CN117603909A - 高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用。本发明提供了一种高免疫抑制的人脐带间充质干细胞的培养方法，包括取新生儿脐带组织，分离并培养得到P0代人脐带间充质干细胞；将所得P0代人脐带间充质干细胞进行传代培养，得到P1代人脐带间充质干细胞；利用低浓度的双炎性因子IFN‑γ和TNF‑α诱导培养P1代人脐带间充质干细胞，得到具有高免疫抑制能力的人脐带间充质干细胞。该人脐带间充质干细胞分泌高浓度的PGE‑2和IDO，具有更强的免疫抑制能力；在自身免疫性疾病治疗方面具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用。
背景技术
间充质干细胞（MSCs）是存在于多种组织的一种具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞。因其具有易于分离扩增、多向分化、造血支持、低免疫原性和免疫调节等特性，而成为组织工程和再生医学中理想的种子细胞。间充质干细胞除了能促进损伤组织再生修复外，还具有明显的调控免疫功能，可用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化病等自身免疫性疾病的治疗。一般认为间充质干细胞与免疫细胞直接或间接接触分泌多种生长因子和免疫调节因子，从而抑制各种免疫细胞的功能，减轻炎症反应。
前列腺素E2（PGE-2）是一种可溶性的抑炎因子，人脐带间充质干细胞（UCMSCs）可通过分泌可溶性的PGE-2发挥其免疫抑制能力；吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）是人脐带间充质干细胞另外一个重要的参与免疫调节反应的蛋白。一般而言这些可溶性炎性因子UCMSCs的表达量较低、甚至不表达。
目前国内“干细胞临床研究备案项目”所采用的间充质干细胞多为通用型细胞产品（非诱导型、非强化功能型）。通用型细胞产品受供者差异、培养体系差异以及实验室技术水平差异等影响，不同机构间的间充质干细胞性能差异巨大，如分泌因子水平参差不齐。亦有学者研究单因子刺激对MSCs分泌因子的影响。如梁晨团队曾报道，采用IFN-γ刺激培养间充质干细胞144小时，可大幅提高PGE-2的分泌水平，平均值为1715.5pg/ml；但分泌因子浓度受个体影响差异大、波动大，最低为738.6pg/ml，最高2617.8pg/ml，CV值为±36.6%。再有，公开号为CN105154395A的中国发明专利公开了采用咪唑喹啉R848 1～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b 100～200U/mL作为预处理因子，来诱导MSCs高表达和分泌细胞因子VEGF、HGF和PGE-2，在一定程度上提高了MSCs的增殖能力和抵抗NK细胞杀伤的能力；但分泌细胞因子PGE-2的浓度在300ng/mL左右，表达量较低。
因此，有必要研究新的方法，进一步培养得到具有更强免疫抑制能力的人脐带间充质干细胞。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有人脐带间充质干细胞中可溶性炎性因子表达量低、免疫抑制能力差等问题，本发明利用低浓度的双炎性因子干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导培养人脐带间充质干细胞，促使其分泌高浓度的PGE-2和IDO，增强其免疫抑制能力。
本发明的目的之一在于提供一种用于无需筛选细胞培养高免疫抑制人脐带间充质干细胞的试剂，该试剂可在72小时内促使UCMSCs分泌高浓度的关键效应因子PGE-2和IDO，进一步增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制能力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于无需筛选细胞培养高免疫抑制人脐带间充质干细胞的试剂，待培养细胞为人脐带间充质干细胞；所述试剂包括含有终浓度为40-50ng/ml的IFN-γ和终浓度为20-30ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培养基。
进一步，所述试剂为含有终浓度为45ng/ml的IFN-γ和终浓度为25ng/ml的TNF-α的人间充质干细胞培养基。
进一步，所述低糖DMEM培养基含有体积分数为10%的胎牛血清。
本发明的目的之二在于提供一种无需筛选细胞培养高免疫抑制的人脐带间充质干细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
