CN111518757A - 一种免疫抑制或抗炎功能增强型pd-l1阳性间充质干细胞、诱导试剂盒及应用 - Google Patents

一种免疫抑制或抗炎功能增强型pd-l1阳性间充质干细胞、诱导试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD‑L1阳性间充质干细胞、诱导试剂盒及应用，通过如下步骤制备：分离并培养间充质干细胞；采用免疫因子诱导复合剂诱导培养的间充质干细胞，获得免疫抑制或抗炎功能增强型PD‑L1阳性间充质干细胞，所述诱导复合剂包括5‑20ng/ml IFN‑γ和0‑20ng/ml TNF‑α。本发明提供的间充质干细胞能够高效表达PD‑L1受体，同野生型间充质干细胞相比，对胶原诱导的关节炎小鼠和CLP脓毒症模型小鼠均具有更好的治疗疗效，且未见副作用的发生。本发明提供的安全、有效的免疫抑制或抗炎功能增强型间充质干细胞，在自身免疫性疾病和炎性相关疾病的临床治疗中极具应用潜力。

Description

一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞、诱 导试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，以及其体外诱导试剂盒、质量评估方法及应用。
背景技术
随着对干细胞研究的深入，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)已被认为是用于组织损伤相关疾病修复治疗的理想工具。MSCs是一种具有自我更新和多向分化潜能的前体细胞，广泛分布于成人骨髓、脂肪、牙髓、胎盘和脐带等组织中。De Miguel等人在其研究(Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells:advances andapplications.)中发现MSCs不仅具有较强的自我更新能力以及向中胚层、外胚层和内胚层的多向分化潜能，而且具有良好的免疫调节能力和较强的抗炎特性，能够通过影响免疫细胞的活性和增殖、分化、分泌功能，从而有效抑制机体炎症级联反应，并且可有效阻止受损组织原位细胞的凋亡，促进血管生成以及激活组织原位干细胞等多种生物学特性，参与受损组织的再生与修复。因此，MSCs移植不仅能平衡校正患者失衡的免疫反应，同时又有组织再生和修复功能，这些特点使MSCs移植有望成为损伤、炎性和免疫相关疾病治疗的一种理想策略。
MSCs通过抑制炎症进而促进受损组织再生修复的途径已被证实，为基于MSCs的细胞移植治疗炎症和免疫相关疾病奠定理论基础。MSCs与炎症/免疫的相互作用在调节免疫应答的各种病理过程中的机制正在被越来越多的研究。尽管缺乏已知内源性MSCs在体内的确切功能，但MSCs在体外的性质和潜在的临床应用价值已被证实，但若想获得更好的临床疗效，需根据MSCs的体内外作用机制，通过相关干预手段针对特定的疾病获特定功能增强的MSCs。目前，大多数研究集中在体外扩增的MSCs群体的分化潜能和免疫调节能力上，但一般认为基于MSCs的细胞治疗发挥疗效不仅是因为MSC提供了重建组织的细胞来源，同时还能调节机体炎症微环境，并“增强/激活”其他原位组织细胞的组织修复能力。虽然细胞替换是MSCs治疗某些疾病的重要组成部分，但已发表的研究表明MSCs的治疗作用主要是通过发挥其免疫调节或者抗炎功能所导致的结果，而且这一功能是由炎症微环境刺激MSCs后发生功能性转换后，才能具有调控平衡机体炎症反应能力，并发挥临床治疗疗效。简而言之，天然条件下MSCs不具备抗炎和免疫调节能力，仅在炎症介质的作用下，发生功能性转变的MSCs能够产生大量的免疫调节蛋白、细胞动员因子、抗炎因子和生长因子，从而通过活化组织驻留的干细胞促进组织修复。
另外，尽管MSCs即可影响先天性免疫，也能够影响获得性免疫。然而，MSCs的免疫调节能力并不是组成性的，即天然状态下MSCs的免疫调节能力或者抗炎功能较弱，其免疫调节或者抗炎功能的获得需要由炎症细胞因子(如炎症微环境中的细胞因子)诱导来“赋能”的。然而，在炎症性疾病的发生和发展过程中，炎性细胞因子的数量和种类在疾病的不同发展阶段存在巨大差异，这些变化严重影响了MSCs向具有免疫调节或者抗炎功能方向活化的效能，因此患者机体免疫微环境状态成为最终决定MSCs免疫调节或者抗炎功能及其临床疗效发挥的重要决定因素，这也是部分MSCs移植治疗同种疾病患者间仍存在巨大临床疗效差异的重要原因。因此，若能在体外直接将MSCs诱导成免疫调节功能或者抗炎功能增强型MSCs，将显著提高MSCs的临床疗效，获得高成药性的MSCs细胞制剂产品。
