CN114438022A - 具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞及其制备方法、用途，制备过程主要包括步骤1、对间充质干细胞进行分离、纯化和培养，获得第3‑8代的间充质干细胞，备用；步骤2、将所述步骤1得到的第3‑8代的间充质干细胞接种于培养瓶中，并将培养瓶放置于培养箱中进行培养，至达到70％‑80％的细胞融合度时，按比例加入ATP和IFN‑γ诱导因子进行诱导；步骤3、撤出诱导剂，继续培养，得到具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞。采用ATP和IFN‑γ进行对间充质干细胞进行体外诱导，获得免疫抑制或者抗炎功能增强的间充质干细胞，并证实，这种间充质干细胞能显著提升其对自身免疫性疾病和炎性相关疾病的治疗疗效。

Description

具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞、其制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能干细胞，广泛分布于骨膜、骨髓、牙髓、脂肪、脐带和胎盘等组织中，具有强大的组织再生修复和抗炎功能。组织受损往往伴随着炎症反应，此时MSCs可被动员至受损部位，既可以通过分化替代受损细胞，也可以通过促进相关细胞分化加强血管生成和胞外基质重塑来促进组织修复，还可以通过产生免疫调节因子调节炎症进程，校正失衡的炎症反应，形成有利于组织修复的微环境，加快组织修复。因此，MSCs在临床上越来越受到青睐，Clinicaltrials.gov上已经注册了超过1200项关于间充质干细胞的临床试验，未来前景可期。
MSCs的免疫抑制和抗炎功能主要依赖于其分泌的免疫调节因子，MSCs可以抑制免疫细胞增殖分化和促炎功能，其免疫调节能力并不是组成型的，而是需要由炎症细胞因子诱导来“赋能”。
IFN-γ目前被广泛认为是MSCs“赋能”的主要细胞因子，可诱导MSCs发挥抗炎功能。然而，近来研究却发现IFN-γ参与诱导的MSCs免疫抑制存在很大问题。临床上在应用IFN-γ预处理的MSCs治疗克罗恩病时，输入体内的MSCs没有按照预期发挥抑炎作用，并且当IFN-γ联合其他细胞因子(例如TNF-α、IL-1α和IL-1β等)对MSCs进行诱导时，有时候却无法抑制T细胞增殖反而促进了其活化。
发明内容
本发明是提供一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞、其制备方法及应用，所述具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞可高效表达IDO和PD-L1，从而增强间充质干细胞的免疫抑制或者抗炎功能。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞，由ATP和IFN-γ对间充质干细胞进行体外诱导获得。
优选地，所述间充质干细胞来源于人脂肪、骨髓、牙髓、脐带、胎盘或脐带血。
本发明还提供了一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：对间充质干细胞进行传代培养后，在所述间充质干细胞的培养瓶中，加入ATP与IFN-γ诱导因子进行培养；培养至预设时间后撤出所述ATP和IFN-γ诱导因子，并对间充质干细胞继续培养，得到具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞。
进一步地，所述预设时间大于24h；所述培养瓶内的细胞密度为3.5×104cells/cm2～4.5×104cells/cm2。
进一步地，所述加入ATP与IFN-γ诱导因子进行培养具体为，当间充质干细胞的细胞融合度达到70％-80％时，加入ATP，培养箱孵育10min～15min后，再加入含有IFN-γ诱导因子的新鲜培养基，其中ATP的添加量为1mM～3mM，IFN-γ在新鲜培养基中浓度为10ng/ml～30ng/ml。
一种预防或治疗自身免疫性疾病和炎性相关疾病的药物，包含上述的间充质干细胞。
上述具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞在制备或评估，预防或治疗自身免疫性疾病和炎性相关疾病的药物中的应用。
一种试剂盒，包括MSCs的基础培养基、1-5mM的ATP以及10-40ng/ml的人重组IFN-γ。
优选地，还包括MSCs增殖培养添加剂、HEPES、破膜蛋白SLO的HBSS中的其中一种或几种。
优选地，包括1mM-40mM的HEPES和50ng/ml-150ng/ml的破膜蛋白SLO的HBSS。
