CN111925985B - 间充质干细胞的驯化培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及间充质干细胞的驯化培养方法。具体涉及无血清驯化培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采集脐带，剥取华通氏胶，加入完全培养基，于培养箱中静置培养，去除组织块并全量更换完全培养基继续进行培养，得到的细胞接下来进行消化；加胰蛋白酶溶液消化，加入完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，得到P0代细胞；将P0代细胞沉淀用含小于10%血清的驯化培养基重悬，于培养箱中静置培养，添加胰蛋白酶溶液消化，中和，得到P1代细胞；接着用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；任选的，继续用无血清驯化培养基进行培养、传代，本发明方法呈现说明书所述优良效果。

Description

间充质干细胞的驯化培养方法
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地涉及一种无血清体外驯化培养人间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res.1991, 9: 641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284: 143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。
从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库已有诸多文献报道，例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。
干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。
间充质干细胞的体外培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行培养传代时，所用的培养基都需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10%胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)对间充质干细胞进行培养传代。
然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清驯化培养间充质干细胞是有意义的。
CN 108642002 A(201810047983.2)公开了一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法。该方法使用新鲜的无血清基础培养基，按照一定的比例添加并置换体外人间充质干细胞的有血清完全培养液，利用间充质干细胞自身在培养过程中分泌的外泌体和微囊成分作为补充，使间充质干细胞完成无血清培养的驯化，最终实现无血清培养体系。据信该发明驯化后的间充质干细胞的密度及活率、细胞表面的主要标志物与有血清培养基无明显差异，检测培养液及外泌体所分泌的细胞因子的组分和丰度发现，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升。然而，由于该CN 108642002 A方法是细胞直接用无血清的培养基进行培养，细胞环境营养急剧降低，会对细胞产生诸多不利的影响。
因此，本领域仍然期待提供一种新的方法来培养间充质干细胞，尤其是提供一种新的方法进行无血清体外驯化培养人间充质干细胞。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种独特的培养方法，为人间充质干细胞的体外培养提供一种无血清驯化培养的方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的第一方面，提供了一种无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管。
(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL。
(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃ 5% CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化。
(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
(5)将P0代细胞沉淀用含小于10%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃ 5% CO2培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的MSC驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞。
(6)采用步骤(5)培养和消化的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的MSC驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞)。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述组织清洗液是含1%青霉素、1%链霉素的0.9%生理盐水溶液。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(2)中用组织清洗液清洗华通氏胶。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC完全培养基是含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(3)中，每间隔2-3天补液一次，每次补加3-4mL的MSC完全培养基。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(4)中，加入胰蛋白酶溶液后，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶充分覆盖细胞表面，消化1min，至显微镜下观察细胞收缩成圆形，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(4)中，在离心机中以1400rpm离心5min。