CN116179475B - 一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法。与现有技术相比，本发明提供的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，对提取方法和培养体系均进行了优化，采用不含动物源性成分的基础培养基，避免了血清带来的污染且批次稳定性差的不足，并且获得数量和细胞总增殖倍数均有明显提高，所用培养时间短，培养2小时即可看到细胞贴壁，整个HUVECs培养工艺标准化、程序化、规范化，为临床应用提供保障。

Description

一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法。
背景技术
脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是单层扁平上皮，连续覆盖在血管内膜，构成血管壁与血液之间的机械屏障，具有重要的生理功能，广泛参与了炎性反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程，血管内皮细胞功能失调与许多心血管疾病的发生有关。与人体动脉内皮细胞相比，HUVECs取材经济、操作简便，且具有与动脉内皮细胞生物学特征相似的优点。
对于HUVECs的分离培养方法的研究确立是细胞存储、扩增、移植应用和产业化的重要基础，目前，脐静脉内皮细胞的获取方式对细胞的纯度和数量影响较大，目前有酶法和非酶法两种，非酶法主要包括：机械刮取、组织块移植等，但是获取过程容易损伤细胞、易混杂其它血管成分细胞，不推荐使用。而酶消化法常用的消化酶主要是胰蛋白酶和胶原酶，胶原酶消化效率适当，收获细胞数量多、结构完整性好、易存活，平均每根脐带可收获2-5×106个细胞，有时混杂少量成纤维细胞；而胰蛋白酶价廉易得，但是会损伤细胞贴壁能力，不容易掌握消化时长，收获细胞数量相对较少，不利于细胞生长。
血管内皮细胞的培养，常常细胞增殖慢，细胞数代以后性状发生改变，或者死亡，使研究成本变大，研究时间拉长。血管内皮细胞体外培养对于培养基营养要求较高，而提高生长速度，增加传代次数，维持传代后细胞性状对于利用血管内皮细胞体外研究多种疾病的显得尤其重要。目前市场上，采用M199基础培养基和10％胎牛血清作为培养基培养内皮细胞，然而此培养基培养的内皮细胞的增殖能力较差。因此，对于HUVECs的分离提取方法存在杂细胞多、细胞收获量少、酶消化导致细胞膜完整性破裂、细胞贴壁能力和状态差、培养代次低等缺点，并且没有简单易行的细胞鉴定方法，并且大批量提取过程中难于统一量化，另外成本较高。如何发明一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法是一项有待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法。
本发明采用的技术方案如下：一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
S1.样本预处理：将新鲜脐带清理、消毒，将消毒后的脐带用清洗液进行清洗，去除夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.HUVECs的原代培养：注射器灌洗脐静脉后，再将脐带一端夹闭，从另一端用注射器向所述脐静脉内注入消化液，直至血管充盈，振荡消化10-15min，收集HUVECs细胞，接种于培养瓶中，加入专用培养液，进行原代培养；通过将消化液充盈脐静脉，使消化液与细胞充分接触后，再振荡下滑，可以有效提高细胞收获量，缩短消化时间。
S3.HUVECs的扩增培养：观察培养瓶中细胞状态，待细胞融合度达到75 %-90 %后，加入专用培养液，进行传代扩增培养。采用专用培养液能够有效地维持了血管内皮细胞的性状，在体外扩充了8代以后，细胞仍能有较大程度维持原有性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间。
优选的，所述清洗液为含青霉素、链霉素和两性霉素的生理盐水溶液。
优选的，所述消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为1-5mg/mL，所述吐温-80的含量为15-25mg/mL。具体的，使用含有表面活性剂的酶溶液作为消化液，可以减少振荡过程中，细胞所受到的物理损伤，保证良好的细胞状态。
优选的，所述振荡消化条件为，在37℃下，振荡转速为100-150rpm，消化时间为10-15min。
