CN106906181A - 一种用于培养人脐带间充质干细胞的培养基 - Google Patents

一种用于培养人脐带间充质干细胞的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于培养脐带间充质干细胞的培养基。本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，由无血清基本培养基和添加成分组成；所述添加成分为人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和细胞因子组合；所述细胞因子组合为表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、IL‑3和IL‑6。本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基在促进细胞增殖方面达到甚至优于含血清培养基或其他无血清培养基的效果，并支持细胞的长期传代培养。

Description

一种用于培养人脐带间充质干细胞的培养基
技术领域
本发明属于细胞培养领域，涉及一种用于培养人脐带间充质干细胞的培养基。
背景技术
人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一类在早期发育过程中除造血干细胞以外具备全能细胞特点的另一类多能干细胞，具有自我更新、多向分化潜能，可以通过调节机体免疫，在脊髓损伤、糖尿病足以及免疫性疾病中得到广泛应用。人脐带间充质干细胞由于来源广泛，取材方便，对供着无不利影响，且不涉及伦理道德限制问题，具备广泛的临床应用前景。
目前已有的多种干细胞培养基，多为通用型干细胞培养基，并不仅用于单一特定的干细胞培养，多用于各种类干细胞培养。然而由于各类干细胞来源广泛，不同干细胞品种培养所需营养条件不尽相同，如果通用培养基无法满足单一类型干细胞的生长需求，可能引起该种类干细胞存活率降低，生长受抑，增殖缓慢，细胞形态和生物学性状等的改变，进而无法满足干细胞的临床应用需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于培养脐带间充质干细胞的培养基。解决现有培养基培养脐带间充质干细胞存在的分离获得的原代脐带间充质干细胞存活率降低，增殖缓慢，细胞形态和生物学性状等易发生改变，无法满足干细胞的临床应用需求的问题。
本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，由无血清基本培养基和添加成分组成；所述添加成分为人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和细胞因子组合；所述细胞因子组合为表皮细胞生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、IL-3和IL-6。
根据需要，本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基可以由以液体形式存在的所述无血清基本培养基和以固体形式存在的所述添加成分构成，也可以是向以液体形式存在的所述无血清基本培养基中添加了所述添加成分后形成的液体培养基。
在所述添加成分中，所述人胰岛素、所述人血清白蛋白、所述转铁蛋白和所述细胞因子组合的质量配比可为(2-10)μg：(0.1-1)mg：(2-10)μg：(6-110)ng。
在本发明的一个实施例中，所述添加成分中，所述人胰岛素、所述人血清白蛋白、所述转铁蛋白和所述细胞因子组合的质量配比具体为5μg：0.5mg：5μg：56ng。
在所述细胞因子组合中，所述表皮细胞生长因子、所述血小板衍生生长因子、所述IL-3和所述IL-6的质量配比可为(1-5)：(1-5)：(2-50)：(2-50)。
在本发明的一个实施例中，所述细胞因子组合中，所述表皮细胞生长因子、所述血小板衍生生长因子、所述IL-3和所述IL-6的质量配比具体为3：3：20：30。
当本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基为向以液体形式存在的所述无血清基本培养基中添加了所述添加成分后形成的液体培养基时，所述培养基中，所述人胰岛素的浓度可为2-10μg/mL；所述人血清白蛋白的浓度可为0.1-1mg/mL；所述转铁蛋白的浓度可为2-10μg/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度可为1-5ng/mL；所述血小板衍生生长因子的浓度可为1-5ng/mL；所述IL-3的浓度可为2-50ng/mL；所述IL-6的浓度可为2-50ng/mL。
在本发明的一个实施例中，所述培养基中，所述人胰岛素的浓度具体为5μg/mL；所述人血清白蛋白的浓度具体为0.5mg/mL；所述转铁蛋白的浓度具体为5μg/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度具体为3ng/mL；所述血小板衍生生长因子的浓度具体为3ng/mL；所述IL-3的浓度具体为20ng/mL；所述IL-6的浓度具体为30ng/mL。
所述无血清基本培养基可选自如下中任一：α-MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基、IMDM培养基、IMDM/F12培养基。其中，以所述α-MEM培养基为最优选。
