CN106834229A - 用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，由基础培养基与血清替代物组合混合构成，其基本组分包含2种糖类、22种氨基酸类、6种脂类、2种核苷类、11种维生素类、16种盐类、1种激素类、2种蛋白类以及羟乙基哌嗪乙磺酸和酚红；将本发明的血清替代物组合添加到本发明的基础培养基中可制成本发明的无血清培养基。本发明组分明确，能支持免疫杀伤细胞的体外扩增，具有高效性和稳定性；能促进生物治疗的深入研究和应用，促进免疫细胞治疗更顺利地进行，利国利民。

Description

用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基
技术领域
本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基。
技术背景
随着现代生物技术研究的长足发展，生物治疗已成为继外科手术、放射治疗、化学治疗之后治疗肿瘤的第四种方式。在肿瘤的生物治疗中，免疫细胞治疗是其重要的一环。近年来，免疫细胞治疗在临床中已显示出了其重要的应用价值。所述免疫细胞治疗，包括肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、T细胞受体基因修饰的T细胞（TCR-T）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的细胞治疗，其中，TCR-T和CAR-T的细胞治疗目前属于较为前沿的过继免疫治疗。
所述过继免疫治疗，其在实施过程中很重要的一个环节就是要通过人免疫细胞的体外扩增，使人免疫细胞数量符合临床注剂量的要求后再输给患者以达到生物治疗的目的。由于生物治疗的特殊性在于，是以人免疫细胞作为治疗药物输入患者体内的，因此，体外扩增免人疫细胞的安全性和质量的稳定性就显得尤为重要。在人免疫杀伤细胞的体外扩增过程中需要确保不能渗入任何可能会给患者生命带来安全风险的物质，例如异源病原菌和病毒。
目前，常规的细胞培养是在有血清的体系中进行的，异源血清的加入可能会增加异源感染的风险，这在临床上是绝对不允许的。使用无血清培养基，即采用血清替代物替代血清在细胞培养中的作用来进行无血清扩增，则能解决上述问题。因此，将无血清培养基用于人免疫杀伤细胞的体外扩增就显得尤为重要。由于无血清培养基相对于有血清培养体系在成分上更加明确，批次间的质量更加稳定，且易于规模化制备和管理，易于规避异源物质的干扰，因此，其质量的稳定性和使用的安全性都有大幅度的提高。
无血清培养基按其组成一般分为基础培养基和添加组分，其中，血清替代物可作为一种独立的添加组分，其提供与血清相似的作用效果，如生长因子、激素、蛋白、脂类或者微量元素等物质；而基础培养基则是提供细胞生长所必须的糖类、氨基酸类、脂类、无机盐类、微量元素和维生素类等物质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，它以所研发的血清替代物为依据，通过多次科学实验、设计与验证，逐步分析优化，最终获得了支持人免疫细胞体外高效扩增的无血清培养基；它组分明确，能支持人免疫杀伤细胞体外高效扩增，具有高效性和稳定性。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，其组分中包括糖类、氨基酸类、脂类、核苷类、维生素类、盐类、激素类、蛋白类以及羟乙基哌嗪乙磺酸和酚红；
所述糖类包括：D-葡萄糖、丙酮酸钠；
所述氨基酸类包括：L-丙氨酸、L-精氨酸·盐酸、L-天冬酰胺·水、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐合水、L-胱氨酸·二盐酸、L-谷氨酸钠、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸·盐酸·水、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·盐酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·二钠·二水、L-缬氨酸、对氨基苯甲酸；
所述脂类包括：亚油酸、氯化胆碱、乙醇胺、α-硫代甘油、亚麻酸、胆固醇；
所述核苷类包括：次黄嘌呤钠、胸苷；
所述维生素类包括：D-生物素、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、核黄素、硫胺素盐酸盐、氰钴胺素、硫辛酸；
所述盐类包括：氯化钙、硝酸钙、氯化钾、硝酸钾、磷酸氢二钠、氯化钠、一水合磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、碳酸氢钠、亚硒酸钠、九水硝酸铁、七水合硫酸亚铁、五水合硫酸铜、七水合硫酸锌、腐胺；
所述激素类包括：胰岛素；
所述蛋白类包括：牛血清白蛋白、转铁蛋白。
一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
D-葡萄糖 2000～4500mg/L；
丙酮酸钠 0.01～110mg/L；
L-丙氨酸 0.1～14.725mg/L；
L-精氨酸·盐酸 14.725～242.13mg/L；
L-天冬酰胺·水 7.5～50mg/L；
L-天冬氨酸 6.65～30mg/L；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 6.65～20mg/L；
L-胱氨酸·二盐酸 31.29～65mg/L；
L-谷氨酸钠 8.46～47.3675mg/L；
L-谷氨酰胺 300～563mg/L；
甘氨酸 10～24.375mg/L；
L-组氨酸·盐酸·水 17.676～36.74mg/L；
L-异亮氨酸 50～79.735mg/L；
L-亮氨酸 50～82.025mg/L；
