CN105524882B - 用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分添加到常规培养基中的最终浓度为：胰岛素0.5～20mg/L；转铁蛋白0.69～22mg/L；牛血清白蛋白3000～6000mg/L；乙醇胺0.61～2.44mg/L；α‑硫代甘油5.41～10.82mg/L；亚麻酸0.5～5.0mg/L；胆固醇0.8～20mg/L。在所述血清替代物组合能添加柠檬酸铵铁0.46～2.3mg/L、β‑甘油磷酸二钠300～1500mg/L和腐胺0.25～1.25mg/L。本发明组分明确，可加入到不同基础培养基，如RPMI1640、DMEM/F12及IMDM培养基中，能支持免疫杀伤细胞的体外扩增，具有高效性和普适性。本发明能实现免疫杀伤细胞的体外无血清扩增，促进肿瘤的生物治疗，尤其是体细胞治疗的进行。
Description
技术领域
本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合。
技术背景
随着生物治疗肿瘤技术的发展，生物治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后肿瘤治疗的第四种治疗方式。在肿瘤的生物治疗中免疫细胞治疗是重要的一环，近年来，免疫细胞治疗已在临床中显示出了重要的应用价值。
所述免疫细胞治疗包括肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的治疗。其中，以自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）为主体的肿瘤过继免疫治疗已逐渐成为肿瘤生物治疗中最活跃的应用与研究项目之一。
过继免疫治疗在实施过程中很重要的一个环节就是要通过免疫细胞的体外扩增，使免疫细胞数量符合临床注剂量要求后输给患者，达到生物治疗的目的。由于生物治疗的特殊性在于，是以免疫细胞作为治疗药物输入患者体内的，因此，体外扩增免疫细胞的安全性和质量的稳定性就显得尤为重要。在免疫杀伤细胞的体外扩增过程中需要确保不能渗入任何可能会给患者生命带来安全风险的物质，例如异源病原菌和病毒。
常规的细胞培养是在有血清的体系中进行，异源血清的加入可能会增加异源感染的风险，这在临床上是不允许的。使用无血清培养基，即采用血清替代物组合替代血清在细胞培养中的作用来进行无血清扩增，则正好能解决上述问题，因此，将无血清培养基用于免疫杀伤细胞的体外扩增就显得尤为重要。由于无血清培养基相比于有血清培养体系成分更加明确，批次间质量更加稳定，且易于规模化制备和管理，易于规避异源物质的干扰，其质量的稳定性和使用的安全性都会有大幅度提高。
然而，由于血清组成复杂多样，包含多种生长因子、蛋白、激素及其他小分子物质，它们对免疫细胞体外扩增的作用也不尽相同。为此，研究血清中各种组分以及组分之间的相互作用对细胞增殖的影响，分析和发现其中对细胞生长增殖有显著促进作用的关键物质，通过科学实验优化其浓度范围，制备出血清替代物，是建立无血清培养基的关键环节。根据2012年由Sunghoon Jung, KrishnaM. Panchalingam, Lawrence Rosenberg和Leo A.Behie发表于Stem Cells International期刊上的《Ex Vivo Expansion of HumanMesenchymal Stem Cells in Defined Serum-Free Media》（用成分明确的无血清培养基体外扩增人间充质干细胞），2012，Stem Cells International，细胞培养中所常用的胎牛血清的组成及其浓度范围如下：
成分 浓度范围
蛋白和多肽 40～80mg/mL
白蛋白 20～50 mg/mL
胎球蛋白 10～20 mg/mL
纤粘连蛋白 1.0～10 μg/mL
球蛋白 1.0～15mg/mL
蛋白酶抑制剂 0.5～2.5mg/mL
α1～抗胰蛋白酶
α2～巨球蛋白
转铁蛋白 2.0～4.0mg/ml
生长因子：
EGF，PDGF，IGF1和2， 1.0～100ng/mL
FGF，IL～1，IL～6
氨基酸 0.01～1.0μM
脂类 2.0～10mg/mL
胆固醇 10μM（3.8665mg/mL）
脂肪酸 0.1～1.0μM
亚油酸 0.01～0.1μM（0.0028～0.028mg/mL）
磷脂 0.7～3.0mg/mL
碳水化合物 1.0～2.0mg/mL
葡萄糖 0.6～1.2mg/mL
氨基己糖 0.6～1.2mg/mL
乳酸 0.5～2.0mg/mL
丙酮酸 2.0～10μg/mL
聚氨 0.1～1.0μM
腐胺、亚精胺
尿素 170～300μg/mL
无机物 0.14～0.16M
钙 4.0～7.0mM
氯 100μM
铁 10～50μM
钾 5.0～15 mM
磷 2.0～5.0 mM
硒 0.01μM
钠 135～155 mM
锌 0.1～1.0μM
激素 0.1～200nM
氢化可的松 10～200nM
胰岛素 1.0～100ng/mL
三碘甲状腺氨酸 20 nM
甲状腺素 100 nM
维生素 0.01～10μg/mL
维生素A 10～100ng/mL
叶酸 5.0～20ng/mL。
在上述胎牛血清的组分中，蛋白质、生长因子、脂类、激素和聚氨等组分很少出现在普通的商业基础培养基中，而这些组分又是免疫细胞生长增殖所必须的关键组分。
在无血清培养基需要添加的蛋白质类物质中，最重要的是白蛋白和转铁蛋白。所述白蛋白能与脂类、激素、维生素、金属离子和生长因子等结合，起到调节上述物质在无血清培养基中浓度和活性的作用。所述转铁蛋白与细胞上的转铁蛋白受体结合是细胞获取铁元素的主要来源，而铁离子在多种代谢途径中起着重要的作用，其与氧的转运、DNA的合成和电子转移密切相关。
对于不同种类的细胞进行增殖需要添加的生长因子种类也是不尽相同的，例如在T淋巴细胞培养过程中是添加IL-2作为生长因子的。对于很多生长因子而言，它们不是直接被添加到初始培养基里的，而是在培养过程中另外添加的，因此，生长因子的作用可以不作为无血清培养基考虑的范围。
激素中最重要的是胰岛素和氢化可的松。胰岛素可与细胞上的胰岛素受体结合后促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞的凋亡。氢化可的松可以抑制由巨噬细胞释放的有毒性的氧自由基和蛋白酶，也可以抑制由单核细胞释放的有毒的超氧化物自由基的生成。
脂类中的脂肪酸、胆固醇和磷脂参与细胞膜结构的合成，是细胞生长必不可少的营养成分。脂肪酸中包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸如棕榈酸、月桂酸、豆蔻酸等，不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸和亚麻酸等。磷脂包括磷脂酰胆碱（卵磷脂）和磷脂酰乙醇胺（脑磷脂），胆碱和乙醇胺分别是合成二者的单体物质。
