CN109294985A - 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法 - Google Patents

一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基体系及NK细胞体外扩增的方法。本发明利用固化的anti‑CD137和RetroNectin直接培养Ficoll分离的PBMC，采用OK‑432作为生物效应剂，在GM‑CSF、IL‑4、IL‑2、IL‑15、IL‑21共同作用下体外活化和扩增自然杀伤细胞，创建了一种高效的NK细胞体外扩增方法；该方法制备的NK细胞CD3‑CD16+/CD56+细胞表达率高达92.5％以上，经过14天培养，NK细胞可扩增1000～2000倍，体外杀瘤活性强。

Description

一种用于NK细胞体外扩增的培养基体系及NK细胞体外扩增的 方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基体系及NK细胞体外扩增的方法。
背景技术
长期以来，手术、放疗和化疗作为传统三大方法，对恶性肿瘤的治疗取得了较好的疗效，但这些治疗手段并非对所有的肿瘤都有效，且有的伴有明显的副反应。因此，寻找损伤小又能有效控制肿瘤生长和转移的治疗方法，成为临床肿瘤治疗的迫切需要。随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗的研究突飞猛进，以免疫学原理为基础、以细胞生物学技术为方法而建立起来的肿瘤免疫细胞治疗，已经从实验室研究逐渐向有效、安全的临床应用过渡。
NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群。NK细胞是机体重要的免疫效应细胞，在抵抗肿瘤和病毒感染等方面起着非常重要的作用。近年来，关于NK细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。NK细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。NK细胞能够临床治疗的肿瘤类型包括但不限于：肾上腺皮质癌、艾滋病相关的癌症、黑色素瘤、膀胱癌、脑肿瘤、中枢神经系统肿瘤、子宫癌、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、食管癌、口腔癌、垂体瘤、T细胞淋巴瘤、肾母细胞瘤、甲状腺癌等等。
在外周血淋巴细胞中NK细胞含量只是10％左右，体外扩增常规方法采用高剂量IL-2扩增NK细胞，只能扩增几十倍，并且需要抽取患者大量的外周血(大于500ml)，才能够达到治疗所需要的细胞数量。所以说NK细胞临床应用的主要障碍在于如何获得足够数量的NK细胞，实现高效的体外扩增效率。国内外科学家进行了卓有成效的研究，已经取得了一定的结果。据报道，研究人员采用逆转录病毒将CD137L和IL-15转染到K562细胞中，获得了膜型表达的CD137L和IL-15分子，利用该细胞与人外周血PBMC共培养，得到了大量的NK细胞。但该方法的缺陷在于逆转录病毒转染的方法操作较为繁琐，不容易推广，并且需要伽马射线对转染腺病毒的细胞进行灭活，一旦灭活不充分本身为癌细胞的K652细胞就会在体内扩增，相当于人为引入了癌细胞。并且采用逆转录病毒有一定风险，培养体系中引入的转基因细胞也将最终混入到NK细胞制剂中。
发明内容
本发明的目的在于为了克服繁琐且有风险的转基因方法，单独采用细胞因子进行NK细胞的激活和扩增，提供了一种操作简单、成本较低、扩增效率高的NK细胞培养体系，对NK细胞在临床上的应用提供了强有力的支持。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于NK细胞体外扩增的培养基体系，其包括诱导培养基和增殖培养基。
所述诱导培养基包括基础培养基和诱导因子组合；
所述诱导因子组合包含OK-432、IL-2、IL-15和IL-21；
所述增殖培养基包括基础培养基和增殖因子组合；
所述增殖因子组合包含rhGM-CSF和rhIL-4。
根据本发明，所述OK-432可增强NK细胞、淋巴细胞等细胞的细胞毒作用，并促进IFN-r、IL-2、TNF-α等的分泌，调节机体的抗肿瘤免疫反应。在本发明中OK-432作为一种生物效应剂在细胞培养的初期加入到培养基中，可激活NK细胞；另外，IL-2、IL-15和Il-21能够维持NK细胞的增殖和存活；OK-432与IL-2、IL-15和Il-21同时存在于细胞培养初期的培养基中，能够有效提高NK细胞的表达率，使其高达92.5％以上，同时大大提高了NK细胞的扩增倍数，增强体外杀瘤活性。
根据本发明，所述GM-CSF和IL-4可以维持DC细胞的存活，可进一步促进NK细胞的体外增殖。
根据本发明，所述诱导因子组合中，OK-432的浓度为1～1.5μg/ml，例如1μg/ml、1.05μg/ml、1.1μg/ml、1.15μg/ml、1.2μg/ml、1.25μg/ml、1.3μg/ml、1.35μg/ml、1.4μg/ml、1.45μg/ml或1.5μg/ml，优选OK-432的浓度为1μg/ml。
根据本发明，所述诱导因子组合中，IL-2的浓度为500～750IU/ml，例如500IU/ml、520IU/ml、550IU/ml、580IU/ml、600IU/ml、620IU/ml、650IU/ml、680IU/ml、700IU/ml、720IU/ml或750IU/ml，优选IL-2的浓度为500IU/ml。
