CN107475196B - 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，应用该细胞培养基质的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin‑NK抗体联合上述细胞培养基质中的IL‑2、IL‑12、IL‑15和IL‑21细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。

Description

自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature Killer cells,NK)是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能，其无须抗原预先致敏就可以直接识别，并且非特异性地杀伤肿瘤细胞，是人体防御体系的第一道屏障。自然杀伤细胞具有强大的细胞毒活性，它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高；同时，自然杀伤细胞的杀伤活性无需抗原刺激，也不受MHC分子的限制；此外，自然杀伤细胞还具有强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。正因为自然杀伤细胞所具有的上述特点，其在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，被认为是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。但自然杀伤细胞是淋巴细胞中的稀有亚群，在外周血淋巴细胞中约只占10％～20％。正常人体外周血中的自然杀伤细胞含量远不能满足临床治疗的需要。
现有自然杀伤细胞的培养方法主要包括以下几种：
(1)使用饲养层细胞培养法，如使用病毒转染的B淋巴细胞或肿瘤细胞，以提高自然杀伤细胞扩增倍数。
(2)免疫磁珠分选系统阴性分选法，从人源外周血单个核细胞中获得少量自然杀伤细胞后，应用不同细胞因子组合培养，以获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的自然杀伤细胞。
(3)自然杀伤细胞分离试剂盒法，使用商品化试剂盒进行自然杀伤细胞培养。
但上述这些培养方法都具有一定程度的缺点，其中，采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作为饲养层细胞以提高自然杀伤细胞扩增倍数的方法，生产工艺繁琐且安全性尚待探讨；采用免疫磁珠分选系统阴性分选法进行自然杀伤细胞培养，生产成本较高；而采用分离试剂盒的方法，因高纯度的自然杀伤细胞在体外扩增效率很低，尚难满足大规模实验以及临床肿瘤免疫治疗的需求。目前大多数自然杀伤细胞培养方法均难以同时满足细胞纯度高、细胞毒性强、扩增倍数高等要求。
因此，研究开发一种能够在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞的细胞培养基质和细胞培养方法，进而获得纯度高，细胞毒性强的自然杀伤细胞变得十分的必要与紧迫。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞。
本发明的第二目的在于提供一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。
本发明提供的一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；
上述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-21。
进一步的，上述无血清培养基由X-VIVO 15培养基和AlyS505NK-AC培养基组成，上述X-VIVO 15培养基和AlyS505NK-AC培养基的质量比为1：1～2：1。
进一步的，上述自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为0～5％。
进一步的，上述IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为2～8ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10～30ng/mL；IL-21细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5～15ng/mL。
更进一步的，IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为20ng/mL；IL-21细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10ng/mL。
本发明提供的一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，所述方法包括：使用上述的细胞培养基质在抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤细胞；
其中，所述诱导培养的时间为10～20天；所述抗体为Lymactin-NK抗体；
优选的，上述Lymactin-NK抗体的浓度为0.3～0.9mg/mL。
进一步的，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL。
更进一步的，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.5×106/mL。
进一步的，上述诱导培养的过程中还包括对培养基进行补液的步骤；
优选的，在诱导培养过程中每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；
进一步的，所述诱导培养的时间为14天，在诱导培养过程中进行补液的具体步骤为：
在诱导培养过程第1～7天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；
在诱导培养过程第8～14天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加IL-2和IL-15细胞因子。
进一步的，上述补液培养基为无血清培养基AIM-V。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，所述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-21。该培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞，上述IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等细胞因子均可促进NK细胞活化增殖、分泌多种细胞因子和增强其细胞毒作用。同时，本发明培养基质使用无血清培养基对自然杀伤细胞进行培养也避免了应用血清培养基进行细胞培养所导致的异源动物血清带来的潜在危险。
本发明提供的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin-NK抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的NK细胞扩增倍数结果图；
图2为本发明实施例5提供的NK细胞培养流式结果图；
图3为本发明实施例6提供的NK细胞杀伤效果结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种自然杀伤细胞培养基质，所述培养基质主要由以下成分组成：无血清培养基、自体血浆和细胞因子；
上述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-21。
