CN108660108A - 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 - Google Patents

一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法，步骤如下：(1)取脐带，清洗，剪短，去除血管和脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成小块，采用StemPro MSC SFM CTS完全培养基培养；(2)待细胞汇合率达25～30％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，洗涤，收集细胞悬液，即可。本发明方法处理的间充质干细胞，免疫调节相关因子的分泌水平高，对单个核细胞的抑制作用大，显著高于常规含血清培养基的作用，且对间充质干细胞的其余性质，如，分化能力等性质没有影响，应用前景良好。

Description

一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法
技术领域
本发明涉及一种增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新、高速增殖、具多向分化潜能的一类细胞，在再学医学领域应用广泛。目前已从包括脐带在内的多种组织中分离得到间充质干细胞，由于脐带组织除采集方便，量大等特点外也没有伦理学问题，因而脐带间充质干细胞逐渐成为科研和医学工作者的研究热点。
脐带间充质干细胞是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种干细胞，不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且相较于其它来源的间充质干细胞，其细胞更原始，具有更强的增殖、自我更新和多项分化能力，是再生医学工程领域良好的种子细胞，已用于骨、软骨、神经等多种组织的再生研究。除应用于再生医学领域，脐带间充质干细胞还可通过旁分泌因子和表面表达粘附因子等途径发挥免疫调节的作用，用于免疫性疾病的治疗。
免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，是防卫病原体入侵机体核心武器。但当免疫功能紊乱时，对自身的机体成分进行攻击，从而损伤正常组织器官及其功能，诱发多种自身免疫性疾病。如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、糖尿病等。另外，移植物抗宿主反应也是一种有害的免疫性疾病，在进行骨髓或脐血移植的过程中，移植物中的免疫活性细胞对免疫力低下且组织不相融性抗原宿主的组织器官进行攻击，可造成皮肤、肝脏和消化道细胞坏死，严重者还会造成被攻击器官的纤维化和萎缩并发生致病性感染，造成宿主死亡。以上所述的免疫性疾病传统上都以免疫抑制性药物进行治疗，但免疫抑制药物有个共同的不良作用，即不同程度地影响机体免疫系统的抗感染、抗肿瘤功能，且某些耐药难治性免疫性疾病治疗效果欠佳。
最新的研究显示间充质干细胞可通过免疫调节作用对免疫性疾病进行治疗，具有良好的疗效。以移植物抗宿主病为例，间充质干细胞能够逆转移植物的免疫细胞对宿主组织造成的损伤损伤，如出血性膀胱炎、纵隔积气、结肠穿孔所致的腹膜炎，对广泛出血也有很好的疗效，提示间充质干细胞在治疗免疫性疾病上前景非常广阔。
目前，用于间充质干细胞培养的常规培养基为含胎牛血清的培养基或者LONZA等无血清培养基，但是它们培养后的间充质干细胞的免疫调节能力不强，有待进一步改进。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的无血清培养及保存方法。
本发明分离制备高免疫调节能力的脐带间充质干细胞的方法，步骤如下：
(1)取脐带，清洗，剪短，去除血管和脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成小块，采用StemPro MSC SFM CTS完全培养基培养；
(2)待细胞汇合率达25～30％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，洗涤，收集细胞悬液，即可。
步骤(1)中，剪短至长度为2厘米。
步骤(1)中，将剩余组织剪成大小为0.5～1立方毫米的小块。
步骤(1)中，采用StemPro MSC SFM CTS完全培养基培养的方式是：将小块与StemPro MSC SFM CTS完全培养基混合后，接种至包被有CELLstart CTS基质的培养皿中培养，20小时后补液。
本发明还提供了前述方法分离制备得到的带间充质干细胞。
本发明还提供了用于前述间充质干细胞的冻存液，其特征在于：它由如下两种组分：StemPro MSC SFM CTS完全无血清培养基与CryoSure-DEX40二甲基亚砜右旋糖酐液组成。
优选地，所述StemPro MSC SFM CTS完全无血清培养基与CryoSure-DEX40二甲基亚砜右旋糖酐液的体积比为4:1。
本发明还提供了一种前述脐带间充质干细胞的冻存方法，它是采用前述冻存液进行冻存。
本发明通过去除脐带血管和羊膜及周围组织，筛取脐带亚结构组织并利用筛取的特定无血清培养基经优化的方案进行培养，从而获得免疫调节能力更强的脐带间充质干细胞，可广泛用于免疫性疾病的临床研究和治疗，造福患者。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为P0代及P1脐带间充质干细胞特征
图2为脐带间充质干细胞成骨、成软骨和成脂分化鉴定
图3为酶联免疫吸附测定实施例1与对比例1、对比例2得到脐带间充质干细胞前列腺素E2旁分泌量
图4为实施例1与对比例1、对比例2得到脐带间充质干细胞与单个核细胞共培养后对单个核细胞增殖的影响
图5为实施例1与对比例1、对比例2得到脐带间充质干细胞与单个核细胞共培养后对单个核细胞干扰素γ分泌的影响
图6为本发明脐带间充质干细胞的无血清冻存方法与市售商品化冻存试剂对脐带间充质干细胞活率的影响
具体实施方式
主要仪器及耗材：生物安全柜、倒置相差显微镜、CO2细胞培养箱、电动移液器、医用有齿镊、医用眼科剪、细胞筛、培养皿、T75培养瓶、移液管；
主要试剂：购自Gibco的StemPro MSC SFM CTS完全培养基、购自Gibco的CELLstart CTS、购自GE的无菌磷酸缓冲溶液、购自Gibco的CTS TrypLE Select Enzyme。
实施例1本发明脐带间充质干细胞的无血清培养方法
利用工作浓度CELLstart CTS基质包被直径为100毫米塑料培养皿，37℃包被1小时，包被完成后去除多余液体，包被后的培养皿待用；
脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，无菌采集后放于磷酸缓冲溶液中4℃保存，24小时内处理；在无菌操作台内取出脐带，反复用磷酸缓冲液清洗，直至清洗后的液体透明；
将清洗后的脐带剪成2厘米小段，拔除动脉及静脉血管并剪除脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成0.5～1立方毫米的小块，混合2毫升(每培养皿内混合2ml培养基)StemPro MSC SFM CTS完全培养基并均匀地铺在包被好的培养皿内，20小时后补液8毫升；
10～14天后，待细胞汇合率达25～30％，用胰酶替代物CTS TrypLE SelectEnzyme进行消化，待细胞变圆后加入十倍体积磷酸缓冲液进行稀释并吹打洗涤，收集细胞悬液，即可。
对比例1未去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法
利用工作浓度CELLstart CTS基质包被直径为100毫米塑料培养皿，37℃包被1小时，包被完成后去除多余液体，包被后的培养皿待用；
脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，无菌采集后放于磷酸缓冲溶液中4℃保存，24小时内处理；在无菌操作台内取出脐带，反复用磷酸缓冲液清洗，直至清洗后的液体透明；
将清洗后的脐带剪成2厘米小段，将组织剪成1立方毫米左右小块，混合2毫升StemPro MSC SFM CTS完全培养基并均匀地铺在包被好的培养皿内，20小时后补液8毫升；
10～14天后，待细胞汇合率达25％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，待细胞变圆后加入十倍体积磷酸缓冲液进行稀释并吹打洗涤，收集细胞悬液，200目细胞筛过滤后离心接种，即可。
对比例2含胎牛血清去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法
脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，无菌采集后放于磷酸缓冲溶液中4℃保存，24小时内处理；
在无菌操作台内取出脐带，反复用磷酸缓冲液清洗，直至清洗后的液体透明；
将清洗后的脐带剪成2厘米小段，拔除动脉及静脉血管并剪除脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成1立方毫米左右小块，混合2毫升含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基并均匀地铺在培养皿内，20小时后补液8毫升；
10～14天后，待细胞汇合率达25％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，待细胞变圆后加入十倍体积磷酸缓冲液进行稀释并吹打洗涤，收集细胞悬液，200目细胞筛过滤后离心接种，即可。
对比例3LONZA无血清培养基去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法
脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，无菌采集后放于磷酸缓冲溶液中4℃保存，24小时内处理；
在无菌操作台内取出脐带，反复用磷酸缓冲液清洗，直至清洗后的液体透明；
将清洗后的脐带剪成2厘米小段，拔除动脉及静脉血管并剪除脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成1立方毫米左右小块，混合2毫升LONZA无血清培养基并均匀地铺在培养皿内，20小时后补液8毫升；
10～14天后，待细胞汇合率达25％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，待细胞变圆后加入十倍体积磷酸缓冲液进行稀释并吹打洗涤，收集细胞悬液，200目细胞筛过滤后离心接种，即可。
以下用试验例的方式来说明本发明的有益效果：
试验例1处理后的间充质干细胞的免疫调节能力
1、实验方法
(1)分化能力检测
取实施例1制备的间充质干细胞，对其分化性能进行检测。
(2)免疫调节相关旁分泌因子含量的检测
分别取实施例1、对比例1和对比例2制备的间充质干细胞，计数后接种1×106细胞至T75培养瓶，72小时后收集上清，进行酶联免疫吸附测定(R&D公司ProstaglandinE2Parameter Assay Kit，货号KGE004B)，按试剂盒标准操作步骤进行，包括标准品稀释、加样、温育、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色及终止，用酶标仪读取450纳米波长各孔的吸光度，根据建立的标准曲线计算测试样品的浓度。
(3)不同培养方式获得的脐带间充质干细胞与单个核细胞的共培养实验
1)利用Ficoll试剂分离外周血单个核细胞
2)分别取实施例1、对比例1、对比例2和对比例3得到的间充质干细胞，于24孔板中每植入3×104个细胞，待贴壁后用10μg/ml丝裂霉素处理30分钟，设置3个复孔；
3)待细胞贴壁后，将培养基置换为单个核细胞培养基，即含10％FBS和10μg/ml的植物凝集素的RPMI1640培养基，每孔加入3×105个单个核细胞，37℃和5％CO2共培养5天；
4)单核细胞吹散后收集至离心管内，离心力500g，离心5分钟，收集上清液；
5)单个核细胞计数；
6)酶联免疫吸附测定共培养上清中干扰素γ含量。
(4)本发明脐带间充质干细胞的无血清冻存方法
将实施例1得到的间充质干细胞按3×106个/毫升浓度与两种冻存保护剂分别重悬，一种冻存液为本发明所示的StemPro MSC SFM CTS完全无血清培养基与CryoSure-DEX40二甲基亚砜右旋糖酐液以4:1比例混合配置而成，另一种为商品化冻存保护剂CELLBANKER。经程控降温后保存于液氮中三个月，后取出复苏统计细胞存活率。
2、实验结果
(1)分化能力检测
本发明脐带间充质干细胞培养方法在7-10天即可看到有间充质干细胞从组织块边缘爬出，所分离培养的脐带间充质干细胞形态为典型间充质干细胞所呈的长梭形，标准接种增殖迅速传代3天细胞汇合率即可达90％以上，如图1所示；经多次传代仍能保持成骨、成软骨和成脂分化潜能，如图2所示。
(2)免疫调节相关旁分泌因子含量的检测
结果如如图3和下表1所示；
表1脐带间充质干细胞前列腺素E2旁分泌量
*p＜0.05表示对比例与实施例相比，均值差具有显著性差异。
本发明脐带间充质干细胞培养方法(实施例1)与未去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法(对比例1)及含胎牛血清去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法(对比例2)相比，经酶联免疫吸附测定，实施例1得到的脐带间充质干细胞分泌的免疫调节相关因子前列腺素E2的分泌量最高，且差异显著，，说明本发明方法制备得到的脐带间充质干细胞的免疫调节能力最强
(3)不同培养方式获得的脐带间充质干细胞与单个核细胞的共培养实验
如图4～5以下述两个表所示：
表2脐带间充质干细胞与单个核细胞共培养后对单个核细胞增殖的影响
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3
细胞数量(×106) 1.52±0.18 1.60±0.20 1.97±0.27* 1.94±0.13*
*p＜0.05表示对比例与实施例相比，均值差具有显著性差异。
表3脐带间充质干细胞与单个核细胞共培养后对单个核细胞干扰素γ分泌的影响
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3
干扰素γ(pg/ml) 168.02±20.00 316.33±32.15* 884.95±98.27* 901.00±109.30*
*p＜0.05表示对比例与实施例相比，均值差具有显著性差异。
与未去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法(对比例1)、含胎牛血清去除血管及羊膜组织的脐带间充质干细胞的培养方法(对比例2)和其他培养基的培养方法(对比例3)相比，本发明脐带间充质干细胞培养方法(实施例1)制备得到的脐带间充质干细胞与单个核细胞共培养后测定，脐带间充质干细胞对单个核细胞的增殖和炎性因子的释放抑制作用最大，说明本发明方法制备得到的脐带间充质干细胞的免疫调节能力最强。
(4)本发明脐带间充质干细胞的无血清冻存方法
如图6和下表所示：
表4本发明脐带间充质干细胞的无血清冻存方法与市售商品化冻存试剂对脐带间充质干细胞活率的影响
本发明冻存夜 商品化试剂冻存
细胞活率(％) 85.27±3.47 88.98±1.86
可以看出，本发明脐带间充质干细胞的无血清冻存方法与商品化冻存保护剂相比对细胞的活性并无显著性差异，而商品化冻存保护剂成分不明，本方法能在保证细胞活率的前提下不掺入额外的成分。
综上，本发明方法制备得到的脐带间充质干细胞，免疫调节相关因子的分泌水平高，对单个核细胞的抑制作用大，显著高于常规含血清培养基的作用，且对间充质干细胞的其余性质，如，分化能力等性质没有影响，应用前景良好。