聚氨包括腐胺、精胺和亚精胺，这些物质可作为激素信号通路的第二信使，调节细胞渗透压，影响细胞的生长增殖和细胞功能。
除了这些关键成分外，还有小分子物质，如α-硫代甘油和β-巯基乙醇，也是调节细胞生长代谢的重要组分。
但是研究发现，只是简单地将上述成分组合在一起并不能有效支持细胞的生长增殖。这是由于上述蛋白质、脂类等物质的种类或者部分成分浓度并不适宜此类细胞的生长增殖或者其本身可能会有抑制作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，它组分明确，可添加到不同基础培养基中，能支持免疫杀伤细胞的体外高效扩增，具有高效性和普适性。
本发明通过科学的实验设计方法-部分因子实验设计和响应面分析，经多次实验重复，从众多候选物中逐步分析优化，最终筛选出数种可支持免疫细胞体外高效扩增的血清替代物组合。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，其成分组成包括：胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、乙醇胺、α-硫代甘油、亚麻酸、胆固醇。
可选的，所述各成分添加到常规培养基中的最终浓度为，单位毫克/升：
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20mg/L。
进一步，在所述血清替代物组合基础上能再添加柠檬酸铵铁、β-甘油磷酸二钠和腐胺；所述柠檬酸铵铁、β-甘油磷酸二钠和腐胺添加到常规培养基中的最终浓度为（单位毫克/升）：柠檬酸铵铁0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠300～1500mg/L；腐胺0.25～1.25mg/L。
一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，其各种成分添加到常规培养基中的最终浓度为，单位mg/L：
胰岛素 0.5～20mg/L；
转铁蛋白 0.69～22mg/L；
牛血清白蛋白 3000～6000mg/L；
乙醇胺 0.61～2.44mg/L；
α-硫代甘油 5.41～10.82mg/L；
亚麻酸 0.5～5.0mg/L；
胆固醇 0.8～20 mg/L；
柠檬酸铵铁 0.46～2.3mg/L；
β-甘油磷酸二钠 300～1500mg/L；
腐胺 0.25～1.25mg/L。
本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的积极效果是：
（1）组分明确，有利于免疫细胞的体外扩增，能促进肿瘤的生物治疗，尤其是体细胞治疗的进行。
（2）研究还发现，本发明的血清替代物组合，可加入到不同基础培养基，如RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基和IMDM培养基中，能支持免疫细胞的高效增殖。
（3）实验证明：本发明的血清替代物组合具有高效性和普适性，容易配制、成本可控，容易实施和推广应用。
附图说明
附图1为实施例1细胞扩增倍数的比较图。
附图2为实施例2细胞扩增倍数的比较图。
附图3为实施例3细胞扩增倍数的比较图。
附图4为实施例4细胞扩增倍数的比较图。
附图5为实施例5细胞扩增倍数的比较图。
附图6为实施例6细胞扩增倍数的比较图。
附图7为实施例7细胞扩增倍数的比较图。
附图8为实施例8细胞扩增倍数的比较图。
附图9为实施例8所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
附图10为实施例9细胞扩增倍数的比较图。
附图11为实施例9所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
附图12为实施例9对肿瘤细胞K562的杀伤活性的比较图。
附图13为实施例10细胞扩增倍数的比较图。
附图14为实施例10所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
附图15为实施例11的细胞扩增倍数的比较图。
附图16为实施例11所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的具体实施方式，提供11个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 0.5mg/L；
转铁蛋白 5.5mg/L；
牛血清白蛋白 3000mg/L；
乙醇胺 1.22mg/L；
α-硫代甘油 5.41mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（二）所述用于免疫细胞体外扩增的血清替代物组合的制备，可采用常规的制备方法，包括以下步骤：
1、根据组分的含量，将胰岛素溶于1%稀盐酸溶液中，配成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:100。。
2、根据组分的含量，将转铁蛋白、乙醇胺及α-硫代甘油分别溶解于无热源超纯水中，配制成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:1000。
3、根据组分的含量，将牛血清白蛋白溶解于无热源超纯水中配制成浓缩液，其所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的100倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:100。
4、根据组分的含量，将亚麻酸和胆固醇分别溶于纯乙醇中，配制成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:1000。
5、将上述各配好后的浓缩液用0.22微米（μm）的无菌滤器过滤除菌，放置于4℃冰箱保存；使用时按各组分所述的比例添加。
实施例1制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合A。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合A按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中，制成培养基A。