优选的，所述专用培养液由无血清基础培养基、重组蛋白、中药提取物和脂联素组成；每1L基础培养基中含有1.5-3%wt中药提取物、2-4mg脂联素。具体的，采用不含动物源性成分的基础培养基，通过添加脂联素可以下调HUVEC中VEGF的表达，通过添加中药提取物可以下调HUVEC中MCP-1和VE-cadherin的表达，有效修复细胞缺氧、高糖损伤/衰退，维持血管内皮细胞活性及血管结构完整性，有效提高内皮细胞的增殖能力，提高了细胞培养体系的稳定性。
优选的，所述基础培养基为DMEM-F12培养基、M199培养基、L-DMEM培养基或IMDM培养基中的任意一种。采用不含动物源性成分的基础培养基，避免了血清带来的污染且批次稳定性差的不足。
优选的，所述中药提取物采用以下方法制备：将原料药粉碎至75μm以下，加入蒸馏水回流提取，过滤除渣，将滤液浓缩至含量为1g/ml，灭菌备用；所述原料药包括：15-22份丹参、7-9份檀香，12-15份赤芍、4-7份川芎，4-7份红花，4-7份当归，12-17份生地黄。通过复合中药超微粉碎后提取有效加快有效成分的吸收，并且诸药配合，可改善微循环、扩张冠脉血管、增加冠脉血流量、抗心肌损伤、对血管内皮细胞保护有明显疗效。
优选的，所述重组蛋白包括氢化可的松、VEGF、FGF、IGF、抗坏血酸、EGF中的一种或多种。
优选的，原代细胞接种1d后更换新鲜专用培养液，以后每2 d更换新鲜专用培
养液，直到细胞融合度达到75 %-90 %。
优选的，所述传代培养的接种密度为1.5×106/T-175瓶。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，对提取方法和培养体系均进行了优化，采用不含动物源性成分的基础培养基，避免了血清带来的污染且批次稳定性差的不足，并且获得数量和细胞总增殖倍数均有明显提高，所用培养时间短，培养2小时即可看到细胞贴壁，整个HUVECs培养工艺标准化、程序化、规范化，为临床应用提供保障。
附图说明
图1为实施例1的培养获得的HUVECs细胞的形态鉴定结果图；
图2为实施例3培养获得的HUVECs细胞的流式细胞检测结果；
图3为本发明和对照组培养的HUVECs细胞的细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
以下实施例中使用的试剂来源：
实施例1
S1.取出健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（要求长度在20 cm以上，从采集到处理时间不超过6 h），放入脐带消毒液中浸泡消毒1 min；将消毒后的脐带转入清洗液两次，使用组织镊和剪刀沿脐带两侧结扎端内侧剪断，剪去有夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.在脐静脉一端插入输液延长管，至少1 cm以上，止血钳固定；从延长管一端用20 ml注射器注入脐带冲洗液清洗脐静脉，至无血迹；用脐带夹夹闭脐带一端，从另一端向脐静脉注入消化液，至血管充盈，夹闭输入端置于37℃振荡消化10-15 min，其中，振荡转速为100-150rpm；打开脐带一端收集消化液到培养基中，用20 ml的培养基冲洗脐静脉两次，合并于同一离心管内，以250 g离心10 min，弃上清液；加入专用培养液，重新悬浮，接种于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；
S3.原代细胞接种后次日弃旧培养液，用PBS轻轻漂洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞，换入新的完全培养液，以后每2 d更换新鲜完全培养液；当细胞融合度达到85%以上时，弃掉原有培养液，用PBS洗一次，加入1 ml的胰酶替代物，孵箱中孵育1 min左右，取出镜下观察，当90%以上细胞变成球形后，加入等量培养基停止消化；移液管轻揉吹打细胞，至95%以上细胞脱落后，收集细胞悬液加入15 ml离心管中，培养瓶用2 ml的PBS洗一次，洗液收集于上述离心管中，250 g离心5 min，弃上清液；加入新鲜完全培养液重悬细胞团，按照1.5×106/T-175瓶进行接种，进行传代培养；
上述培养获得的HUVECs细胞按照50%培养基+40%人血清白蛋白+10%DMSO（或80%培养基+10%人血清白蛋白+10%DMSO）的比例配制冻存液，按照上述方法收集细胞并按照1×106/1.5ml冻存管的细胞数量进行冻存，程序降温或者放置于-80℃过夜后转移到液氮中。
其中，消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为1mg/mL，所述吐温-80的含量为15mg/mL；