本发明通过ATP联合IFN-γ体外增强MSCs免疫调节功能的诱导方法获得了一种能大量分泌可溶性PD-L1和IDO等免疫因子的MSCs。所述增强型间充质干细胞能大量分泌可溶性PD-L1和IDO等免疫因子，对关节炎小鼠、肺炎小鼠和CLP模型脓毒症小鼠具有优秀的治疗效果，安全性高。本发明的制备方法简单，操作方便，效果好。
本发明功能增强的间充质干细胞较野生型和单独IFN-γ诱导的间充质干细胞相比，对胶原诱导的关节炎小鼠、急性肺炎小鼠和CLP脓毒症模型小鼠均具有更好的治疗疗效，可以应用于制备预防或治疗自身免疫性疾病和炎性相关疾病的药物，安全性高，效果好。
本发明的免疫抑制、抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞可简便通过检测抗炎因子IDO和PD-L1的表达，即可对MSCs细胞药品制剂的抗炎或者免疫抑制功能进行质量评估，为免疫功能增强型MSCs细胞药品制剂的质量控制提供可标准化的指标和方案。
附图说明
图1为实施例1的流式检测间充质干细胞表面标志分子图。
图2为实施例1的hUC-MSCs三系分化结果图。
图3为实施例2的一定浓度ATP联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO和PD-L1的免疫印记检测结果。
图4为实施例2的一定浓度ATP联合IFN-γ诱导MSCs表达PD-L1的定量PCR检测结果图。
图5为实施例2的一定浓度ATP联合IFN-γ诱导MSCs表达IDO1的定量PCR检测结果图。
图6为实施例3的静脉注射WT-MSCs(野生型)、I-MSCs(IFN-γ诱导型)和A+I-MSCs(ATP联合IFN-γ诱导型)可明显减轻实验性关节炎的组织病理学检查结果。
图7为实施例4的静脉注射WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs可明显减轻小鼠急性肺炎的细胞学检查结果。
图8为实施例4的静脉注射WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs可明显减轻小鼠急性肺炎的组织病理学检查结果。
图9为实施例4的静脉注射WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs可明显减轻小鼠急性肺炎的肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量的结果。
图10为实施例5的免疫抑制或者抗炎功能增强型间充质干细胞移植对CLP模型脓毒症小鼠生存率的保护作用结果图。
图11为实施例5的免疫抑制或者抗炎功能增强型间充质干细胞移植对CLP模型脓毒症小鼠炎症调控作用结果图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。
采用本发明所述具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞制备的药物，可有效预防或治疗各种疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性溃疡性结肠炎和强直性脊柱炎，并且安全可靠。
本发明中的间充质干细胞可来源于人脂肪、骨髓、牙髓、脐带、胎盘和脐带血等。下面以脐带为例，对本发明进行说明。
实施例1 人脐带间充质干细胞的分离、培养与鉴定
采用现有技术，从新生儿脐带分离、培养并鉴定人脐带间充质干细胞，具体步骤为：
1、MSCs的分离及培养
人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离培养：将无菌条件下采集的新鲜脐带样本(样本来源于乙肝、丙肝、HIV和梅毒等传染病检查阴性及无遗传疾病的健康产妇)于超净工作台用生理盐水中洗净，去除表面杂物，后转入酒精中浸泡1min，再转入干净的生理盐水中洗净脐带上的酒精；之后将脐带两端剪掉，尽量去除脐带内凝固的血液，并剪下约2cm的脐带；将剪下的小段脐带置于干净的生理盐水皿中再次洗涤，以保证脐带尽可能没有凝固血液；取一干净培养皿，用于分离华通氏胶；依次去除每段脐带中的血管(一根静脉和两根动脉)，再将剩下的脐带组织外侧面向下沿边缘分离组织块(组织块为华尔氏通胶)；将分离出来的胶体置于一干净的生理盐水皿中，用镊子和剪刀将大块的华通氏胶尽量分成约0.5cm×0.5cm的小块，最后再次用生理盐水中洗涤；另取25cm2培养瓶，写上原代培养字号，培养日期和编号，向培养瓶中分别加入4ml serum-free UltraCULTURETM培养基(含2mM/L-谷氨酰胺)(每0.5g组织块加入4ml培养基)，并将华通氏胶转移到培养瓶中；置于培养箱中(37℃,5％CO2培养箱)，培养5～7天后，再加入新鲜培养基；当原代细胞生长至细胞密度>80％时，用TrypLE消化解离并进行传代培养。本发明中使用的hUC-MSCs为第3～8代。
