CN108300694B - 一种nk细胞的无血清培养方法 - Google Patents

一种nk细胞的无血清培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：(1)从外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度，培养箱中静置培养过夜；(2)第2天，从培养液中吸出悬浮细胞，接种于细胞培养瓶，补加无血清培养基，同时添加抗CD16抗体、IL2和IL3；第4天，补加无血清培养基，添加IL2、IL3，继续培养至第6天；(3)第7天，补加无血清培养基，添加IL15、α‑半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；(4)离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型。本发明的优点在于：采用无血清培养方法，通过14天的体外培养，获得90％纯度以上、扩增倍数80倍以上的NK细胞。

Description

一种NK细胞的无血清培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞的无血清培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫系统中最重要的效应细胞，NK细胞具有强大的抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等功能，在肿瘤免疫治疗相关领域具有良好的应用前景。
NK细胞具有特殊的靶细胞识别机制，无须接触抗原分子即可杀伤肿瘤细胞，并且不同于T细胞的MHC限制性杀伤特性，NK细胞是非MHC限制性，通过释放杀伤介质主要有颗粒酶素和穿孔素使肿瘤细胞发生凋亡，表达TNF家族分子启动ADCC抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。
外周血中NK细胞含量较少，并且目前市面上多采用含血清培养基培养NK细胞，由于血清成分非常复杂、血清批次间差异大，并且可能含有病原性物质，对细胞制品质量造成严重影响。
据此，目前急需一种细胞纯度高、扩增倍数大的NK细胞的无血清培养方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种细胞纯度高、扩增倍数大的NK细胞的无血清培养方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25-35mL外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至(1-3)x106细胞/mL，培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的细胞培养瓶中，并补加无血清培养基至45-55mL，同时添加150-250ng/mL抗CD16抗体、450-550U/mL IL2(白细胞介素-2)和15-25ng/mL IL3(白细胞介素-3)；
第4天，补加无血清培养基至95-105mL，同时添加450-550U/mL IL2(白细胞介素-2)、15-25ng/mL IL3(白细胞介素-3)，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加无血清培养基至195-205mL，并添加45-55ng/mL IL15(白细胞介素-15)、95-105ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中于36-38℃、4％-6％CO2培养箱中静置培养过夜。
作为本发明的优选方式之一，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中细胞培养瓶为T175细胞培养瓶。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中添加的IL15具体浓度为50ng/mL。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中添加的α-半乳糖神经酰胺具体浓度为100ng/mL。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中于500g x10min离心条件下收集NK细胞。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述无血清培养基具体为KBM 581无血清培养基。
作为本发明的优选方式之一，所述KBM581无血清培养基直接购自市场，且成分具体包括：50-200U/mL IL-2、100-200mMβ-巯基乙醇、2-5mM丙酮酸钠、5-15mg/L转铁蛋白、5-15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)制备过程简单、方便，提供了一种NK细胞的无血清培养方法，通过14天的体外培养，可以获得90％纯度以上、扩增倍数达到80倍以上的NK细胞；
(2)NK细胞的继续培养阶段采用NK细胞因子与NK细胞激活剂共同刺激NK细胞培养；其中，更是采用α-半乳糖神经酰胺作为NK细胞激活剂，其通过与CD-1d配体的限制性结合，可特异激活自然杀伤(NK)细胞。
附图说明
图1是实施例1-3中的NK细胞的无血清培养方法流程图；
图2是实施例4中各实验条件下NK细胞的细胞扩增曲线图；
图3是实施例4中各实验条件下NK细胞的纯度柱状对比图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25mL外周血分离单个核细胞，重悬于KBM 581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至1x106细胞/mL，36℃、4％CO2培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的T175细胞培养瓶中，并补加KBM 581无血清培养基至45mL，同时添加150ng/mL抗CD16抗体、450U/mL IL2和15ng/mLIL3；
第4天，补加KBM 581无血清培养基至95mL，同时添加450U/mL IL2、15ng/mL IL3，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加KBM 581无血清培养基至195mL，并添加45ng/mL IL15、95ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，500g x10min离心收集NK细胞，同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从35mL外周血分离单个核细胞，重悬于KBM 581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至3x106细胞/mL，38℃、6％CO2培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的T175细胞培养瓶中，并补加KBM 581无血清培养基至55mL，同时添加250ng/mL抗CD16抗体、550U/mL IL2和25ng/mLIL3；
第4天，补加KBM 581无血清培养基至105mL，同时添加550U/mL IL2、25ng/mL IL3，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加KBM 581无血清培养基至205mL，并添加55ng/mL IL15、105ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，500g x10min离心收集NK细胞，同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从30mL外周血分离单个核细胞，重悬于KBM 581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至2x106细胞/mL，37℃、5％CO2培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的T175细胞培养瓶中，并补加KBM 581无血清培养基至50mL，同时添加200ng/mL抗CD16抗体、500U/mL IL2和20ng/mLIL3；
第4天，补加KBM 581无血清培养基至100mL，同时添加500U/mL IL2、20ng/mL IL3，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加KBM 581无血清培养基至200mL，并添加50ng/mL IL15、100ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，500g x10min离心收集NK细胞，同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
实施例4
本实施例用以说明上述实施例中“NK细胞的继续培养”步骤中采用不同浓度IL15(0ng/mL、50ng/mL、150ng/mL)及α-半乳糖神经酰胺(0ng/mL、100ng/mL、300ng/mL)对所得NK细胞的纯度、扩增倍数的影响，实验条件组合如表1所示。
表1不同浓度IL15及α-半乳糖神经酰胺对所得NK细胞的纯度、扩增倍数的影响
Figure BDA0001573008660000061
Figure BDA0001573008660000071
结果：将各实验条件下的NK细胞扩增倍数绘制成如图2所示的细胞扩增曲线图，将各实验条件下的NK细胞纯度绘制成如图3所示的柱状图；
由图2和3可知：(1)NK细胞的继续培养阶段，采用NK细胞因子(IL15)与NK细胞激活剂(α-半乳糖神经酰胺)共同刺激NK细胞培养，可明显提高最终细胞的纯度及扩增倍数；(2)按照实验条件1的浓度，NK细胞的纯度可达90％以上，并且其扩增倍数也最大，达到80倍以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25-35mL外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至(1-3)×106细胞/mL，培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的细胞培养瓶中，并补加无血清培养基至45-55mL，同时添加150-250ng/mL抗CD16抗体、450-550U/mL IL2和15-25ng/mL IL3；
第4天，补加无血清培养基至95-105mL，同时添加450-550U/mL IL2、15-25ng/mL IL3，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加无血清培养基至195-205mL，并添加45-55ng/mL IL15、95-105ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型；
所述步骤(1)中于36-38℃、4％-6％CO2培养箱中静置培养过夜；
所述步骤(3)中添加的α-半乳糖神经酰胺具体浓度为100ng/mL；
所述步骤(4)中于500g×10min离心条件下收集NK细胞；
所述无血清培养基具体为KBM581无血清培养基。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO2。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中细胞培养瓶为T175细胞培养瓶。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中添加的IL15具体浓度为50ng/mL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
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Address after: 215000 Room 301, floor 3, building F2, Suzhou 2.5 Industrial Park, No. 88, Dongchang Road, Suzhou Industrial Park, Suzhou area, free trade pilot zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Suzhou Yixi Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 16 / F, F5 building, phase II, innovation industrial park, 2800 innovation Avenue, high tech Zone, Hefei City, Anhui Province, 230000

Patentee before: Hefei Yixi Biotechnology Co.,Ltd.