中药提取物制备方法如下：将15份丹参、7份檀香，12份赤芍、4份川芎，7份红花，4份当归，13份生地黄混合后，转移至粉碎机中进行粗粉碎，得到药材粗粉，将药材粗粉置于棒磨机中再次粉碎，将所得细粉通过风送专用双向气流筛分机过200~400目筛，即得75μm以下细粉末，加1 L蒸馏水浸泡1 h后，煎煮回流提取约2 h，过滤去渣，将滤液置于水浴上浓缩至相当于生药含量2g/mL，再经110-130℃下蒸汽灭菌和紫外灭菌的方式，保存备用。
实施例2
S1.取出健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（要求长度在20 cm以上，从采集到处理时间不超过6 h），放入脐带消毒液中浸泡消毒1 min；将消毒后的脐带转入清洗液两次，使用组织镊和剪刀沿脐带两侧结扎端内侧剪断，剪去有夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.在脐静脉一端插入输液延长管，至少1 cm以上，止血钳固定；从延长管一端用20 ml注射器注入脐带冲洗液清洗脐静脉，至无血迹；用脐带夹夹闭脐带一端，从另一端向脐静脉注入消化液，至血管充盈，夹闭输入端置于37℃振荡消化10-15 min，其中，振荡转速为100-150rpm；打开脐带一端收集消化液到培养基中，用20 ml的培养基冲洗脐静脉两次，合并于同一离心管内，以250 g离心10 min，弃上清液；加入专用培养液，重新悬浮，接种于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；
S3.原代细胞接种后次日弃旧培养液，用PBS轻轻漂洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞，换入新的完全培养液，以后每2 d更换新鲜完全培养液；当细胞融合度达到85%以上时，弃掉原有培养液，用PBS洗一次，加入1 ml的胰酶替代物，孵箱中孵育1 min左右，取出镜下观察，当90%以上细胞变成球形后，加入等量培养基停止消化；移液管轻揉吹打细胞，至95%以上细胞脱落后，收集细胞悬液加入15 ml离心管中，培养瓶用2 ml的PBS洗一次，洗液收集于上述离心管中，250 g离心5 min，弃上清液；加入新鲜完全培养液重悬细胞团，按照1.5×106/T-175瓶进行接种，进行传代培养；
上述培养获得的HUVECs细胞按照50%培养基+40%人血清白蛋白+10%DMSO（或80%培养基+10%人血清白蛋白+10%DMSO）的比例配制冻存液，按照上述方法收集细胞并按照1×106/1.5ml冻存管的细胞数量进行冻存，程序降温或者放置于-80℃过夜后转移到液氮中。
其中，消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为5mg/mL，所述吐温-80的含量为20mg/mL；
中药提取物制备方法如下：将22份丹参、9份檀香，15份赤芍、7份川芎，7份红花，4份当归，12份生地黄混合后，转移至粉碎机中进行粗粉碎，得到药材粗粉，将药材粗粉置于棒磨机中再次粉碎，将所得细粉通过风送专用双向气流筛分机过200~400目筛，即得75μm以下细粉末，加1 L蒸馏水浸泡1 h后，煎煮回流提取约2 h，过滤去渣，将滤液置于水浴上浓缩至相当于生药含量1g/mL，再经110-130℃下蒸汽灭菌和紫外灭菌的方式，保存备用。
实施例3
S1.取出健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（要求长度在20 cm以上，从采集到处理时间不超过6 h），放入脐带消毒液中浸泡消毒1 min；将消毒后的脐带转入清洗液两次，使用组织镊和剪刀沿脐带两侧结扎端内侧剪断，剪去有夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.在脐静脉一端插入输液延长管，至少1 cm以上，止血钳固定；从延长管一端用20 ml注射器注入脐带冲洗液清洗脐静脉，至无血迹；用脐带夹夹闭脐带一端，从另一端向脐静脉注入消化液，至血管充盈，夹闭输入端置于37℃振荡消化10-15 min，其中，振荡转速为100-150rpm；打开脐带一端收集消化液到培养基中，用20 ml的培养基冲洗脐静脉两次，合并于同一离心管内，以250 g离心10 min，弃上清液；加入专用培养液，重新悬浮，接种于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；