无需筛选细胞培养高免疫抑制的人脐带间充质干细胞的方法，利用前述试剂进行培养，具体包括如下步骤：
（1）取新生儿脐带组织，分离并培养得到P0代人脐带间充质干细胞；
（2）将步骤（1）所得P0代人脐带间充质干细胞进行传代培养，得到P1代人脐带间充质干细胞；
（3）利用前述试剂对步骤（2）所得P1代人脐带间充质干细胞进行传代培养，得到高免疫抑制的人脐带间充质干细胞；
所述方法中无需筛选细胞，直接进行诱导培养；所述方法中，细胞在CO2浓度为10%的CO2培养箱中进行培养。
进一步，步骤（1）和步骤（2）中，培养基为含有体积分数为10%的胎牛血清的低糖DMEM培养基。
进一步，步骤（3）中，培养时间为72小时。
进一步，所述步骤（1）具体包括如下步骤：取足月新生儿脐带置于无菌生理盐水，充分洗涤至无血迹,剥离外层羊膜和中间血管壁组织，将剩余的华通氏胶剪碎至碎泥状后转入培养皿，平铺均匀，加入含体积分数为10%的胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、10% CO2培养箱培养；6天后，进行首次换液，此后每3天换液1次，细胞逐渐长出，并形成克隆团，待克隆团达到一定数量进行细胞传代。
进一步，细胞培养所用消化液为含有0.25%胰酶和0.02%EDTA的细胞消化液。
进一步，所述步骤（2）具体包括如下步骤：将步骤（1）所得P0代人脐带间充质干细胞，弃去培养基后，用生理盐水漂洗培养皿1遍，加入适量消化液，当细胞收缩变圆时，即刻加入适量培养基终止消化，反复吹打混匀，离心，弃上清液，加入新鲜培养基，进行传代培养，记为P1，每3天换液1次，培养至汇合度达到80%时传代。
进一步，所述步骤（3）具体包括如下步骤：将步骤（2）所得P1代人脐带间充质干细胞，弃去培养基后，用生理盐水漂洗培养皿1遍，加入适量消化液，当细胞收缩变圆时，即刻加入适量培养基终止消化，反复吹打混匀，离心，弃上清液，加入含IFN-γ和TNF-α的新鲜培养基进行传代培养，记为P2，培养72小时，得到具有高免疫抑制能力的人脐带间充质干细胞。
作为优选，离心条件为400g/min离心10min。
本发明的目的之三在于提供一种利用前述培养方法培养得到的高免疫抑制的人脐带间充质干细胞。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用前述培养方法培养得到的高免疫抑制的人脐带间充质干细胞，所述人脐带间充质干细胞高表达PGE-2和IDO。
进一步，所述人脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14、CD34、CD45、CD79α、HLA-DR。
进一步，所述人脐带间充质干细胞呈均一的长梭形，且呈漩涡状生长。
进一步，所述人脐带间充质干细胞具有诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力。
进一步，所述人脐带间充质干细胞中CD4+CD25+Tregs细胞比例不低于总细胞的25%。
本发明的目的之四在于提供一种前述人脐带间充质干细胞在制备淋巴细胞增殖抑制剂中的应用。
本发明的目的之五在于提供一种前述人脐带间充质干细胞在制备用于促进初始T细胞向调节性T细胞转变的促进剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明通过向人间充质干细胞培养基里加入45ng/ml的IFN-γ和25ng/ml的TNF-α，诱导培养人脐带间充质干细胞，使其在72小时内成功分泌高浓度的关键效应因子PGE-2和IDO，增强其免疫抑制能力；并且诱导培养过程中，人脐带间充质干细胞细胞形态、增殖能力、表型、多项分化潜能均未受到明显影响。
2. 本发明利用双因子诱导培养的UCMSCs显示出极强的对淋巴细胞增殖的抑制能力，以及促进初始T细胞转变为调节性T细胞的能力，在自身免疫性疾病治疗方面具有巨大的应用前景。
3. 本发明方法采用低糖DMEM培养基作为基础培养基，并添加不同厂家的胎牛血清，使得所有细胞可以直接进行诱导培养，而不需要筛选细胞就可以获得具有免疫抑制能力的间充质干细胞。
附图说明
图1为对照组细胞传代（P2）培养48h后的UCMSCs细胞形态的图。
图2为实验组细胞传代（P2）双因子诱导培养48h后的UCMSCs细胞形态的图。