在本发明的一个实施例中，所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基具体为向所述α-MEM培养基中加入终浓度为5μg/mL的人胰岛素、终浓度为0.5mg/mL的人血清白蛋白、终浓度为5μg/mL的转铁蛋白、终浓度为3ng/mL的表皮细胞生长因子(EGF)、终浓度为3ng/mL的血小板衍生生长因子(PDGF)、终浓度为20ng/mL的IL-3和终浓度为30ng/mL的IL-6后得到的培养基。
本发明还保护所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基的制备方法。
本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基的制备方法，具体包括如下(A)或(B)的步骤：
(A)将以液体形式存在的所述无血清基本培养基单独包装，得到包装A；将以固体形式存在的组成所述添加成分中的各物质按照前文所述的质量配比混合并包装，得到包装B；所述包装A和所述包装B即构成所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基。
(B)向以液体形式存在的所述无血清基本培养基中添加所述添加成分，使组成所述添加成分中的各物质在所述培养基中的浓度为前文所述的浓度，即得到所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基。
另外，所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围。
(a)培养脐带间充质干细胞；
(b)提高脐带间充质干细胞的增殖能力；
(c)提高脐带间充质干细胞的分化能力；
(d)提高脐带间充质干细胞的分化成脂能力；
(e)提高脐带间充质干细胞的分化成骨能力。
在本发明中，最初被培养的所述脐带间充质干细胞优选为原代脐带间充质干细胞。
在本发明中，所述脐带间充质干细胞具体为人脐带间充质干细胞。
实验证明，本发明所提供的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基，通过在无血清培养基基础上添加表皮细胞生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、IL-3和IL-6，各类因子低浓度联合应用可起到协同促进MSC的增殖作用，并延缓MSC在培养过程中的老化现象，使MSC在传到第15代以上时，仍可以保持较好的增殖及分化能力，保持原有的间充质干细胞特性，特别是在促进细胞增殖方面达到甚至优于含血清培养基或其他无血清培养基的效果。另外，本发明提供的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基不含外源性血清，极大地避免了含血清培养基由于所添加血清批次间不稳定，或可能由于含有的异源性蛋白引起细胞毒性等的风险。
与传统的含血清培养基和其他无血清培养基相比，本发明提供的培养基的优势在于：无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞增殖速率高，且保持了良好的干细胞幼稚形态和特性，并具有良好的细胞诱导分化潜能，降低了成本。
附图说明
图1为人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养得到的细胞增殖能力比较结果。
图2为人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成脂诱导分化潜能和成骨诱导分化潜能比较结果。
图3为人脐带间充质干细胞在本发明实施例1制备的培养基中长期培养后细胞表型检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
α-MEM培养基：Hyclone公司产品，其产品目录号为SH30265.01B。
人胰岛素：Sigma公司产品，其产品目录号为I3536。
人血清白蛋白：Sigma公司产品，其产品目录号为A9731。
转铁蛋白：Sigma公司产品，其产品目录号为T8158。
表皮细胞生长因子(EGF)：R&D公司产品，其产品目录号为#.236-EG。
血小板衍生生长因子(PDGF-BB)：R&D公司产品，其产品目录号为#220-BB。
IL-3：R&D公司产品，其产品目录号为#203-IL。
IL-6：R&D公司产品，其产品目录号为#206-IL。
实施例1、本发明用于培养人脐带间充质干细胞的培养基的制备
本发明所提供的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基，由无血清基本培养基和添加成分组成；所述添加成分为人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和细胞因子组合；所述细胞因子组合为表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、IL-3和IL-6。其具体制备过程如下：
向无血清基本培养基——α-MEM培养基中加入人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、IL-3和IL-6，使人胰岛素的终浓度为5μg/mL、人血清白蛋白的终浓度为0.5mg/mL、转铁蛋白的终浓度为5μg/mL、表皮细胞生长因子的终浓度为3ng/mL、血小板衍生生长因子的终浓度为3ng/mL、IL-3的终浓度为20ng/mL、IL-6的终浓度为30ng/mL，即得到本发明用于培养人脐带间充质干细胞的培养基。
实施例2、人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养得到的细胞增殖能力比较
一、人脐带间充质干细胞的获得及检测
本发明所用人脐带间充质干细胞来源于足月妊娠分娩胎儿脐带(捐赠者知情且同意)。对P1代(即原代)人脐带间充质干细胞进行ABO/RH血型分型、HLA分型、微生物学检测，HIV，HBV，HCV，TP检测，以上各指标的检测结果均为阴性。
