CN113881629A - 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开提供了一种体外高效扩增NK细胞的培养基和培养方法，所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为X‑VIVO 15，添加物各组分及浓度为：2.0%‑10.0%自体血浆，0.5‑2.0 uM白藜芦醇，1.0‑10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%L‑谷氨酰胺。本发明还公开了一种体外扩增NK细胞的方法，不使用滋养层细胞或磁珠分选纯化，操作简便，可扩增出数量大，活性高，对肿瘤细胞杀伤力强的NK细胞。本发明提供的NK细胞培养基培养NK细胞两周后，增殖倍数翻了近150倍；对1301的杀伤活性在25:1的效靶比时达到了84.21%。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，涉及一种体外高效扩增NK细胞的培养基及培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞（nature killer cell，NK）是独立于T、B细胞的第三类淋巴细胞亚群，是机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞是机体先天获得性免疫系统最重要的组成细胞之一，无需预先致敏就可以杀伤某些血液肿瘤和异质细胞群，可在免疫应答早期发挥作用；同时NK细胞可释放穿孔素、颗粒酶B，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶B进入靶细胞诱导凋亡程序，同时并分泌大量细胞因子作用于靶细胞，并可表达诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关诱导配体，使靶细胞发生程序性凋亡。因此，NK细胞在免疫治疗中发挥重要作用。
目前，NK细胞体外培养方法主要包括：（1）免疫磁珠分选法。从外周血单个核细胞中分离少量NK细胞，经IL-2，IL-12，IL-15，IL-18等细胞因子组合，刺激外周血中单核细胞，获得纯度高，扩增力强，细胞毒性强的NK细胞。（2）NK细胞分离试剂盒法，通过商品化试剂盒进行NK细胞体外扩增。（3）采用照射致死的K562细胞或HFWT细胞刺激PBMC中的NK细胞扩增。然而免疫磁珠分离方法，生产成本较高，费时费力，不利于大规模生产；以肿瘤细胞作为饲养层细胞扩增NK细胞，操作复杂且异体细胞的安全性尚待探讨。虽然商品化培养基可体外扩增NK细胞，但是细胞的纯度和数量并不能满足临床需求。因此，开发一种高效、安全的NK细胞培养基及培养方法是NK细胞的临床研究与应用领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种体外高效扩增NK细胞培养基及培养方法，可扩增出稳定增殖，活性高，对肿瘤细胞杀伤力强的NK细胞。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种体外高效扩增NK细胞的培养基，包括基础培养基和添加物，添加物及各组分浓度为：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
其中，基础培养基为X-VIVO 15培养基。
其中，添加物各组分及浓度：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
其中，添加物各组分及浓度为：10%自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
为解决上述技术问题，本发明提供一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
（1）培养瓶抗体包被：用PBS稀释anti-HER2 MAb至所需浓度，包被T-75细胞培养瓶，4℃过夜或37℃ 1 h；
（2）血液分离：采集外周血50 ml于肝素锂抗凝的采血管中，1000 g离心15 min，取上层血浆，56℃灭活30 min，放置室温，400 g离心20 min分装，4℃保存；
（3）单个核细胞分离：Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗两遍，细胞计数，调整细胞密度为3-5×106个/ml；
（4）NK细胞体外诱导培养：细胞培养瓶中加入10%自体血浆，200 U/ml 重组人IL-2，1ng/ml重组人 IL-15，将细胞培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养3到4天。培养预定天数后，获得扩增的NK细胞。其中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，添加物及各组分浓度为2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
其中，初始悬于NK细胞培养基中NK细胞的密度为5×106个/20ml。
其中，anti-HER2 MAb浓度为10 ug/ml，重组人IL-2浓度为200 IU/ml，重组人IL-15浓度为1 ng/ml。
其中，基础培养基为X-VIVO 15。
其中，添加物及各组分浓度为10% 自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
其中，细胞培养为细胞培养瓶和透气细胞培养袋。