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(5)中，将P0代细胞沉淀用含7~9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(5)中，将P0代细胞沉淀用含8~9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬，例如含8%、8.5%、9%、或9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(6)之重复步骤(5)的过程中，随着细胞代次的增加，MSC驯化培养基中的胎牛血清浓度降低，直至胎牛血清在MSC驯化培养基中的浓度为0。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(6)中，通过逐渐降低胎牛血清浓度的方式，至P4~P10代得到无血清体外驯化培养的间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(6)中，通过逐渐降低胎牛血清浓度的方式，至P4~P9代得到无血清体外驯化培养的间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(6)中，通过逐渐降低胎牛血清浓度的方式，至P4~P8代得到无血清体外驯化培养的间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的方法，其中步骤(7)中，对步骤(6)最终所得0%胎血清体外驯化培养的间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代，继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白8~12ng/mL、8~12ng/mL胰岛素、胎牛血清0~9.5%、平衡量的DMEM/F12培养基。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白10ng/mL、10ng/mL胰岛素、胎牛血清0~9.5%、平衡量的DMEM/F12培养基。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC驯化培养基中还包含3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇和硫酸镁。在一个实施方案中，3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇的浓度为0.08~0.12mg/mL。在一个实施方案中，硫酸镁以镁离子浓度计4~6µg/mL。在一个实施方案中，3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇的浓度为0.1mg/mL。在一个实施方案中，硫酸镁以镁离子浓度计5µg/mL。3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇，亦称为愈创甘油醚、愈创木酚甘油醚，其CAS登记号为93-14-1。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白8~12ng/mL、胰岛素8~12ng/mL、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.08~0.12mg/mL、硫酸镁以镁离子浓度计4~6µg/mL、0~9.5%胎牛血清、平衡量的DMEM/F12培养基。根据本发明第一方面所述的方法，其中所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白10ng/mL、胰岛素10ng/mL、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.1mg/mL、硫酸镁以镁离子浓度计5µg/mL、0~9.5%胎牛血清、平衡量的DMEM/F12培养基。在本发明中，如未另外说明，术语“平衡量”表示添加至总量的量，其在本文中指以DMEM/F12培养基为介质添加其余物质基础至其各自规定的浓度。
在本发明描述的各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它任一实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
众所周知，MSC的来源丰富，主要以围产期组织：胎盘、脐带、羊膜、羊水等为主。而尤以脐带来源的MSC制备更为方便、优质。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是华通氏胶，外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路，已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源。处理方法是首先剥离脐带动静脉和外层上皮，留下凝胶状组织(华通氏胶)，切除双侧带夹痕及淤血的部分。
本发明无血清体外驯化培养人间充质干细胞的方法，其所制得的间充质干细胞呈现如本文所述一个或者多个方面的优异技术效果。
附图说明
图1：成骨诱导分化结果，a为无血清驯化实验组(原始照片图中深色部分为橘红色)，b对照组。
图2：成脂诱导分化结果，a无血清驯化实验组(原始照片图中深色部分为红色)，b对照组。
图3：成软骨诱导分化结果，a无血清驯化实验组(原始照片图中的中间深色部分为深蓝色，b对照组。
图4：流式细胞表型结果(自上而下依次为CD73、CD90、CD105、HLA-DR，左图为无血清驯化组、右图为常规培养组)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。在本文中，提及的PBS缓冲液或者PBS溶液或者PBS等，如未特别说明，均是指pH6.8的磷酸盐缓冲液，其配制方法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，用水稀释至1000mL，摇匀，即得。
MSC完全培养基的配制：向DMEM/F12培养基中添加胎牛血清至浓度为10%，即得。