二、供试培养基
培养基-I：本发明实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基。
培养基-II：α-MEM培养基+10％体积百分比的FBS。
培养基-III：市售无血清培养基(StemPro MSC SFM人间充质干细胞无血清培养
基)，Invitrogen公司产品，货号A10332-01。
三、比较人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养得到的细胞增殖能力
将P1代(即原代)hUC-MSCs以5000个/ml的密度接种到T25培养瓶中，接种5mL，分别用培养基-I、培养基-II和培养基-III培养，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至80％～90％汇合度时加入含0.25％(体积百分含量)Trypsin和0.04％(体积百分含量)EDTA的消化液进行消化，计算细胞量，然后以5000个/ml的密度再次传代培养，直至第9代，根据每个代次的细胞数量，计算每代的平均细胞群体倍增数目(Cumulative PopulationDoublings，CPDs)，绘制细胞群体倍增曲线。
CPDs＝lg(培养后细胞计数/培养前细胞计数)/lg2
结果如图1所示，由图可见：培养基-I培养的细胞增殖速率显著大于其他两类培养基(培养基-II与培养基-III)。这说明本发明实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基能够提高细胞的增殖能力。
实施例3、人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成脂诱导分化潜能比较
一、人脐带间充质干细胞的获得及检测
同实施例2。
二、供试培养基
同实施例2。
三、比较人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成脂诱导分化潜能
将P1代(即原代)hUC-MSCs以5000个/ml的密度接种到T25培养瓶中，接种5mL，分别用培养基-I、培养基-II和培养基-III培养，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至80％～90％汇合度时加入含0.25％(体积百分含量)Trypsin和0.04％(体积百分含量)EDTA的消化液进行消化，计算细胞量，然后以5000个/ml的密度再次传代培养，直至第9代。将P9代人脐带间充质干细胞以4×104细胞/孔，分别接种入12孔培养板中，待24h后细胞完全贴壁后，换以成脂肪诱导分化培养基(Life Tecnology公司产品，货号A10070-01)，每3天换液一次，第21天时用油红O进行成脂鉴定。
结果如图2所示，由图可见：培养基-I所培养的细胞其成脂分化潜能明显优于培养基-II和培养基-III。这说明本发明实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基能够提高细胞的分化成脂能力。
实施例4、人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成骨诱导分化潜能比较
一、人脐带间充质干细胞的获得及检测
同实施例2。
二、供试培养基
同实施例2。
三、比较人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成骨诱导分化潜能
将P1代(即原代)hUC-MSCs以5000个/ml的密度接种到T25培养瓶中，接种5mL，分别用培养基-I、培养基-II和培养基-III培养，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至80％～90％汇合度时加入含0.25％(体积百分含量)Trypsin和0.04％(体积百分含量)EDTA的消化液进行消化，计算细胞量，然后以5000个/ml的密度再次传代培养，直至第5代。将P5代人脐带间充质干细胞以4×104细胞/孔，分别接种入12孔培养板中，待24h后细胞完全贴壁后，换以成骨诱导培养基培养(Life Tecnology公司，货号A10072-01)，每3天换液一次，分别取培养后第14、28天，做碱性磷酸酶钙钴法染色和钙Von Kossa染色，确认骨组织形成。
结果如图2所示，由图可见：培养基-I所培养的细胞其成骨分化潜能优于培养基-II和培养基-III。这说明本发明实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基能够提高细胞的分化成骨能力。
实施例5、人脐带间充质干细胞在本发明实施例1制备的培养基中长期培养后细胞表型检测
一、人脐带间充质干细胞的获得及检测
同实施例2。
二、检测人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的细胞表型
将P1代(即原代)hUC-MSCs以5000个/ml的密度接种到T25培养瓶中，接种5mL，用实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基进行培养，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至80％～90％汇合度时加入含0.25％(体积百分含量)Trypsin和0.04％(体积百分含量)EDTA的消化液进行消化，计算细胞量，然后以5000个/ml的密度再次传代培养，直至第15代。
