CN102827810A - 一种无动物源的脐血干细胞无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，公开了一种无动物源的无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、植物血凝素PHA、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、IL-3、SCF、Fit3-L、IL-6、G-CSF。本发明所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养脐血干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常，具有良好的工业应用前景。

Description

一种无动物源的脐血干细胞无血清培养基

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种化学成分明确、无动物源的脐血干细胞无血清培养基。

背景技术

脐血作为一种可替代干细胞来源，含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。脐血干细胞是近年发现的一类具有与骨髓干细胞、外周血干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞。脐血干细胞具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。作为骨髓及外周血干细胞的替代物，脐血干细胞可重建骨髓造血及免疫，用于治疗骨髓衰竭、恶性及非恶性血液病、某些遗传病、重型免疫缺陷等疾病。

与骨髓和外周血相比，脐血作为移植来源具有很多优势，首先，脐血中原始干/祖细胞的比例高于骨髓和动员的外周血；其次减少了移植中病毒性疾病的传播，并且降低了移植物抗宿主病（GVHD）的发生率；另外，脐血来源广泛，采集方便，所以近年来有关脐血干细胞移植的研究越来越广泛。但是由于单份脐血量少，一般为60～80mL左右，只能满足较小儿童移植的需要，因此人们希望通过体外培养来增加脐血干/祖细胞的数量以满足较大儿童和成人移植的需要。

目前国内外对于脐血干细胞的扩增体系主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清（FBS）。尽管欧洲等允许使用FBS，但中国、美国等国家严禁在细胞治疗中使用动物源成分。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明干细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/10⁸cells)，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。当前已有一些公司开发新一代无血清培养基．如Invitrogen开发

无血清培养基、Lonza开发的X-VIVO无血清培养基和加拿大stemcell公司开发了

无血清培养基等。

这些无血清培养基化学成分不确定，且价格昂贵，难以保证培养基批次间的一致性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种无血清培养基，其必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、碳酸氢钠3.024g/L、重组人胰岛素1-10mg/L、人转铁蛋白5-20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、植物血凝素PHA 1-5ug/ml、脂质0.1-1mg/ml、氨基酸1-10g/l、维生素1-10mg/ml、微量元素1-5mg/ml、IL-31-10ng/ml、SCF 100ng/ml、Fit3-L 100ng/ml、IL-610-20ng/ml、G-CSF 1-10ng/ml。

更优选地，本发明所述无血清培养基其必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺5mM、碳酸氢钠3.024g/L、丙酮酸钠110mg/L、重组人胰岛素10mg/L、人转铁蛋白10mg/L、重组人白蛋白4g/L、2-巯基乙醇55nM、植物血凝素PHA 2ug/ml、脂质0.5mg/ml、氨基酸5g/l、维生素8mg/ml、微量元素2mg/ml、IL-37ng/ml、SCF 100ng/ml、Fit3-L100ng/ml、IL-620ng/ml、G-CSF 10ng/ml。

作为优选，本发明所述无血清培养基还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂10-20mg/L、F-68100-500mg/L、TPO 1-10ng/ml、GM-CSF 1-10ng/ml、IL-111-10ng/ml。

更优选地，本发明所述无血清培养基包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂15mg/L、

F-68100mg/L、TPO 2ng/ml、GM-CSF10ng/ml、IL-111ng/ml。

用本发明提供无动物源的无血清培养基与有血清培养基以及X-VIVO无血清培养基培养脐血干细胞，结果显示，其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子没有统计学差异，而且避免了动物成分和批次的不稳定性。

本发明还提供所述无血清培养基在培养脐血干细胞中的应用。

本发明提供了的化学成分明确、无动物源、无血清培养基是目前培养脐血肝细胞最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其次是培养基性质明确，有助于进一步研究脐血干细胞扩增过程中细胞因子的分泌情况。移植的脐血干细胞通过多种细胞因子与微环境相互作用以达到彼此适应，微环境中基质细胞产生细胞因子对移植后干细胞的趋化、归巢、活化及存活均起着重要的作用。而且培养基无动物源成分，可以避免在细胞培养的过程中引入动物成分，干扰细胞生长。

附图说明

图1为本发明所述培养基和X-VIVO无血清培养基培养脐血干细胞细胞形态图；

图2示本发明所述培养基和X-VIVO无血清培养基培养脐血干细胞细胞总数；

图3为本发明所述培养基和X-VIVO无血清培养基培养脐血干细胞细胞表型图；

图4示本发明所述培养基和X-VIVO无血清培养基培养脐血干细胞分泌细胞因子；

图5示本发明所述培养基和X-VIVO无血清培养基脐血干细胞软琼脂克隆形成实验结果。

具体实施方式

本发明公开了一种无动物源的脐血干细胞无血清培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的无动物源的脐血干细胞无血清培养基及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：培养基的配制

重组人胰岛素储存液的配制：称取100mg重组人胰岛素溶于40ml注射用水中，滴加2M HCl至重组人胰岛素完全溶解，定容至50ml，配制成20mg/ml的储存液，4℃保存。

人人转铁蛋白储存液的配制：称取100mg人人转铁蛋白溶于40ml注射用水中，至完全溶解后定容至50ml，配制成20mg/ml的储存液，4℃保存。

本发明所述培养基SFM成分如下：

更优选地，本发明所述培养基SFM成分如下：

上表中所述氨基酸是L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸的混合物;

所述维生素包含泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺。

所述脂质包含花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸;

所述微量元素为Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ba、K的混合物。

用pH计调节培养基PH在7.2-7.4之间，渗透压在260-320mOsm/kg之间，内毒素检测<0.25EU/ml，0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存。

