CN112375733B - 可增进间充质干细胞干细胞性的植物血凝素及其在间充质干细胞扩增培养中的应用 - Google Patents

可增进间充质干细胞干细胞性的植物血凝素及其在间充质干细胞扩增培养中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新型可增进骨髓间充质干细胞(Bone‑marrow‑derived mesenchymal stem cells,BM‑MSCs)干细胞性和增殖效率的糖类化合物以及其联合无血清培养基的扩增培养方法。本发明提供的糖类化合物为植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)。将继代培养的BM‑MSCs(BGJb+15％FCS)培养于添加PHA的培养基PHA+BGJb+15％FCS中，以增进BM‑MSCs的干细胞性，再将PHA+BGJb+15％FCS中培养的BM‑MSCs经过消化后转入PHA+无血清ZEzh培养基中短期培养，以增进BM‑MSCs扩增效率和临床疗效，从数量和质量上均可达到临床要求。

Description

可增进间充质干细胞干细胞性的植物血凝素及其在间充质干 细胞扩增培养中的应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及可增进间充质干细胞干细胞性的小分子化合物--植物血凝素及其在间充质干细胞扩增培养中的应用。
背景技术
现有国内外大量研究表明，体外培养获取的哺乳类动物BM-MSCs具有多向或跨胚层分化潜能，可分化为多种用于修复的功能细胞，例如分化为肝、胆、胰、肺、肾、软骨、脑、视网膜、肠、脾、血液、皮肤等功能细胞。说明BM-MSCs在适当培养环境下，可被诱导多向功能分化，进而促进修复再生。目前已有临床案例证明，移植BM-MSCs到患者体内，可成功用于修复损伤性疾病，如用于诱导损伤肝再生[1]、骨缺损再生[2]和梗塞心肌再生[3]等，尤其在治疗移植物抗宿主反应(Graft-Versus-Host-Reaction GVHR)方面效果甚佳[4]。由于具有BM-MSCs体外培养成熟技术，免疫调节和促进内源性修复等特性，故BM-MSCs成为治疗各种疾病的优选细胞。在细胞治疗和组织工程上拥有越来越广阔的应用前景。然而，目前无论是学术界还是临床研究在BM-MSCs培养和临床应用方面存在的难题：临床所需BM-MSCs的高剂量性，BM-MSCs临床治疗通常需要约109个左右高剂量细胞,体外培养一次性获取此剂量成本较高。如果采用干细胞库中冻存复苏的BM-MSCs，因需含特殊成分培养基保持细胞活性和后期使用所需剂量，成本更高；动物源性血清培养BM-MSCs的必须性，为满足细胞分化所需要的必要营养，目前学术界体外培养BM-MSCs均需要胎牛或小牛血清((FCS或FBS)，而小(肽)牛血清为动物源性，其异源和未知毒性限制了临床应用。因此，在培养中寻找既能提高BM-MSCs扩增效率，同时又不改变BM-MSCs干细胞特性的无害有效化合物增进培养效果，成为临床需求的关键。
培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，如基础培养基加适量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞包括BM-MSCs培养需求。无血清培养基是不需要添加血清即可维持干细胞体外长时间生长的合成培养基，其工作基础是用合适的无害有效成分如激素、营养物和相关物质的组合置换培养基的成分。例如在无血清培养基中添加细胞因子如IL-3，SCF，Fit3-L，IL-6等[1，2]，营养蛋白如白蛋白，人转铁蛋白等[3，4]和血小板替代品[5]等技术。在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清培养的不均一性。
因此，改进BM-MSCs培养方法，提高BM-MSCs的扩增效率，同时增进体外连续传代的间充质干细胞的干细胞性，克服血清的影响，是达到治疗需要的关键。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种同时增进继代中间充质干细胞干细胞性及扩增效率，并消除异源血清影响的间充质干细胞扩增培养方法。
为达到上述目的，本发明提供植物血凝素PHA在间充质干细胞扩增培养中的应用。