2、取1mL所述培养基A置于48孔板中，将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，以减少实验误差。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数。结果参见图1：实施例1培养基A的细胞的扩增倍数为8.30±0.83；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为6.83±1.43；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例1的血清替代物组合A可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例2
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 20mg/L；
转铁蛋白 5.5mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 0.61mg/L；
α-硫代甘油 5.41mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例2制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合B。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合B按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中，制成培养基B。
2、取1mL所述培养基B置于48孔板中，将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图2：实施例2培养基B的细胞扩增倍数为8.87±0.61；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为6.83±1.43；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例2的血清替代物组合B可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例3
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 5.5mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 2.44mg/L；
α-硫代甘油 10.82mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例3制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合C。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合C按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中，制成培养基C。
2、取1mL所述培养基C置于48孔板中，将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图3：实施例3培养基C的细胞扩增倍数为10.53±4.08；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为6.83±1.43；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例3的血清替代物组合C可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例4
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 5.5mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 8mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例4制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合D。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合D按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中， 制成培养基D。
2、取1mL所述培养基D置于48孔板中，将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图4：实施例4培养基D的细胞扩增倍数为10.33±0.72；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为6.83±1.43；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例4的血清替代物组合D可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例5
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 5mg/L；
转铁蛋白 0.69mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 5.41mg/L；
亚麻酸 0.5mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例5制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合E。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合E按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中， 制成培养基E。
2、取所述培养基E 1mL置于48孔板中, 将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图5：实施例5培养基E的细胞扩增倍数为5.36±1.76；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为4.77±1.53；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例5的血清替代物组合E可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例6