MSC驯化培养基(亦称为减量血清培养基)的配制：向DMEM/F12培养基中添加转铁蛋白(至浓度为10ng/mL，Transferrin，ProSpec-Tany公司产品)、胰岛素(至浓度为10ng/mL，Sigma-Aldrich公司产品)、胎牛血清(至浓度为0~9.5%，例如至浓度为9.5%、9%、8%、7.5%、7%、6%、5.5%、5%、4%、3%、2%、1%、0%等，Gibco产品)，制得含有转铁蛋白、胰岛素以及不同浓度胎牛血清的MSC驯化培养基。
一、制备间充质干细胞
实施例1：无血清驯化培养MSC
(1)用组织清洗液(含1%青霉素、1%链霉素的0.9%生理盐水)清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管。
本实施例具体按如下方式操作：在生物安全柜中将不锈钢托盘、滤网、不锈钢杯、饭盒、组织清洗液(含1%青霉素、1%链霉素的0.9%生理盐水)、移液器等物品摆放到适当位置。使用手术镊子将胎盘组织取出放入不锈钢托盘中，用组织清洗液对胎盘表面进行清洗，去除胎盘表面上的淤血。使用手术剪刀及镊子将连接胎盘处的脐带剪断，另一端从脐带无菌夹后方剪断。取出脐带，用组织清洗液清洗3次，去除表面的淤血和凝血块。用镊子夹住脐带的一端，用另一把镊子夹住脐带且沿着脐带组织滑动，以去除血管中的残留脐血。先将脐带剪成2-3cm长的几段，然后用剪刀沿脐带的纵切面将其剖开，展平，去除内部的3根血管(2根脐动脉、1根脐静脉)。转移至新的平皿中。
(2)剥取脐带中的华通氏胶，(用组织清洗液)清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL。
本实施例具体按如下方式操作：用镊子剥取其华通氏胶，放入装有组织清洗液的培养皿中，用组织清洗液清洗并且将华通氏胶撕成长条状。处理完毕后用镊子将华通氏胶转移至50mL离心管中，用剪刀剪至2-3mm3的小块，用3mL无菌滴管转移T75培养瓶中，每瓶1mL，滴管在使用前需用无菌剪刀剪掉其尖头。
(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃ 5% CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次(每次补加3-4mL的MSC完全培养基)，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化。
本实施例具体按如下方式操作：向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中。将T75培养瓶置于37℃ 5% CO2培养箱中静置培养。在培养至第三天的时候将培养瓶从培养箱中取出，补加3.5mL的MSC完全培养基，此后间隔3天补液一次。在补液3次之后，培养瓶底部会有细胞爬出，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养。待细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化。
(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取(20mL的)PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
本实施例具体按如下方式操作：细胞传代培养前，将0.25%胰蛋白酶、MSC完全培养基(包含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)、PBS置于室温平衡温度。将培养瓶从培养箱中取出，用移液管将培养瓶中的培养基吸弃，吸取20mL的PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清后。在培养瓶中添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶充分覆盖细胞表面，消化约1min，至显微镜下观察细胞收缩成圆形，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中。将离心管置于离心机中，1400rpm离心5min，去除上清液，该沉淀的细胞记为P0代。
(5)将P0代细胞沉淀用含9%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃ 5% CO2培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取(20mL的)PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的MSC驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞。
(6)采用步骤(5)培养和消化的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的MSC驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞(本实施例中，依次为：对P1代细胞用含有7.5%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养和消化(得到P2代细胞)、对P2代细胞用含有5.5%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养和消化(得到P3代细胞)、对P3代细胞用含有3%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养和消化(得到P4代细胞)、对P4代细胞用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养和消化(得到P5代细胞)，收获的P5代细胞可进行后续的检测或者用于后续的无血清培养、传代)。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、7.5%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、5.5%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、3%胎牛血清)培养获得P4代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P5代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