Claims (8)

1.一种分离制备高免疫调节能力的脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取脐带，清洗，剪短，去除血管和脐带外围的羊膜组织，将剩余组织剪成小块，采用StemPro MSC SFM CTS完全培养基培养；
(2)待细胞汇合率达25～30％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme进行消化，洗涤，收集细胞悬液，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，剪短至长度为2厘米。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，将剩余组织剪成大小为0.5～1立方毫米的小块。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，采用StemPro MSC SFM CTS完全培养基培养的方式是：将小块与StemPro MSC SFM CTS完全培养基混合后，接种至包被有CELLstart CTS基质的培养皿中培养，20小时后补液。
5.权利要求1～4任意一项所述方法分离制备得到的脐带间充质干细胞。
6.一种用于权利要求5所述脐带间充质干细胞的冻存液，其特征在于：它由如下两种组分：StemPro MSC SFM CTS完全无血清培养基与
CryoSure-DEX40二甲基亚砜右旋糖酐液组成。
7.根据权利要求6所述的冻存液，其特征在于：所述StemPro MSC SFM CTS完全无血清培养基与CryoSure-DEX40二甲基亚砜右旋糖酐液的体积比为4:1。
8.一种权利要求5所述脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：它是采用权利要求6或7所述的冻存液进行冻存。
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