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 22mg/L；
牛血清白蛋白 6000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 20mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例6制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合F。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合F按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基中，制成培养基F。
2、取所述培养基F 1mL置于48孔板中, 将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图6：实施例6培养基F的细胞的扩增倍数为5.33±1.19；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为4.77±1.53；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例6血清替代物组合F可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例7
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 4mg/L；
牛血清白蛋白 4000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 5mg/L；
胆固醇 4mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例7制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合G。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合G按照所述浓度添加到IMDM培养基中，制成培养基G。
2、取所述培养基G 1mL置于48孔板中, 将脐血单个核细胞以1×105 cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养六天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基按上述相同的方法培养脐血单个核细胞作为对照组。每个实验重复3个实验样本，其意义同实施例1。
3、六天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数，其结果参见图7：实施例7培养基G的总细胞的扩增倍数为8.78±4.50；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为6.83±1.43；二者的扩增倍数不存在显著性差异。说明：实施例7血清替代物组合G可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例8
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L ；
转铁蛋白 4mg/L；
牛血清白蛋白 4000mg/L ；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 0.8mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例1）
实施例8制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合H。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合H按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基中，制成培养基H。
2、取5mL所述培养基H置于T25细胞培养方瓶中，将脐血单个核细胞以1×106cells/mL的密度接种入该培养基中，添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养十四天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基作为对照组。
3、十四天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增细胞中各类免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+细胞比例越高，说明扩增效果越好。
细胞扩增倍数结果参见图8：实施例8培养基H中细胞的扩增倍数为15.10±1.85；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为7.14±1.48。培养基H的细胞扩增倍数明显高于对照组。
免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图9。培养基H扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为90.10%，CD8+细胞的比例为66.69%，CD3+CD56+细胞的比例为16.69%；含10%胎牛血清的RPMI1640扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为97.44%，CD8+细胞的比例为61.78%，CD3+CD56+细胞的比例为13.85%。两者结果相近。
这说明：实施例8的培养基H可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例9
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 4mg/L；
牛血清白蛋白 4000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 4mg/L；
柠檬酸铵铁 2.3mg/L；
β-甘油磷酸二钠 700mg/L；
腐胺 1.25mg/L。
（二）所述用于免疫细胞体外扩增的血清替代物组合的制备，可采用常规的制备方法，包括以下步骤：
1、根据组分的含量，将胰岛素溶于1%稀盐酸溶液中，配成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:100。。