2、间充质干细胞的鉴定
⑴间充质干细胞表面标志物鉴定：取第3～8代hUC-MSCs，经TrypLE消化后用生理盐水洗涤并重悬制备成单细胞悬液(约1×106个细胞/样本)。将细胞悬液均分为7管，每管100μL，分别加入1μL的Isotype Control-PE、CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE和CD105-PE,混匀后室温避光孵育30min。PBS洗涤1-2遍后，再各加入100μL PBS重悬细胞,流式细胞仪采样分析。
鉴定结果如图1所示为实施例1的流式检测间充质干细胞表面标志分子，建立间充质干细胞流式质量控制方案，本发明获得的体外培养纯化的hUC-MSCs的表面标志表达：CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率>95％，CD34、CD45的阳性率<5％，符合国际细胞治疗协会MSCs的定义标准。
⑵三系分化能力鉴定(试剂盒，赛业)：
成骨诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化计数后以2×104cells/cm2的细胞密度接种在预先包被0.1％明胶的六孔板中，每孔加入2mL完全培养基，待细胞融合至60％-70％时，将培养基更换为成骨诱导分化培养基，每隔2-3天换液1次(使用前需预热至37℃)。诱导21天后，用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS漂洗2遍后每孔中加入1mL茜素红染液染色5min，PBS漂洗2遍后于显微镜下观察染色效果并拍照留存。
成软骨诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化计数后以2×104cells/cm2的细胞密度接种至6孔板，每孔加入2mL完全培养基，待细胞融合至70％时，将培养基更换为成软骨诱导分化培养基，每隔2-3天换液1次。诱导21天后，用4％多聚甲醛固定细胞30min,PBS漂洗2遍后每孔中加入1mL阿尔新蓝染液染色10min，PBS漂洗2遍后于显微镜下观察染色效果并拍照留存。
成脂诱导分化：取第3代hUC-MSCs，消化计数后以2×104cells/cm2的细胞密度接种至6孔板中，每孔加入2mL完全培养基，待细胞融合至100％时，弃去完全培养基，并向每孔中加入2mL成脂诱导分化培养基A液；诱导3天后，吸走六孔板中的A液，再加入2mL成脂诱导分化培养基B液；1天后，吸走B液，换回A液继续进行诱导，A液和B液交替培养5个周期后，继续用B液维持培养7天(每3天换液一次)，直到镜下观察到的脂滴变得足够大；然后用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤后每孔中加入1mL油红O染料工作液染色30min，PBS洗去多余染料，显微镜下观察成脂染色效果并拍照留存。
由图2可知，本发明获得的hUC-MSCs在特定的诱导培养条件下能分化形成脂肪细胞(图2B)、骨细胞(图2C)和软骨细胞(图2D)，且hUC-MSCs成梭形、贴壁、漩涡状生长(40倍光镜)，提示本发明培养纯化获得的hUC-MSCs符合国际细胞治疗协会关于人MSCs的标准。
实施例2 免疫抑制或者抗炎功能增强型人脐带间充质干细胞的诱导、培养与鉴定
在实施例1的基础上，通过ATP和IFN-γ联合诱导hUC-MSCs，获得免疫抑制或者抗炎功能增强的hUC-MSCs，具体步骤为：
1、体外诱导制备免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs
将实施例1获得的hUC-MSCs冻存细胞复苏，并以4×104cells/cm2的细胞密度接种于75cm2培养瓶中，将培养瓶放置于培养箱中(37℃,5％CO2培养箱)，培养细胞生长至细胞密度>80％时，用TrypLE消化解离并进行传代培养，将消化的细胞以4×104cells/cm2的细胞密度接种于75cm2培养瓶中，并将细胞分成ATP和IFN-γ单独及联合处理0.5h、1h和24h组。将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱培养至70％-80％的细胞融合度时，再吸出培养基，加入30mM的HEPES和100ng/ml破膜蛋白SLO的HBSS 2ml和2mM ATP，培养箱孵育15min，后吸出并加入含IFN-γ(20ng/ml)的新鲜培养基继续培养。上述因子诱导分别诱导0.5h、1h和24h后，吸出旧培养基并用PBS漂洗2遍，再加入新鲜培养基培养24h。后用TrypLE消化收获细胞，再行免疫印记实验检测细胞免疫抑制因子(IDO、PD-L1)的表达，间接评估细胞的免疫抑制或者抗炎功能。
