CN111690608A

CN111690608A - 一种双抗体联合胸腺肽体外培养nk细胞试剂及试剂盒和培养方法

Info

Publication number: CN111690608A
Application number: CN202010569141.0A
Authority: CN
Inventors: 孔伟圣; 王燕; 蓝欣; 何娟娟
Original assignee: Zhuhai Basso Cell Science And Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Basso Cell Science And Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明涉及一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒和培养方法，所述试剂包括，主要成分为CD161、CD137和IL‑2的诱导液，主要成分为IL‑2、IL‑12、IL‑7、IL‑15的活化液，主要成分为IL‑2、IL‑21的扩增液；由于本发明构建的前述细胞试剂中诱导液和活化液、扩增液的成分可以可刺激NK细胞的增殖、细胞因子的分泌、调节NK细胞的活化以及分化，故本发明试剂能够提高所获得的NK细胞的纯度、数量；另外由于本试剂采用不含动物源成分的无血清细胞培养基，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，提高了试剂的安全性。

Description

一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒和培养方法

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗技术领域，涉及一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒和培养方法。

技术背景

自然杀伤细胞(natural killer cell，简称NK)作为一种特殊的淋巴细胞，它包含不同种类的免疫学功能，主要分布于外周血、淋巴结、骨髓、和脾脏，免疫表型特点为CD3^-CD56⁺CD16⁺，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞可通过其表面的多种受体被激活，主要包括细胞因子受体、膜整素分子天然细胞毒受体(CD16、NKp46、NKp30 NKp44、NKp80)免疫球蛋白样杀伤受体(NKG2)家族、DHAM-1/CD266家族、SLAM家族/SLAM、2B4、NTB-A(CD84)/识别非己分子抗原的受体(Ly49H)以及一些其它受体(如CD18、CD2、TLR-3/-9等)。

目前，NK在临床应用于治疗恶性肿瘤主要有以下特点：1.NK细胞是人体内抗肿瘤活性最强的细胞，可直接识别、杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；2.NK细胞会通过其分泌的因子抑制肿瘤附近新血管的增生，限制肿瘤生长；3.NK细胞可直接改善并调节患者的免疫力，间接提高患者的生活质量；4.NK细胞会分泌多种细胞因子，减少患者疼痛，且治疗天然无副作用。

总的来说，NK细胞是一种广泛应用的肿瘤免疫治疗手段。NK细胞能通过体外诱导而扩增，常规的NK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用NK抗体诱导，再加入IL-2因子进行刺激，最后获得一定数量的NK细胞。但最终获得的NK细胞的增殖倍数和细胞表型都一般。同时，所用的培养液主要利用胎牛血清或小牛血清作为细胞培养的营养物，虽然有足够的供应量、价格便宜，但是有潜在传播传染病的风险，在临床治疗也会存在伦理的影响以及异种蛋白可能会导致过敏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及应用和培养方法；以便提高所获得的NK细胞的纯度、数量和安全性。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

作为一种可能方案，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度范围分别为500ng/ml～1500ng/ml、100ng/ml～1000ng/ml、100～500ug/ml、50IU/ml～500IU/ml。

作为进一步的方案，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、300ug/ml、100IU/ml。

作为一种可能方案，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/ml、1IU/ml～50IU/ml和1IU/ml～50IU/ml。

作为进一步的方案，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml、10IU/ml和20IU/ml。

作为一种可能方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、50IU/ml～200IU/ml。

作为进一步的方案，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为500IU/ml、100IU/ml。

一种利用前述双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂的试剂盒，主要由诱导液1ml、活化液1ml、扩增液1ml组成。

一种利用前述试剂培养NK细胞的培养方法，

(1)制备PBMC：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血20ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用。

(2)制备INDM诱导培养基:吸取1ml诱导液加入19ml ALyS505NK-AC培养基内配制成INDM诱导培养基；单个核细胞用20ml含10％自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，使细胞密度范围为1.3-1.5×10⁶个/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(3)制备ACTM活化培养基:吸取0.5ml活化液加入180ml ALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM活化培养基；Day2补加活化液0.5ml，Day3补加40ml ACTM和Day5补加140ml ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml。