研究表明，MSCs的免疫抑制或者抗炎作用依赖于微环境中IFN-γ的诱导，而使用IFN-γ受体中和抗体可使MSCs抑制T细胞的增殖作用消失。而体外培养扩增的MSCs经IFN-γ预处理后，MSCs可通过STAT信号通路上调IL-10、IDO和TSG2等免疫抑制因子的mRNA表达，增加这些免疫抑制因子的分泌，对免疫和炎性相关疾病的治疗发挥免疫抑制和抗炎功能，达到临床治疗作用。另外，近年发现免疫检查点PD-1/PD-L1信号在机体免疫负性调节中起重要作用，其可参与肿瘤免疫逃避，是肿瘤免疫治疗的重要治疗靶点，同时在自身免疫性疾病或者炎性相关疾病的发生、发展和治疗中也起关键作用。因此，若能在诱导MSCs高表达分泌上述免疫抑制因子的同时，再增加MSCs免疫抑制性受体PD-L1的表达，同时通过此通路平衡机体的免疫反应，将能获得免疫功能增强的MSCs细胞制剂产品。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明旨在提供一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，通过如下步骤制备：(1)分离并培养间充质干细胞；(2)采用免疫因子诱导复合剂诱导培养的间充质干细胞，获得免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，所述诱导复合剂包括IFN-γ和TNF-α，所述IFN-γ的浓度为5-20ng/ml，所述TNF-α的浓度为0-20ng/ml。
进一步，所述IFN-γ的浓度为20ng/ml，所述TNF-α的浓度为5-20ng/ml。
进一步，所述诱导复合剂还包括白蛋白赋形剂。
进一步，在通过步骤(1)获得的3-8代间充质干细胞增殖培养至70-80％细胞融合度时，加入所述诱导复合剂。
进一步，所述步骤(2)采用免疫因子诱导复合剂诱导间充质干细胞的诱导时间为18～24h，然后撤出所述诱导复合剂继续培养诱导后的间充质干细胞至少24h，优选地撤出所述诱导复合剂继续培养24-96h。
进一步，所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血。
进一步，所述步骤(1)分离并培养间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；分离组织；将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重，转入离心管中离心，弃上清液；向离心管中加入MSCs培养基，培养一段时间；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，消化解离并进行传代培养，获得间充质干细胞。
本发明还提供一种上述免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞的体外培养诱导试剂盒，包括MSCs的基础培养基，MSCs增殖培养添加剂，免疫因子诱导复合剂。
本发明还提供一种上述免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞的质量评估方法，将所述间充质干细胞内的PD-L1受体的阳性表达率作为所述间充质干细胞的质量控制指标。
进一步，通过流式细胞检测法检测间充质干细胞的PD-L1受体的阳性表达率。
进一步，所述PD-L1受体阳性表达率至少为30％。
本发明还提供一种上述的免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞在制备预防或治疗自身免疫性疾病和/或炎性相关疾病的药物中的应用。
进一步，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种IFN-γ联合TNF-a体外诱导方法和试剂盒，并诱导获得了一种既能高表达PD-L1免疫抑制性受体，又能大量分泌IL-10和IDO(不限于本发明所检测的IDO，例如还包括COX2和TSG6等)等免疫抑制因子的MSCs。另外，本发明的免疫功能增强型PD-L1阳性MSCs可简便通过细胞流式检测PD-L1的表达，即，可对MSCs细胞药品制剂的抗炎或者免疫抑制功能进行质量评估，为免疫功能增强型MSCs细胞药品制剂的质量控制提供可标准化的指标和方案。
本发明根据间充质干细胞发挥免疫抑制或者抗炎功能为非组成性的(即非天然存在的)，需受IFN-γ和TNF-α等免疫因子的诱导后才能赋予此功能的特点，研发了一种体外诱导试剂盒，并建立了应用此试剂盒诱导免疫抑制或抗炎功能增强型间充质干细胞的制备工艺。同时，提出并建立应用流式细胞术检测间充质干细胞免疫检查点受体PD-L1表达来对此功能细胞进行质量控制的新方法和新方案。另外，本发明进一步证实，此功能增强的间充质干细胞同野生型间充质干细胞相比，对胶原诱导的关节炎小鼠和CLP脓毒症模型小鼠均具有更好的治疗疗效，且未见副作用的发生。本发明提供了一种安全、有效的免疫抑制或抗炎功能增强型间充质干细胞，在自身免疫性疾病和炎性相关疾病的临床治疗中极具应用潜力。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为间充质干细胞表面标志分子流式检测结果。