S3.原代细胞接种后次日弃旧培养液，用PBS轻轻漂洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞，换入新的完全培养液，以后每2 d更换新鲜完全培养液；当细胞融合度达到85%以上时，弃掉原有培养液，用PBS洗一次，加入1 ml的胰酶替代物，孵箱中孵育1 min左右，取出镜下观察，当90%以上细胞变成球形后，加入等量培养基停止消化；移液管轻揉吹打细胞，至95%以上细胞脱落后，收集细胞悬液加入15 ml离心管中，培养瓶用2 ml的PBS洗一次，洗液收集于上述离心管中，250 g离心5 min，弃上清液；加入新鲜完全培养液重悬细胞团，按照1.5×106/T-175瓶进行接种，进行传代培养；
上述培养获得的HUVECs细胞按照50%培养基+40%人血清白蛋白+10%DMSO（或80%培养基+10%人血清白蛋白+10%DMSO）的比例配制冻存液，按照上述方法收集细胞并按照1×106/1.5ml冻存管的细胞数量进行冻存，程序降温或者放置于-80℃过夜后转移到液氮中。
其中，消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为4mg/mL，所述吐温-80的含量为22mg/mL；
中药提取物制备方法如下：将20份丹参、8份檀香，14份赤芍、5份川芎，5份红花，7份当归，14份生地黄混合后，转移至粉碎机中进行粗粉碎，得到药材粗粉，将药材粗粉置于棒磨机中再次粉碎，将所得细粉通过风送专用双向气流筛分机过200~400目筛，即得75μm以下细粉末，加1 L蒸馏水浸泡1 h后，煎煮回流提取约2 h，过滤去渣，将滤液置于水浴上浓缩至相当于生药含量2g/mL，再经110-130℃下蒸汽灭菌和紫外灭菌的方式，保存备用。
实施例4
S1.取出健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（要求长度在20 cm以上，从采集到处理时间不超过6 h），放入脐带消毒液中浸泡消毒1 min；将消毒后的脐带转入清洗液两次，使用组织镊和剪刀沿脐带两侧结扎端内侧剪断，剪去有夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.在脐静脉一端插入输液延长管，至少1 cm以上，止血钳固定；从延长管一端用20 ml注射器注入脐带冲洗液清洗脐静脉，至无血迹；用脐带夹夹闭脐带一端，从另一端向脐静脉注入消化液，至血管充盈，夹闭输入端置于37℃振荡消化10-15 min，其中，振荡转速为100-150rpm；打开脐带一端收集消化液到培养基中，用20 ml的培养基冲洗脐静脉两次，合并于同一离心管内，以250 g离心10 min，弃上清液；加入专用培养液，重新悬浮，接种于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；
S3.原代细胞接种后次日弃旧培养液，用PBS轻轻漂洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞，换入新的完全培养液，以后每2 d更换新鲜完全培养液；当细胞融合度达到85%以上时，弃掉原有培养液，用PBS洗一次，加入1 ml的胰酶替代物，孵箱中孵育1 min左右，取出镜下观察，当90%以上细胞变成球形后，加入等量培养基停止消化；移液管轻揉吹打细胞，至95%以上细胞脱落后，收集细胞悬液加入15 ml离心管中，培养瓶用2 ml的PBS洗一次，洗液收集于上述离心管中，250 g离心5 min，弃上清液；加入新鲜完全培养液重悬细胞团，按照1.5×106/T-175瓶进行接种，进行传代培养；
上述培养获得的HUVECs细胞按照50%培养基+40%人血清白蛋白+10%DMSO（或80%培养基+10%人血清白蛋白+10%DMSO）的比例配制冻存液，按照上述方法收集细胞并按照1×106/1.5ml冻存管的细胞数量进行冻存，程序降温或者放置于-80℃过夜后转移到液氮中。
其中，消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为2mg/mL，所述吐温-80的含量为18mg/mL；
中药提取物制备方法如下：将15份丹参、9份檀香，12份赤芍、7份川芎，7份红花，7份当归，15份生地黄混合后，转移至粉碎机中进行粗粉碎，得到药材粗粉，将药材粗粉置于棒磨机中再次粉碎，将所得细粉通过风送专用双向气流筛分机过200~400目筛，即得75 μm以下细粉末，加1 L蒸馏水浸泡1 h后，煎煮回流提取约2 h，过滤去渣，将滤液置于水浴上浓缩至相当于生药含量1.5g/mL，再经110-130℃下蒸汽灭菌和紫外灭菌的方式，保存备用。
对比例1
与实施例3不同在于，消化液为浓度为1 mg/ml胰蛋白酶溶液，并且不采用振荡消化。
对比例2