本发明自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，所述细胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-21。该培养基质能够大量高效的将人源外周血单个核细胞诱导培养为自然杀伤细胞，上述IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等细胞因子均可促进NK细胞活化增殖、分泌多种细胞因子和增强其细胞毒作用，其中：
IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，广泛应用于促进T细胞和NK细胞的活化和增殖。IL-2能够刺激NK细胞增殖、增加细胞毒作用并刺激NK细胞分泌多种细胞因子。
IL-12即白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)，是活化NK细胞的生长因子，主要刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ)，增强其免疫调节功能。
IL-15即白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，可活化NK细胞，NKT细胞和γδT细胞。IL-2和IL-15在增强NK细胞杀伤功能及促进其扩增作用方面有协同作用。
IL-21即白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)，与其他IL-2家族成员一样通过一个特异性受体亚单位及IL-2受体γc亚单位复合受体发挥其生物学功能。IL-21可增强NK细胞的细胞毒性而不引起活化产生的细胞凋亡。
同时，本发明培养基质使用无血清培养基对自然杀伤细胞进行培养避免了应用血清培养基进行细胞培养所导致的异源动物血清带来的潜在危险。
在本发明的一种优选实施方式中，上述无血清培养基由X-VIVO 15培养基和AlyS505NK-AC培养基组成，上述X-VIVO 15培养基和AlyS505NK-AC培养基的质量比为1:2～2:1。
在本发明的一种优选实施方式中，上述自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为0～5％。
在本发明的一种优选实施方式中，上述IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为500～1500IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为2～8ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10～30ng/mL；IL-21细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5～15ng/mL。
本发明中，IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中典型但非限制性的浓度为：500IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、1000IU/mL、1100IU/mL或1200IU/mL或1500IU/mL。
本发明中，IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中典型但非限制性的浓度为：2ng/mL、5ng/mL或8ng/mL。
本发明中，IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中典型但非限制性的浓度为：10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、20ng/mL、22ng/mL、25ng/mL、28ng/mL或30ng/mL。
本发明中，IL-21细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中典型但非限制性的浓度为：5ng/mL、10ng/mL或15ng/mL。
在上述优选实施方式中，IL-2细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为1000IU/mL；IL-12细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5ng/mL；IL-15细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为20ng/mL；IL-21细胞因子在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为10ng/mL。
根据本发明的一个方面，一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，所述方法包括：使用上述的细胞培养基质在抗体包被后的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞，得到自然杀伤细胞；
其中，所述诱导培养的时间为10～20天，所述抗体为Lymactin-NK抗体；
优选的，所述Lymactin-NK抗体的包被时间为1.5～2.5h，包被温度为25～37℃
本发明自然杀伤细胞的扩增培养方法包括以下培养步骤，首先采集外周血，随后使用淋巴细胞分离液分离得到人源外周血单个核细胞，同时，将Lymactin-NK抗体包被在细胞培养瓶中；然后使用上述的细胞培养基质在Lymactin-NK抗体包被的细胞培养瓶中诱导培养人源外周血单个核细胞10～20天，得到自然杀伤细胞。该扩增培养方法中Lymactin-NK抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤细胞。NKG2D激活型受体表达于自然杀伤细胞表面，Lymactin-NK抗体与NKG2D的主要配体结合，可特异地活化自然杀伤细胞功能，进而增强细胞杀伤活性。上述方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。
优选的，上述Lymactin-NK抗体的浓度为0.3～0.9mg/mL。
本发明中，Lymactin-NK抗体典型但非限制性的浓度为：0.3mg/mL、0.5mg/mL或0.9mg/mL。
在本发明的一种优选实施方式中，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL。
本发明中，诱导培养过程中培养基质中的细胞密度典型但非限制性的为：1.0×106/mL、1.5×106/mL或2.0×106/mL。
在上述优选实施方式中，上述诱导培养过程中培养基质中的细胞密度为1.5×106/mL。
在本发明的一种优选实施方式中，上述诱导培养的过程中还包括对培养基进行补液的步骤；
优选的，在诱导培养过程中每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；
在本发明的一种优选实施方式中，所述诱导培养的时间为14天，在诱导培养过程中进行补液的具体步骤为：
在诱导培养过程第1～7天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；
在诱导培养过程第8～14天，每2～4天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.0×106/mL～2.0×106/mL，并补加IL-2和IL-15细胞因子。
在本发明的一种优选实施方式中，上述补液培养基为无血清培养基AIM-V。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1：Lymactin-NK抗体包被