分别将P1代(即原代)hUC-MSCs和P15代hUC-MSCs经PBS洗涤2～3遍后加入含0.25％(体积百分含量)Trypsin和0.04％(体积百分含量)EDTA的消化液进行消化，1000r/min离心5min，调整细胞浓度，制成浓度为105个/mL的单细胞悬液，加入10μL特异性抗体(分别为用于检测CD45、CD34、CD44和CD90的抗体)，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤2～3遍，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，然后上流式细胞仪检测。
结果如图3所示，由图可见：流式检测结果显示该脐带MSC P1代细胞CD34-CD44+的表达率为96.9％，CD45-CD90+的表达率高达97.6％；而脐带MSC P15代细胞CD34-CD44+的表达率为94.1％，CD45-CD90+的表达率为95.4％。结果表明，P15代的细胞表面标记的表达率，与P1代细胞的表达率相比，并无明显的改变，均为较高水平的表达。这说明采用本发明实施例1制备的用于培养人脐带间充质干细胞的培养基培养的人脐带间充质干细胞经过15次传代培养，能够很好的维持细胞生物学特性不变。

Claims (10)

1.一种用于培养脐带间充质干细胞的培养基，由无血清基本培养基和添加成分组成；
所述添加成分为人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和细胞因子组合；
所述细胞因子组合为表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、IL-3和IL-6。
2.根据权利要求1所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述添加成分中，所述人胰岛素、所述人血清白蛋白、所述转铁蛋白和所述细胞因子组合的质量配比为(2-10)μg：(0.1-1)mg：(2-10)μg：(6-110)ng。
3.根据权利要求2所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述添加成分中，所述人胰岛素、所述人血清白蛋白、所述转铁蛋白和所述细胞因子组合的质量配比为5μg：0.5mg：5μg：56ng。
4.根据权利要求1-3中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述细胞因子组合中，所述表皮细胞生长因子、所述血小板衍生生长因子、所述IL-3和所述IL-6的质量配比为(1-5)：(1-5)：(2-50)：(2-50)。
5.根据权利要求4中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述细胞因子组合中，所述表皮细胞生长因子、所述血小板衍生生长因子、所述IL-3和所述IL-6的质量配比为3：3：20：30。
6.根据权利要求1-5中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述培养基中，所述人胰岛素的浓度为2-10μg/mL；所述人血清白蛋白的浓度为0.1-1mg/mL；所述转铁蛋白的浓度为2-10μg/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为1-5ng/mL；所述血小板衍生生长因子的浓度为1-5ng/mL；所述IL-3的浓度为2-50ng/mL；所述IL-6的浓度为2-50ng/mL。
7.根据权利要求6所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述培养基中，所述人胰岛素的浓度为5μg/mL；所述人血清白蛋白的浓度为0.5mg/mL；所述转铁蛋白的浓度为5μg/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为3ng/mL；所述血小板衍生生长因子的浓度为3ng/mL；所述IL-3的浓度为20ng/mL；所述IL-6的浓度为30ng/mL。
8.根据权利要求1-7中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述无血清基本培养基选自如下中任一：α-MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基、IMDM培养基、IMDM/F12培养基。
9.权利要求1-8中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基的制备方法，包括如下(A)或(B)的步骤：
(A)将以液体形式存在的所述无血清基本培养基单独包装，得到包装A；将以固体形式存在的组成所述添加成分中的各物质按照权利要求2-5任一中所述的质量配比混合并包装，得到包装B；所述包装A和所述包装B即构成所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基；
(B)向以液体形式存在的所述无血清基本培养基中添加所述添加成分，使组成所述添加成分中的各物质在所述培养基中的浓度为权利要求6或7中所述的浓度，即得到所述用于培养脐带间充质干细胞的培养基。
10.权利要求1-8中任一所述的用于培养脐带间充质干细胞的培养基在如下任一中的应用：
(a)培养脐带间充质干细胞；
(b)提高脐带间充质干细胞的增殖能力；
(c)提高脐带间充质干细胞的分化能力；
(d)提高脐带间充质干细胞的分化成脂能力；
(e)提高脐带间充质干细胞的分化成骨能力。
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