本发明的有益效果是：通过上述技术方案，本发明提供的NK细胞体外扩增培养基能够避免动物血清成分和异体细胞的添加，增加NK细胞在临床应用中的安全性。采用不同组分的培养基在细胞生产的特定阶段有针对性的进行培养，可更好的满足NK细胞在不同阶段的生长需求，更有效的扩增和活化NK细胞，且不改变细胞的表型并能增强细胞的杀伤活力。因此，可以将白藜芦醇，烟酰胺，丙酮酸钠，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺添加到培养基中开发成细胞体外专用培养基。通过上述培养基体外扩增NK细胞，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。
附图说明
图1为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（40×）；
图2为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（20×）；
图3为实施例中分离培养的NK传代细胞的显微镜图（10×）；
图4增殖曲线；
图5杀伤活性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一、实验材料
淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；X-VIVO 15，重组人IL-2，重组人IL-15均购自北京同立海源生物科技有限公司；FITC-Anti-CD3，PE-Anti-CD56，APC-Anti-CD16；FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control；PE Mouse IgG1，κ Isotype Control；APC MouseIgG1，κ Isotype Control均购自美国BD公司；CCK-8东仁化学科技（上海）有限公司；烟酰胺，白藜芦醇购自山东优科生物科技有限公司，纯度≥95%。
二、实验方法
1.NK细胞的培养和表型鉴定
取健康成年志愿者外周静脉血，肝素锂抗凝后加入淋巴细胞分离液，1000 g离心15min，取上层血浆，56 ℃灭活30 min，放置室温，400 g离心20 min，分装，备用。将剩余血用PBS 1:1稀释，充分混匀，加入等体积的淋巴细胞分离液，1000 g离心30 min。吸取单个核细胞层。PBS洗涤3次，加入含有10%人自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺，200 IU/ml 重组人IL-2和1 ng/ml的重组人IL-15培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中，每3天补加一次培养基。收集培养10 d的NK细胞，PBS洗涤三次后调整细胞密度为1×106/ml，在细胞悬液中加入FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control；PEMouse IgG1，κ Isotype Control；APC Mouse IgG1，κ Isotype Control避光孵育20 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞仪检测表型。
2.CCK-8法检测NK细胞增殖率
取培养10 d的NK细胞，用含有200 IU/ml 重组人IL-2，1ng/ml重组人IL-15和10% 自体血浆的培养基制成5×104/ml的细胞悬液，以5×103/ml接种于96孔板（即每孔100 ul），按如下分组更换培养基，每组3个复孔；
对照组：用含200 IU/ml 的重组人IL-2，1ng/ml重组人IL-15和10% 自体血浆的X-VIVO15培养基培养；
实验组：在对照组的基础上还含有1 uM白藜芦醇， 5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺；
另设只含有培养基不添加NK细胞的空白组；
在接种8 h后，每孔加入CCK-8液10 ul，继续培养4 h后弃去上清，在450 nm波长酶标仪上测定各孔吸光值（OD），求其平均值，扣除空白孔本底OD值按下式计算实验组细胞增殖率（%）：
NK细胞增殖率（%）=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%。
3.CCK-8法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
取培养10 d的NK细胞，用含有1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺的培养基（含有200 IU/ml 重组人IL-2，1 ng/ml 重组人IL-15和10%自体血浆的X-VIVO 15培养基）培养48 h，PBS充分洗涤3次，配成1×106/ml的细胞悬液，作为效应细胞；取对数生长期的1301人急性T淋巴细胞白血病细胞配成1×105/ml的细胞悬液，作为靶细胞。将效应细胞悬液和靶细胞悬液等体积（即效靶比10：1）接种于96孔板，同时设单独效应细胞孔，单独靶细胞孔，空白孔，每组3个复孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养8 h。每孔加入CCK-8试剂10 ul，孵育0.5 h，在450 nm 波长酶标仪上测定各孔吸光值（OD），求其平均值，扣除本底孔OD值，按下式计算杀伤活性：
杀伤率（%）=[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值]×100%。
4.统计学方法