与实施例3不同在于，消化液为浓度为1 mg/ml I型胶原酶溶液，并且不采用振荡消化和加压灌注。
对比例3
与实施例4不同在于，去除专用培养液中的中药提取物。
对比例4
与实施例4不同在于，去除专用培养液中的脂联素。
对比例5
与实施例4不同在于，采用M199基础培养基和10％胎牛血清作为培养基。
HUVECs形态学观察：
对实施例1的HUVECs原代分离方法分离的过程、原代培养过程中，以及对分离得到的HUVECs细胞的传代培养过程中的细胞形态进行显微观察（见图1）：可以看到各代次细胞形态呈鹅卵石状排列，边界清晰，折光度良好。
流式细胞仪检测细胞免疫表型：
采用实施例3获得的P1/P2代的HUVECs细胞收集后进行流式分析细胞表面标记物，实验结果如附图2所示。细胞表面抗原鉴定的结果显示：CD31和CD105阳性率99%以上；HLA-DR的阳性率在0.5%以下，另外HUVECs的干性标记物CD34和CD133的表达率高达50%以上。
HUVECs细胞活力测定：
对本发明和对比例培养获得的HUVECs细胞的细胞活力进行测定。绘制得到的细胞活力图（如图3）所示。表明本发明培养获得的HUVECs细胞的细胞活力明显高于对照组，本发明培养到P10代时，细胞生长依然旺盛，而对比例5培养到P10代时已经几乎不增殖了。
采用ELISA检测细胞中MCP-1、VE-cadherin蛋白及VEGF蛋白的表达情况，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，测试结果见表1。
注：与实施例比较，*P＜0.05
表明本发明相较于对比例3的MCP-1和VE-cadherin表达水平均明显降低，可显著改善内皮细胞损伤，显著提高内皮细胞的生存率，本发明相较于对比例4的VEGF表达水平均明显降低，表明可以下调HUVEC中VEGF的表达，抑制新生血管的生成及组织血管化进程。
表2为本发明与对比例的消化效果对比
本发明仅用15分钟就可以达到I型胶原酶消化45min的效果，大大缩短了消化时间，降低时间成本和原料成本。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：S1.样本预处理：将新鲜脐带清理、消毒，将消毒后的脐带用清洗液进行清洗，去除夹痕、凝血阻塞的脐带部分，并暴露脐带中动脉和静脉开口；
S2.HUVECs的原代培养：注射器灌洗脐静脉后，再将脐带一端夹闭，从另一端用注射器向所述脐静脉内注入消化液，直至血管充盈，振荡消化10-15min，收集HUVECs细胞，接种于培养瓶中，加入专用培养液，进行原代培养；所述振荡消化条件为，在37℃下，振荡转速为100-150rpm，消化时间为10-15min；所述消化液包括胰蛋白酶和吐温-80，所述胰蛋白酶的浓度为1-5mg/mL，所述吐温-80的含量为15-25mg/mL；
S3.HUVECs的扩增培养：观察培养瓶中细胞状态，待细胞融合度达到75 %-90 %后，加入专用培养液，进行传代扩增培养；
所述专用培养液由无血清基础培养基、重组蛋白、中药提取物和脂联素组成；每1L基础培养基中含有1.5-3%wt中药提取物、2-4mg脂联素；所述中药提取物采用以下方法制备：将原料药粉碎至75μm以下，加入蒸馏水回流提取，过滤除渣，将滤液浓缩至生药材量为1-2g/ml的浓缩液，灭菌备用；所述原料药包括：15-22份丹参、7-9份檀香、12-15份赤芍、4-7份川芎、4-7份红花、4-7份当归和12-17份生地黄。
2.根据权利要求1所述的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述清洗液为含青霉素、链霉素和两性霉素的生理盐水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述基础培养基为DMEM-F12培养基、M199培养基、L-DMEM培养基或IMDM培养基中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述重组蛋白包括VEGF、FGF、IGF、EGF中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于：原代细胞接种1d后更换新鲜专用培养液，以后每2 d更换新鲜专用培养液，直到细胞融合度达到75 %-90 %。
6.根据权利要求2所述的一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述传代培养的接种密度为1.5×106/T-175瓶。
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