图2为间充质干细胞三系分化结果。
图3为不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的免疫印记检测结果。
图4为不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达PD-L1的定量PCR检测结果。
图5为不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO1的定量PCR检测结果。
图6为TNF-α和IFN-γ单独或者联合诱导MSCs表达PD-L1的流式检测结果。
图7为阴性对照组小鼠与静脉注射PBS、WT-MSCs和T+I-MSCs的CIA小鼠的组织病理学检查结果。
图8为阴性对照组小鼠与静脉注射PBS、WT-MSCs和T+I-MSCs的CIA小鼠的影像学检查结果。
图9为假手术对照组、PBS治疗对照组、WT-MSCs组和T+I-MSCs组的CLP脓毒症小鼠存活率对比结果。
图10为对照组和治疗组的小鼠体内炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的血清浓度对比结果。
具体实施方式
本发明提供了一种以IFN-γ和TNF-α为主要因子成份的免疫抑制或抗炎功能增强型MSCs体外诱导试剂盒，诱导MSCs高效表达PD-L1免疫检查点膜受体及分泌表达IDO等免疫抑制因子的制备工艺流程，质量控制标准及方案，同时应用类风湿性关节炎模型小鼠和CLP模型脓毒症小鼠，评估此免疫抑制或抗炎功能增强型MSCs对免疫或者炎症相关疾病治疗的临床前有效性和安全性。
本发明的研究发现，虽然单独应用IFN-γ即能够上调hUC-MSCs细胞免疫抑制因子IDO和免疫检查点受体PD-L1 mRNA的表达，但单独IFN-γ不能在蛋白水平上调免疫检查点受体PD-L1的表达。而尽管单独应用TNF-α既不能上调IDO和PD-L1的mRNA表达，也不能上调他们的蛋白表达，但有趣的是，TNF-α联合IFN-γ处理hUC-MSCs，能够显著上调IDO和PD-L1的蛋白表达，增强hUC-MSCs的免疫调节和抗炎功能。
本发明创新性提出利用TNF-α联合IFN-γ诱导处理hUC-MSCs，即显著上调免疫抑制因子IDO，又能刺激免疫检查点受体PD-L1的表达，从不同角度提升hUC-MSCs的免疫调节和抗炎能力，增强其对免疫和炎症相关疾病的治疗疗效。
同时，本发明还创造性地将免疫检查点受体PD-L1表达的阳性率作为判断免疫抑制或抗炎功能增强型MSCs抗炎功能判断的质量控制指标，为抗炎型MSCs进一步研发细胞新药制剂提供简便可操作的质量控制标准。
本发明创新性提出利用本发明获得的免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs治疗脓毒症，可显著降低脓毒症的死亡率和炎症反应。治疗胶原诱导的关节炎也可显著改善小鼠关节炎的临床症状。同时，本发明根据抗炎型MSCs的诱导工艺流程，研发可简易推广应用的抗炎型MSCs诱导试剂盒。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
实施例1人脐带间充质干细胞的分离、培养与鉴定
建立人脐带间充质干细胞的制备工艺。
从新生儿脐带分离、培养并鉴定人脐带间充质干细胞，具体步骤为：
(1)MSCs的分离及培养
人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离培养：将无菌条件下采集的新鲜脐带样本(样本来源于乙肝、丙肝、HIV和梅毒等传染病检查阴性及无遗传疾病的健康产妇)于超净工作台中置于生理盐水中洗涤，将表面的血等物质洗净，转入酒精皿中浸泡1min中左右，再转入干净的生理盐水皿中洗净脐带上的酒精；并且将脐带两端剪掉，排除脐带内凝固的血液，再从整条脐带上剪下2cm的脐带；将剪下的小段脐带置于干净的生理盐水皿中洗涤，以进一步保证脐带没有凝固血液；取一干净培养皿，用于分离华通氏胶；用止血钳依次去除每段脐带中的血管(一根静脉和两根动脉)，再将剩下的脐带组织皮面向下沿边缘将组织皮与组织块分离(组织块为华尔氏通胶)；将分离出来的胶体置于一干净的生理盐水皿中，分离好胶体后，用镊子将大条的华通氏胶尽量分细，最后将胶体在一干净的生理盐水皿中洗涤，并将华通氏胶转入已消毒的无菌小瓶中；用剪刀将华通氏胶尽量剪碎并称重，按重量分入15ml离心管中，每管0.5g，加入10ml生理盐水，2000rpm离心5min，后弃上清液；取两个25CM2培养瓶，写上原代培养字号，培养日期和编号；向两个离心管中分别加入4ml