本实施例所述减量血清培养基或MSC驯化培养基，例如，用于获得P1代细胞的减量血清培养基，其是照如下方式配制的：向DMEM/F12培养基中添加转铁蛋白(至浓度为10ng/mL)、胰岛素(至浓度为10ng/mL)、胎牛血清(至浓度为9%)，制得含有转铁蛋白、胰岛素以及不同浓度胎牛血清的MSC驯化培养基；换言之，本实施例用于获得P1代细胞的减量血清培养基中包含：转铁蛋白10ng/mL、胰岛素10ng/mL、胎牛血清9%、平衡量的DMEM/F12培养基。在本发明中，减量血清培养基或MSC驯化培养基，如无另外说明，均有类似的含义。
实施例2：无血清驯化培养MSC
步骤(1)~(4)同实施例1，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
步骤(5)~(6)参照实施例1的相应步骤，不同的仅是MSC驯化培养基中胎牛血清浓度降低的梯度改变。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、7%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、5%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、3%胎牛血清)培养获得P4代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P5代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例3：无血清驯化培养MSC
步骤(1)~(4)同实施例1，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
步骤(5)~(6)参照实施例1的相应步骤，不同的仅是MSC驯化培养基中胎牛血清浓度降低的梯度改变。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P18代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、8%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、6%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、4%胎牛血清)培养获得P4代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、2%胎牛血清)培养获得P5代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P6代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例4：无血清驯化培养MSC
步骤(1)~(4)同实施例1，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
步骤(5)~(6)参照实施例1的相应步骤，不同的仅是MSC驯化培养基中胎牛血清浓度降低的梯度改变。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9.5%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、8.5%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、7.5%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、6%胎牛血清)培养获得P4代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、4%胎牛血清)培养获得P5代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、2%胎牛血清)培养获得P6代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P7代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例5：无血清驯化培养MSC
步骤(1)~(4)同实施例1，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
步骤(5)~(6)参照实施例1的相应步骤，不同的仅是MSC驯化培养基中胎牛血清浓度降低的梯度改变。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P15代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、8%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、6%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、3%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P4代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例6：无血清驯化培养MSC
步骤(1)~(4)同实施例1，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。
步骤(5)~(6)参照实施例1的相应步骤，不同的仅是MSC驯化培养基中胎牛血清浓度降低的梯度改变。任选的
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代(可如此继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞)。
本实施例中，
