CN105462924B - Nk细胞的培养方法及无血清培养基组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了NK细胞培养方法及无血清培养基组合。所述NK细胞无血清培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分。NK细胞的培养方法分阶段依次使用本发明诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。本发明NK细胞无血清培养基组合包含诱导培养基、增殖培养基和活化培养基，是分别针对NK细胞诱导、增殖和活化时期的不同影响需求而设计的，培养得到的NK细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术。
Description
技术领域
本发明涉及NK细胞的培养领域，特别是涉及NK细胞的培养方法及无血清培养基组合。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是机体天然免疫的主要细胞，在识别靶细胞上具有非特异性，通过靶细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的作用参与NK细胞的识别过程。另外，NK细胞通过分泌穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等对靶细胞进行杀伤作用。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，被称为自然杀伤活性。因此，NK细胞在细胞免疫治疗中具有重要作用。
现有的细胞免疫治疗中的NK细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有NK细胞的培养基主要是由基础培养基、自体血浆(或动物血清)和各种因子培养组成，培养得到的NK细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了NK细胞在免疫细胞治疗中的应用。
所以，NK细胞无血清培养基的研究成为免疫细胞治疗中一个重要的突破点，人们开始尝试用含有多种氨基酸、无机盐、维生素和细胞因子的培养基培养NK细胞。如公开号为CN 103849600 A的中国发明专利申请公开了一种适用于培养NK细胞的无血清培养基，由基础培养基组份I、NK细胞特异性培养组份II以及水组成。所述基础培养基组份I是由以下浓度的组分组成的：无水氯化钙29mg/L，i-肌醇15mg/L，L-酪氨酸4.5mg/L，L-蛋氨酸4mg/L，L-缬氨酸13.5mg/L，L-苯丙氨酸6mg/L，D-葡萄糖1800mg/L，盐酸吡哆醇0.055mg/L，次黄嘌呤5mg/L，L-丝氨酸8mg/L，氯化钠7500mg/L，核黄素0.028mg/L，亚油酸0.079mg/L，L-苏氨酸13mg/L，磷酸氢二钠135mg/L，盐酸硫胺0.25mg/L，硫辛酸0.19mg/L，L-天门冬酰胺14.4mg/L，L-精氨酸盐酸盐200mg/L，L-天门冬氨酸13.5mg/L，1，4－丁二胺二盐酸盐0.18mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐29mg/L，L-谷氨酰胺124mg/L，L-谷氨酸13.9mg/L，丙酮酸钠105mg/L，氯化胆碱12.9mg/L，甘氨酸7mg/L，L-亮氨酸13.4mg/L，维生素H 0.005mg/L，L-赖氨酸盐酸盐37.5mg/L，L-组氨酸盐酸盐14mg/L，L-脯氨酸25.6mg/L。所述NK细胞特异性培养组份II是由以下浓度的组分组成的：表皮生长因子50mg/L，CD16单抗70mg/L，神经生长因子10mg/L，IL-2160mg/L，成纤维素细胞生长因子50mg/L，IL-1850mg/L，卵泡刺激因子150mg/L，IL-12100mg/L，CD3单抗100mg/L，CD125单抗100mg/L。
现有技术中虽然对NK细胞的培养基进行了较大改进，但整个培养过程中都使用同一种培养基。使用现有培养基和培养方法获得的NK细胞的细胞数量、细胞活率和杀伤活性等仍有待进一步提高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能更高效的扩增和活化NK细胞的培养基组合，使获得的NK细胞的数量更多、增殖倍数更高和杀伤效果更佳。
本发明的第二个目的在于提供一种NK细胞的培养方法。
本发明的第一个目的通过以下技术方案予以实现：
一种NK细胞无血清培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分。