serum-freeUltraCULTURETM培养基(含2mM L-谷氨酰胺)(每0.5g组织块加入4ml培养基)；盖上盖子摇匀，将培养瓶放置于培养箱中(37℃，5％CO2培养箱)，培养5～7天后，再加入新鲜培养基；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，用TrypLE消化解离并进行传代培养。本发明中使用的hUC-MSCs为第3～8代的细胞。
(2)间充质干细胞的鉴定
①间充质干细胞表面标志物鉴定：
采用流式检测法对分离培养的间充质干细胞进行表面标记物表达水平检测。流式检测干细胞标志分子有阳性分子CD73、CD44、CD90和CD105，以及阴性yCD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。经鉴定结果显示，本发明获得的体外培养纯化的hUC-MSCs的表面标志表达：CD73、CD44、CD90和CD105为阳性，CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性，符合国际细胞治疗协会MSC的定义标准。其中，阳性表达的表面标志物的流式检测结果如图1所示。
②间充质干细胞三系分化能力鉴定：
成骨诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化计数后接种在六孔板中，每孔加入一定量完全培养基，待细胞密度达60％-70％时，将培养基更换为OriCell人脐带间质干细胞成骨诱导分化完全培养基，每隔一段时间更换一次新鲜成骨诱导分化完全培养基。培养约2-4周后，每孔中加入1mL茜素红染液染色，PBS洗涤两遍后置于显微镜下观察成骨染色效果。
成软骨诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化后将4×105个细胞转移到离心管中，离心吸去上清；加入0.5mL试剂盒预混液，重悬hUC-MSCs沉淀，室温下再次离心，弃上清；后用0.5mL OriCell人脐带间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬，后再离心后，将其放置于培养箱中培养；每隔一段时间给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基。持续诱导培养28天后，对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，阿利辛蓝染液染色，PBS洗去多余染料，显微镜下观察成软骨染色效果。
成脂诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化计数后接种在六孔板中，每孔加入一定量完全培养基并置于培养箱中进行培养至细胞密度达到100％；向每孔中更换OriCell人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基A液；诱导72h后，吸走六孔板中的A液，再加入OriCell人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基B液；24h后，吸走B液，再换回A液进行诱导，之后A液和B液交替培养3-5个周期后(约12-20天)，继续用B液维持培养(3天换液一次)7天；然后用多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤后每孔中加入1mL油红O染料工作液染色，PBS洗去多余染料，显微镜下观察成脂染色效果。
间充质干细胞三系分化能力鉴定结果如图2所示，由图2可知，hUC-MSCs向成骨、成软骨和成脂肪三系分化结果显示，本发明获得的hUC-MSCs在特定的诱导培养条件下能分化形成骨细胞(图2B)、软骨细胞(图2C)和脂肪细胞(图2D)，且hUC-MSCs成梭形、贴壁、漩涡状生长(40倍光镜，图2A所示)，表明本发明培养纯化获得的hUC-MSCs符合国际细胞治疗协会关于人MSCs的标准。
实施例2免疫抑制或者抗炎功能增强型人脐带间充质干细胞的诱导、培养与鉴定
通过IFN-γ和TNF-α联合诱导实施例1制备的hUC-MSCs，获得PD-L1阳性表达的免疫抑制或者抗炎功能增强的hUC-MSCs，具体步骤为：