用MSC完全培养基(含10%胎牛血清)培养获得P0代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9.5%胎牛血清)培养获得P1代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、9%胎牛血清)培养获得P2代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、8.5%胎牛血清)培养获得P3代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、7.5%胎牛血清)培养获得P4代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、6%胎牛血清)培养获得P5代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、4.5%胎牛血清)培养获得P6代细胞，
用减量血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、2.5%胎牛血清)培养获得P7代细胞，
用无血清培养基(含转铁蛋白、胰岛素、0%胎牛血清)培养获得P8代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以此代细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例7：无血清驯化培养MSC
分别参照实施例1~6的操作，不同的仅是在所用各种胎牛血清浓度的MSC驯化培养基中，还额外添加3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇(至在各MSC驯化培养基中的浓度为0.1mg/mL)和硫酸镁(至镁离子在各MSC驯化培养基中的浓度为5µg/mL)，最终得到6类无血清驯化培养的间充质干细胞，分别称为实施例71~76的各代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以所参考操作实施例用于检测的相应代次细胞进行(其亦称为检测细胞)。
本实施例所述减量血清培养基或MSC驯化培养基，例如，在参考实施例1时，用于获得P1代细胞的减量血清培养基，其是照如下方式配制的：向DMEM/F12培养基中添加转铁蛋白(至浓度为10ng/mL)、胰岛素(至浓度为10ng/mL)、胎牛血清(至浓度为9%)、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇(至浓度为0.1mg/mL)、硫酸镁(至镁离子浓度为5µg/mL)，制得含有转铁蛋白、胰岛素、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇)、硫酸镁以及不同浓度胎牛血清的MSC驯化培养基；换言之，本实施例参考实施例1用于获得P1代细胞的减量血清培养基中包含：转铁蛋白10ng/mL、胰岛素10ng/mL、胎牛血清9%、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.1mg/mL、硫酸镁以镁离子计5µg/mL、平衡量的DMEM/F12培养基。在本发明中，减量血清培养基或MSC驯化培养基，如无另外说明，均有类似的含义。
实施例8：无血清驯化培养MSC
分别参照实施例1~6的操作，不同的仅是在所用各种胎牛血清浓度的MSC驯化培养基中，还额外添加3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇(至在各MSC驯化培养基中的浓度为0.1mg/mL)，最终得到6类无血清驯化培养的间充质干细胞，分别称为实施例81~86的各代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以所参考操作实施例用于检测的相应代次细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例9：无血清驯化培养MSC
分别参照实施例1~6的操作，不同的仅是在所用各种胎牛血清浓度的MSC驯化培养基中，还额外添加硫酸镁(至镁离子在各MSC驯化培养基中的浓度为5µg/mL)，最终得到6类无血清驯化培养的间充质干细胞，分别称为实施例91~96的各代细胞；在本发明后续的各种检测试验中，若未另外说明，以所参考操作实施例用于检测的相应代次细胞进行(其亦称为检测细胞)。
实施例10：有血清培养MSC
在实施例1之步骤(5)和步骤(6)中，将各种MSC驯化培养基全部改用MSC完全培养基进行细胞的培养、消化，得到P5代细胞为有血清培养的间充质干细胞，作为用于检测的对照细胞。
二、间充质干细胞的测试
MSC是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，能够分化为肝细胞样细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌原细胞以及神经外胚泡等。因此在实验室中多以MSC的成骨、成脂肪、成软骨的分化实验来验证其细胞的多向分化潜能，从而体现细胞质量的高低。
试验例1：无血清驯化的MSC细胞成骨诱导分化及染色实验
一、接种及成骨诱导培养
1、高糖完全培养基配制：500mL高糖-DMEM培养基中加入56mL胎牛血清，配制成含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基；
2、取实施例1所得P5代经无血清驯化后的对数生长期内的MSC细胞，用0.25%胰蛋白酶液进行消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部表面。消化约1min，至镜下观察细胞收缩成团，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部，加入与胰蛋白酶等体积的完全培养基终止消化，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中。
3、1400rpm离心5min后，去除上清。用10mL完全培养基重悬细胞，计数。
4、按照6×104/mL的接种密度接种至24孔板中，每孔1mL，共接种4孔。1孔为对照孔，3孔为实验孔。将培养板置于30℃ 5% CO2培养箱中培养。
5、待细胞融合率达到80%后洗掉培养基，在对照孔中添加0.5mL含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，另3孔实验孔中添加0.5mL的MSC成骨诱导培养基。将培养板重新置于30℃ 5% CO2培养箱中继续培养。
6、每2～3天换一次液。换液时先将孔内原培养基吸弃，然后加入0.5mL对应的培养基，诱导时间为15～20天。
二、染色鉴定
1、成骨诱导分化培养的染色鉴定采用茜红素S染色法。