进一步，植物血凝素PHA在间充质干细胞扩增培养中增进其干细胞性的应用，所述应用是将植物血凝素PHA添加于间充质干细胞继代培养基中，将间充质干细胞培养于所述培养基中，所述植物血凝素PHA在所述培养基中的质量百分比含量为：0.5-1％。
进一步，植物血凝素PHA在间充质干细胞扩增培养中增进间充质干细胞扩增效率的应用，所述应用是将植物血凝素PHA添加于间充质干细胞增殖培养基中，将间充质干细胞培养于所述培养基中，所述植物血凝素PHA在所述培养基中的质量百分比含量为：0.5-1％。
进一步，所述继代培养基为添加20％小牛血清FCS的BGjb培养基。
进一步，所述增殖培养基为ZEzh培养基，所述ZEzh培养基包括如下成分：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。
进一步，所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B12 0.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191-0.196mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4490-4504mg/L和丙酮酸钠23-27mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2593-2604mg/L；所述指示剂为：酚红7.8-8.5mg/L。
进一步，所述间充质干细胞为哺乳类动物骨髓间充质干细胞。
进一步，所述间充质干细胞为体外连续传代的哺乳类动物骨髓间充质干细胞。
进一步，将继代培养于PHA+BGJb+15％FCS培养基中的BM-MSCs经过胰酶/EDTA消化液消化后转入所述PHA+ZEzh培养基进行24小时培养以增进其干细胞性和扩增效率，所述的培养为在37℃，5％CO2培养箱中进行，所述培养的接种密度为1-1.5×106/瓶。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现PHA+BGJb+15％FCS培养基在增进BM-MSCs扩增效率和干细胞性中的作用，其增殖效率达到约4-5倍，细胞干细胞性提升约10倍左右。
本发明首次发现一种PHA+无血清ZEzh培养基在提升BM-MSCs扩增效率中的作用，其增殖效率达到约66倍，可完全满足临床需求。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为在常规BGJb+15％FCS培养基(O)中，从原代(P0)到传代(P1-P6培养的哺乳类动物BM-MSCs照片(20×)；
图2为在BGJb+15％FCS培养基(O)中培养的BM-MSCs表面标志物照片；
图3为在BGJb+15％FCS培养基(O)和PHA+BGJb+15％FCS培养基(A)中培养的BM-MSCs对比照片(20×)；
图4为BM-MSCs在BGJb+15％FCS培养基(O)和PHA+BGJb+15％FCS培养基(A)中干性(增殖和分化实验)对比的曲线图和照片；
图5为BM-MSCs在PHA+BGJb+15％FCS培养基(A)中培养，以及消化获取的BM-MSCs在PHA+无血清BGJb培养基(B)中培养24h和在PHA+无血清ZEzh培养基(C)中培养24h的对比照片(20×)；其中：C与A对此；C与B对比；
图6为BM-MSCs在PHA+BGJb+15％FCS培养基(A)中培养，以及消化获取的BM-MSCs在PHA+无血清BGJb培养基(B)中培养24h和在PHA+无血清ZEzh培养基(C)中培养24h增殖效率对比的柱状图；其中：C与A对此；C与B对比；
其中：O指示BGJb+15％FCS培养基；A指示PHA+BGJb+15％FCS培养基；B指示PHA+无血清BGJb培养基；C指示PHA+无血清ZEzh培养基。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1：配制BGJb培养基：