1、体外诱导制备PD-L1阳性免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs
将实施例1获得的hUC-MSCs冻存细胞复苏，并以4×104cells/cm2的细胞密度接种于75cm2培养瓶中，将培养瓶放置于培养箱中(37℃，5％CO2培养箱)，培养细胞生长至细胞密度>80％时，用TrypLE消化解离并进行传代培养，将消化的细胞以4×104cells/cm2的细胞密度接种于25cm2培养瓶中，并将细胞分成IFN-γ(0、5、10、20ng/ml)和TNF-α(0、5、10、20ng/ml)单独和联合处理组。将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱培养至细胞密度>80％，再加入上述因子诱导剂诱导24h，再用TrypLE消化收获细胞，再行RT-PCR、免疫印记检测和流式细胞术检测细胞免疫抑制因子(IDO、TSG6和COX-2)和受体(PD-L1)的表达，评估细胞的免疫抑制或者抗炎功能。
2、免疫印记检测免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞IDO和PD-L1蛋白表达
对上述不同刺激因素处理MSCs进行处理，制备蛋白样品；对制备的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；然后再对电泳后的凝胶进行Western blot分析。
图3示出不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO1和PD-L1的免疫印记检测结果。由图3的免疫印记结果显示，20ng/ml IFN-γ单独刺激MSCs 24小时，能够诱导IDO1的表达，但不能诱导PD-L1的表达。20ng/ml TNF-α单独刺激MSCs 24小时，既不能诱导IDO1的表达，也不能诱导PD-L1的表达。然而，保持20ng/ml IFN-γ联合不同浓度TNF-α处理MSCs，结果显示，加入5ng/ml的TNF-α即能同时诱导IDO1和PD-L1的表达，且随着TNF-α浓度的增加，IDO1和PD-L1的表达量逐渐增加。
3、定量PCR检测免疫抑制因子IDO和PD-L1免疫抑制受体的mRNA表达
采用定量PCR检测技术检测免疫抑制或者抗炎功能增强型人脐带间充质干细胞的免疫抑制因子IDO和PD-L1免疫抑制受体的mRNA表达量。
图4示出不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达PD-L1的定量PCR检测结果图。由图可知，5、10和20ng/ml的TNF-α单独刺激均不能诱导PD-L1的转录，mRNA仅见轻微升高。5、10和20ng/ml的IFN-γ单独刺激均能显著诱导PD-L1的mRNA升高，特别是20ng/ml的IFN-γ可诱导PD-L1的mRNA升高达85倍。然而，有趣的是，不像免疫印记检测结果，TNF-α联合IFN-γ刺激并不能进一步增加PD-L1的mRNA表达，相反20ng/ml的TNF-α反而轻微弱化了IFN-γ诱导的PD-L1的mRNA表达。
图5示出不同浓度TNF-α联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO1的定量PCR检测结果图。由图5可知，5、10和20ng/ml的TNF-α单独刺激均不能诱导IDO1的转录，mRNA仅见轻微升高。5、10和20ng/ml的IFN-γ单独刺激均能显著诱导IDO1的mRNA升高，特别是20ng/ml的IFN-γ可诱导IDO1的mRNA升高达94倍。然而，有趣的是，不像免疫印记检测结果，TNF-α联合IFN-γ刺激并不能进一步增加IDO1的mRNA表达，相反20ng/ml的TNF-α反而轻微弱化了IFN-γ诱导的IDO1的mRNA表达。
4、流式细胞仪检测免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞免疫检查点受体PD-L1表达
培养至80％融合度的hUC-MSCs，后经20ng/ml IFN-γ单独、20ng/ml TNF-α单独、20ng/ml IFN-γ和20ng/ml TNF-α联合以及阴性对照PBS处理24小时后，用TrypLE消化后用生理盐水洗涤并重悬制备成单细胞悬液(1×106个细胞/样本)。于细胞悬液加入PD-L1FITC，室温避光孵育30分钟。PBS洗涤2遍后，后行流式检测。
