CN114196630B

CN114196630B - 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法

Info

Publication number: CN114196630B
Application number: CN202210048639.1A
Authority: CN
Inventors: 董坚; 顾加明; 袁露; 宋倩; 陈艳; 徐晓明; 田翎含
Original assignee: Individual
Current assignee: Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114196630A

Abstract

本发明实施例公开了一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明的NK细胞培养基中IL‑2、IL‑15和IL‑21协同增效，共同作用于脐带血来源的单个核细胞，得到大量高纯度、高杀伤活性、高细胞毒活性的NK细胞。本发明的NK细胞培养方法具有诱导效率高、扩增速度快的优点；在采用本发明的培养基进行NK细胞的培养过程中，无需引入肿瘤细胞，无需添加动物血清，避免了安全隐患，具有安全性高的优点；本发明的NK细胞培养基添加因子少，成本低，培养方法操作简便、高效，能够满足临床对NK细胞的需求。

Description

一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法

技术领域

本发明实施例涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞)是参与机体抵抗肿瘤和抗病毒感染以及免疫调节的重要免疫细胞，其在杀伤靶细胞的过程中无MHC限制性，不依赖抗体，通过直接和间接途径有效杀伤多种肿瘤细胞。因而在过继免疫治疗上有其独特的应用前景。由于不能从人体获得数量大、纯度高的人NK细胞，使NK细胞在免疫治疗中的应用受到了限制。

采用体外扩增的方法获得足够数量和较高纯度的人NK细胞，是近年来研究NK细胞功能特别是探讨过继免疫治疗的一个重要环节。因此，开发安全且能保证NK细胞增殖效率和肿瘤细胞杀伤效果的NK细胞培养体系尤为重要。目前市场上NK细胞培养基的成本偏高，并且添加的因子种类多，操作步骤繁琐。

申请号CN201910845554.4公开一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法。该培养方法在诱导阶段，每隔一天补加一次培养基，重复操作增加污染的风险；扩增培养使用培养瓶，封闭性差，增加污染的概率；该方法收获的NK细胞的纯度较低。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，以解决现有技术中NK细胞培养成本偏高、操作步骤繁琐、纯度低等问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种NK细胞培养基，所述NK细胞培养基包括包被液、诱导培养基和扩增培养基；其中，所述包被液包括抗CD16单克隆抗体和DPBS；所述诱导培养基包括IL-15、IL-21和基础培养基；所述扩增培养基包括IL-2和基础培养基。

进一步地，所述包被液中抗CD16单克隆抗体的浓度为1-5μg/mL，优选2.2-2.8μg/mL。

进一步地，所述诱导培养基中IL-15的浓度为40-80ng/mL，优选55-65ng/mL；所述IL-21的浓度为40-80ng/mL，优选55-65ng/mL。

进一步地，所述扩增培养基中IL-2的浓度为500-1500IU/mL，优选900-1100IU/mL。

进一步地，所述NK细胞培养基还包括自体灭活血浆。

进一步地，所述基础培养基为AIM-V培养基。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种采用上述的NK细胞培养基培养NK细胞的方法，包括以下步骤：

1)采用所述包被液对培养瓶进行包被；

2)将脐带血单个核细胞悬浮于所述诱导培养基，之后接种于包被好的培养瓶中，同时加入自体灭活血浆进行诱导培养，接种当天记为第0天；

3)培养至第5-6天，离心去上清，将所得沉淀细胞转入细胞培养袋中，加入所述扩增培养基和所述自体灭活血浆进行扩增培养；

4)培养至第8-9天，向所述细胞培养袋中加入所述扩增培养基继续进行扩增培养；

5)培养至第13-15天，即得到NK细胞。

在诱导培养结束后，转入细胞培养袋(容量可达到1000mL)进行扩增培养，与培养瓶相比，封闭性强，大大降低细胞污染，同时气体交换面积大，可获得更多数量的细胞。

进一步地，步骤2)中，所述自体灭活血浆的用量为所述诱导培养基体积的5％-12％，优选10％；步骤3)中，所述自体灭活血浆的用量为所述扩增培养基体积的1％-8％，优选5％。