L-赖氨酸·盐酸 40～118.625mg/L；
L-蛋氨酸 15～23.62mg/L；
L-苯丙氨酸 15～50.74mg/L；
L-脯氨酸 17.25～28.625mg/L；
L-丝氨酸 26.25～34.125mg/L；
L-苏氨酸 20～74.225mg/L；
L-色氨酸 5～12.51mg/L；
L-酪氨酸·二钠·二水 29～88.26mg/L；
L-缬氨酸 20～73.425mg/L；
对氨基苯甲酸 0.01～1mg/L；
亚油酸 0.001～0.042 mg/L；
氯化胆碱 3～8.98mg/L；
次黄嘌呤钠 0.01～2.39mg/L；
胸苷 0.0001～0.365mg/L；
D-生物素 0.0035～0.2mg/L；
叶酸 1～3.325mg/L；
肌醇 9.9～35mg/L；
烟酰胺 1～3.01mg/L；
泛酸钙 0.25～3.12mg/L；
吡哆醇盐酸盐 1～2.031mg/L；
吡哆醛盐酸盐 0.001～0.1mg/L；
核黄素 0.2～0.3095mg/L；
硫胺素盐酸盐 1～3.085mg/L；
氰钴胺素 0.005～0.68mg/L；
硫辛酸 0.0001～0.105mg/L；
氯化钙 0.1～165mg/L；
硝酸钙 0.1～69.5mg/L；
氯化钾 311.8～400mg/L；
硝酸钾 0.001～0.076mg/L；
磷酸氢二钠 0.1～423.88mg/L；
氯化钠 5747.75～6995.5mg/L；
一水合磷酸二氢钠 62.5～676.13mg/L；
硫酸镁 40.276～73.255mg/L；
氯化镁 0.1～28.64mg/L；
碳酸氢钠 2000～2731mg/L；
亚硒酸钠 0.0001～0.0114mg/L；
九水硝酸铁 0.001～0.05mg/L；
七水合硫酸亚铁 0.001～0.417mg/L；
五水合硫酸铜 0.00001～0.0013mg/L；
七水合硫酸锌 0.001～0.432mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 2383～4766.25mg/L；
酚红 5～11.55mg/L；
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20mg/L；
腐胺·二盐酸 0.001～0.081mg/L。
进一步，所述组分中还能添加柠檬酸铵铁：0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠：300～1500mg/L；腐胺：0.25～1.25mg/L。
一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，由基础培养基与血清替代物组合混合构成；
所述基础培养基各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
D-葡萄糖 2000～4500mg/L；
丙酮酸钠 0.01～110mg/L；
L-丙氨酸 0.1～14.725mg/L；
L-精氨酸·盐酸 14.725～242.13mg/L；
L-天冬酰胺·水 7.5～50mg/L；
L-天冬氨酸 6.65～30mg/L；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 6.65～20mg/L；
L-胱氨酸·二盐酸 31.29～65mg/L；
L-谷氨酸钠 8.46～47.3675mg/L；
谷氨酰胺 300～563mg/L；
甘氨酸 10～24.375mg/L；
L-组氨酸·盐酸·水 17.676～36.74mg/L；
L-异亮氨酸 50～79.735mg/L；
L-亮氨酸 50～82.025mg/L；
L-赖氨酸·盐酸 40～118.625mg/L；
L-蛋氨酸 15～23.62mg/L；
L-苯丙氨酸 15～50.74mg/L；
L-脯氨酸 17.25～28.625mg/L；
L-丝氨酸 26.25～34.125mg/L；
L-苏氨酸 20～74.225mg/L；
L-色氨酸 5～12.51mg/L；
L-酪氨酸·二钠·二水 29～88.26mg/L；
L-缬氨酸 20～73.425mg/L；
对氨基苯甲酸 0.01～1mg/L；
亚油酸 0.001～0.042mg/L；
氯化胆碱 3～8.98mg/L；
次黄嘌呤钠 0.01～2.39mg/L；
胸苷 0.0001～0.365mg/L；
D-生物素 0.0035～0.2mg/L；
叶酸 1～3.325mg/L；
肌醇 9.9～35mg/L；
烟酰胺 1～3.01mg/L；
泛酸钙 0.25～3.12mg/L；
吡哆醇盐酸盐 1～2.031mg/L；
吡哆醛盐酸盐 0.001～0.1mg/L；
核黄素 0.2～0.3095mg/L；
硫胺素盐酸盐 1～3.085mg/L；
氰钴胺素 0.005～0.68mg/L；
硫辛酸 0.0001～0.105mg/L；
氯化钙 0.1～165mg/L；
硝酸钙 0.1～69.5mg/L；
氯化钾 311.8～400mg/L；
硝酸钾 0.001～0.076mg/L；
磷酸氢二钠 0.1～423.88mg/L；
氯化钠 5747.75～6995.5mg/L；
一水合磷酸二氢钠 62.5～676.13mg/L；
硫酸镁 40.276～73.255mg/L；
氯化镁 0.1～28.64mg/L；
碳酸氢钠 2000～2731mg/L；
亚硒酸钠 0.0001～0.0114mg/L；
九水硝酸铁 0.001～0.05mg/L；
七水合硫酸亚铁 0.001～0.417mg/L；
五水合硫酸铜 0.00001～0.0013mg/L；
七水合硫酸锌 0.001～0.432mg/L；
腐胺·二盐酸 0.001～0.081mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 2383～4766.25mg/L；