图6A-6C示出TNF-α和IFN-γ单独或者联合诱导hUC-MSCs细胞PD-L1表达流式检测结果。图6A中(1)-(4)分别表示无诱导因子、20ng/ml TNF-α单独诱导、20ng/ml IFN-γ单独诱导以及20ng/ml TNF-α和20ng/ml IFN-γ联合诱导hUC-MSCs细胞24小时后PD-L1表达流式检测结果；图6B中(1)-(4)分别表示无诱导因子、20ng/ml TNF-α单独诱导、20ng/ml IFN-γ单独诱导以及20ng/ml TNF-α和20ng/ml IFN-γ联合诱导hUC-MSCs细胞24小时后，撤出刺激因素再培养MSCs细胞24小时后，PD-L1表达流式检测结果；图6C中(1)-(4)分别表示无诱导因子、20ng/ml TNF-α单独诱导、、20ng/ml IFN-γ单独诱导以及20ng/ml TNF-α和20ng/ml IFN-γ联合诱导hUC-MSCs细胞24小时后，撤出刺激因素再培养MSCs细胞48小时，PD-L1表达流式检测结果。由图6A-6C所示的检测结果可知，20ng/ml TNF-α单独诱导hUC-MSCs，无论刺激24h或者刺激24小时后再培养24或者48小时，免疫抑制受体PD-L1的表达均不受影响。而20ng/ml IFN-γ单独诱导hUC-MSCs，刺激24h后免疫抑制受体PD-L1的表达轻微升高，但刺激24小时后再培养24或者48小时，PD-L1的表达明显升高，48小时达31.94％。相比之下，将20ng/ml TNF-α与20ng/ml IFN-γ联合刺激处理hUC-MSCs，可显著快速升高PD-L1的表达，刺激后24小时，PD-L1表达的阳性率即可快速达到25.85％，若再培养24小时和48小时，阳性率分别达到33.55％和61.23％，几乎达到IFN-γ单独诱导的1倍。
实施例3免疫抑制或者抗炎功能增强型人脐带间充质干细胞在胶原诱导的关节炎小鼠治疗中的应用
1、小鼠胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型建立与评价
构建CIA小鼠模型，并使用足跖肿胀进行关节炎临床评分对CIA小鼠进行评估。临床关节炎评估采用以下系统：0分，无肿胀；1分，轻度肿胀和红斑；2分，明显水肿；3分，关节僵硬。对每条肢体都进行评分后汇总，最大可能评分为每只动物12分。
2、TNF-α联合IFN-γ诱导的免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs在胶原诱导的关节炎小鼠模型中的应用
1)MSCs治疗胶原模型鼠方案：按实施例2应用的20ng/ml TNF-α联合20ng/ml IFN-γ处理hUC-MSCs 24小时，换液后继续培养48小时，收获细胞并制备MSCs细胞制剂。采用单次尾静脉输注1×106野生型人脐带间充质干细胞(WT-hUC-MSCs)，记为WT-MSCs组，治疗对照组)、1×106TNF-α+IFN-γ处理的hUC-MSCs(TNF-α+IFN-γ组，简称T+I-MSCs组，治疗实施组)和PBS组(非治疗对照组)。另外，为了减少动物个体差异以便更好地评价疗效，当在加强注射后关节炎评分达到或超过3分时，即在发病后再开始治疗。本研究所选胶原模型鼠的干预时间均在关节炎发病后(约为加强注射后3-5天内)进行MSCs静脉注射。第50天处死动物，取血和四肢关节进行流式分析、细胞因子检测和组织病理学检查。
2)组织病理学检查
4％多聚甲醛固定的肢体标本用含15％EDTA的脱钙液脱钙，然后按照标准的组织学方法将脱钙肢体进行脱水处理和石蜡包埋。
a)苏木精-伊红染色(H&E)染色：切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，入温热苏木精染液2分钟，清水快速漂净染液，1％的盐酸酒精水化15秒后再次清水漂洗，镜下观察染色效果，标准为胞核呈蓝紫色，细胞间质无着色。而后伊红染色1分钟，依次梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用H&E染色对关节炎的严重程度进行评估：正常滑膜0分，滑膜肥大和细胞浸润1分，血管膜和软骨侵蚀2分，软骨和软骨下骨侵蚀3分，关节完整性丧失和强直4分。评估由多名第三方检测者进行，使用多名检测者评分的平均值作为终值。
b)番红O(Safranin O)和固绿(Fast Green)染色：脱蜡并再水化成水，0.02％固绿5分钟(不冲洗)，1％乙酸30秒(不要冲洗)，0.1％番红O 20分钟(不冲洗)，在95％乙醇中冲洗2分钟，然后用100％酒精冲洗3分钟2次。二甲苯2min 2次。覆盖盖玻片。切片Safranin O和Fast Green染色来评价软骨破坏情况。
3)影像学评价
在实验结束时(第50天)，用vivaCT 40小动物CT(SCANO MEDICAL，瑞士)和BrukerBioSpec 7T/20cm system小动物磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)(布鲁克(Bruker)，德国)对CIA小鼠的后肢进行影像学的成像。