所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸250.0-320.0mg/L，L-门冬酰胺40.0-60.0mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐55.15-85.15mg/L，L-谷氨酸15.00-25.00mg/L，甘氨酸8.00-12.00mg/L，L-组氨酸13.00-16.00mg/L，L-羟脯氨酸18.00-22.00mg/L，L-异亮氨酸35.00-55.00mg/L，L-亮氨酸40.00-60.00mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30.00-50.00mg/L，L-甲硫氨酸12.00-18.00mg/L，L-苯丙氨酸12.00-18.00mg/L，L-脯氨酸18.00-22.00mg/L，L-丝氨酸25.00-32.00mg/L，L-苏氨酸18.00-22.00mg/L，L-色氨酸2.00-6.00mg/L，L-酪氨酸20.19-25.89mg/L，L-缬氨酸18.00-22.00mg/L，神经细胞生长因子0.50-60.00ng/mL，L-门冬氨酸12.00-25.00mg/L，无水氯化钙28.00-32.00mg/L，氯化钾300.00-500.00mg/L，氯化钠5800.00-6500.00mg/L，葡萄糖1800.00-2200.00mg/L，还原谷胱甘肽0.70-1.20mg/L，维生素B120.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200.00-400.00mg/L，生物素0.20-0.50mg/L，次黄嘌呤3.00-5.00mg/L，叶酸0.80-1.00mg/L，i-肌醇32.00-36.00mg/L，烟酰胺0.80-1.40mg/L，氯化胆碱2.50-3.20mg/L，盐酸吡哆醇0.80-1.20mg/L，核黄素0.20-0.40mg/L，盐酸硫胺素0.80-1.00mg/L，表皮细胞生长因子0.50-50.00ng/mL，卵泡刺激因子80.00-100.00ng/mL。
优选地，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸290.00mg/L，L-门冬酰胺50.00mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸20.00mg/L，甘氨酸10.00mg/L，L-组氨酸15.00mg/L，L-羟脯氨酸20.00mg/L，L-异亮氨酸50.00mg/L，L-亮氨酸50.00mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40.00mg/L，L-甲硫氨酸15.00mg/L，L-苯丙氨酸15.00mg/L，L-脯氨酸20.00mg/L，L-丝氨酸30.00mg/L，L-苏氨酸20.00mg/L，L-色氨酸5.00mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20.00mg/L，神经细胞生长因子5.00ng/mL，L-门冬氨酸20.00mg/L，无水氯化钙30.00mg/L，氯化钾400.00mg/L，氯化钠6000.00mg/L，葡萄糖2000.00mg/L，还原谷胱甘肽1.00mg/L，维生素B120.005mg/L，L-谷氨酰胺300.00mg/L，生物素0.20mg/L，次黄嘌呤4.00mg/L，叶酸1.00mg/L，i-肌醇35.00mg/L，烟酰胺1.00mg/L，氯化胆碱3.00mg/L，盐酸吡哆醇1.00mg/L，核黄素0.20mg/L，盐酸硫胺素1.00mg/L，表皮细胞生长因子5.00ng/mL，卵泡刺激因子80.00ng/mL。
优选地，诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体10-100μg/L，白细胞介素-2(IL-2)10-200μg/L，白细胞介素-12(IL-12)10-100μg/L，白细胞介素-15(IL-15)10-150μg/L，白细胞介素-18(IL-18)10-100μg/L，白细胞介素-21(IL-21)10-200μg/L。
更优选地，所述诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体50μg/L，白细胞介素-220μg/L，白细胞介素-1240μg/L，白细胞介素-1520μg/L，白细胞介素-1840μg/L，白细胞介素-2120μg/L。
优选地，增殖组分及含量为：白细胞介素-210-400μg/L，白细胞介素-1510-400μg/L，白细胞介素-1810-500μg/L，CD16单克隆抗体10-400μg/L。
更优选地，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-240μg/L，白细胞介素-1520μg/L，白细胞介素-1840μg/L，CD16单克隆抗体20μg/L。
优选地，活化组分及含量为：白细胞介素-210-100μg/L，白细胞介素-1510-100μg/L，INF-α10-100μg/L，TNF-α10-200μg/L，白细胞调节素(LR)10-100μg/L。
更优选地，所述活化组分及含量为：白细胞介素-210μg/L，白细胞介素-1510μg/L，INF-α20μg/L，TNF-α40μg/L，白细胞调节素40μg/L。