酚红 5～11.55mg/L；
所述血清替代物组合各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20mg/L。
进一步，所述血清替代物组合中还包括柠檬酸铵铁：0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠：300～1500mg/L；腐胺：0.25～1.25mg/L。
本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基的积极效果是：
（1）组分明确，能支持人免疫杀伤细胞的体外扩增，具有高效性和稳定性。
（2）研究中发现，本发明的无血清培养基在促进人免疫杀伤细胞体外扩增和功能维持方面的效果不低于甚至优于现有同类产品。
（3）本发明的无血清培养基能促进生物治疗的深入研究和应用，促进人免疫细胞治疗更顺利地进行，利国利民。
附图说明
图1为实施例1细胞扩增倍数的比较图。
图2为实施例2细胞扩增倍数的比较图。
图3为实施例2所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
图4为实施例2对肿瘤细胞K562的杀伤活性的比较图。
图5为实施例3细胞扩增倍数的比较图。
图6为实施例3所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基的具体实施方式，提供3个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
（一）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的基础培养基，命名为BM1，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
氯化钙CaCl2 0.1；
硝酸钙Ca(NO3)2 69.5；
氯化钾KCl 400
硝酸钾KNO3 0.001；
磷酸氢二钠Na2HPO4 423.88；
氯化钠NaCl 6000；
一水合磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 676.13；
硫酸镁MgSO4 40.276；
氯化镁MgCl2 0.1；
碳酸氢钠NaHCO3 2000；
亚硒酸钠Na2SeO3 0.001；
九水硝酸铁Fe (NO3)3·9H2O 0.001；
七水合硫酸亚铁FeSO3·7H2O 0.001；
五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.00001；
七水合硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.001；
L-丙氨酸L-Alanine 0.1；
L-精氨酸·盐酸 L-Arginine·HCl 242.13；
L-天冬酰胺·水 L-Asparagine·H2O 50；
L-天冬氨酸 L-Aspartic acid 20；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 L-Cysteine·HCl·H2O 20；
L-胱氨酸·二盐酸 L-Cystine·2HCl 65；
L-谷氨酸钠 L-Glutamic Acid Sodium 23；
L-谷氨酰胺 L-Glutamine 300；
甘氨酸 Glycine 10；
L-组氨酸·盐酸·水 L-Histine·HCl·H2O 17.676；
L-异亮氨酸 L-Isoleucine 50；
L-亮氨酸 L-Leucine 50；
L-赖氨酸·盐酸 L-Lysine·HCl 40；
L-蛋氨酸 L-Methionine 15；
L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine 15；
L-脯氨酸 L-Proline 20；
L-丝氨酸 L-Serine 30；
L-苏氨酸 L-Threonine 20；
L-色氨酸 L-Typtophan 5；
L-酪氨酸·二钠·二水 L-Tyrosine·2 Na·2H2O 29；
L-缬氨酸 L-Valine 20；
对氨基苯甲酸 Para Aminobenzoic acid 1；
D-生物素 D-Biotin 0.2；
叶酸（维生素B） Folic Acid 1；
肌醇 i-Inositol 35；
烟酰胺 Niacinamine 1；
泛酸钙 Calcium pantothenate 0.25；
吡哆醇盐酸盐 Pyridoxine HCl 1；
吡哆醛盐酸盐 Pyridoxal HCl 0.1；
核黄素（维生素B2） Riboflavin 0.2；
硫胺素盐酸盐（维生素B1） Thiamine hydrochloride 1；
氰钴胺素（维生素B12） Vitamin B-12 0.005；
硫辛酸 Thioctic acid 0.0001；
D-葡萄糖 D-Glucose 2000；
丙酮酸钠 Sodium Pyruvate 0.1；
亚油酸 Linoleic 0.001；
氯化胆碱 Choline chloride 3；
腐胺·二盐酸 Putrescine·2hydrochloride 0.001；
胸苷 Thymidine 0.0001；
次黄嘌呤钠 Hypoxanthine 0.01；
羟乙基哌嗪乙磺酸 HEPES 2383；
酚红 Phenol red 5。
（二）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，标号为α，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
胰岛素 0.5mg/L；
转铁蛋白 5.5mg/L；
牛血清白蛋白 3000mg/L；
乙醇胺 1.22mg/L；