图3为双因子诱导培养72小时后UCMSCs细胞表型的检测结果图；其中，图3-A为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物CD90的检测结果图；图3-B为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物CD105的检测结果图；图3-C为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物CD45的检测结果图；图3-D为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物HLA-DR的检测结果图；图3-E为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物CD73的检测结果图；图3-F为双因子诱导培养72小时后细胞表面标志物CD14、CD34和CD79α的检测结果图。
图4为双因子诱导培养72小时的UCMSCs成脂分化的检测结果图。
图5为双因子诱导培养72小时的UCMSCs成骨分化的检测结果图。
图6为双因子诱导培养UCMSCs 72小时后上清中PEG-2的表达量的图（P<0.01）。
图7为双因子诱导培养UCMSCs 72小时后上清中IDO的表达量的图（P<0.01）。
图8为双因子诱导培养UCMSCs对PBMCs增殖作用的影响的检测结果图（P<0.01）。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，低糖DMEM培养基的生产商Gibco，货号为11885084；胎牛血清的生产商Gibco，货号为10099141C。
实施例1、高免疫抑制的人脐带间充质干细胞的制备方法
1、人脐带组织处理及间充质干细胞（P0）的分离和培养
取足月新生儿脐带置于无菌生理盐水，充分洗涤至无血迹，剥离外层羊膜和中间血管壁组织，将剩余的华通氏胶剪碎至碎泥状后转入Φ10cm培养皿，平铺均匀，加入含体积分数为10%的胎牛血清（FBS）的低糖DMEM培养基（以下简称培养基）10毫升，置于37℃、10%CO2培养箱培养；6天后，进行首次换液，此后每3天换液1次，细胞逐渐长出，并形成克隆团，克隆团达到一定数量进行细胞传代。
2、细胞传代（P1）
弃去培养基，用生理盐水漂洗培养皿1遍，加入1毫升0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液，当细胞收缩变圆时，即刻加入10ml培养基终止消化，反复吹打混匀，400g/min离心10min，弃上清液，加入新鲜培养基，进行传代培养，记为P1，每3天换液1次，培养至汇合度达到80%时传代。
3、细胞传代（P2）/双因子诱导培养
弃去培养基，用生理盐水漂洗培养皿1遍，加入1毫升0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液，当细胞收缩变圆时，即刻加入10ml培养基终止消化，反复吹打混匀，400g/min离心10min，弃上清液，加入含45ng/ml IFN-γ和25ng/ml TNF-α的新鲜培养基（实验组），进行传代，记为P2，对照组不加IFN-γ和TNF-α；培养72小时后，收集细胞上清及细胞进行测定。
实施例2、双因子处理对UCMSCs的影响
1、人脐带间充质干细胞的形态学观察与鉴定
采用倒置相差显微镜观察实施例1培养得到的实验组和对照组人脐带间充质干细胞的细胞形态。取P2代细胞用流式细胞仪对细胞表面标志物CD14、CD34、CD45、CD73、CD79a、CD90、CD105和HLA-DR进行鉴定。将P2代细胞以2x104个/孔浓度接种24孔板里，分别用成脂、成骨分化培养基培养，每3天换液，共培养3周，3周后分别用油红O染色成脂分化组，用茜素红染色成骨分化组，显微镜下观察UCMSCs成脂、成骨分化情况。
结果：
1）双因子处理对UCMSCs形态的影响：如图1-图2所示，镜下观察可见，对照组UCMSCs形态多呈较均一的长梭形，且呈漩涡状生长；双因子处理组，UCMSCs仍呈长梭、漩涡状生长。表明双因子对UCMSCs形态无明显影响。
2）双因子处理对UCMSCs增殖的影响：加入双因子后，HUMSCs增殖未受到明显影响。实验组和对照组中UCMSCs的增殖从第1天至第3天，均快速生长。
3）双因子处理对UCMSCs表型的影响：如图3所示，加入双因子培养72小时后，HUMSCs仍高表达CD73、CD90、CD105（>95%），不表达CD14、CD34、CD45、CD79α、HLA-DR（<2%），呈现典型的间充质干细胞表型特征，未受到明显影响。
4）双因子处理对UCMSCs多项分化能力的影响：如图4-图5所示，在成脂和成骨分化培养基培育下，双因子处理的细胞能够诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。
2、细胞分泌因子分析
收集各组细胞培养72小时后上清液，ELISA法检测PGE-2、IDO水平，具体操作均参考试剂说明书。