2、样本固着处理：小心吸去24孔板中的培养液，每孔加入400μL的PBS缓冲液清洗细胞表面。小心吸弃PBS清洗液，每孔加入300μL BI的Fixation Solution，覆盖整个生长表面。在室温下静置30min后小心的吸弃BI的Fixation Solution，每孔加入300μL的BI washI洗液，清洗细胞表面2～3次。
3、样本染色处理：吸弃wash I洗液，加入300μL BI的Staining Solution，底面浸润均匀。室温染色30min，小心吸弃BI的Staining Solution，加入300μL BI的wash II，润洗细胞2～3次。吸弃wash II，加入300μL的Inspection Solution，置于显微镜下观察细胞并拍照(分化后的细胞会被染成橘红色)。
结果见图1，图1中a无血清驯化实验组显示细胞被染成典型的橘红色，图1中b对照组细胞没有被染成典型的橘红色。
参照本试验例1的方法，对实施例2~6的5种检测细胞、实施例7的6种检测细胞、实施例81的检测细胞、实施例91的检测细胞进行检测，结果显示这些细胞均呈现细胞被染成典型的橘红色的结果。
试验例2：无血清驯化的MSC细胞成脂肪诱导分化及染色实验
一、溶液试剂准备：
1、实验开始前先将胰蛋白酶、MSCgo Adipogenic Differentiation BasalMedium、MSCgo Adipogenic SF，XF Supplement Mix I，MSCgo Adipogenic SF，XFSupplement Mix II放入37℃培养箱预热。
2、高糖完全培养基配制：500mL高糖-DMEM培养基中加入56mL胎牛血清，配制成含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基；
3、脂肪诱导培养基的配置：将Supplement Mix I、Supplement Mix II用移液器加到MSCgo Adipogenic Differentiation Basal Medium中。
4、实施例1所得P5代经无血清驯化后的对数生长期内的MSC细胞，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部表面。消化约1min，至镜下观察细胞收缩成团，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部，加入与胰蛋白酶等体积的完全培养基终止消化，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中。
5、1400rpm离心5min后，去除上清。用10mL完全培养基重悬细胞，计数。
6、按照6×104/mL的接种密度接种至24孔板中，每孔1mL，共接种4孔。1孔为对照孔，3孔为实验孔。将培养板置于30℃ 5% CO2培养箱中培养。
7、待细胞融合率达到80%后洗掉培养基，在对照孔中添加0.5mL含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，另3孔实验孔中添加0.5mL的MSC成脂肪诱导培养基。将培养板重新置于30℃ 5% CO2培养箱中继续培养。
8、每2～3天换一次液。换液时先将孔内原培养基吸弃，然后加入0.5mL对应的培养基，诱导时间为15～20天。
二、染色鉴定
1、成脂肪诱导分化培养的染色鉴定采用中性脂质油红O染色法。
2、样本固着处理：小心吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μL的PBS缓冲液清洗细胞表面。小心吸弃PBS清洗液，每孔加入300μL BI的Adipo-Fixation，覆盖整个生长表面。在室温下静置30min后小心的吸弃BI的Adipo-Fixation，每孔加入300μL的BI Adipo-washI洗液，清洗细胞表面，静置2～3分钟。小心抽去BI的Adipo-Wash I。
3、样本染色处理：将Adipo-Staining A和Adipo-Staining B按3：2的体积混合，即为染色工作液。小心加入300μL BI的染色工作液，覆盖整个生长表面，室温下静置30min。小心抽去BI的染色工作液，小心加入300μLBI的wash II，润洗表面，吸弃Wash II，重复前述步骤，再次漂洗细胞(如上清依然很红，可延长漂洗时间或再漂洗一次，注意不要把细胞冲下来)。每孔加入300μL Adipo-Inspection。即刻用光学显微镜进行观察，脂类物质会呈现典型红色。
结果见图2，图2中a无血清驯化实验组显示呈现典型红色的脂类物质，图2中b对照组细胞没有显示呈现典型红色的脂类物质。
参照本试验例2的方法，对实施例2~6的5种检测细胞、实施例7的6种检测细胞、实施例81的检测细胞、实施例91的检测细胞进行检测，结果显示这些细胞均呈现典型红色的脂类物质的结果。
试验例3：无血清驯化的MSC细胞成软骨诱导分化及染色实验
一、试剂配置及细胞培处理
1、实验开始前先将胰蛋白酶，MSCgo Chondrogenic Differentiation BasalMedium，MSCgo Chondrogenic Differentiation Supplement Mix放入37℃培养箱预热。
2、高糖完全培养基配制：500mL高糖-DMEM培养基中加入56mL胎牛血清，配制成含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基；
3、软骨诱导培养及的配置：将10mL Supplement Mix用移液器加入到100mL的Chondrogenic Differentiation Basal Medium中。
4、取实施例1所得P5代经无血清驯化后的对数生长期内的MSC细胞，用胰蛋白酶进行消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部表面。消化约1min，至镜下观察细胞收缩成团，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部，加入与胰蛋白酶等体积的完全培养基终止消化，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中。
5、1400rpm离心5min后，去除上清。用10mL完全培养基重悬细胞，计数。
二、软骨诱导
方案一：
1、按照1×107cells/mL的密度接种至24孔细胞培养板中的3个培养孔中，每孔10μL。周边空白孔中加入1mL无菌PBS封边用于保持湿度；