数据采用SPSS软件处理，以平均数±标准差表示，组间的表示采用独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
三、实验结果
1.NK细胞表型检测结果
收集培养10 d的NK细胞，PBS洗涤三次后调整细胞密度为1×106/ml，在细胞悬液中加入FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control；PE Mouse IgG1，κ Isotype Control；APC MouseIgG1，κ Isotype Control避光孵育20 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞仪检测表型，实验组的CD3-CD56+的NK细胞占81.45±1.38%，对照组的CD3-CD56+的NK细胞占52.13±1.02%，两组有显著性差异（P＜0.05），结果如表1所示：
表1 实验组与常规组细胞纯度比较
2.NK细胞增殖率测定结果
将效应细胞和靶细胞按10：1、25：1和50：1的比例接种8 h后，每孔加入CCK-8液10 ul，继续培养0.5 h，在450 nm波长酶标仪上测定各孔吸光值（OD），取其平均值，扣除空白孔本底OD值，按下式计算实验组细胞增殖率（%）：
NK细胞增殖率（%）=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%，结果如表2所示：
表2 NK细胞增殖率测定结果
3.NK细胞对1301细胞杀伤率测定结果
以处于对数生长期的人急性T淋巴细胞白血病细胞1301为靶细胞，以实验组，对照组扩增的NK细胞作为效应细胞，采用CCK-8法检测NK细胞的杀伤活性。具体为10：1、25：1和50：1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔，靶细胞孔，用酶标仪检测450 nm处的OD值。其中，杀伤率计算公式为：杀伤率=[1-(实验孔OD值-效应孔OD)/靶细胞孔OD值]×100%，在不同效靶比的情况下，实验组扩增的NK细胞对1301的杀伤活性均高于对照组扩增的NK细胞的杀伤活性，结果如表3所示：
表3细胞杀伤率测定结果
综上所述，利用本发明的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可促进NK细胞的体外增殖，又可显著提高其1301细胞的杀伤力。需要指出的是，本发明的NK细胞培养基为体外扩增NK细胞的无血清细胞培养基。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种体外高效扩增NK细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：2.0-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为X-VIVO 15培养基。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的培养基，其特征在于，所述添加物及各组分浓度：2.0%-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
4.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：10%自体血浆，1 uM白藜芦醇，5 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
5.一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养瓶包被：1 mg/ml anti-HER2 MAb，用无菌7.6~8.2的无菌PBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T-75瓶，4 ℃过夜或37 ℃预包被1 h，最优浓度为10 ug/ml；
外周血采集：检测HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体，检测项目均为阴性；
单个核细胞分离；
接种：细胞以1~5×106/ml的密度接种到预先包被的T-75培养瓶中，加入20 ml NK细胞培养基，接种培养；
将步骤（3）获得的单个核细胞接种到培养容器中，从接种时间开始计时，每隔三天补加新鲜培养基，培养14天后收集细胞，所述培养基中含有权利要求4中的各种组分；
收集细胞进行质检和流式检测。
6.根据权利要求5所述的体外培养NK细胞的方法，其特征在于，初始悬于NK细胞培养基中NK细胞的密度为5×106个/20ml。
7.根据权利要求5所述的体外培养NK细胞的方法，其特征在于，所述自体血浆浓度为体积比10%，所述anti-HER2 MAb浓度为10 ug/ml，所述重组人IL-2的浓度为200 U/ml，所述重组人IL-15的浓度为1 ng/ml。
8.根据权利要求5所述的体外培养NK细胞的方法，其特征在于，所述基础培养基为X-VIVO 15培养基。
9.根据权利要求5所述的体外培养NK细胞的方法，其特征在于，所述添加物及各组分浓度为：2.0%-10.0%自体血浆，0.5-2.0 uM白藜芦醇，1.0-10.0 mM烟酰胺，1%丙酮酸钠，1% 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺。
10.根据权利要求5所述，体外培养NK细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养容器为细胞培养瓶或细胞培养袋。
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