结果：双因子处理对UCMSCs免疫相关因子分泌的影响的检测结果如图6、图7所示，用含45ng/ml IFN-γ和25ng/ml TNF-α的培养基诱导培养人脐带间充质干细胞72小时后，培养上清中PGE-2、IDO含量与对照相比明显升高，平均浓度分别为2.419±0.147ng/ml和11.088±1.482ng/ml，其中PGE-2的增幅为66.6%；同时降低了个体间因子分泌水平的波动，CV值分别为±6.08%和±13.4%；PGE-2在对照组中呈现组成性表达，为1.452±0.365ng/ml，而IDO在对照组中几乎不表达。
3、双因子诱导培养的UCMSCs对人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖以及调节性T细胞（Tregs）影响
按照CCK-8法，采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，计数待用。取对照组和双因子诱导培养的UCMSCs，以2x104个/孔接种于圆底96孔细胞培养板置中，于37℃培养至贴壁后，经30Gy的铯线照射，抑制增殖，换成含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，按1：10的比例接种PBMCs，与MSC共培养，并加入刺激剂PHA（5μg/ml）和IL-2（5ng/ml），置37℃，5% CO2饱和湿度的细胞培养箱培养72h；每孔加入10μl的CCK-8溶解液，继续培养4h，上酶标仪检测A490及A690值。同时采用流式细胞仪检测调节性T细胞的比例。
结果：
1）双因子处理的UCMSCs抑制人外周血单个核细胞增殖。如图8所示，UCMSCs可明显抑制PHA和IL-2活化的PBMCs的增殖能力，抑制率为50.7%；双因子诱导培养后的UCMSCs对活化的PBMCs的增殖抑制增强，抑制率为80.2%。该结果表明一定浓度的IFN-γ和TNF-α可增强UCMSCs对PBMCs增殖的抑制作用。
2）双因子处理的UCMSCs促进调节性T细胞比例升高。调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。UCMSCs能够显著增加共培养体系中CD4+CD25+Tregs（调节性T细胞）的比例，为17.63%，增幅为181.2%，而对照组仅为6.27%；双因子诱导培养后的UCMSCs的促进作用更显著，共培养后调节性T细胞的比例为27.18%，增幅为333.5%。
Claims (10)
1.用于无需筛选细胞培养高免疫抑制人脐带间充质干细胞的试剂，其特征在于，待培养细胞为人脐带间充质干细胞；所述试剂包括含有终浓度为40-50ng/ml的IFN-γ和终浓度为20-30ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述低糖DMEM培养基含有体积分数为10%的胎牛血清。
3.无需筛选细胞培养高免疫抑制的人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1-2任一项所述的试剂进行培养，具体包括如下步骤：
（1）取新生儿脐带组织，分离并培养得到P0代人脐带间充质干细胞；
（2）将步骤（1）所得P0代人脐带间充质干细胞进行传代培养，得到P1代人脐带间充质干细胞；
（3）利用权利要求1-2任一项所述的试剂对步骤（2）所得P1代人脐带间充质干细胞进行传代培养，得到高免疫抑制的人脐带间充质干细胞；
所述方法中无需筛选细胞，直接进行诱导培养；所述方法中，细胞在CO2浓度为10%的CO2培养箱中进行培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，培养基为含有体积分数为10%的胎牛血清的低糖DMEM培养基。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，培养时间为72小时。
6.利用权利要求3-5任一项所述的方法培养得到的高免疫抑制的人脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞高表达PGE-2和IDO。
8.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞中CD4+CD25+Tregs细胞比例不低于总细胞的25%。
9.权利要求6-8任一项所述的人脐带间充质干细胞在制备淋巴细胞增殖抑制剂中的应用。
10.权利要求6-8任一项所述的人脐带间充质干细胞在制备用于促进初始T细胞向调节性T细胞转变的促进剂中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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