根据本发明，所述诱导因子组合中，IL-15的浓度为15～30ng/ml，例如15ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml、25ng/ml、28ng/ml或30ng/ml，优选IL-15的浓度为20ng/ml。
根据本发明，所述诱导因子组合中，IL-21的浓度为45～60ng/ml，例如45ng/ml、48ng/ml、50ng/ml、52ng/ml、54ng/ml、56ng/ml、58ng/ml或60ng/ml，优选IL-21的浓度为50ng/ml。
根据本发明，所述增殖因子组合中，rhGM-CSF的浓度为900～1200U/ml，例如900U/ml、920U/ml、950U/ml、1000U/ml、1050U/ml、1080U/ml、1100U/ml、1120U/ml、1150U/ml、1180U/ml或1200U/ml，优选rhGM-CSF的浓度为1000U/ml。
根据本发明，所述增殖因子组合中，rhIL-4的浓度为400～500U/ml，例如400U/ml、420U/ml、440U/ml、450U/ml、480U/ml、490U/ml或500U/ml，优选rhIL-4的浓度为500U/ml。
根据本发明，所述培养基体系还包括5％自体血清、1％谷氨酰胺和1％非必需氨基酸。
具体地，本发明所述诱导培养基可以由如下组分组成：
基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1～1.5μg/ml OK-432，500～750IU/ml IL-2，15～30ng/ml IL-15，45～60ng/ml IL-21。
示例性地，本发明所述诱导培养基采用由如下组分组成：
Cellgro基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/ml OK-432，500IU/ml IL-2，20ng/ml IL-15，50ng/ml IL-21。
具体的，本发明所述增殖培养基可以由如下组分组成：
基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，900～1200U/ml U/mlrhGM-CSF，400～500U/ml rhIL-4。
示例性地，本发明所述增殖培养基采用由如下组分组成：
Cellgro基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1000U/mlrhGM-CSF，500U/ml rhIL-4。
本发明中，所述基础培养基可以采用本领域公知的基础培养基，例如RPMI-1640培养基等，本发明不做特殊限定。
本发明中所提及的“自体血清”、“谷氨酰胺”、“非必需氨基酸”以及OK-432、IL-2、IL-15、IL-21、rhGM-CSF和rhIL-4，均采用本领域公知的含义，本领域技术人员可以根据实际需要采用其市售商品，对其来源不做特殊限定。
本发明通过在诱导培养基和增殖培养基中添加组合因子，其能够有效提高NK细胞的表达率，使其高达92.5％以上，同时大大提高NK细胞的扩增倍数，达到1000～2000倍，有效增强体外杀瘤活性。
第二方面，本发明还提供了一种NK细胞体外扩增的方法，所述方法包括分阶段依次使用本发明第一方面所述的诱导培养基和增殖培养基。
根据本发明，所述NK细胞体外扩增的方法还包括利用固化的anti-CD137和RetroNectin直接培养Ficoll分离的PBMC。
本发明采用固化的CD137单克隆抗体与NK细胞的CD137分子结合，激活了CD137共刺激信号通路，能够促进NK细胞的活化和增殖；RetroNectin能够有力地促进免疫细胞在体外的扩增，其作用机制是：促进细胞之间的黏附，增强信号传导；诱导细胞活化和扩增；抵抗活化的细胞凋亡；促使细胞由G1期进入S期。本发明用固定化的RetroNectin进行NK细胞的培养，在促进NK细胞增殖的同时又避免了因细胞扩增而引起的细胞凋亡；综合来看，本发明利用固化的anti-CD137和RetroNectin对培养瓶进行预包被，直接培养Ficoll分离的PBMC，anti-CD137和RetroNectin的组合不仅能够促进NK细胞的活化和增殖，还可有效避免因细胞扩增而引起的细胞凋亡，二者具有协同增效作用。
本发明中所述anti-CD137和RetroNectin均采用本领域公知的含义，本领域技术人员可以根据实际需要采用其市售商品，对其来源不做特殊限定。
根据本发明，所述利用固化的anti-CD137和RetroNectin直接培养Ficoll分离的PBMC的过程可以采用如下操作：
取T75培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2加入浓度为5μg/ml的RetroNectin，4℃过夜，使用前弃去包被液，用DPBS洗涤3次，待用；
分离获得外周血单个核细胞，将得到的PBMC按照5×105/ml的浓度用诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；2小时后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2；培养瓶1中的贴壁DC细胞用增殖培养基继续培养24小时。
根据本发明，所述NK细胞体外扩增的方法，具体包括以下步骤：