2、免疫印记检测免疫抑制、抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞IDO和PD-L1蛋白表达
⑴蛋白样品制备：用不同刺激因素处理MSCs达到既定时间，弃掉上清并用PBS洗涤1-2次，弃去PBS并加入适量的RIPA裂解液(碧云天P0013C)于冰上裂解30min后用细胞刮收集样品至1.5ml EP管，12000g 4℃离心15分钟，收集上清并用BCA法测定蛋白浓度并根据结果调齐蛋白浓度，混匀后加入5X loading buffer(碧云天P0015L)并用沸水浴10分钟使蛋白变性，室温冷却后，存储于-80℃冰箱备用。
⑵聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
1)试剂配制(TGX Strain-FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit，10％)如表1和表2所示。
表1试剂配制
Figure BDA0003391346460000091
Figure BDA0003391346460000101
表2试剂配制
溶液名称 主要组分及含量
5×电泳液缓冲液 甘氨酸72g，Tris 15.10g，SDS 5g，蒸馏水1000mL
快转缓冲液 5×快转缓冲液20mL，乙醇20mL，蒸馏水60mL
TBST缓冲液 TBS缓冲液1000mL，Tween 20 1mL
2)蛋白样品的上样：玻板固定在电泳天线上，先倒入双蒸水检漏，后倒入电泳液，并拔出梳子，冲去每个上样孔中的碎胶，然后依次上样。上样结束，将玻板放入电泳槽内(正极对正极，负极对负极)倒入电泳液至对应刻度线(2gel或4gel)。
3)电泳：安装好电路调整电压80V 30min，120V 60min。根据溴酚蓝跑到分离胶底部的具体时间决定(溴酚蓝到达凝胶下缘即可停止)。
(3)Western blot分析
快转法转膜：取出电泳后的凝胶，于凝胶成像仪中活化。再根据免染胶大小裁剪0.22μm的PVDF膜，置于甲醇中5min使之活化。将免染胶、膜、滤纸均放入快转液中。取出快转仪的“抽屉盒”，从下往上依次放置滤纸(2层，滑面均朝上)→膜→胶→滤纸(1层，滑面朝下)，并倒入快转液使之充分润湿，注意排净起泡。然后将“抽屉盒”放入快转仪中，连接电源，2.5A恒流转印3min。
封闭：将转膜后的含有样品蛋白的PVDF膜浸于新鲜配制含5％脱脂奶粉的TBST中，室温摇床上缓慢匀速振荡封闭1小时。
抗体的孵育：TBST漂洗封闭后的PVDF膜3次，每次5min，按照目的蛋白的分子量大小剪膜后加入对应的一抗，4℃振荡孵育过夜。第二天吸取一抗，用TBST洗膜，3次每次5min。用含5％脱脂奶粉的TBST配制二抗孵育液，比例为TBST：抗体＝10000:1。将二抗倒入放置膜的盒子中。每个小格子倒入5mL的二抗。室温摇晃孵育1h。TBST洗膜3次，每次5分钟，所用试剂规格如表3所示。
表3
一抗名称 品牌及货号 稀释比
PD-L1 CST,#13684 1∶1000
IDO CST,#86630 1∶1000
β-actin CST,#4970 1∶1000
化学发光信号检测：ECL化学发光试剂盒A液和B液等体积混合后均匀滴加在待测PVDF膜上，直接利用印迹成像系统Bio-Ra ChemiDocTMXRS+观察并拍照。
如图3所示为免疫抑制、抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞表达IDO和PD-L1的免疫印记检测结果。由图可知，20ng/ml IFN-γ仅单独刺激MSCs 24小时，能够诱导IDO和PD-L1的表达。2mM ATP无论单独刺激MSCs 0.5、1还是24小时，既不能诱导IDO的表达，也不能诱导PD-L1的表达。采用2mM ATP联合20ng/ml IFN-γ处理MSCs 24小时，大幅上调了IDO和PD-L1的表达，甚至达到了IFN-γ单独刺激MSCs 24小时组的2倍。
本发明的免疫抑制、抗炎功能增强型hUC-MSCs细胞可简便通过检测抗炎因子IDO和PD-L1的表达，即可对MSCs细胞药品制剂的抗炎或者免疫抑制功能进行质量评估，为免疫功能增强型MSCs细胞药品制剂的质量控制提供可标准化的指标和方案。
3、定量PCR检测免疫抑制因子IDO和PD-L1免疫抑制受体的mRNA表达