按照如下成分含量：甘氨酸(800mg/L)、L-丙氨酸(250mg/L)、L-精氨酸(175mg/L)，L-天冬氨酸(150mg/L)，L-半胱氨酸(101mg/L)，L-谷氨酰胺(200mg/L)，L-组氨酸(150mg/L)，L-异亮氨酸(30mg/L)，L-亮氨酸(50mg/L)，L-赖氨酸(240mg/L)，L-蛋氨酸(50mg/L)，L-苯丙氨酸(50mg/L)，L-脯氨酸(400mg/L)，L-丝氨酸(200mg/L)，L-苏氨酸(75mg/L)，L-色氨酸(40mg/L)，L-酪氨酸二钠盐(58mg/L)和L-缬氨酸(65mg/L)；维生素C(50mg/L)，生物素(0.2mg/L)氯化胆碱(50mg/L)，泛酸钙(0.2mg/L)，DL-α-生育酚(1.0mg/L)叶酸(0.2mg/L)，烟酰胺(20mg/L)，对氨基苯甲酸(2.0mg/L)盐酸吡哆醛(0.2mg/L)，核黄素(0.2mg/L)，盐酸硫胺素(4mg/L)，维生素B12(0.04mg/L)和肌醇(0.2mg/L)；硫酸镁(98mg/L)氯化钾(400mg/L)，磷酸二氢钾(160mg/L)，碳酸氢钠(3500mg/L)，氯化钠(5300mg/L)和一水磷酸二氢钠(90mg/L)；所述碳源包括：D-葡萄糖(10000mg/L)；其他成分包括：乳酸钙(555mg/L)，乙酸钠(50mg/L)；所述指示剂为：酚红(20mg/L)。
取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.0-7.4，即得。
实施例2：配制BGJb+15％FCS培养基(O)：在实施例1配制的BGJb培养基中添加质量百分比15％的胎牛血清。
实施例3：配制PHA+BGJb+15％FCS培养基(A)：在实施例2配制的BGJb+15％FCS培养基中添加质量百分比0.8％的PHA。
实施例4：配制PHA+无血清BGJb培养基(B)：在实施例1配制的BGJb培养基中添加0.8％的PHA。
实施例5：配制ZEzh培养基：
按照如下成分含量：甘氨酸(30mg/L)、丙氨酸(2mg/L)、L-精氨酸盐酸盐(84mg/L)，L-天冬酰胺-H2O(0.83mg/L)，半胱氨酸(31.5mg/L)，L-组氨酸盐酸盐-H2O(42.0mg/L)，L-异亮氨酸(105mg/L)，L-亮氨酸(105mg/L)，L-赖氨酸盐酸盐(146mg/L)，L-蛋氨酸(30mg/L)，L-苯丙氨酸(66mg/L)，脯氨酸(7.76mg/L)，L-丝氨酸(42mg/L)，苏氨酸(95mg/L)，L-色氨酸(16mg/L)，酪氨酸(72mg/L)和缬氨酸(94mg/L)；氯化胆碱(4mg/L)，D-泛酸钙(4mg/L)，叶酸(4mg/L)，烟酰胺(4mg/L)，盐酸吡醛(4mg/L)，核黄素(0.4mg/L)，盐酸硫胺素(4mg/L)，维生素B12(0.0068)和肌醇(7.2)；氯化钙(无水)(200mg/L)，硝酸铁(0.1mg/L)，氯化镁(无水)(77.3mg/L)，氯化钾(400mg/L)，碳酸氢钠(2200mg/L)，氯化钠(4000mg/L)，磷酸二氢钠(125mg/L)和硫酸锌(0.194mg/L)；所述碳源包括：葡萄糖(4500mg/L)和丙酮酸钠(25mg/L)，所述缓冲液为：HEPES(缓冲液)(2600mg/L)；所述指示剂为：酚红(8.1mg/L)。
取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.0-7.4，即得。
实施例6：配制PHA+无血清ZEzh培养基(C)：在实施例5配制的ZEzh培养基中添加质量百分比0.8％的PHA。
实施例7：哺乳类动物BM-MSCs的原代和传代培养
1)分离骨髓组织细胞：取6-8周龄雄性或雌性C57BL/6纯系小鼠，4只/次，脱臼处死后，浸泡入75％酒精进行消毒，再在无菌条件下取后肢股骨并至于冰袋上，剪断干骺端，提取骨髓细胞。
2)199基础培养基冲洗：采用199基础培养基(Gibco，包括1％青霉素和链霉素)将股骨中骨髓细胞冲出，经过70μm筛网过滤，缓慢加至0.791g/ml的单核细胞分离液上，离心2000rpm/min，20min。取出中间膜层液(约1mL)，加199基础培养基至10mL，离心1000rpm/min，5min，弃上清后加完全培养基5ml，混匀。
3)原代培养：原代培养采用完全培养基，其包括BGJb培养基(Gibco)+20％FBS+1％双抗+0.1％抗支原体成分。将重悬细胞调整为5×105/mm接种到100mm培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，每隔2天换液1次，直至传代。