实施例2：脐血分离

脐血来源：脐血来自北京武警医院产科妊娠足月正常分娩的产妇，按卫生部颁布的《献血体检标准》检验合格，于第3产程自脐静脉消毒后全封闭采集脐血，肝素抗凝，平均采量80～130ml。分离过程如下：

1：将新鲜脐血和缓冲液PBS按1:1体积比稀释后，沿试管壁缓慢加至分离液Ficoll上层。注意保持两界面清晰，勿使血液混入分离液内。

2：1800rpm离心15min，用毛细吸管轻轻插入白色雾状层（从上向下数第二层），沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。

3：将所得的单个核细胞悬液用一倍体积的PBS洗涤，1500rpm离心10min，洗涤3遍。

4：计数细胞，调整细胞至所需的浓度，按照1～5×10⁶/ml的密度进行接种，培养在孔板或者培养瓶中。

实施例3：细胞培养

分别用本发明实施例1制备的培养基SFM、Lonza开发的无血清培养基X-VIVO培养脐血干细胞，显微镜下观察细胞形态，见图1，结果显示在3天时，X-VIVO无血清培养基培养的脐血干细胞悬浮细胞为圆形，有很多贴壁细胞呈梭形，细胞密度高于本发明提供的无血清培养基（SFM），但在12天和18天时，两种无血清培养基的脐血干细胞形态呈圆形，均一性高。

培养每三天后在1000rpm离心10min，进行半量换液，台盼蓝染色计细胞数，结果见图2，显示在3天时，X-VIVO无血清培养基培养的脐血干细胞总数多于本发明提供的无血清培养基，但在6天以后，本发明提供的无血清培养基培养脐血干细胞总数要高于X-VIVO无血清培养基。

实施例4：细胞表型变化检测

CD34+标记阳性为造血干细胞；CD3+CD8+为效应性T细胞；CD3+CD4+为辅助性T细胞；CD3+CD56-为T细胞；CD3-CD56+为NK细胞；CD4+CD25+为调节性T细胞；CD19+为B细胞及前体细胞。

采用流式细胞仪分别测定培养18天后脐血干细胞中CD34+、CD56+CD3-、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD56-CD3+、CD19+的表达。取培养18天的脐血干细胞，加入荧光抗体20μl，混合后用流式细胞仪检测，以Cell Quest软件分析，设一管对照，结果见图3。

结果显示，在18天后，本发明实施例1提供的无血清培养基培养脐血干细胞中造血干细胞、效应性T细胞、调节性T细胞扩增倍数高于X-VIVO无血清培养基。而T细胞扩增倍数要低于X-VIVO无血清培养基。辅助性T细胞、NK细胞、B细胞及前体细胞扩增倍数与X-VIVO无血清培养基无统计学差异。

实施例5：细胞因子含量测定

培养上清中IL-4、TNF-α和IFN-γ均采用双抗体夹心ELISA法检测，严格按试剂盒(均为北京欣博盛公司提供)说明书操作。均设2个复孔，并设空白及阴性对照孔。稀释浓度和步骤按方法说明。终止反应后即用自动酶标仪测定492nm处的吸光度(A)值。以标准品稀释浓度的对数值为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线，由样品的A值查出相应的细胞因子含量，结果见图4。

图4显示，移植的脐血干细胞通过多种细胞因子与微环境相互作用以达到彼此适应，细胞因子可以通过影响微环境来调节移植的脐血干细胞的功能。研究显示，脐血干细胞细胞产生白细胞介素4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子在脐血干细胞移植治疗免疫缺陷疾病及恶性肿瘤等疾病发挥重要的作用。结果显示，本发明实施例1所述培养基SFM、Lonza开发的无血清培养基X-VIVO培养细胞上清液分泌IL-4、TNF-α和IFNγ没有统计学差异。实施例6：脐血干细胞的致瘤性实验

根据《中国生物制品规程》进行软琼脂克隆形成实验。用含本发明实施例1提供的培养基SFM、Lonza开发的无血清培养基X-VIVO的0.5％琼脂铺于24孔板作为底层琼脂；将两种无血清培养基增殖的脐血干细胞及HL60细胞分别重悬于含各自培养基的0.33％琼脂中，均匀接种在底层琼脂上，每天观察1次，连续观察3周，结果见图5。

图5软琼脂克隆形成实验显示：HL60细胞组每孔可见数个克隆，两种无血清培养基培养的脐血干细胞散在分布，而未见克隆形成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种无血清培养基，其必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、碳酸氢钠3.024g/L、重组人胰岛素1-10mg/L、人转铁蛋白5-20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、植物血凝素PHA 1-5ug/ml、脂质0.1-1mg/ml、氨基酸1-10g/l、维生素1-10mg/ml、微量元素1-5mg/ml、IL-31-10ng/ml、SCF 100ng/ml、Fit3-L 100ng/ml、IL-610-20ng/ml、G-CSF 1-10ng/ml。

2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，其必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺5mM、碳酸氢钠3.024g/L、丙酮酸钠110mg/L、重组人胰岛素10mg/L、人转铁蛋白10mg/L、重组人白蛋白4g/L、2-巯基乙醇55nM、植物血凝素PHA 2ug/ml、脂质0.5mg/ml、氨基酸5g/l、维生素8mg/ml、微量元素2mg/ml、IL-37ng/ml、SCF 100ng/ml、Fit3-L100ng/ml、IL-620ng/ml、G-CSF 10ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂10-20mg/L、

F-68

100-500mg/L、TPO 1-10ng/ml、GM-CSF 1-10ng/ml、IL-111-10ng/ml。

4.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂15mg/L、

F-68100mg/L、TPO2ng/ml、GM-CSF 10ng/ml、IL-111ng/ml。

5.权利要求1-4任一项所述无血清培养基在培养脐血干细胞中的应用。

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