α-硫代甘油 5.41mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（三）本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基的制备与应用
第一步：将实施例1（二）的血清替代物组合α添加到实施例1（一）的基础培养基BM1中，制成本发明的无血清培养基，标号为SFM1。
第二步：在48孔板的每个孔中置入1mL本发明的无血清培养基SFM1，再将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入所述SFM1中，添加IFN-γ（γ型干扰素）1000IU/mL、OKT-3（单克隆抗体）20ng/mL、IL-2（白细胞介素2）200IU/mL、IL-1α（白细胞介素1α）100IU/mL、PHA（植物凝集素）0.1μg/mL，在37℃、5% CO2的培养箱内培养6天。
同时，设置RPMI 1640基础培养基+10% FBS（胎牛血清）的培养基，按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组；每个实验重复三个实验样本，以减少实验误差。
第三步：6天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色统计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到的总细胞的扩增倍数，计数结果参见图1：实施例1制成的无血清培养基SFM1对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为8.30 ± 0.83；而RPMI1640+10%FBS培养基对照组对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为6.83 ± 1.43；二者对细胞体外扩增的倍数不存在显著性差异（p＞0.05）。
对照结果说明：实施例1制成的无血清培养基SFM1能支持人免疫杀伤细胞的体外扩增。
实施例2
（一）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的基础培养基，命名为BM2，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
氯化钙CaCl2 165；
硝酸钙Ca(NO3)2 0.1；
氯化钾KCl 320
硝酸钾KNO3 0.038
磷酸氢二钠Na2HPO4 0.1；
氯化钠NaCl 5747.75；
一水合磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 93.75；
硫酸镁MgSO4 73.255；
氯化镁MgCl2 14.32；
碳酸氢钠NaHCO3 2731；
亚硒酸钠Na2SeO3 0.0114；
九水硝酸铁Fe (NO3)3·9H2O 0.025；
七水合硫酸亚铁FeSO3·7H2O 0.2085；
五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.00065；
七水合硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.216；
L-丙氨酸L-Alanine 14.725；
L-精氨酸·盐酸 L-Arginine·HCl 115.75；
L-天冬酰胺·水 L-Asparagine·H2O 16.25；
L-天冬氨酸 L-Aspartic acid 30；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 L-Cysteine·HCl·H2O 8.78；
L-胱氨酸·二盐酸 L-Cystine·2HCl 61.345；
L-谷氨酸钠 L-Glutamic Acid Sodium 47.3675；
L-谷氨酰胺 L-Glutamine 563；
甘氨酸 Glycine 24.375；
L-组氨酸·盐酸·水 L-Histine·HCl·H2O 36.74；
L-异亮氨酸 L-Isoleucine 79.735；
L-亮氨酸 L-Leucine 82.025；
L-赖氨酸·盐酸 L-Lysine·HCl 118.625；
L-蛋氨酸 L-Methionine 23.62；
L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine 50.74；
L-脯氨酸 L-Proline 28.625；
L-丝氨酸 L-Serine 34.125；
L-苏氨酸 L-Threonine 74.225；
L-色氨酸 L-Typtophan 12.51；
L-酪氨酸·二钠·二水 L-Tyrosine·2 Na·2H2O 88.26；
L-缬氨酸 L-Valine 73.425；
对氨基苯甲酸 Para Aminobenzoic acid 0.01；
D-生物素 D-Biotin 0.00825；
叶酸（维生素B） Folic Acid 3.325；
肌醇 i-Inositol 9.9；
烟酰胺 Niacinamine 3.01；
泛酸钙 Calcium pantothenate 3.12；
吡哆醇盐酸盐 Pyridoxine HCl 1.0155；
吡哆醛盐酸盐 Pyridoxal HCl 0.001；
核黄素（维生素B2） Riboflavin 0.3095；
硫胺素盐酸盐（维生素B1） Thiamine hydrochloride 3.085；
氰钴胺素（维生素B12） Vitamin B-12 0.3465；
硫辛酸 Thioctic acid 0.0525；
D-葡萄糖 D-Glucose 4500；
丙酮酸钠 Sodium Pyruvate 110；