4)传代培养：当原代培养使细胞融合度大于70％-80％时，约7-14天左右可以传代。采用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化，经3次离心(1000-1200rpm/min，5min/次)后，调整细胞浓度为0.5-1×105/培养皿(100mm)，在BGJb培养基上(Gibco)进行传代后培养，直至下次传代(约7-10天左右)(参见图1)。
实施例7：传至2-4代哺乳类动物BM-MSCs在BGJb+15％FCS培养基，37℃，5％CO2培养箱中的培养(参见图1)
实施例8：传至2-4代哺乳类动物BM-MSCs在BGJb+15％FCS培养基和在PHA+BGJb+ 15％FCS培养基中分别培养(参见图3)
实施例9：传至2-4代哺乳类动物BM-MSCs在PHA+BGJb+15％FCS培养基、PHA+无血清 BGJb培养基和在PHA+无血清ZEzh培养基中分别培养(参见图5)
试验例1：BM-MSCs定性检测。采用流式细胞计数仪，检测实施例7中在BGJb+15％ FCS培养基中培养的BM-MSCs表面标志物(参见图2)
结论：传代培养中的BM-MSCs保持着BM-MSCs特性。
试验例2：实施例8中哺乳类动物BM-MSCs在BGJb+15％FCS培养基和在PHA+BGJb+ 15％FCS培养基中培养后干性对比(见图4)
消化后分别在BGJb+15％FCS和PHA+BGJb+15％FCS培养基中培养的BM-MSCs，各自分为两组，一组采用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8，Dojindo，CK04)进行增殖实验，另一组采用成骨、成脂、成软骨试剂盒(成骨试剂盒：Cyagen，MUBMX—90021；成脂肪试剂盒：Cyagen，MUBMX—90031；成软骨试剂盒：Cyagen，MUBMX—90041)进行分化实验。
结论：PHA+BGJb+15％FCS培养基对BM-MSCs的增殖和分化作用明显优于其在BGJb+ 15％FCS培养基中，对BM-MSCs的干细胞性有明显增进作用。
试验例3：实施例9中哺乳类动物BM-MSCs在(1)PHA+无血清ZEzh培养基、(2)PHA+无 血清BGJb培养基、(3)PHA+BGJb+15％FCS培养基中培养后扩增效率的对比(见图5、6)
将消化的BM-MSCs(在BGJb+15％FCS培养基中)计数后，移入PHA+无血清ZEzh培养 基，同时以其在PHA+无血清BGJb培养基中培养的BM-MSCs作为对照，观察扩增效率。
结论：培养基(1)数量明显高于培养基(2)，扩增效率高达66倍。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.植物血凝素PHA在间充质干细胞扩增培养中增进间充质干细胞扩增效率的应用，其特征在于，所述应用是将植物血凝素PHA添加于间充质干细胞增殖培养基中，将间充质干细胞培养于所述培养基中，所述植物血凝素PHA在所述培养基中的质量百分比含量为：0.5-1％；
所述增殖培养基为ZEzh培养基，所述ZEzh培养基包括如下成分：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82mg/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B120.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191-0.196mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4490-4504mg/L和丙酮酸钠23-27mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2593-2604mg/L；所述指示剂为：酚红7.8-8.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为哺乳类动物骨髓间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为体外连续传代的哺乳类动物骨髓间充质干细胞。
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