进一步地，步骤2)中，所述诱导培养基的用量为20mL；步骤3)中，所述扩增培养基的用量为180-200mL；步骤4)中，所述扩增培养基的用量为600-800mL。

进一步地，所述脐带血单个核细胞的接种量为1×10⁶/mL-2×10⁶/mL。

本发明实施例具有如下优点：

本发明的NK细胞培养基中IL-2、IL-15和IL-21协同增效，用CD16单克隆抗体进行培养瓶包被，共同作用于脐带血来源的单个核细胞，得到大量高纯度、高杀伤活性、高细胞毒活性的NK细胞。本发明的NK细胞培养方法具有诱导效率高、扩增速度快的优点；在采用本发明的培养基进行NK细胞的培养过程中，无需引入肿瘤细胞，无需添加动物血清，避免了安全隐患，具有安全性高的优点；本发明的NK细胞培养基添加因子少，成本低，培养方法操作简便、高效，能够满足临床对NK细胞的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例3提供的NK细胞培养第0天流式图；

图2为本发明实施例3提供的NK细胞培养第5天流式图；

图3为本发明实施例3提供的NK细胞培养第14天流式图；

图4为本发明对比例1提供的NK细胞培养第14天流式图；

图5为本发明实施例3提供的NK细胞对K562肿瘤细胞杀伤活性图；

图6为本发明实施例3提供的NK细胞增殖曲线；

图7为本发明对比例1提供的NK细胞增殖曲线。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例及对比例中：

抗CD16单克隆抗体品牌为同立海源；

IL-15和IL-21品牌为peprotech Inc；

IL-2购自品牌为双鹭；

AIM-V培养基品牌为gibco；

淋巴细胞分离液品牌为天津灏洋；

1升NK细胞培养袋品牌为corning；

DPBS品牌为BI；

K562肿瘤细胞购自中科院昆明细胞库。

实施例1

本实施例提供一种脐带血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：

(A)全血分离及血浆处理

采集100mL脐带血平均分装到5支50mL离心管中，2500rpm离心20min，将离心后的血浆和血细胞分离开，上层血浆转移到新的离心管中，置于56.0℃水浴锅中热灭活30min，1000g离心5分钟后得到自体灭活血浆放4℃冰箱保存待用；

(B)分离脐带血单个核细胞：在15mL离心管中加入6mL淋巴分离液，将步骤(A)得到的血细胞用DPBS按照1:1的体积比例稀释后，以匀速慢速沿管壁加到淋巴分离液上层，淋巴分离液和稀释血细胞的体积比例为1:1；2500rpm离心20min，慢升慢降离心；

(C)脐带血单个核细胞洗涤：将步骤(B)得到的白膜层细胞用DPBS洗涤，1500rpm离心5min；

(D)获得脐带血单个核细胞：弃上清液。沉淀物即为脐带血单个核细胞，计数。

实施例2

本实施例提供一种NK细胞培养基，包括：

包被液，向DPBS中加入抗CD16单克隆抗体，配制成抗CD16单克隆抗体浓度为2.5μg/mL的包被液；

诱导培养基，向AIM-V培养基中加入IL-15和IL-21，配制成IL-15浓度为60ng/mL、IL-21浓度为60ng/mL的诱导培养基；

扩增培养基，向AIM-V培养基中加入IL-2，配制成IL-2浓度为1000IU/mL的扩增培养基。

实施例3

本实施例提供一种采用实施例2的NK细胞培养基培养NK细胞的方法，包括以下步骤：

(A)包被培养瓶：使用实施例2的包被液1mL，在37℃培养箱包被包被T75培养瓶30min以上，待用；

(B)将实施例1分离的脐带血单个核细胞按2×10⁷/mL悬浮到20mL实施例2的诱导培养基中，然后接种于包被好的T75培养瓶中，同时加入2mL实施例1步骤(A)得到的自体灭活血浆进行诱导培养，接种当天记为第0天，培养条件：恒温CO₂培养箱，温度37℃，CO₂浓度5％；