2、将上述24孔细胞培养板放入5% CO2培养箱中2hr；
3、待细胞贴壁后，以其中1孔为对照组，添加1mL含10%的FBS的高糖DMEM培养基；另外3孔为实验组，添加0.5mL的MSC成软骨诱导培养基；
4、放入5%的CO2培养箱中继续培养；
5、每3天更换一次培养基，诱导时间为14～21天。
方案二：
1、按照6×105cells/mL的密度，重悬MSC细胞沉淀，配置4mL的MSC细胞悬液；
2、将细胞悬液接种于24孔板中，每孔接种1mL，37℃的5%CO2培养箱中继续培养；
3、24hr后洗掉培养液，以其中1孔为对照孔，添加0.5mL含10% FBS的高糖培养基，另3孔为实验组，添加0.5mL的MSC软骨诱导培养基后放入5%的CO2培养箱中37℃培养。
4、每3～4天换一次液，换液时先将孔内的培养基吸弃，然后加入0.5mL相对应的培养基，诱导时间为14～21天。
三、染色鉴定
1、成软骨诱导分化培养的染色鉴定采用阿尔辛兰染色法；
2、样本固着处理：小心吸去24孔板中的培养液，每孔加入400μL的PBS缓冲液清洗细胞表面。小心吸弃PBS清洗液，每孔加入400μL BI的Fixation Solution，覆盖整个生长表面。在室温下静置30min后小心的吸弃BI的Fixation Solution，每孔加入200μL的BI washI洗液，静置2～3min；
3、样本染色处理：吸弃Wash I，加入300μL BI的Staining solution，底面浸润均匀，室温避光染色过夜；
4、吸弃Staining solution，加入300μL BI的Wash II，润洗细胞；
5、吸弃Wash II，加入300μL BI的Wash II再次漂洗一次(如若上清依然很蓝，可延长漂洗时间再漂洗一次)；
6、加入300μL BI的Inspection Solution；用光学显微镜进行观察，成软骨诱导分化成功的细胞呈深蓝色。
方案一的结果见图3，图3中a无血清驯化实验组显示呈现典型深蓝色的细胞，图3中b对照组细胞没有显示呈现典型深蓝色的细胞。方案二的结果与方案一的结果基本上相同。
参照本试验例3的方法，对实施例2~6的5种检测细胞、实施例7的6种检测细胞、实施例81的检测细胞、实施例91的检测细胞进行检测(方案一)，结果显示这些细胞均呈现典型深蓝色的细胞的结果。
以上试验例1~3的结果表明，通过本发明实施例1~9无血清体外驯化培养方法所得的人间充质干细胞，呈现典型的间充质干细胞分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞的性能。
试验例4：利用Annexin V/PI试剂检测P5代驯化细胞早期/晚期凋亡
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞早期凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光，区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。
本试验例的测试物：本发明方法无血清驯化培养获得的间充质干细胞(实施例1~9的检测细胞，例如实施例1之P5间充质干细胞)、参照CN108642002A (201810047983.2)实施例1方法进行无血清驯化培养获得的P5间充质干细胞。
1、取待测试的无血清驯化的P5代间充质干细胞，用移液管吸弃完全培养基，用20mL的PBS润洗培养瓶30s后吸弃；
2、向培养瓶中添加2mL预热至37℃的胰蛋白酶液(0.25%)，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部表面。消化约1min，至镜下观察细胞收缩成团，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部，加入与胰蛋白酶等体积的完全培养基终止消化，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中；
3、将细胞悬液置于离心机中1000rpm离心5min，吸弃上层清液，再用预冷至4℃的PBS重悬细胞沉淀，再次以1000rpm，离心5min漂洗细胞；
4、用27mL的去离子水稀释3mL的Binding Buffer(10×)至30mL；
5、用1mL 1×的Binding Buffer悬浮细胞，1000rpm离心10min，弃上清；
6、用1mL 1×的Binding Buffer重悬细胞，使细胞的密度为1×107细胞/mL；
7、取1.5mL的EP管，向管内添加100μL细胞悬液，即细胞数量为1×106细胞/mL；
8、再向管中加入5μL的Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温，避光孵育10min；
9、加入5μL的PI，室温，避光孵育5min；
10、加入PBS至500μL，轻轻混匀后，流式上机，在488nm处检测细胞表达量，各测试组同时收集75万个细胞，计算细胞的早期凋亡和晚期凋亡/死亡的比例(n=5的均值)；
11、经测定和计算，结果表明，使用本发明无血清驯化培养方法获得的间充质干细胞，其早期凋亡细胞比例、晚期凋亡/死亡细胞比例两个参数均呈现优良结果。
结果：实施例1~6的6种检测细胞，早期凋亡细胞比例在23.5%~25.2%范围内、晚期凋亡/死亡细胞比例在13.6%~15.1%范围内，例如实施例1之P5干细胞的早期凋亡细胞比例为24.3%、晚期凋亡/死亡细胞比例为14.4%；实施例7的6种检测细胞，早期凋亡细胞比例在12.6%~13.8%范围内、晚期凋亡/死亡细胞比例在6.6%~7.8%范围内，例如实施例71之P5干细胞的早期凋亡细胞比例为13.1%、晚期凋亡/死亡细胞比例为7.2%；实施例8的6种检测细胞，早期凋亡细胞比例在23.7%~25.7%范围内、晚期凋亡/死亡细胞比例在13.7%~15.3%范围内，例如实施例81之P5干细胞的早期凋亡细胞比例为23.9%、晚期凋亡/死亡细胞比例为14.8%；实施例9的6种检测细胞，早期凋亡细胞比例在23.2%~24.4%范围内、晚期凋亡/死亡细胞比例在14.1%~15.2%范围内，例如实施例91之P5干细胞的早期凋亡细胞比例为23.5%、晚期凋亡/死亡细胞比例为14.6%；CN108642002A早期凋亡细胞比例为33.4%、晚期凋亡/死亡细胞比例为21.7%。
根据本试验例4的结果可见，本发明无血清驯化培养方法获得的间充质干细胞呈现比之于现有技术方案更优良的性能。特别是出人意料的发现，在添加转铁蛋白和胰岛素且胎牛血清逐渐减量的MSC驯化培养基中同时添加二醇化合物和镁盐可以显著提高细胞的性能。