2、根据组分的含量，将转铁蛋白、乙醇胺、α-硫代甘油、腐胺、β-甘油磷酸二钠以及柠檬酸铵铁分别溶解于无热源超纯水中，配制成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:1000。
3、根据组分的含量，将牛血清白蛋白溶解于无热源超纯水中配制成浓缩液，其所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的100倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:100。
4、根据组分的含量，将亚麻酸和胆固醇分别溶于纯乙醇中，配制成浓缩液，所述浓缩液的浓度为组分中表述的浓度的1000倍，使用时浓缩液的添加体积与基础培养基的体积比为1:1000。
5、将上述各配好后的浓缩液用0.22微米（μm）的无菌滤器过滤除菌，放置于4℃冰箱保存；使用时按组分所述的比例添加。
实施例9制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合J。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合J按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基中以1︰1的体积混合成的基础培养基中，制成培养基J。
2、取5mL所述培养基J置于T25细胞培养基方瓶中，将脐血单个核细胞以1×106cells/mL的密度接种入其中；添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养十四天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基、商业化无血清培养基X-VIVO 15（瑞士Lonza公司产）和GT-T551（日本Takara公司产）作为对照组。
3、十四天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增细胞中各类免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+细胞比例越高，说明扩增效果越好。
细胞扩增倍数结果参见图10：实施例9培养基J中细胞的扩增倍数为18.14±2.48；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基为7.14±1.48；X-VIVO 15中细胞的扩增倍数为4.00±2.03; GT-T551中细胞的扩增倍数为3.53±1.21。培养基J的细胞扩增倍数明显高于其他对照组。
免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图11。采用培养基J扩增后的细胞中CD3+细胞比例为97%，CD8+细胞比例为71.12%，CD3+CD56+细胞的比例为25.20%。
含10%胎牛血清的RPMI1640培养基扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为94.90%，CD8+细胞的比例为78.13%，CD3+CD56+细胞的比例为20.30%。
X-VIVO 15培养基扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为17.83%，CD8+细胞的比例为23.43%，CD3+CD56+细胞的比例为2.85%。
GT-T551培养基扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为59.90%，CD8+细胞的比例为0.33%，CD3+CD56+细胞的比例为3.27%。
检测结果表明：实施例9培养基J扩增后的细胞中CD3+细胞、CD8+细胞以及CD3+CD56+细胞的比例接近于含10%胎牛血清的RPMI1640对照组，优于X-VIVO 15和GT-T551两个对照组。
说明：实施例9血清替代物组合J可支持免疫杀伤细胞的体外无血清高效扩增，并优于同类商业产品。
（四）检测实施例9中所扩增的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性
检测比较实施例9的培养基J、含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基、X-VIVO 15培养基以及GT-T551培养基培养14天后的细胞对于肿瘤细胞K562的杀伤活性。检测方法为取9×105所扩增的免疫细胞与1×105肿瘤细胞K562共培养24小时后，检测死亡肿瘤细胞的比例，即为免疫细胞的杀伤活性。对肿瘤细胞K562的杀伤活性越高表明所扩增免疫杀伤细胞功能越好。结果参见图12。鉴于X-VIVO 15培养基及GT-T551培养基对免疫细胞的扩增效果与培养基J、含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基相差太远，故这里只比较实施例9的培养基J与含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基中所扩增的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性。
实施例9的培养基J所扩增的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性为76.07%；而含10%胎牛血清的RPMI1640培养基所扩增的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性为53.48%。可见，实施例9的培养基J所扩增的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤能力明显高于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基所扩增的细胞。
综上所述，实施例9血清替代物组合J不仅能支持免疫杀伤细胞的体外高效扩增，而且扩增得到的免疫杀伤细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性强，明显优于同类产品。
实施例10
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L ；
转铁蛋白 4mg/L；
牛血清白蛋白 4000 mg/L ；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 0.8 mg/L；
β-甘油磷酸二钠 300mg/L；
柠檬酸铵铁 0.46mg/L；