优选地，所述诱导培养基、增殖培养基和活化培养基用于NK细胞不同培养阶段。
本发明的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
一种NK细胞的培养方法，分阶段依次使用诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。
优选地，所述NK细胞的培养方法包括以下步骤：
S1、使用上述诱导培养基培养PBMC 3-4天；
S2、更换为上述增殖培养基培养至第10-12天；
S3、更换为上述活化培养基培养至第14天，得到成熟的NK细胞。
优选地，PBMC的接种密度为0.5×106-2×106cells/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明NK细胞无血清培养基组合包含诱导培养基、增殖培养基和活化培养基，是分别针对NK细胞诱导、增殖和活化时期的不同影响需求而设计的，培养得到的NK细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术。
(2)本发明NK细胞无血清培养基组合的三种培养基中使用相同的基础培养基，便于NK细胞无血清培养基组合的大量配制；基础培养基及诱导组分、增殖组分和活化培组分均不含动物血清，避免了由动物血清对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成的不确定影响。
(3)本发明NK细胞的培养方法分阶段依次使用诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养，大大提高了NK细胞得率，增加了NK细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
附图说明
图1是效果实施例1中的增殖曲线图。
图2是效果实施例2中对照组1的流式检测图。图2A为FSC-SSC散点图，图2B的右下象限即为CD3-CD56+的表达率。
图3是效果实施例2中实验组3的流式检测图。图3A为FSC-SSC散点图，图3B的右下象限即为CD3-CD56+的表达率。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。本发明中所用的试剂均为市售试剂，所用的培养基的配制方法、检测方法、培养方法等均为本领域人员所熟知的，在此不再赘述。
实施例1、NK细胞无血清培养基
为了更清楚的说明本实施例NK细胞无血清培养基组合的组分，下面采用表格的形式将其列出。其中表1为基础培养基的组分及其含量，表2为诱导组分、增殖组分和活化组分及含量，分别按照下述含量将诱导组分、增殖组分和活化组分添加到基础培养基中，即可得到诱导培养基、增殖培养基和活化培养基。
表1、基础培养基的组分及其含量
表2、实施例1中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
实施例2、NK细胞无血清培养基
本实施例中基础培养基的成分如表3所示，诱导组分、增殖组分和活化组分及含量如表4所示。
表3、基础培养基组分及含量
表4、实施例2中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
实施例3、NK细胞无血清培养基
本实施例中基础培养基的组分如表5所示，诱导组分、增殖组分和活化组分及含量如表6所示。
表5、实施例3中基础培养基组分及含量
表6、实施例3中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
实施例4、NK细胞无血清培养基
本实施例中基础培养基的组分与实施例1相同，诱导组分、增殖组分和活化组分及含量如表7所示。
表7、实施例4中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
对比例1、NK细胞无血清培养基
本对比例中基础培养基、特异性组分及含量分别如表8所示。
表8、对比例1中的NK细胞无血清培养基
实施例5、NK细胞的培养方法
采用常规方法自外周血中分离出单个核细胞(PBMC)，平均分成5组，每组初始细胞量为8×106，分别进行NK细胞培养。
其中，4组PBMC采用本发明NK细胞的培养方法进行培养，分别为实验组1-4，培养方法如下：
S1、按1×106cells/mL密度将PBMC接种于T75培养瓶，分别添加实施例1-4中的诱导培养基，培养4天；
S2、第5天，更换为实施例1-4中的增殖培养基继续培养，培养至第10天；
S3、第11天，更换为实施例1-4中的活化培养基继续培养至第14天，得到成熟的NK细胞。
另一组PBMC采用常规方法培养，作为对照组1，培养方法为：按1×106cells/mL密度将PBMC接种于T75培养瓶，添加对比例1中的培养基进行培养至第14天，收获成熟的NK细胞。
实验组和对照组中未说明的其他条件均相同，且采用现有技术中的常规条件，如培养温度37℃和二氧化碳的含量为5％等。
效果实施例1、增殖效果检测
在实施例5所述的对照组1和实验组1-4的培养过程中每两天取样进行细胞计数(台盼蓝染色法)，绘制增殖曲线，如图1所示。在培养结束后再进行细胞总量、增殖倍数、细胞活率的测定和计算，结果如表9所示。