⑴细胞总RNA的提取(试剂盒，百泰克)：将诱导完成的细胞上清弃掉后直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积加入1ml TRIzol，并用移液枪吹打(加入TRIzol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA)。将样品在室温放置5-10min，使得核酸蛋白复合物完全分离。每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃1200044m离心15min后样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中，约600μl转移到新的离心管中。在得到的水相溶液中加入等体积70％乙醇，颠倒混匀后将混合溶液及可能的沉淀一起转入吸附柱RA中。1000044m离心45s，弃废液，将吸附柱重新套回收集管。再向吸附柱中加入500μl去蛋白液RE，1200044m离心45s，弃废液。分2次分别向吸附柱中加入700μl和500μl漂洗液RW，均1200044m离心60s，弃废液，之后再次1200044m离心2min，尽量去除漂洗液。最后取出吸附柱RA，套上一个新的RNase f4ee EP管，根据预期RNA产量，在吸附膜的中间部位加入50-80μl RNase f4ee wate4(事先在65-70℃水浴锅中加热效果更好)，室温放置2min，1200044m离心1min，再将离心得到的溶液重新加入吸附膜中央，继续室温放置2min后1200044m离心1min，将得到的溶液使用Nano4hotomete4 N60 Touch(德国IMPLEN)仪器测定所提RNA的浓度。
⑵RNA逆转录
使用RNA逆转录试剂盒(Vazyme)完成反转录过程。
1)去除基因组DNA反应
所用试剂规格如表4所示。
表4
试剂 体积
4X gDNA Wiper Mix 2.0μl
total RNA to 1μg
RNase Free dH2O add to 16μl
Total 16μl
42℃反应2min。
2)逆转录反应
所用试剂规格如表5所示。
表5
试剂 体积
Reaction solution from Step 1 16.0μl
5X HiScript II qPT SuperMix II 4.0μl
Total 20μl
逆转录反应条件：50℃，15min；85℃，5sec；存储条件-80℃。
⑶Real-Time PCR
1)引物(由华大基因合成)序列如表6所示。
表6
Figure BDA0003391346460000141
2)人PD-L1的PCR扩增
反应体系如表7所示。
表7
Figure BDA0003391346460000142
反应程序如表8所示。
表8
Figure BDA0003391346460000143
Figure BDA0003391346460000151
图4为MSCs表达PD-L1的定量PCR检测结果图。由图可知，仅采用20ng/ml IFN-γ单独刺激MSCs 24小时，能够提高PD-L1的转录mRNA的水平。2mM ATP单独刺激MSCs无论多长时间，均不能诱导PD-L1的转录。然而，当2mM ATP联合20ng/ml IFN-γ处理MSCs 24小时，却能大幅上调PD-L1的转录，这与免疫印迹结果一致。
图5为MSCs表达IDO1的定量PCR检测结果图。由图可知，结果与PD-L1的mRNA表达一致，仅有在IFN-γ存在并诱导24h的情况下，IDO1的mRNA水平才能显著上调，而ATP更能协同增加IFN-γ的诱导效应。
实施例3 免疫抑制或者抗炎功能增强型人脐带间充质干细胞在胶原诱导的关节炎小鼠治疗中的应用
1、胶原诱导的关节炎(collagen induced a4th4itis，CIA)模型建立与评价
⑴制备胶原诱导乳液：使用匀浆仪(直径为5mm或更小)或搅拌器将4mg/ml完全福式佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)与胶原溶液在三通管密封注射器中乳化(用于加强注射的不完全福式佐剂IFA同理)。由于加热会使胶原蛋白变性，而变性的胶原蛋白不会诱发关节炎，故将注射器夹在一个环形支架上，并浸入冰水浴中保持低温。
⑵向注射器中加入一次最大为2.5ml的CFA，然后缓慢加入等体积的胶原溶液(2mg/ml胶原溶于0.05M醋酸中)，边加入边慢速搅拌(1000-3000rpm)。注意：为了确保高质量的乳化液，最大乳液量体积应为5ml。如果需要更多，则多个批次制备。