将浓度为0.6mg/mL的Lymactin-NK抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h，得到包被后的细胞培养瓶。
实施例2：制备自体血浆和人源外周血单个核细胞
采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在2000rmp，20℃的离心条件下离心10分钟得到自体血浆；随后使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞，将收集到的人源外周血单个核细胞用PBS缓冲液清洗三次，得到人源外周血单个核细胞。
其中，使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞的步骤具体包括：
1、将吸取血浆后的血液样本按照1：1的比例加入PBS，混匀；
2、将稀释后的血液样本缓慢加在淋巴细胞分离液面上，稀释后的血液样本与淋巴细胞分离液的比例为1：1；
3、离心，转速2000rpm，时间15min，慢升慢降，离心温度为20℃；
4、离心后吸取单个核细胞层细胞。
实施例3：诱导培养
步骤1：使用X-VIVO 15:AlyS505NK-AC＝1:1的无血清培养基重悬实施例2得到的人源外周血单个核细胞，并将培养基中的细胞浓度调整至1.5×106/mL，随后接种至实施例1得到的包被有Lymactin-NK抗体的细胞培养瓶中；
步骤2：将实施例2中得到的自体血浆加入上述步骤1细胞培养瓶中，自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5％，并添加细胞因子：IL-2(1000IU/mL)，IL-12(5ng/mL)，IL-15(20ng/mL)，IL-21(10ng/mL)，随后进行诱导培养14天；
步骤3：在诱导培养过程中前7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；在诱导培养过程中后7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加IL-2和IL-15细胞因子；
步骤4：在诱导培养14天时收集自然杀伤细胞，将收集到的自然杀伤细胞用PBS缓冲液清洗3次，得到自然杀伤细胞。
实施例4细胞扩增倍数分析
分别在培养第0天、12天、14天取细胞计数，用台盼蓝染色后计数，计算扩增倍数及细胞活率，计数结果除以初始细胞数即为细胞扩增倍数。
结果分析：此方法可检测细胞的扩增情况，结果如下表和图1所示，人源外周血单个核细胞经14天培养后均可扩增100倍以上，能够满足临床治疗所需数量，表中NK细胞扩增倍数结果为重复实验数据的统计结果。
培养天数(天) 0天 12天 14天
扩增倍数 1 111.52±14.71 196.63±27.91
实施例5细胞纯度分析
在培养第14天时取细胞，PBS缓冲液清洗3次，洗涤后调整细胞浓度为1.5×105/mL，加入流式抗体，上述流式抗体具体为CD3-PE、CD4-FITC、CD16-PEcy5、CD25-APC、CD56-FITC、NKG2D-APC荧光标记单抗10μL。随后4℃避光孵育30min，PBS洗涤1次，PBS重悬后使用流式细胞仪进行细胞表型检测，其结果如图2所示。
图2中A为CD4+CD25+细胞占比：0.80％；B为CD3-CD56+细胞占比：88.71％；C为CD3-CD16+细胞占比：86.32％；D为CD16+CD56+细胞占比：96.16％；E为CD3-NKG2D+细胞占比：85.79％。
结果分析：结果如下表所示，细胞表型为CD3-CD56+、CD3-CD16+、CD3-NKG2D+、CD16+CD56+的细胞比例均大于80％，细胞表型为CD4+CD25+的细胞比例均小于5％，表明NK细胞纯度高。表中流式结果为重复实验数据的统计结果，图2为其中一次实验结果图。
实施例6细胞毒性分析
取培养至14天的细胞，用RPMI1640培养基重悬细胞为1×106/mL细胞悬液备用；
使用K562细胞作为靶细胞，使用含2％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞为1×105/mL细胞悬液备用；
均按照效靶比为1：1、5：1、10：1接种细胞至96孔板中，设置效应细胞孔和靶细胞孔，每种培养方法接3个副孔，37℃，5％CO2培养24h；使用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率，结果如下表和图3所示。表中NK细胞杀伤效果为重复实验数据的统计结果。
结果分析：培养的NK细胞杀伤效果明显。
效靶比 1：1 5：1 10：1
杀瘤率(％) 26.65±6.77 69.25±5.19 85.53±6.97
综合上述分析可知，本发明提供的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin-NK抗体联合上述细胞培养基质中的细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：使用X-VIVO 15:AlyS505NK-AC＝1:1的无血清培养基重悬人源外周血单个核细胞，并将培养基中的细胞浓度调整至1.5×106/mL，随后接种至包被有Lymactin-NK抗体的细胞培养瓶中；
步骤2：将自体血浆加入上述步骤1细胞培养瓶中，自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5％，并添加细胞因子：IL-2 1000IU/mL，IL-12 5ng/mL，IL-15 20ng/mL，IL-2110ng/mL，随后进行诱导培养14天；
步骤3：在诱导培养过程中前7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加自体血浆和IL-2、IL-12、IL-15、IL-21细胞因子；在诱导培养过程中后7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×106/mL，并补加IL-2和IL-15细胞因子；
步骤4：在诱导培养14天时收集自然杀伤细胞，将收集到的自然杀伤细胞用PBS缓冲液清洗3次，得到自然杀伤细胞；
所述步骤1包被有Lymactin-NK抗体的细胞培养瓶的制备方法为：将浓度为0.6mg/mL的Lymactin-NK抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h，得到包被后的细胞培养瓶；
所述步骤2自体血浆的制备方法为：采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在2000rpm ，20℃的离心条件下离心10分钟得到步骤2自体血浆；
所述步骤1人源外周血单个核细胞的制备方法为：采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在2000rpm ，20℃的离心条件下离心10分钟得到自体血浆；随后使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞，然后将收集到的人源外周血单个核细胞用PBS缓冲液清洗三次，得到步骤1人源外周血单个核细胞；其中，使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞的步骤具体包括：
1、将吸取血浆后的血液样本按照1：1的比例加入PBS，混匀；
2、将稀释后的血液样本缓慢加在淋巴细胞分离液面上，稀释后的血液样本与淋巴细胞分离液的比例为1：1；
3、离心，转速2000rpm，时间15min，慢升慢降，离心温度为20℃；
4、离心后吸取单个核细胞层细胞。
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