亚油酸 Linoleic 0.021；
氯化胆碱 Choline chloride 6.49；
腐胺·二盐酸 Putrescine·2hydrochloride 0.0405；
胸苷 Thymidine 0.1825；
次黄嘌呤钠 Hypoxanthine 1.195；
羟乙基哌嗪乙磺酸 HEPES 4766.25；
酚红 Phenol red 11.55。
（二）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，标号为β，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
胰岛素 20mg/L；
转铁蛋白 22mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 0.61mg/L；
α-硫代甘油 10.82mg/L；
亚麻酸 0.5mg/L；
胆固醇 0.8mg/L。
（三）本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基的制备与应用
第一步：将实施例2（二）的血清替代物组合β添加到实施例2（一）的基础培养基BM2中，制成无血清培养基SFM2。
第二步：在T25细胞培养瓶中置入5mL本发明的无血清培养基SFM2，再将脐血单个核细胞以1×106 cells/mL的密度接种入所述SFM2中，添加IFN-γ（γ型干扰素）1000IU/mL、OKT-3（单克隆抗体）20ng/mL、IL-2（白细胞介素2）200IU/mL、IL-1α（白细胞介素1α）100IU/mL、PHA（植物凝集素）0.1μg/mL，在37℃、5% CO2的培养箱内培养14天。
同时，设置RPMI 1640基础培养基+10% FBS（胎牛血清）的培养基、商业化的无血清培养基X-VIVO 15和GT-T551作为对照。按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组；每个实验重复三个实验样本，以减少实验误差。
第三步：从第4天开始每天取样计数，并通过添加新鲜的培养基稀释补液的方式维持细胞密度为1×106 cells/mL，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色统计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到的总细胞的扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增14天的细胞中各类人免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+ 细胞比例越高，说明扩增效果越好；另外，采用CCK-8试剂盒检测扩增14天的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性。
计数结果参见图2：实施例2制成的无血清培养基SFM2对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为18.14±2.48；而RPMI1640+10%FBS培养基对照组对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为7.14±1.48；X-VIVO 15中细胞的体外扩增倍数为4.00±2.03；GT-T551中细胞的体外扩增倍数为3.53±1.21。无血清培养基SFM2的细胞扩增倍数明显高于其他对照组（p＜0.05）。
免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图3。实施例2制成的无血清培养基SFM2扩增后的细胞中CD3+ 细胞比例为97%，CD8+细胞比例为71.12%，CD3+CD56+细胞的比例为25.20%。
RPMI1640+10%FBS培养基扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为94.90%，CD8+细胞的比例为78.13%，CD3+CD56+ 细胞的比例为20.30%。
X-VIVO 15培养基扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为17.83%，CD8+ 细胞的比例为23.43%，CD3+CD56+ 细胞的比例为2.85%。
GT-T551培养基扩增后的细胞中CD3+ 细胞的比例为59.90%，CD8+ 细胞的比例为0.33%，CD3+CD56+ 细胞的比例为3.27%。
检测结果表明：实施例2无血清培养基SFM2扩增后的细胞中CD3+ 细胞、CD8+ 细胞以及CD3+CD56+ 细胞的比例接近于含10%胎牛血清的RPMI1640对照组，优于X-VIVO 15和GT-T551两个对照组。
对照结果说明：实施例2制成的无无血清培养基SFM2能支持人免疫杀伤细胞的体外扩增。
K562细胞杀伤实验检测结果参见图4。实施例2制成的无血清培养基SFM2扩增后的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性为76.07%；RPMI1640+10%FBS培养基所扩增的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性为53.48%。可见，实施例2的无血清培养基SFM2所扩增的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤能力明显高于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基所扩增的细胞。可见，实施例2的无血清培养基SFM2所扩增的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤能力明显高于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基所扩增的细胞。