1)加完胶原溶液后以最高速度(大约10000-30000rpm)混合乳液2min，再冰水浴中冷却5min。重复搅拌和冷却过程2-3次。对于较大的体积(2-5ml)乳化液制备，建议在混合过程中上下移动匀浆仪。
2)制备结束，通过在烧杯中加入一滴乳液来测试乳液的稳定性。如果乳液液滴保持为不散开的固体团块，则证明制备成功。注意：如果乳液在水面上消散，则乳状液是不稳定的。添加几滴佐剂，再次混合，然后重新测试。
3)将制备好的乳剂转移到1ml Hamilton玻璃注射器中。在制备好乳液后1小时内注射胶原蛋白乳液。将乳状液保持在4℃的温度下冷却，直到使用为止。
4)DBA/1小鼠尾部皮内注射胶原：每次注射前，擦拭针头，防止乳胶渗漏。将针头斜面朝上插入，并在距尾巴底部2cm处平行于尾部，直到针尖到达距底部0.5cm的位置注射。保持针头处于皮内。在尾部皮内注射0.1ml(100mg胶原/鼠)乳剂。
5)加强注射。于首次胶原乳液注射21天后进行IFA+胶原乳液的加强注射(乳液的制备方法同前)，在距尾巴基底部3cm处入针，直到针尖到达距底部1.5cm的位置。加强注射应在与初始注射不同的位置进行。
6)关节炎评估。每隔一天由两个独立的第三方检查者对CIA小鼠进行大体评估，并使用足跖肿胀进行关节炎临床评分。临床关节炎评估采用以下系统：0分，无肿胀；1分，轻度肿胀和红斑；2分，明显水肿；3分，关节僵硬。对每条肢体都进行评分后汇总，最大可能评分为每只动物12分。
2、ATP联合IFN-γ诱导的免疫抑制或者抗炎功能增强型hUC-MSCs在胶原诱导的关节炎小鼠模型中的应用
⑴MSCs治疗胶原模型鼠方案：按实施例2应用2mM ATP联合20ng/ml IFN-γ处理hUC-MSCs 24小时，换液后继续培养24小时，收获细胞并制备MSCs细胞制剂，后采用单次尾静脉输注1×106个细胞/100μl WT-hUC-MSCs(WT-MSCs组)、IFN-γ处理的hUC-MSCs(I-MSCs组)、ATP+IFN-γ处理的hUC-MSCs(A+I-MSCs组)和PBS组。另外，为了减少动物个体差异以便更好地评价疗效，当在加强注射后关节炎评分达到或超过3分时，即在发病后再开始治疗。本研究所选胶原模型鼠的干预时间均在关节炎发病后(约为加强注射后3-5天内)进行MSCs静脉注射。第50天处死动物，取血和四肢关节进行流式分析、细胞因子检测和组织病理学检查。
⑵组织病理学检查
4％多聚甲醛固定的肢体标本用含15％EDTA的脱钙液脱钙，然后按照标准的组织学方法将脱钙肢体进行脱水处理和石蜡包埋。
1)苏木精-伊红染色(H&E)染色：切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，入温热苏木精染液2min，清水快速漂净染液，1％的盐酸酒精水化15s后再次清水漂洗，镜下观察染色效果，标准为胞核呈蓝紫色，细胞间质无着色。而后伊红染色1min，依次梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用H&E染色对关节炎的严重程度进行评估：正常滑膜0分，滑膜肥大和细胞浸润1分，血管膜和软骨侵蚀2分，软骨和软骨下骨侵蚀3分，关节完整性丧失和强直4分。评估由2名第三方检测者进行，使用2者评分的平均值作为终值。
2)番红O(Safranin O)和固绿(Fast Green)染色：脱蜡并再水化成水，0.02％固绿5min(不冲洗)，1％乙酸30s(不要冲洗)，0.1％番红O 20min(不冲洗)，在95％乙醇中冲洗2min，然后用100％酒精冲洗3min2次。二甲苯2min 2次。覆盖盖玻片。切片Safranin O和Fast Green染色来评价软骨破坏情况。
如图6所知，单次静脉注射WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs可显著改善CIA的临床严重程度，而注射PBS的小鼠则相反，表现出严重的关节炎症状(图6B和6C)。进一步通过组织病理学评价发现，与PBS组对比，WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs处理的CIA小鼠的关节滑膜炎、关节破坏和软骨破坏均有明显减轻(图6D和6E)，与WT-MSCs和I-MSCs治疗相比，A+I-MSCs处理组显示出更好的疗效(图6B、6C和6D)。最后，经WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs处理的小鼠在实验终止前均未出现任何副作用或死亡。