腐胺 0.25mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例9）
实施例10制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合K。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合K按照所述浓度添加到DMEM/F12培养基和IMDM培养基以1︰1的体积混合成的基础培养基，制成培养基K。
2、取5mL所述培养基K置于T25细胞培养基方瓶中，将脐血单个核细胞以1×106cells/mL的密度接种入其中；添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5% CO2的培养箱内培养十四天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基作为对照组。
3、十四天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增细胞中各类免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+细胞比例越高，说明扩增效果越好。
细胞扩增倍数结果参见图13：实施例10培养基K中细胞的扩增倍数为15.10±1.33；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为7.14±1.48。培养基K的总细胞扩增倍数明显高于对照组。
免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图14。培养基K扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为97.29%，CD8+细胞的比例为75.84%，CD3+CD56+细胞的比例为25.18%；
含10%胎牛血清的RPMI1640扩增的细胞中CD3+细胞的比例为96.84%，CD8+细胞的比例为82.46%，CD3+CD56+细胞的比例为30.89%。
这说明：实施例10的培养基K可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
实施例11
（一）一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其各种成分的最终浓度为，单位为毫克/升（mg/L）：
胰岛素 10mg/L；
转铁蛋白 4mg/L；
牛血清白蛋白 4000mg/L；
乙醇胺 0.8mg/L；
α-硫代甘油 7mg/L；
亚麻酸 1mg/L；
胆固醇 0.8mg/L；
柠檬酸铵铁 1mg/L；
β-甘油磷酸二钠 1500mg/L；
腐胺 0.8mg/L。
（二）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制备方法（同实施例9）
实施例11制备的血清替代物组合标记为血清替代物组合L。
（三）本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的实施与对照
1、将上述血清替代物组合L按照所述浓度添加到RPMI1640培养基中，制成培养基L。
2、取5mL所述培养基L置于T25细胞培养基方瓶中，将脐血单个核细胞以1×106cells/mL的密度接种入其中；添加1000U/mL的IFN-γ；20ng/mL的OKT-3；200 U/mL的IL-2；100 U/mL的IL-1α；0.1μg/mL的PHA；在37℃、5%CO2的培养箱内培养十四天。同时设置含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基作为对照组。
3、十四天后取样，使用血球计数板，用0.4%的台盘兰染色计活细胞数数，得到活细胞的密度，计算得到总细胞扩增倍数；同时，采用流式细胞术检测扩增细胞中各类免疫杀伤细胞的比例，特别是其中主要效应细胞CD3+CD56+细胞的比例。扩增倍数越高，CD3+CD56+细胞比例越高，说明扩增效果越好。
细胞扩增倍数结果参见图15：实施例11培养基L中细胞的扩增倍数为38.10；含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基对照组为49.00。
免疫杀伤细胞的比例分析结果参见图16：培养基L扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为98.76%，CD8+细胞的比例为56.74%，CD3+CD56+细胞的比例为11.17%；
含10%胎牛血清的RPMI1640扩增后的细胞中CD3+细胞的比例为99.54%，CD8+细胞的比例为72.03，CD3+CD56+细胞的比例为6.35%。
说明，实施例11的培养基L可支持免疫杀伤细胞的体外无血清扩增。
Claims (2)
1.一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，其成分组成包括：胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、乙醇胺、α-硫代甘油、亚麻酸、胆固醇，所述各成分添加到常规培养基中的最终浓度为，单位毫克/升：
2.根据权利要求1所述的用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，在所述血清替代物组合能再添加柠檬酸铵铁、β-甘油磷酸二钠和腐胺；所述柠檬酸铵铁、β-甘油磷酸二钠和腐胺添加到常规培养基中的最终浓度为：柠檬酸铵铁0.46～2.3mg/L；β-甘油磷酸二钠300～1500mg/L；腐胺0.25～1.25mg/L。
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Citations (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (4)
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| 体外大量扩增CIK 细胞的研究;康自珍 等;《细胞与分子免疫学杂志》;20021231;第18卷(第5期);全文 |
| 动物无血清细胞培养基的研究现状及进展;王祎;《科技文汇》;20081031;全文 |
| 哺乳动物细胞无血清培养基研究进展;杨学义 等;《动物医学进展》;20111231;第32卷(第2期);全文 |
| 无血清培养基的研究进展;梁菁 等;《西北药学杂志》;20090831;第24卷(第4期);全文 |
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