综上所述，实施例2无血清培养基SFM2不仅能支持人免疫杀伤细胞的体外高效扩增，而且扩增得到的人免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性强，明显优于同类产品。
实施例3
（一）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的基础培养基，命名为BM3，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
氯化钙CaCl2 116.6；
硝酸钙Ca(NO3)2 0.1；
氯化钾KCl 311.8；
硝酸钾KNO3 0.076；
磷酸氢二钠Na2HPO4 71.02；
氯化钠NaCl 6995.5；
一水合磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 62.5；
硫酸镁MgSO4 48.84；
氯化镁MgCl2 28.64；
碳酸氢钠NaHCO3 2438；
亚硒酸钠Na2SeO3 0.0001；
九水硝酸铁Fe (NO3)3·9H2O 0.05；
七水合硫酸亚铁FeSO3·7H2O 0.417；
五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.0013；
七水合硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.432；
L-丙氨酸L-Alanine 4.45；
L-精氨酸·盐酸 L-Arginine·HCl 147.5；
L-天冬酰胺·水 L-Asparagine·H2O 7.5；
L-天冬氨酸 L-Aspartic acid 6.65；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 L-Cysteine·HCl·H2O 6.65；
L-胱氨酸·二盐酸 L-Cystine·2HCl 31.29；
L-谷氨酸钠 L-Glutamic Acid Sodium 8.46；
L-谷氨酰胺 L-Glutamine 542；
甘氨酸 Glycine 18.75；
L-组氨酸·盐酸·水 L-Histine·HCl·H2O 31.48；
L-异亮氨酸 L-Isoleucine 54.47；
L-亮氨酸 L-Leucine 59.05；
L-赖氨酸·盐酸 L-Lysine·HCl 91.25；
L-蛋氨酸 L-Methionine 17.24；
L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine 35.48；
L-脯氨酸 L-Proline 17.25；
L-丝氨酸 L-Serine 26.25；
L-苏氨酸 L-Threonine 53.45；
L-色氨酸 L-Typtophan 9.02；
L-酪氨酸·二钠·二水 L-Tyrosine·2 Na·2H2O 55.79；
L-缬氨酸 L-Valine 52.85；
对氨基苯甲酸 Para Aminobenzoic acid 0.01；
D-生物素 D-Biotin 0.0035；
叶酸（维生素B） Folic Acid 2.65；
肌醇 i-Inositol 12.6；
烟酰胺 Niacinamine 2.02；
泛酸钙 Calcium pantothenate 2.24；
吡哆醇盐酸盐 Pyridoxine HCl 2.031；
吡哆醛盐酸盐 Pyridoxal HCl 0.1；
核黄素（维生素B2） Riboflavin 0.219；
硫胺素盐酸盐（维生素B1） Thiamine hydrochloride 2.17；
氰钴胺素（维生素B12） Vitamin B-12 0.68；
D-葡萄糖 D-Glucose 3151；
丙酮酸钠 Sodium Pyruvate 55；
亚油酸 Linoleic 0.042；
硫辛酸 Thioctic acid 0.105；
氯化胆碱 Choline chloride 8.98；
腐胺·二盐酸 Putrescine·2hydrochloride 0.081；
胸苷 Thymidine 0.365；
次黄嘌呤钠 Hypoxanthine 2.39；
羟乙基哌嗪乙磺酸 HEPES 3574.5；
酚红 Phenol red 8.1。
（二）一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，标号为γ，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
胰岛素 8mg/L；
转铁蛋白 0.69mg/L；
牛血清白蛋白 4500mg/L；
乙醇胺 2.44mg/L；
α-硫代甘油 8.00mg/L；
亚麻酸 5mg/L；
胆固醇 20mg/L；
柠檬酸铵铁 1.0mg/L；
β-甘油磷酸二钠 300mg/L；
腐胺 0.80mg/L。
（三）本发明用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基的制备与应用
第一步：将实施例3（二）的血清替代物组合γ添加到实施例3（一）的基础培养基BM3中，制成无血清培养基SFM3。
第二步：在T25细胞培养瓶中置入5mL本发明的无血清培养基SFM3，将脐血单个核细胞以1×106 cells/mL的密度接种入所述SFM3中，添加IFN-γ（γ型干扰素）1000IU/mL、OKT-3（单克隆抗体）20ng/mL、IL-2（白细胞介素2）200IU/mL、IL-1α（白细胞介素1α）100 IU/mL、PHA（植物凝集素）0.1μg/mL，在37℃、5% CO2的培养箱内培养14天。