图6注:(A)小鼠CIA模型诱导和MSCs治疗方案示意图。(B)对CIA小鼠的具有代表性的后肢的大体损伤进行拍照以进行临床评估。(C)持续监测CIA小鼠四肢足跖肿胀严重程度并进行关节炎临床评分直到实验终止。****p<0.0001，*p<0.05，**p<0.01vs PBS组；&&&&p<0.0001，&&&p<0.001vs WT-MSCs组；##p<0.01，#p<0.05vs I-MSCs(每个时间点的多因素方差分析比较)。(D)第50天处死所有小鼠进行组织病理学评估。(E)参照方法中的组织病理学评分对这些图像进行评估并统计分析。用H&E以及Safranin O和Fast Green对CIA小鼠的掌骨和指骨后关节的石蜡包埋切片进行染色以平均其组织学关节损伤和软骨破坏，并选取其中具有代表性的图像，比例尺＝200μm。每组至少使用5只小鼠：NC＝阴性对照(n＝5)、PBS＝CIA小鼠PBS处理组(红色；n＝6只小鼠)，WT-MSCs＝CIA小鼠WT-MSCs治疗组(蓝色；n＝6只小鼠)，I-MSCs＝CIA小鼠IFN-γ诱导的MSCs治疗组(黄色；n＝8只小鼠)，A+I-MSCs＝CIA小鼠ATP联合IFN-γ诱导的MSCs治疗组(绿色；n＝10只小鼠)，所有结果均为平均值±标准差。
实施例4 免疫抑制或者抗炎功能增强型间充质干细胞在急性肺炎小鼠治疗汇中的应用
1、MSCs治疗急性肺炎模型鼠方案：将BALB/c小鼠麻醉，捏住鼻子吸入脂多糖4h后，假手术对照组和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.1mL无菌PBS，WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs组各注射含1×106个细胞的100μl细胞悬液，3d后处死动物，取肺和肺泡灌洗液进行免疫细胞检测、细胞因子检测和组织病理学检查。
2、免疫细胞检测：取肺泡灌洗液，离心取下层细胞沉淀用于瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观测细胞染色及炎性细胞浸润情况。结果如7所示，由图可知，PBS组的肺泡灌洗液有大量炎性细胞聚集，WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs均可减轻炎性细胞的聚集程度，而A+I-MSCs组治疗效果最好，几乎完全逆转了炎性细胞聚集。
3、组织病理学检查：另取一部分肺组织，于PBS中洗净后用4％多聚甲醛固定。之后按照标准的组织学方法将样本进行脱水处理和石蜡包埋并切片。切片常规二甲苯脱蜡及梯度酒精水化后，入温热苏木精染液10min，清水快速漂净染液，1％的盐酸酒精水化15s后再次清水漂洗，镜下观察染色效果，标准为胞核呈蓝紫色，细胞间质无着色。而后伊红染色30s，清水快速漂净染液，中性树胶封片。显微镜下观测肺组织的完整程度。结果如图8所示，由图可知，通过HE染色发现，与PBS组相比，WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs组均显著改善了肺泡组织的破坏程度，其中A+I-MSCs组的肺泡形态最为完整，甚至将要达到NC组的程度。
4、细胞因子检测：将肺组织切割称重，后取一小块加入一定量的PBS，用液氮迅速冷冻。在冰上再加入一定量的PBS，将样本充分匀浆，2000rpm离心20min取上清。采用ELISA法检测其中主要炎症因子IL-1β的水平，具体操作参照武汉博士德生物ELISA试剂盒说明书进行。结果如图9所示。由图可知，与NC组相比，PBS组的IL-1β水平大幅上升，WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs可显著降低IL-1β的水平，其中A+I-MSCs下降的最为明显，效果最好。(每组小鼠均5只，****p<0.0001)
实施例5 免疫抑制或者抗炎功能增强型间充质干细胞在CLP脓毒症小鼠治疗中的应用
BALB/c小鼠进行盲肠结扎穿孔术(CLP)3h后，假手术对照组和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.1mL无菌PBS，WT-MSCs组和T+I-MSCs组各注射含1×106个细胞的100μl细胞悬液，24h时后加注亚胺培南西司他丁钠(14mg/kg)抗生素，最终统计120h各组死亡率。
结果如图10所示，由图可知，PBS组的小鼠存活率为8％，sham假手术组无死亡发生，A+I-MSCs移植治疗后小鼠的120h生存率由PBS组的8％提高到53.5％(p<0.0001)，I-MSCs组为38.5％，WT-MSCs组只有23.1％(p<0.05),由此提示抗炎功能增强的A+I-MSCs对脓毒症小鼠的治疗疗效显著增强，对临床脓毒症的治疗具有巨大潜在的价值。
实施例6 免疫抑制或者抗炎功能增强型MSCs对CLP模型脓毒症小鼠的炎症调节作用
