用酶标仪读取OD450数值，检测结果显示，Caspase-9单克隆抗体对SEQ ID NO.1多肽的EC50可达到0.09845μg/mL，证明其具备较好的结合活性。
采用Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、GST和BSA作为特异性抗原，通过westernblot检测发现，Caspase-9单克隆抗体只与Caspase-9形成特异性条带，与其他均无条带产生，表明Caspase-9单克隆抗体具有较好的特异性。
实施例2脐带间充质干细胞的分离制备
在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌含双抗(50-100u/ml青霉素+50-100u/ml链霉素)的PBS充分洗涤，切成2～3cm小段之后，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，只留血管周围的华通胶物质，用锋利的剪刀剪成小块；使用0.1-0.2％的透明质酸酶和0.2-0.5％的膜蛋白酶依次消化，37℃10-30分钟；向消化液中加入等体积0.01-0.02％乙二胺四乙酸磷酸盐溶液，37℃摇床振荡10-20分钟；振荡结束后，采用100-200目滤网过滤，收集滤过液，将收集的滤过液以1000g离心5-10分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗2-3次，即获得脐带间充质干细胞；经血球计数板计数后接种于T225培养瓶，加入低糖DMEM培养基进行培养；首次传代后每2天更换一次培养基，传至第3代做形态和免疫表型鉴定，结果显示：脐带间充质干细胞能够贴壁于培养瓶表面，细胞形态呈现典型的梭样成纤维细胞形态，并且经流式细胞仪测定分析，该分离的脐带间充质干细胞CD29、CD44、CD90、CD105、CD49b、CD49c、CD51表达呈阳性，阳性率＞95％；CD34、CD45、CD80、CD86、CD40几乎不表达。
实施例3脐带间充质干细胞的冷冻方法
一种脐带间充质干细胞冻存方法，其包括如下步骤：将分离得到的脐带间充质干细胞与冻存保护剂混合均匀，细胞与冻存保护剂的体积比为1:5，将上述混合物通过注射器注入到冻存管内，轻轻的摇晃混匀；将冻存管依次置于4℃30min、-20℃2h、-80℃12h，并最后放置于液氮中进行冷冻保存。其中，实验组冻存保护剂由10-20％Caspase-9单克隆抗体、10-20％海藻糖、1-5％羧甲基纤维素钠溶液、10-15％二甲基亚砜，采用低糖DMEM培养基清溶解混匀。对照组冻存保护剂省略10-20％Caspase-9单克隆抗体。
冻存细胞的复苏：分别将冻存1个月、6个月和12个月的样品复苏，每组3个重复，采用快速复温法，将冻存管至于37℃水浴箱中快速解冻，用低糖DMEM培养基复苏，复苏率＝复苏后活细胞的总数/冻存前活细胞总数×100％。细胞数量总计方法如下：取100μL细胞培养液和等体积的0.4％台盼蓝混合均匀后统计活细胞的数量。
表1冻存复苏率
| 组别 | 实验组 | 对照组 |
| 1个月复苏率(％) | 99.56±1.34 | 90.23±2.21 |
| 6个月复苏(％) | 98.73±1.98 | 80.35±2.06 |
| 12个月复苏(％) | 95.56±2.68 | 71.54±2.39 |
结果如表1所示：实验组中经冻存1个月后的脐带间充质干细胞的平均复苏率为99.56±1.34％，而对照组中的复苏率仅达到了90.23±2.21％，相比于对照组，实验组具有显著的提升效果，这充分说明本发明的Caspase-9单克隆抗体能够有效的抑制细胞在冻存过程中因为环境变化而激发的凋亡刺激，实现了细胞存活率提高的效果。且伴随着冻存试验的延长，本发明实验组的复苏效果逐渐显示其优势，相比于对照组的复苏率具有明显的提升，且差异显著，P＜0.05。尤其是在12个月的冻存后，脐带间充质干细胞的复苏率还高达95.56±2.68％。充分证明，在本发明所述的Caspase-9单克隆抗体作用下，脐带间充质干细胞的凋亡速度和凋亡数量呈现显著性下降，更有利于脐带间充质干细胞的长期冻存。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)分离得到的脐带间充质干细胞；
2)配置包含Caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂；
3)将步骤1)中分离的得到的脐带间充质干细胞溶解于步骤2)配置的冻存保护剂，摇晃混匀；
4)将上述步骤3)中的混匀液依次置于4℃30min、-20℃2h、-80℃12h处理，并最后放置于液氮中进行冷冻保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中包括如下步骤：
a)在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌含双抗的PBS充分洗涤，切成2-3cm小段之后，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，只留血管周围的华通胶物质，用锋利的剪刀剪成小块；
b)使用0.1-0.2％的透明质酸酶和0.2-0.5％的膜蛋白酶依次消化，37℃10-30分钟；
c)向消化液中加入等体积0.01-0.02％乙二胺四乙酸磷酸盐溶液，37℃摇床振荡10-20分钟；
d)振荡结束后，采用100-200目滤网过滤，收集滤过液，将收集的滤过液以1000g离心5-10分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗2-3次，即获得脐带间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含双抗是由50-100u/ml青霉素和50-100u/ml链霉素组成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，所述CDR-H1-3的序列如SEQ ID NO.4-6所示，轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，所述CDR-L1-3的序列如SEQ ID NO.7-9所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)的配置方法为依次称取10-20％Caspase-9单克隆抗体、10-20％海藻糖、1-5％羧甲基纤维素钠溶液、10-15％二甲基亚砜，并采用低糖DMEM培养基清溶解混匀，即可得到冻存保护剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中细胞与冻存保护剂的体积比为1:5-10。
8.一种Caspase-9单克隆抗体，其特征在于，所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，所述CDR-H1-3的序列如SEQ ID NO.4-6所示，轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，所述CDR-L1-3的序列如SEQ ID NO.7-9所示。
9.一种Caspase-9单克隆抗体，其特征在于，所述Caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
10.权利要求8-9任一项所述Caspase-9单克隆抗体在制备脐带间充质干细胞冻存保护剂中的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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