同时，设置RPMI 1640培养基 +10% FBS（胎牛血清）作为对照，按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复三个实验样本，以减少实验误差。
第三步：从第4天开始每天取样计数，并通过添加新鲜的培养基稀释补液的方式维持细胞密度为1×106 cells/mL，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色统计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到的总细胞的扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增14天的细胞中各类免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+ 细胞比例越高，说明扩增效果越好。
计数结果参见图 5：实施例3制成的无血清培养基SFM3对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为15.10±1.33；而对照组RPMI1640+10%FBS对人免疫杀伤细胞的体外扩增倍数为7.14±1.48；前者明显高于后者（p＜0.05）。
对照结果说明：实施例3制成的无血清培养基水溶液SFM3能支持人免疫杀伤细胞的体外扩增。
人免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图6。无血清培养基SFM3扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为97.29%，CD8+细胞的比例为75.84%，CD3+CD56+细胞的比例为25.18%。
对照组RPMI1640+10%FBS所扩增的细胞中CD3+细胞的比例为96.84%，CD8+细胞的比例为82.46%，CD3+CD56+细胞的比例为30.89%。
对照结果说明：实施例3的无血清培养基SFM3可支持人免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。

Claims (5)

1.一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，其组分中包括糖类、氨基酸类、脂类、核苷类、维生素类、盐类、激素类、蛋白类以及羟乙基哌嗪乙磺酸和酚红；
所述糖类包括：D-葡萄糖、丙酮酸钠；
所述氨基酸类包括：L-丙氨酸、L-精氨酸·盐酸、L-天冬酰胺·水、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐合水、L-胱氨酸·二盐酸、L-谷氨酸钠、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸·盐酸·水、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·盐酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·二钠·二水、L-缬氨酸、对氨基苯甲酸；
所述脂类包括：亚油酸、氯化胆碱、乙醇胺、α-硫代甘油、亚麻酸、胆固醇；
所述核苷类包括：次黄嘌呤钠、胸苷；
所述维生素类包括：D-生物素、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、核黄素、硫胺素盐酸盐、氰钴胺素、硫辛酸；
所述盐类包括：氯化钙、硝酸钙、氯化钾、硝酸钾、磷酸氢二钠、氯化钠、一水合磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、碳酸氢钠、亚硒酸钠、九水硝酸铁、七水合硫酸亚铁、五水合硫酸铜、七水合硫酸锌、β-甘油磷酸二钠、柠檬酸铵铁、腐胺；
所述激素类包括：胰岛素；
所述蛋白类包括：牛血清白蛋白、转铁蛋白。
2.一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，其各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
D-葡萄糖 2000～4500mg/L；
丙酮酸钠 0.01～110mg/L；
L-丙氨酸 0.1～14.725mg/L；
L-精氨酸·盐酸 14.725～242.13mg/L；
L-天冬酰胺·水 7.5～50 mg/L；
L-天冬氨酸 6.65～30mg/L；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 6.65～20mg/L；
L-胱氨酸·二盐酸 31.29～65mg/L；
L-谷氨酸钠 8.46～47.3675mg/L；
L-谷氨酰胺 300～563mg/L；
甘氨酸 10～24.375mg/L；
L-组氨酸·盐酸·水 17.676～36.74mg/L；
L-异亮氨酸 50～79.735mg/L；
L-亮氨酸 50～82.025mg/L；
L-赖氨酸·盐酸 40～118.625mg/L；
L-蛋氨酸 15～23.62mg/L；
L-苯丙氨酸 15～50.74mg/L；
L-脯氨酸 17.25～28.625mg/L；
L-丝氨酸 26.25～34.125mg/L；
L-苏氨酸 20～74.225mg/L；
L-色氨酸 5～12.51 mg/L；
L-酪氨酸·二钠·二水 29～88.26mg/L；
L-缬氨酸 20～73.425mg/L；
对氨基苯甲酸 0.01～1mg/L；
亚油酸 0.001～0.042 mg/L；
氯化胆碱 3～8.98mg/L；
次黄嘌呤钠 0.01～2.39mg/L；
胸苷 0.0001～0.365mg/L；
D-生物素 0.0035～0.2mg/L；
叶酸 1～3.325mg/L；