(C)诱导培养到第5天，所得培养液1500rpm离心5min，丢上清，将所得沉淀细胞转到1升NK细胞培养袋中，加入200mL实施例2的扩增培养基，同时加入10mL实施例1步骤(A)得到的自体灭活血浆进行扩增培养，培养条件：恒温CO₂培养箱，温度37℃，CO₂浓度5％；

(D)扩增培养到第8天，向NK细胞培养袋中加入800mL实施例2的扩增培养基继续进行扩增培养，培养条件：恒温CO₂培养箱，温度37℃，CO₂浓度5％；

(E)培养到第14天收获细胞：将所得培养液转到6个250mL离心管，1500rpm离心5min，收集细胞，取样计数，计活率，冻存或备用。

对比例1

本对比例提供一种培养NK细胞的方法与实施例3的区别仅在于使用的诱导培养基不同。本对比例使用的诱导培养基的配制方法：向AIM-V培养基中加入IL-15和IL-21，得到IL-15浓度为6ng/mL、IL-21浓度为100ng/mL的诱导培养基。

测试例

1、NK细胞中CD3-CD56+检测。

采用流式细胞术进行检测。图1-3分别是实施例3提供的NK细胞培养第0天、第5天及第14天流式图；图4为对比例1提供的NK细胞培养第14天流式图。结果显示：本发明提供的D0天到D14天扩增倍数可达到200-250倍，可获得数10亿的NK细胞，且D14天CD3-CD56+细胞比例可达89％以上，明显高于对比例1(75.64％)。

2、NK细胞杀伤活性的测定

采用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤效果。

图5为实施例3提供的NK细胞对K562肿瘤细胞杀伤活性图。结果显示：效靶比为5：1时的细胞杀伤率为51.14％，效靶比为10：1时的细胞杀伤率为66.58％，效靶比为20：1时的细胞杀伤率为87.46％，效靶比为40：1时的细胞杀伤率达100％，说明本发明的NK细胞杀伤活性高。

3、NK细胞增殖检测

采用血球计数板冲池计数的方法计数，间隔两天取样计数。图6为实施例3提供NK细胞增殖曲线，图7为对比例1提供NK细胞增殖曲线。

结果显示：与对比例1相比，本发明方法培养的NK细胞能大量稳定增殖，细胞活性高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种采用NK细胞培养基培养NK细胞的方法，其特征在于，所述NK细胞培养基包括包被液、诱导培养基和扩增培养基；其中，

所述包被液包括抗CD16单克隆抗体和DPBS，所述包被液中抗CD16单克隆抗体的浓度为1-5μg/mL；

所述诱导培养基包括IL-15、IL-21和基础培养基，所述诱导培养基中IL-15的浓度为40-80ng/mL，所述IL-21的浓度为40-80ng/mL；

所述扩增培养基包括IL-2和基础培养基，所述扩增培养基中IL-2的浓度为500-1500IU/mL；

所述方法包括以下步骤：

1）采用所述包被液对培养瓶进行包被；

2）将脐带血单个核细胞悬浮于所述诱导培养基，之后接种于包被好的培养瓶中，同时加入自体灭活血浆进行诱导培养，接种当天记为第0天；

3）培养至第5-6天，离心去上清，将所得沉淀细胞转入细胞培养袋中，加入所述扩增培养基和所述自体灭活血浆进行扩增培养；

4）培养至第8-9天，向所述细胞培养袋中加入所述扩增培养基继续进行扩增培养；

5）培养至第13-15天，即得到NK细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包被液中抗CD16单克隆抗体的浓度为2.2-2.8μg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基中IL-15的浓度为55-65ng/mL；所述IL-21的浓度为55-65ng/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基中IL-2的浓度为900-1100IU/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NK细胞培养基还包括自体灭活血浆。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述基础培养基为AIM-V培养基。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述自体灭活血浆的用量为所述诱导培养基体积的5%-12%；步骤3）中，所述自体灭活血浆的用量为所述扩增培养基体积的1%-8%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述诱导培养基的用量为20mL；步骤3）中，所述扩增培养基的用量为180-200mL；步骤4）中，所述扩增培养基的用量为600-800mL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带血单个核细胞的接种量为1×10⁶/mL-2×10⁶/mL。