图7示出阴性对照组小鼠(NC，健康小鼠)与静脉注射PBS、WT-MSCs和T+I-MSCs的CIA小鼠的组织病理学检查结果。其中，图7中A表示小鼠CIA模型诱导和MSCs治疗方案示意图；图7中B表示对CIA小鼠的具有代表性的后肢的大体损伤进行拍照以进行临床评估；图7中C表示持续监测CIA小鼠四肢足跖肿胀严重程度并进行关节炎临床评分直到实验终止，*p<0.05，**p<0.01vs PBS组(每个时间点的多因素方差分析比较)；图7中D表示第50天处死所有小鼠进行组织病理学评估结果图；图7中E表示参照方法中的组织病理学评分对这些图像进行评估并统计分析。用H&E以及Safranin O和Fast Green对CIA小鼠的掌骨和指骨后关节的石蜡包埋切片进行染色以平均其组织学关节损伤和软骨破坏，并选取其中具有代表性的图像，比例尺＝200μm。每组至少使用5只小鼠：图7中，NC＝阴性对照(n＝5只小鼠)、PBS＝CIA小鼠PBS处理组(n＝10只小鼠)，WT-MSCs＝CIA小鼠WT-MSCs治疗组(n＝10只小鼠)，T+I-MSCs＝CIA小鼠TNF-α联合IFN-γ诱导的MSCs治疗组(n＝10只小鼠)，所有结果均为平均值±标准差。由图7结果所示，WT-MSCs和T+I-MSCs可明显减轻实验性关节炎的组织病理学检查结果。如图7所示，单次静脉注射WT-MSCs和T+I-MSCs可显著改善CIA的临床严重程度，而注射PBS的小鼠则相反，表现出严重的关节炎症状(如图7中B和C所示)。进一步通过组织病理学评价发现，与PBS组对比，WT-MSCs和T+I-MSCs处理的CIA小鼠的关节滑膜炎、关节破坏和软骨破坏均有明显减轻(如图7中D和E所示)，与WT-MSCs治疗相比，T+I-MSCs处理组显然显示出更好的疗效(如图7中B、C和D所示)。最后，经WT-MSCs和T+I-MSCs处理的小鼠在实验终止前均未出现任何副作用或死亡。
图8示出阴性对照组小鼠(NC)与静脉注射PBS、WT-MSCs和T+I-MSCs的CIA小鼠的影像学检查结果。在第50天用小动物MRI和小动物CT对CIA小鼠后肢进行影像学检测，并显示出具有代表性的图像。每组至少使用5只小鼠：NC＝阴性对照(n＝5只小鼠)、PBS＝CIA小鼠PBS处理组(n＝10只小鼠)，WT-MSCs＝CIA小鼠WT-MSCs治疗组(n＝10只小鼠)，T+I-MSCs＝CIA小鼠TNF-α联合IFN-γ诱导的MSCs治疗组(n＝10只小鼠)，所有结果均为平均值±标准差。如图8所示，单次静脉注射WT-MSCs和T+I-MSCs可显著改善CIA的临床严重程度。通过影像学的手段，与PBS治疗对照相比，发现WT-MSCs和T+I-MSCs单次静脉注射可显著改善CIA小鼠肢体的关节破坏。此外，T+I-MSCs组对关节破坏的治疗疗效显著优于WT-MSCs组。
实施例4免疫抑制或者抗炎功能增强型间充质干细胞在CLP脓毒症小鼠治疗中的应用
BALB/c小鼠进行盲肠结扎穿孔术(CLP)3小时后，假手术对照组(sham)和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.2mL无菌PBS，WT-MSCs组和T+I-MSCs组各注射含2×105个细胞的200μl细胞悬液，24h时后加注亚胺培南西司他丁钠(14mg/Kg)抗生素，最终统计120小时各组死亡率。
图9示出假手术对照组(sham)、PBS对照组、WT-MSCs组和T+I-MSCs组的CLP脓毒症小鼠120小时后的存活率对比结果。如图9所知，sham假手术组无死亡发生，PBS组的小鼠存活率仅为10％，T+I-MSCs移植治疗后小鼠的120h生存率由PBS组的10％提高到56.7％(p<0.01)，而WT-MSCs组小鼠存活率只有30.7％(p<0.05)，由此提示抗炎功能增强的T+I-MSCs对脓毒症小鼠的治疗疗效显著增强，对临床脓毒症的治疗具有巨大潜在的价值。
实施例5免疫抑制或者抗炎功能增强型MSCs对CLP模型脓毒症小鼠的炎症调节作用研究
BALB/c小鼠进行盲肠结扎穿孔术(CLP)3小时后，假手术对照组和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.2mL无菌PBS，WT-MSCs组和T+I-MSCs组各注射含2×105个细胞的200μl细胞悬液，24h时后加注亚胺培南西司他丁钠(14mg/Kg)抗生素，CLP术后48h，各组小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/Kg)麻醉后摘眼球取血。全血于室温下静置2h，血液凝固分层后以1500r/min的转速离心10min，共离心3次，收集血清后采用ELISA法检测其中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。
