CN112011504A - 一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括：S1、放入含75％酒精的无菌托盘中；S2、通过生理盐水对胎盘蜕膜材料进行清洗去除酒精；S3、通过D‑Hanks溶液清洗，并剔除每个小块上的血管以及挤出血管内的血；S4、用剪刀将胎盘蜕膜材料剪碎为小块，通过生理盐水清洗，然后剪碎为组织块；S5、用组合消化酶进行消化；S6、对组织混合物等体积PBS稀释后，取上清悬浊液；S7、对上清悬浊液进行离心，获取沉淀，然后采用红细胞裂解液重悬，静置裂解，再离心获取沉淀，用培养液重悬，然后接种至培养皿；S8、对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代，从而获得经传代的临床级胎盘间充质干细胞；整个培养周期短，能高效、稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)主要来源于胚胎发育早期的中胚层，其具有自我更新、多向分化和调节免疫等特点。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像APSC多能细胞。胎盘间充质干细胞的主要功能在于具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。
目前，在从胎盘上分离间充质干细胞过程中，酶处理在分离胎盘间充质干细胞中起重要作用。目前使用的主要有组织块贴壁法和酶消化法。采用组织块贴壁法分离时，约7-10天后可见贴壁生长的单个长条梭形细胞从组织块中分离出，细胞融合达80％～90％时，胰酶消化传代，但是组织贴壁法培养周期长不利于大规模生产制备。对于酶消化法，即对剪碎后的胎盘蜕膜块加入胶原酶、胰酶或各种酶的混合液进行消化，直接获取贴壁生长的单个细胞。虽然酶消化法可以快速分离出胎盘间充质干细胞，但酶体系中可能会降解细胞外膜蛋白，甚至会导致细胞无法贴壁。因此，消化酶的选择、用量及消化的时间是分离胎盘间充质干细胞的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法及其制备方法，以解决现有的通过组织块贴壁法和酶消化法从胎盘上分离间充质干细胞生产制备效率低，导致难以实现大规模生产的问题。
本发明提供了如下的技术方案：
一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、将含间充质干细胞的胎盘蜕膜材料从采样瓶中取出，放入含75％酒精的无菌托盘中，漂洗浸泡1min；S2、通过生理盐水对胎盘蜕膜材料进行清洗去除酒精，然后去除其两面的上皮层以及钙化层；S3、通过D-Hanks溶液清洗，并剔除每个小块上的血管以及挤出血管内的血；S4、用无菌剪刀将胎盘蜕膜材料剪碎为1-2cm长的小块，通过生理盐水清洗至没有血色，然后将小块的胎盘蜕膜材料剪碎为1-3mm长的组织块；S5、对获得的组织块用组合消化酶进行消化，按体积比例1：2的比例将组合消化酶与组织块混合均匀，从而获得经消化的组织混合物；S6、组织混合物置于37℃恒温环境中消化3-5小时以上，终止消化，对组织混合物等体积PBS稀释后，取上清悬浊液；S7、对上清悬浊液进行离心，获取沉淀，然后采用红细胞裂解液重悬，静置裂解，再离心获取沉淀，用培养液重悬，然后接种至培养皿；S8、对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代，从而获得经传代的临床级胎盘间充质干细胞；S9、用细胞冻存保护剂悬浮间充质干细胞，混匀后按每根冻存管细胞数为3×106-5×106个将细胞分装到做好标记的冻存管中，每管体积为1mL。
优选的，所述组合消化酶包括浓度为50U/ml-100U/m胶原酶IV和0.005wt％-0.01wt％胰蛋白酶。
优选的，所述对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代包括：培养第3天，更换培养液；培养第6-8天，观察到细胞形成小型集落时，更换培养液；第9-12天，细胞生长接近融合状态，加入组合消化酶消化细胞，获得胎盘间充质干细胞。
优选的，所述培养液为含有15％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。
优选的，所述细胞冻存保护剂按体积百分比包括二甲基亚砜8-16％、人血白蛋白5-10％、羟乙基淀粉3-6％、培养基60-80％、人参提取物1-5％以及青霉素0.1-1％，所述Rock抑制剂Y27632为5-10umol/L。
优选的，所述培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清。
优选的，所述人参提取物通过如下方法制备得到：将人参粉碎，获得人参粉末；对人参粉末进行水上蒸馏，除去馏出液，收集固相残渣得到第一人参粉末残渣；用浓度不小于90％的酒精对第一人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集固相残渣得到第二人参粉末残渣；用浓度为20％-60％的酒精对第二人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集液相；对液相进行浓缩，得到人参提取物。
优选的，所述人参提取物包含0.48mg/100mL-0.56mg/100mL的人参皂苷、1.35g/100mL-1.50g/100mL的人参多糖。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，采用组合消化酶，有利于组织破碎分散，消化效果更彻底，可以缩短消化时间；采用红细胞裂解液可有效破碎红细胞，增加间充质干细胞贴壁概率，利于间充质干细胞生长；同时通量程序化操作的分离方法，以便于细胞产业化，利于间充质干细胞实现大规模生产。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明制备方法流程图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、将含间充质干细胞的胎盘蜕膜材料从采样瓶中取出，放入含75％酒精的无菌托盘中，漂洗浸泡1min。
S2、通过生理盐水对胎盘蜕膜材料进行清洗去除酒精，然后去除其两面的上皮层以及钙化层。
S3、通过D-Hanks溶液清洗，并剔除每个小块上的血管以及挤出血管内的血。
S4、用无菌剪刀将胎盘蜕膜材料剪碎为1-2cm长的小块，通过生理盐水清洗至没有血色，然后将小块的胎盘蜕膜材料剪碎为1-3mm长的组织块。