试验例5：无血清驯化后的MSC细胞表型的检测
分别取实施例1所得P5代经无血清驯化培养细胞、实施例10所得P5代有血清培养的间充质干细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，观察驯化培养过程中细胞表面标志的变化是否与常规培养产生差异。具体实施方式如下：消化收集P5代无血清驯化后的MSC细胞及常规培养MSC细胞，计数后取8×106个细胞，分装16管；PBS洗一次，1500rpm离心10min；弃上清，残留100～200μL，吹打混匀细胞；加入FITC标记的CD73抗体10μL、PerCP-Cy5.5标记的CD90抗体10μL、PerCP-Cy5.5标记的CD105抗体10μL、PE标记的HLA-DR抗体10μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应30min；PBS洗一次，1500rpm离心10min；直接标记的细胞弃上清，加入200μL的PBS吹打混匀细胞，200μL的1%多聚甲醛固定，置4℃待测，3天内上流式细胞仪检测。
结果如图4所示。从图中结果可见，无血清驯化培养细胞与有血清培养细胞的流式细胞表型结果一致。
参照本试验例5的方法，对实施例2~6的5种检测细胞、实施例7的6种检测细胞、实施例81的检测细胞、实施例91的检测细胞进行检测，与图4结果基本相同，显示这些无血清驯化培养细胞均与有血清培养细胞的流式细胞表型结果一致，表明通过本发明实施例1~9无血清驯化培养方法所得间充质干细胞，呈现优良的细胞性能。
另外，在补充的实施例a中，参照实施例1的方法，不同的仅是，将其中转铁蛋白浓度改为8ng/mL、胰岛素浓度改为12ng/mL，或者将其中转铁蛋白浓度改为12ng/mL、胰岛素浓度改为8ng/mL，得到分别称为补a1和补a2的两种P5代无血清驯化培养的间充质干细胞；另外，在补充的实施例b中，参照实施例71的方法，不同的仅是，将其中3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇浓度改为0.08mg/mL、硫酸镁以镁离子计浓度改为6µg/mL，或者将其中3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇浓度改为0.12mg/mL、硫酸镁以镁离子计浓度改为4µg/mL，得到分别称为补b1和补b2的两种P5代无血清驯化培养的间充质干细胞。此四种细胞经试验例1~5的方法测定，补a1和补a2两种细胞各项参数的试验结果与实施例1之P5细胞基本一致，补b1和补b2两种细胞各项参数的试验结果与实施例71之P5细胞基本一致，例如补a1细胞的早期凋亡细胞比例为23.7%、晚期凋亡/死亡细胞比例为14.6%。
本发明实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管；
(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL；
(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃ 5% CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，每次补加3-4mL的MSC完全培养基，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化；
(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞；
(5)将P0代细胞沉淀用含7~9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃ 5% CO2培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的MSC驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞；
(6)重复步骤(5)的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度的MSC驯化培养基进行处理，随着细胞代次增加至P4~P10代之间的任一代时，使胎牛血清在MSC驯化培养基中的浓度降至0%，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代；
其中，
所述MSC完全培养基是含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基；
所述MSC驯化培养基由以下组分组成：转铁蛋白8~12ng/mL、胰岛素8~12ng/mL、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.08~0.12mg/mL、硫酸镁以镁离子浓度计4~6µg/mL、0~9.5%胎牛血清、平衡量的DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1的方法，其中所述组织清洗液是含1%青霉素、1%链霉素的0.9%生理盐水溶液。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，加入胰蛋白酶溶液后，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶充分覆盖细胞表面，消化1min，至显微镜下观察细胞收缩成圆形，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(7)中，对步骤(6)最终所得0%胎牛血清体外驯化培养的间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代，继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞。
5.根据权利要求1的方法，其中所述MSC驯化培养基由以下组分组成：转铁蛋白10ng/mL、胰岛素10ng/mL、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.1mg/mL、硫酸镁以镁离子浓度计5µg/mL、0~9.5%胎牛血清、平衡量的DMEM/F12培养基。
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