图10示出对照组和治疗组的小鼠体内炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的血清浓度对比结果。如图10所知，与sham假手术组相比，PBS组小鼠血清中TNF-α、IL-11818β、IL-6和IL-10的水平均有大幅上升。WT-MSCs和T+I-MSCs间充质干细胞组均能够显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平；与WT-MSCs治疗相比，移植T+I-MSCs治疗后IL-1β、TNF-α和IL-6的水平有更为明显的降低作用(p<0.01)，对IL-10也则有显著的升高作用(p<0.05)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (13)

1.一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，通过如下步骤制备：
(1)分离并培养间充质干细胞；
(2)采用免疫因子诱导复合剂诱导培养的间充质干细胞，获得免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，
所述诱导复合剂包括IFN-Υ和TNF-α，所述IFN-Υ的浓度为5-20ng/ml，所述TNF-α的浓度为0-20ng/ml。
2.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，所述IFN-Υ的浓度为20ng/ml，所述TNF-α的浓度为5-20ng/ml。
3.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，所述诱导复合剂还包括白蛋白赋形剂。
4.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，在通过步骤(1)获得的3-8代间充质干细胞增殖培养至70-80％细胞融合度时，加入所述诱导复合剂。
5.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，所述步骤(2)采用免疫因子诱导复合剂诱导间充质干细胞的诱导时间为18～24h，然后撤出所述诱导复合剂继续培养诱导后的间充质干细胞至少24h。
6.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人脂肪、牙髓、骨髓、脐带、胎盘或脐带血。
7.根据权利要求1所述的一种免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞，其特征在于，所述步骤(1)分离并培养间充质干细胞包括：采集样本组织进行洗涤；分离组织；将分离出的组织块置于生理盐水中洗涤，并剪碎、称重，转入离心管中离心，弃上清液；向离心管中加入MSCs培养基，培养一段时间；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，消化解离并进行传代培养，获得间充质干细胞。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞的体外培养诱导试剂盒，其特征在于，包括MSCs的基础培养基，MSCs增殖培养添加剂，免疫因子诱导复合剂。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞的质量评估方法，将所述间充质干细胞内的PD-L1受体的阳性表达率作为所述间充质干细胞的质量控制指标。
10.一种如权利要求9所述的间充质干细胞的质量评估方法，通过流式细胞检测法检测间充质干细胞的PD-L1受体的阳性表达率。
11.一种如权利要求9所述的间充质干细胞的质量评估方法，所述PD-L1受体的阳性表达率至少为30％。
12.一种如权利要求1-7任一项所述的免疫抑制或抗炎功能增强型PD-L1阳性间充质干细胞在制备预防或治疗自身免疫性疾病和/或炎性相关疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、重症肌无力和多发性溃疡性结肠炎等中的至少一种；
所述炎性相关疾病包括脓毒症、退行性关节炎和新生儿支气管肺发育不良性肺炎等中的至少一种。
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