(1)利用anti-CD137和RetroNectin分别对培养瓶1和2进行预包被；
(2)分离获得外周血单个核细胞；
(3)将得到的外周血单个核细胞用权利要求1～3之一所述的诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；然后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2，培养瓶1中的贴壁DC细胞用权利要求1～3之一所述的增殖培养基继续培养；
(4)培养瓶1中贴壁的DC细胞成熟后重悬添加到培养瓶2中，补加rhGM-CSF和hIL-4；
(5)继续培养到第4天，补加IL-2、IL-15和IL-21；
(6)培养直至收获。
根据本发明，步骤(1)所述预包被的方法包括：
取培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1中加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2中加入浓度为5μg/ml的RetroNectin，4℃过夜，使用前弃去包被液，用DPBS洗涤3次，待用。
示例性地，本发明所述NK细胞体外扩增的方法，包括以下步骤：
(1)取培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2加入浓度为5μg/ml RetroNectin，4℃过夜，使用前弃去包被液，用DPBS洗涤3次，待用；
(2)无菌采外周血50ml，用DPBS按照1:2的比例稀释外周血，共得稀释后的血液150ml，取5支50ml离心管，每管加入15ml密度为1.077的Ficoll分离液，每管加入30ml稀释后的外周血，800g，30min离心，洗涤得到PBMC；
(3)将得到的PBMC按照5×105/ml的浓度用诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；2h后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2；培养瓶1中的贴壁DC细胞用增殖培养基继续培养24h；
其中，诱导培养基的组成为：基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/ml OK-432，500IU/ml IL-2，20ng/ml IL-15，50ng/ml IL-21；增殖培养基的组成为：基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1000U/ml rhGM-CSF，500U/ml rhIL-4；
(4)24h之后，培养瓶1中贴壁的DC细胞成熟，并悬浮；将培养瓶1中的DC细胞转移到50ml离心管，1000rpm，10min离心，重悬后添加到培养瓶2中，加入rhGM-CSF 1000U/ml和rhIL-4 500U/ml；
(5)继续培养到第4天，补加IL-2 500IU/ml，IL-15 20ng/ml，IL-21 50ng/ml；
(6)培养到第7天，扩瓶培养；培养细胞到第14天进行收获。
本发明所述NK细胞体外扩增的方法，是利用固化的anti-CD137、RetroNectin直接培养Ficoll分离的PBMC，采用OK-432作为生物效应剂，在GM-CSF、IL-4、IL-2、IL-15、IL-21共同作用下体外活化和扩增自然杀伤细胞(NK)的方法，该方法制备的NK细胞CD3-CD16+/CD56+细胞表达率高达92.5％以上，经过14天培养，NK细胞可扩增1000～2000倍。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明采用固定化的抗人CD137单克隆抗体诱导和促进了NK细胞的体外扩增，OK-432作为生物效应剂提供了NK细胞初始活化的环境，RetroNectin增强了NK细胞的扩增效率，并且避免了因细胞增殖而引起的凋亡；
(2)本发明创建了一种高效的NK细胞体外扩增的方法，该方法制备的NK细胞CD3-CD16+/CD56+细胞表达率高达92.5％以上，经过14天培养，NK细胞可扩增1000～2000倍。
附图说明
图1是实施例1培养的NK细胞的增殖曲线；
图2-1、图2-2和图2-3是实施例1培养的NK细胞的流式细胞仪检测结果图；
图3是利用MTT法检测实施例1培养的NK细胞对K562的杀伤活性；
图4是利用Calcein-AM法检测实施例1培养的NK细胞对K562的杀伤活性。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
(1)培养瓶预包被：
取T75培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1中加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2中加入浓度为5μg/ml的RetroNectin，4℃过夜；培养瓶1用于促进DC细胞成熟，培养瓶2用于NK细胞活化扩增；
(2)诱导培养基和增殖培养基的配制：
诱导培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/ml OK-432，500IU/ml IL-2，IL-15 20ng/ml，IL-21 50ng/ml；