肌醇 9.9～35mg/L；
烟酰胺 1～3.01mg/L；
泛酸钙 0.25～3.12mg/L；
吡哆醇盐酸盐 1～2.031mg/L；
吡哆醛盐酸盐 0.001～0.1mg/L；
核黄素 0.2～0.3095mg/L；
硫胺素盐酸盐 1～3.085mg/L；
氰钴胺素 0.005～0.68mg/L；
硫辛酸 0.0001～0.105mg/L；
氯化钙 0.1～165mg/L；
硝酸钙 0.1～69.5mg/L；
氯化钾 311.8～400mg/L；
硝酸钾 0.001～0.076mg/L；
磷酸氢二钠 0.1～423.88mg/L；
氯化钠 5747.75～6995.5mg/L；
一水合磷酸二氢钠 62.5～676.13mg/L；
硫酸镁 40.276～73.255mg/L；
氯化镁 0.1～28.64mg/L；
碳酸氢钠 2000～2731mg/L；
亚硒酸钠 0.0001～0.0114mg/L；
九水硝酸铁 0.001～0.05mg/L；
七水合硫酸亚铁 0.001～0.417mg/L；
五水合硫酸铜 0.00001～0.0013mg/L；
七水合硫酸锌 0.001～0.432mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 2383～4766.25mg/L；
酚红 5～11.55mg/L；
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20mg/L；
腐胺·二盐酸 0.001～0.081mg/L。
3.根据权利要求2所述的用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，所述组分中还能添加柠檬酸铵铁：0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠：300～1500mg/L；腐胺：0.25～1.25mg/L。
4.一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，由基础培养基与血清替代物组合混合构成；
所述基础培养基各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
D-葡萄糖 2000～4500mg/L；
丙酮酸钠 0.01～110mg/L；
L-丙氨酸 0.1～14.725mg/L；
L-精氨酸·盐酸 14.725～242.13mg/L；
L-天冬酰胺·水 7.5～50 mg/L；
L-天冬氨酸 6.65～30mg/L；
L-半胱氨酸盐酸盐合水 6.65～20mg/L；
L-胱氨酸·二盐酸 31.29～65mg/L；
L-谷氨酸钠 8.46～47.3675mg/L；
谷氨酰胺 300～563mg/L；
甘氨酸 10～24.375mg/L；
L-组氨酸·盐酸·水 17.676～36.74mg/L；
L-异亮氨酸 50～79.735mg/L；
L-亮氨酸 50～82.025mg/L；
L-赖氨酸·盐酸 40～118.625mg/L；
L-蛋氨酸 15～23.62mg/L；
L-苯丙氨酸 15～50.74mg/L；
L-脯氨酸 17.25～28.625mg/L；
L-丝氨酸 26.25～34.125mg/L；
L-苏氨酸 20～74.225mg/L；
L-色氨酸 5～12.51 mg/L；
L-酪氨酸·二钠·二水 29～88.26mg/L；
L-缬氨酸 20～73.425mg/L；
对氨基苯甲酸 0.01～1mg/L；
亚油酸 0.001～0.042 mg/L；
氯化胆碱 3～8.98mg/L；
次黄嘌呤钠 0.01～2.39mg/L；
胸苷 0.0001～0.365mg/L；
D-生物素 0.0035～0.2mg/L；
叶酸 1～3.325mg/L；
肌醇 9.9～35mg/L；
烟酰胺 1～3.01mg/L；
泛酸钙 0.25～3.12mg/L；
吡哆醇盐酸盐 1～2.031mg/L；
吡哆醛盐酸盐 0.001～0.1mg/L；
核黄素 0.2～0.3095mg/L；
硫胺素盐酸盐 1～3.085mg/L；
氰钴胺素 0.005～0.68mg/L；
硫辛酸 0.0001～0.105mg/L；
氯化钙 0.1～165mg/L；
硝酸钙 0.1～69.5mg/L；
氯化钾 311.8～400mg/L；
硝酸钾 0.001～0.076mg/L；
磷酸氢二钠 0.1～423.88mg/L；
氯化钠 5747.75～6995.5mg/L；
一水合磷酸二氢钠 62.5～676.13mg/L；
硫酸镁 40.276～73.255mg/L；
氯化镁 0.1～28.64mg/L；
碳酸氢钠 2000～2731mg/L；
亚硒酸钠 0.0001～0.0114mg/L；
九水硝酸铁 0.001～0.05mg/L；
七水合硫酸亚铁 0.001～0.417mg/L；
五水合硫酸铜 0.00001～0.0013mg/L；
七水合硫酸锌 0.001～0.432mg/L；
腐胺·二盐酸 0.001～0.081mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 2383～4766.25mg/L；
酚红 5～11.55mg/L；
所述血清替代物组合各种组分及最终使用的浓度为（单位为毫克/升）：
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20mg/L。
5.根据权利要求4所述的用于人免疫杀伤细胞体外扩增的无血清培养基，其特征在于，所述血清替代物组合中还包括柠檬酸铵铁：0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠：300～1500mg/L；腐胺：0.25～1.25mg/L。
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