S5、对获得的组织块用组合消化酶进行消化，按体积比例1：2的比例将组合消化酶与组织块混合均匀，从而获得经消化的组织混合物；组合消化酶包括浓度为50U/ml-100U/m胶原酶IV和0.005wt％-0.01wt％胰蛋白酶。
S6、组织混合物置于37℃恒温环境中消化3-5小时以上，终止消化，对组织混合物等体积PBS稀释后，取上清悬浊液。
S7、对上清悬浊液进行离心，获取沉淀，然后采用红细胞裂解液重悬，静置裂解，再离心获取沉淀，用培养液重悬，然后接种至培养皿。
S8、对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代，从而获得经传代的临床级胎盘间充质干细胞；对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代包括：培养第3天，更换培养液；培养第6-8天，观察到细胞形成小型集落时，更换培养液；第9-12天，细胞生长接近融合状态，加入组合消化酶消化细胞，获得胎盘间充质干细胞；培养液为含有15％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。
S9、用细胞冻存保护剂悬浮间充质干细胞，混匀后按每根冻存管细胞数为3×106-5×106个将细胞分装到做好标记的冻存管中，每管体积为1mL；细胞冻存保护剂按体积百分比包括二甲基亚砜8-16％、人血白蛋白5-10％、羟乙基淀粉3-6％、培养基60-80％、人参提取物1-5％以及青霉素0.1-1％，Rock抑制剂Y27632为5-10umol/L；培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清。
人参提取物通过如下方法制备得到：将人参粉碎，获得人参粉末；对人参粉末进行水上蒸馏，除去馏出液，收集固相残渣得到第一人参粉末残渣；用浓度不小于90％的酒精对第一人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集固相残渣得到第二人参粉末残渣；用浓度为20％-60％的酒精对第二人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集液相；对液相进行浓缩，得到人参提取物；人参提取物包含0.48mg/100mL-0.56mg/100mL的人参皂苷、1.35g/100mL-1.50g/100mL的人参多糖。
本申请采用组合消化酶，有利于组织破碎分散，消化效果更彻底，可以缩短消化时间；采用红细胞裂解液可有效破碎红细胞，增加间充质干细胞贴壁概率，利于间充质干细胞生长；同时通量程序化操作的分离方法，以便于细胞产业化，利于间充质干细胞实现大规模生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将含间充质干细胞的胎盘蜕膜材料从采样瓶中取出，放入含75％酒精的无菌托盘中，漂洗浸泡1min；
S2、通过生理盐水对胎盘蜕膜材料进行清洗去除酒精，然后去除其两面的上皮层以及钙化层；
S3、通过D-Hanks溶液清洗，并剔除每个小块上的血管以及挤出血管内的血；
S4、用无菌剪刀将胎盘蜕膜材料剪碎为1-2cm长的小块，通过生理盐水清洗至没有血色，然后将小块的胎盘蜕膜材料剪碎为1-3mm长的组织块；
S5、对获得的组织块用组合消化酶进行消化，按体积比例1：2的比例将组合消化酶与组织块混合均匀，从而获得经消化的组织混合物；
S6、组织混合物置于37℃恒温环境中消化3-5小时以上，终止消化，对组织混合物等体积PBS稀释后，取上清悬浊液；
S7、对上清悬浊液进行离心，获取沉淀，然后采用红细胞裂解液重悬，静置裂解，再离心获取沉淀，用培养液重悬，然后接种至培养皿；
S8、对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代，从而获得经传代的临床级胎盘间充质干细胞；
S9、用细胞冻存保护剂悬浮间充质干细胞，混匀后按每根冻存管细胞数为3×106-5×106个将细胞分装到做好标记的冻存管中，每管体积为1mL。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组合消化酶包括浓度为50U/ml-100U/m胶原酶IV和0.005wt％-0.01wt％胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述对培养皿中的沉淀进行无血清扩增传代包括：培养第3天，更换培养液；培养第6-8天，观察到细胞形成小型集落时，更换培养液；第9-12天，细胞生长接近融合状态，加入组合消化酶消化细胞，获得胎盘间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养液为含有15％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。
5.根据权利要求1所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞冻存保护剂按体积百分比包括二甲基亚砜8-16％、人血白蛋白5-10％、羟乙基淀粉3-6％、培养基60-80％、人参提取物1-5％以及青霉素0.1-1％，所述Rock抑制剂Y27632为5-10umol/L。
6.根据权利要求5所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清。
7.根据权利要求5所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述人参提取物通过如下方法制备得到：
将人参粉碎，获得人参粉末；
对人参粉末进行水上蒸馏，除去馏出液，收集固相残渣得到第一人参粉末残渣；
用浓度不小于90％的酒精对第一人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集固相残渣得到第二人参粉末残渣；
用浓度为20％-60％的酒精对第二人参粉末残渣进行提取，分离固液相，收集液相；
对液相进行浓缩，得到人参提取物。
8.根据权利要求7所述的一种胎盘蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述人参提取物包含0.48mg/100mL-0.56mg/100mL的人参皂苷、1.35g/100mL-1.50g/100mL的人参多糖。
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