增殖培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1000U/ml rhGM-CSF，500U/ml rhIL-4；
(3)Ficoll分离液的预处理
取250ml 1.077的Ficoll分离液，加入1ml DPBS，摇匀，待用；
(4)无菌采外周血50ml，用DPBS按照1:2的比例稀释外周血，共得稀释后的血液150ml，取5支50ml离心管，每管加入15ml密度为1.077的Ficoll分离液，每管加入30ml稀释后的外周血，800g，30min离心，洗涤得到PBMC；
(5)将得到的PBMC按照5×105/ml的浓度用诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；2h后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2；培养瓶1中的贴壁DC细胞用增殖培养基继续培养24h；
24h之后，培养瓶1中贴壁的DC细胞成熟，并悬浮；将培养瓶1中的DC细胞转移到50ml离心管，1000rpm，10min离心，重悬后添加到培养瓶2中，加入rhGM-CSF 1000U/ml和rhIL-4 500U/ml；
(6)继续培养到第4天，补加IL-2 500IU/ml，IL-15 20ng/ml，IL-21 50ng/ml；
(7)培养到第7天，扩瓶培养；培养细胞到第14天进行收获。
实施例2
与实施例1相比，除了步骤(2)中的培养基配制如下：
诱导培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1.5μg/ml OK-432，750IU/ml IL-2，IL-15 30ng/ml，IL-21 60ng/ml；
增殖培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1200U/ml rhGM-CSF，500U/ml rhIL-4；
其他步骤与条件与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，除了步骤(2)中的培养基配制如下：
诱导培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/ml OK-432，500IU/ml IL-2，IL-15 15ng/ml，IL-21 45ng/ml；
增殖培养基：Cellgro基础培养基，加5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，900U/ml rhGM-CSF，400U/ml rhIL-4；
其他步骤与条件与实施例1相同。
实施例4
由于实施例2-3培养的NK细胞的情况与实施例1类似，后续采用实施例1培养的细胞进行后续试验。
配制0.4％的台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7.2，分别取实施例1第0天、第4天，第7天，第9天、第11天、第14天培养的细胞，取50μl NK细胞悬液，加入50μl台盼蓝混合，细胞染色4min，细胞计数板计数细胞总数量。
由图1可以看出，在培养至第9天时，NK细胞的增殖开始表现为对数生长，其在第14天时，细胞数量可达到2700×106。
实施例5 NK细胞的表面标志物表达(流式检测)
取实施例1培养至第14天的NK细胞悬液0.2ml，DPBS洗涤2次，用直接免疫荧光法，加入FITC-CD3CD16/CD56-PE 20μl，于4℃放置30min，通过流式细胞仪检测NK的纯度。
由图2-1、图2-2和图2-3可以看出，经培养至第14天，NK细胞的含量大幅上升，表达率，即纯度可达到92.59％。
实施例6 NK细胞的体外杀瘤实验(MTT法)
用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入K562。在实验孔及单纯效应细胞孔中各加入实施例1的培养14天的NK细胞，效靶比设为5:1、10:1、20:1和40:1四组，培养24h。加入WST 20μl，继续培养4h，酶标仪检测OD值。
杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-单纯效应细胞组OD值)×单纯靶细胞OD值]×100％。
由图3可以看出，在5:1～40:1效靶比范围内NK细胞与K562细胞和PC-3细胞分别共培养24h后，NK细胞发挥了较强的杀瘤活性；并且效靶比越高，其体外杀瘤活性越强。
实施例7 NK细胞的体外杀瘤实验(Calcein-AM法)
用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入标记Calcein-AM的K562(绿色荧光标记活细胞)。在实验孔及单纯效应细胞孔中各加入实施例1经培养21天的NK细胞，效靶比设为500:1、400:1、300:1、200:1及100:1五组，4h后荧光显微镜观察结果并拍照。
由图4可以看出，PBMC在培养前的细胞毒活性较低，随着培养时间的增加，细胞毒活性逐渐增强。以K562为靶细胞，在100:1～500:1效靶比范围内，NK细胞在体外较短时间内就发挥了其杀瘤活性；2h后，大量NK细胞向靶细胞进行迁移，围绕在肿瘤细胞周围，释放杀伤介质、细胞因子或通过ADCC作用，开始对肿瘤细胞进行杀伤，少部分肿瘤细胞已经发生凋亡(荧光减弱)；4h后，大部分肿瘤细胞处于凋亡的状态(荧光减弱或没有)；并且效靶比越高，其杀伤活性越强。