表9、对照组和各实验组的细胞总量、增殖倍数和活率
| 组别 | 细胞总量(cells) | 增殖倍数 | 细胞活率 |
| 实验组1 | 1.88×10<sup>9</sup> | 235 | 96.43％ |
| 实验组2 | 2.32×10<sup>9</sup> | 290 | 95.23％ |
| 实验组3 | 2.48×10<sup>9</sup> | 310 | 95.77％ |
| 实验组4 | 2.28×10<sup>9</sup> | 285 | 96.12％ |
| 对照组1 | 1.27×10<sup>9</sup> | 158.75 | 95.78％ |
由表9和图1可知，在第1-6天，实验组和对照组的细胞数量基本相同，第6天开始至培养结束，实验组的增殖速度都明显快于对照组。实验组之间的增殖速度在第1至第10天基本相同，第10天之后，实验组1的增殖速度要稍慢于实验组2-4，实验组3的增殖速度最快。
实验组1的细胞总量为1.88×109个细胞，其增殖倍数为235倍，实验组2-4的细胞总量为2.28×109-2.48×109个细胞，其增殖倍数为285-310倍，细胞总量和增殖倍数都远远大于对照组。实验组和对照组的细胞活率基本相当，都在95％以上，说明本发明方法获得的细胞活率良好。
效果实施例2、流式检测
采用常规方法对实施例5中所述的实验组1-4和对照组1培养得到的NK细胞进行流式检测，考察其表面抗原CD3和CD56的表达情况。结果如图2-3和表10所示。
表10、流式检测结果
由表10和图2-3可知，实验组NK细胞中CD3-CD56+细胞的比例明显高于对照组1中CD3-CD56+细胞的比例，说明采用本发明培养基和方法获得的NK细胞纯度更高。
效果实施例3、杀伤活性检测
采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法对实施例5中所述的实验组1-4和对照组1培养得到的NK细胞进行K562细胞(人白血病细胞)的杀伤活性检测。结果如表11所示。
表11、杀伤活性检测结果
| 组别 | 效靶比(10:1) | 效靶比(20:1) | 效靶比(40:1) |
| 实验组1 | 0.82 | 0.88 | 0.93 |
| 实验组2 | 0.79 | 0.86 | 0.92 |
| 实验组3 | 0.81 | 0.89 | 0.94 |
| 实验组4 | 0.82 | 0.86 | 0.93 |
| 对照组1 | 0.56 | 0.68 | 0.80 |
由表11可知，实验组NK细胞的杀伤活性在效靶比10:1时为0.8左右，在效靶比20:1时为0.86-0.89，在效靶比40:1时为0.9以上，均高于相同效靶比情况下的对照组NK细胞的杀伤活性。说明采用本发明培养基和方法获得的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性更强。
本发明并不限于以上实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变通，这些变通也属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，包括诱导培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分；
所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸250.0-320.0mg/L，L-门冬酰胺40.0-60.0mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐55.15-85.15mg/L，L-谷氨酸15.00-25.00mg/L，甘氨酸8.00-12.00mg/L，L-组氨酸13.00-16.00mg/L，L-羟脯氨酸18.00-22.00mg/L，L-异亮氨酸35.00-55.00mg/L，L-亮氨酸40.00-60.00mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30.00-50.00mg/L，L-甲硫氨酸12.00-18.00mg/L，L-苯丙氨酸12.00-18.00mg/L，L-脯氨酸18.00-22.00mg/L，L-丝氨酸25.00-32.00mg/L，L-苏氨酸18.00-22.00mg/L，L-色氨酸2.00-6.00mg/L，L-酪氨酸20.19-25.89mg/L，L-缬氨酸18.00-22.00mg/L，神经细胞生长因子0.50-60.00ng/mL，L-门冬氨酸12.00-25.00mg/L，无水氯化钙28.00-32.00mg/L，氯化钾300.00-500.00mg/L，氯化钠5800.00-6500.00mg/L，葡萄糖1800.00-2200.00mg/L，还原谷胱甘肽0.70-1.20mg/L，维生素B12 0.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200.00-400.00mg/L，生物素0.20-0.50mg/L，次黄嘌呤3.00-5.00mg/L，叶酸0.80-1.00mg/L，i-肌醇32.00-36.00mg/L，烟酰胺0.80-1.40mg/L，氯化胆碱2.50-3.20mg/L，盐酸吡哆醇0.80-1.20mg/L，核黄素0.20-0.40mg/L，盐酸硫胺素0.80-1.00mg/L，表皮细胞生长因子0.50-50.00ng/mL，卵泡刺激因子80.00-100.00ng/mL；
诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体10-100μg/L，白细胞介素-2 10-200μg/L，白细胞介素-12 10-100μg/L，白细胞介素-15 10-150μg/L，白细胞介素-18 10-100μg/L，白细胞介素-21 10-200μg/L；
活化组分及含量为：白细胞介素-2 10-100μg/L，白细胞介素-15 10-100μg/L，INF-α10-100μg/L，TNF-α10-200μg/L，白细胞调节素10-100μg/L；
增殖组分及含量为：白细胞介素-2 10-400μg/L，白细胞介素-15 10-400μg/L，白细胞介素-18 10-500μg/L，CD16单克隆抗体10-400μg/L。
2.根据权利要求1所述的NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸290.00mg/L，L-门冬酰胺50.00mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸20.00mg/L，甘氨酸10.00mg/L，L-组氨酸15.00mg/L，L-羟脯氨酸20.00mg/L，L-异亮氨酸50.00mg/L，L-亮氨酸50.00mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40.00mg/L，L-甲硫氨酸15.00mg/L，L-苯丙氨酸15.00mg/L，L-脯氨酸20.00mg/L，L-丝氨酸30.00mg/L，L-苏氨酸20.00mg/L，L-色氨酸5.00mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20.00mg/L，神经细胞生长因子5.00ng/mL，L-门冬氨酸20.00mg/L，无水氯化钙30.00mg/L，氯化钾400.00mg/L，氯化钠6000.00mg/L，葡萄糖2000.00mg/L，还原谷胱甘肽1.00mg/L，维生素B12 0.005mg/L，L-谷氨酰胺300.00mg/L，生物素0.20mg/L，次黄嘌呤4.00mg/L，叶酸1.00mg/L，i-肌醇35.00mg/L，烟酰胺1.00mg/L，氯化胆碱3.00mg/L，盐酸吡哆醇1.00mg/L，核黄素0.20mg/L，盐酸硫胺素1.00mg/L，表皮细胞生长因子5.00ng/mL，卵泡刺激因子80.00ng/mL。
3.根据权利要求1所述的NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体50μg/L，白细胞介素-2 20μg/L，白细胞介素-12 40μg/L，白细胞介素-15 20μg/L，白细胞介素-18 40μg/L，白细胞介素-21 20μg/L。
4.根据权利要求1所述的NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-2 40μg/L，白细胞介素-15 20μg/L，白细胞介素-1840μg/L，CD16单克隆抗体20μg/L。
5.根据权利要求1所述的NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述活化组分及含量为：白细胞介素-2 10μg/L，白细胞介素-15 10μg/L，INF-α20μg/L，TNF-α40μg/L，白细胞调节素40μg/L。
6.根据权利要求1所述的NK细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述诱导培养基、增殖培养基和活化培养基用于NK细胞不同培养阶段。
7.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，分阶段依次使用权利要求1-5任一项所述的诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。
8.根据权利要求7所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用上述诱导培养基培养PBMC 3-4天；
S2、更换为上述增殖培养基培养至第10-12天；
S3、更换为上述活化培养基培养至第14天，得到成熟的NK细胞。
9.根据权利要求8所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，PBMC的接种密度为0.5×106-2×106cells/mL。
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