BALB/c小鼠进行盲肠结扎穿孔术(CLP)3h后，假手术对照组和PBS治疗对照组经尾静脉注射0.1mL无菌PBS，WT-MSCs组和T+I-MSCs组各注射含1×106个细胞的100μl细胞悬液，24h时后加注亚胺培南西司他丁钠(14mg/kg)抗生素，CLP术后48h，各组小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉后摘眼球取血。全血于室温下静置2h，血液凝固分层后以1500rpm的转速离心10min，共离心3次，收集血清后采用ELISA法检测其中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平，具体操作参照武汉博士德生物ELISA试剂盒说明书进行。
结果如图11所示，由图可知，与sham假手术组相比，PBS组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平均有大幅上升。WT-MSCs、I-MSCs和A+I-MSCs间充质干细胞组均能够显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平；与WT-MSCs和I-MSCs治疗相比，移植A+I-MSCs治疗后IL-1β、TNF-α和IL-6的水平有更为明显的降低作用(*p<0.05，**p<0.01)，对IL-10也则有显著的升高作用(***p<0.001)。
实施例7
一种试剂盒，包括MSCs的基础培养基、MSCs增殖培养添加剂、免疫抑制或者抗炎功能诱导复合剂，1mM-40mM的HEPES和50ng/ml-150ng/ml的破膜蛋白SLO的HBSS。进一步的，所述免疫抑制或者抗炎功能诱导剂主要由1-5mM的ATP、10-40ng/ml的人重组IFN-γ以及白蛋白赋形剂组成。
本发明试剂盒的使用方法：在获得的3-8代MSCs增殖培养至70-80％细胞融合度时，加入免疫抑制或者抗炎功能诱导剂诱导24小时，撤出诱导剂后继续培养24小时后收获细胞，并制做临床级细胞药品制剂产品。
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在申请待批的本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞，其特征在于，由ATP和IFN-γ对间充质干细胞进行体外诱导获得。
2.根据权利要求1所述的具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人脂肪、骨髓、牙髓、脐带、胎盘或脐带血。
3.一种具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对间充质干细胞进行传代培养后，在所述间充质干细胞的培养瓶中，加入ATP与IFN-γ诱导因子进行培养；
培养至预设时间后撤出所述ATP和IFN-γ诱导因子，并对间充质干细胞继续培养，得到具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述预设时间大于24h；所述培养瓶内的细胞密度为3.5×104cells/cm2～4.5×104cells/cm2。
5.根据权利要求3所述的具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述加入ATP与IFN-γ诱导因子进行培养具体为，当间充质干细胞的细胞融合度达到70％-80％时，加入ATP，培养箱孵育10min～15min后，再加入含有IFN-γ诱导因子的新鲜培养基，其中ATP的添加量为1mM～3mM，IFN-γ在新鲜培养基中浓度为10ng/ml～30ng/ml。
6.一种预防或治疗自身免疫性疾病和炎性相关疾病的药物，其特征在于，包含权利要求1所述的间充质干细胞。
7.如权利要求1所述的具有免疫抑制、抗炎功能的间充质干细胞在制备或评估，预防或治疗自身免疫性疾病和炎性相关疾病的药物中的应用。
8.一种试剂盒，包括MSCs的基础培养基、1-5mM的ATP以及10-40ng/ml的人重组IFN-γ。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：还包括MSCs增殖培养添加剂、HEPES、破膜蛋白SLO的HBSS中的其中一种或几种。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于：还包括1mM-40mM的HEPES和50ng/ml-150ng/ml的破膜蛋白SLO的HBSS。
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