通过上述结果可以得出，本发明创建了一种高效的NK细胞体外扩增的方法，该方法制备的NK细胞CD3-CD16+/CD56+细胞表达率高达92.5％以上，经过14天培养，NK细胞可扩增1000～2000倍，并且体外杀瘤活性强。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种用于NK细胞体外扩增的培养基体系，其特征在于，包括诱导培养基和增殖培养基；
所述诱导培养基包括基础培养基和诱导因子组合；
所述诱导因子组合包含OK-432、IL-2、IL-15和IL-21；
所述增殖培养基包括基础培养基和增殖因子组合；
所述增殖因子组合包含rhGM-CSF和rhIL-4。
2.如权利要求1所述的培养基体系，其特征在于，所述诱导因子组合中，OK-432的浓度为1～1.5μg/ml，IL-2的浓度为500～750IU/ml，IL-15的浓度为15～30ng/ml，IL-21的浓度为45～60ng/ml；优选OK-432的浓度为1μg/ml，IL-2的浓度为500IU/ml，IL-15的浓度为20ng/ml，IL-21的浓度为50ng/ml；
优选地，所述增殖因子组合中，rhGM-CSF的浓度为900～1200U/ml；rhIL-4的浓度为400～500U/ml；优选rhGM-CSF的浓度为1000U/ml；rhIL-4的浓度为500U/ml。
3.如权利要求1或2所述的培养基体系，其特征在于，所述培养基体系还包括5％自体血清、1％谷氨酰胺和1％非必需氨基酸。
4.一种NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述方法包括分阶段依次使用权利要求1～3之一所述的诱导培养基和增殖培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用固化的anti-CD137和RetroNectin直接培养Ficoll分离的PBMC。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用anti-CD137和RetroNectin分别对培养瓶1和2进行预包被；
(2)分离获得外周血单个核细胞；
(3)将得到的外周血单个核细胞用权利要求1～3之一所述的诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；然后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2，培养瓶1中的贴壁DC细胞用权利要求1～3之一所述的增殖培养基继续培养；
(4)培养瓶1中贴壁的DC细胞成熟后重悬添加到培养瓶2中，补加rhGM-CSF和hIL-4；
(5)继续培养到第4天，补加IL-2、IL-15和IL-21；
(6)培养直至收获。
7.如权利要求4～6之一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述预包被的方法包括：
取培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1中加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2中加入浓度为5μg/ml的RetroNectin，4℃过夜，使用前弃去包被液，用DPBS洗涤3次，待用。
8.如权利要求4～7之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)取培养瓶2个，各加入5ml DPBS，培养瓶1加入浓度为5μg/ml的anti-CD137，培养瓶2加入浓度为5μg/ml RetroNectin，4℃过夜，使用前弃去包被液，用DPBS洗涤3次，待用；
(2)无菌采外周血50ml，用DPBS按照1:2的比例稀释外周血，共得稀释后的血液150ml，取5支50ml离心管，每管加入15ml密度为1.077的Ficoll分离液，每管加入30ml稀释后的外周血，800g，30min离心，洗涤得到PBMC；
(3)将得到的PBMC按照5×105/ml的浓度用诱导培养基进行重悬，接种到培养瓶1；2h后将培养瓶1中的悬浮细胞转移到培养瓶2；培养瓶1中的贴壁DC细胞用增殖培养基继续培养24h；
其中，诱导培养基的组成为：基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1μg/ml OK-432，500IU/ml IL-2，20ng/ml IL-15，50ng/ml IL-21；增殖培养基的组成为：基础培养基，5％自体血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1000U/ml rhGM-CSF，500U/ml rhIL-4；
(4)24h之后，培养瓶1中贴壁的DC细胞成熟，并悬浮；将培养瓶1中的DC细胞转移到50ml离心管，1000rpm，10min离心，重悬后添加到培养瓶2中，加入rhGM-CSF 1000U/ml和rhIL-4500U/ml；
(5)继续培养到第4天，补加IL-2 500IU/ml，IL-15 20ng/ml，IL-21 50ng/ml；
(6)培养到第7天，扩瓶培养；培养细胞到第14天进行收获。
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