(4)制备EXPM扩增培养基:吸取1ml扩增液加入2L ALyS505NK-EX内配制成EXPM；Day7转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM扩增培养基，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(5)培养Day14收获细胞，计数并进行检测，其中，利用CD3⁺CD56⁺进行表型检测。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过构建一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒和培养方法，由于本发明诱导液和活化液、扩增液的成分可以刺激NK细胞的增殖、细胞因子的分泌、调节NK细胞的活化以及分化，能够提高获得的高增殖量、高纯度、高杀伤性NK细胞；由于采用不含动物源成分的无血清细胞培养基，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，提高了试剂的安全性。

(2)本发明构建的NK细胞培养方法，只需采集患者外周血20ml，采血量少，且无需使用细胞分选等系统，减轻患者痛苦及医疗成本。

(3)利用本发明提供的试剂与培养方法培养NK细胞，培养周期仅为14天即可获得高纯度、高数量、高杀伤力的NK细胞，培养周期短。

(4)本发明提供的试剂采用的成分均为临床治疗级别药物或因子，避免了外源性动物成分的带入，对细胞培养无毒副作用。

(5)本发明提供的试剂与培养方法操作简单，无需包被培养瓶，无需额外添加其它试剂和因子。

(6)本发明提供的试剂盒与培养方法培养NK细胞，可使NK细胞培养标准化，减少误差，是一个实用性高、操作简便的商品化试剂盒。

综上所述，本发明提供的NK细胞培养的试剂、试剂盒及其培养方法，能够提高所获得的NK细胞的纯度、数量，简单高效，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，使NK细胞的培养标准化、规范化。为细胞治疗临床广泛应用和研究提供了优质的培养方案，所获得的NK细胞纯度高、杀瘤活性强。

【附图说明】

图1本发明实施例三实验组培养方法在Day3细胞生长图。

图2本发明实施例三实验组培养方法在Day5细胞生长图。

图3本发明实施例三实验组培养方法在Day7细胞生长图。

图4本发明实施例三实验组培养方法与常规方法细胞生长曲线图。

图5本发明实施例三中实验组方法培养细胞到Day14流式分析检测的结果图。

图6本发明实施例三中常规方法培养细胞到Day14流式分析检测的结果图。

图7本发明培养方法与常规方法细胞培养到Day14对MOLT-4细胞杀伤性试验图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂厂商购买得到的。

本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：

1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。

2、试剂：鲎试剂、除热原吸嘴、除热原空安瓿、内毒素工作标准品(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)，支原体液体培养液、硫乙醇酸盐流体培养液、胰酪大豆胨液体培养液(珠海经济特区益民生物制品厂)，恒温自动加热仪、台盼蓝染色液、PBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505N-AC无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，ALyS505N-EX无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，IgG1-APC、IgG1-FITC、CD56-APC、CD3-FITC(美国贝克曼公司)，MOLT-4细胞株(遵义医学院珠海校区研发中心提供)MTT试剂盒、二甲亚砜、胎牛血清，人淋巴细胞分离液、肝素钠溶液。

3、仪器与设备：离心机(THERMO，美国)、T75cm²悬浮培养瓶、T225cm²悬浮培养瓶、细胞培养袋(日本NIPRO株式会社)、CO₂培养箱(三洋，中国)、程控降温仪(THERMO，美国)、超净工作台(智净、中国)、50ml离心管(BD，美国)、96孔板、酶联免疫检测仪、移液管、血细胞计数盘(株式会社细胞科学研究所CSTI)、液氮罐。

实施例一：

本实施例用于介绍本发明一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及其制备和试剂盒质量检测。本发明提供的NK细胞培养的试剂、试剂盒及其培养方法，能够提高所获得的NK细胞的纯度、数量，简单高效，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性。

一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度范围分别为500ng/ml～1500ng/ml、100ng/ml～1000ng/ml、100-500ug/ml和50IU/ml～500IU/ml。所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/m、1IU/ml～50IU/ml和1IU/ml～50IU/ml。所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、50IU/ml～200IU/ml。所述诱导液、活化液、扩增液按照1:1:1的比例配置。

需要说明的是，诱导液、活化液、扩增液中各成分含量是根据其培养体系内最佳作用浓度乘以培养基体积量而定，使用时试剂需按培养流程加入培养体系内；考虑到试剂生产、包装工艺及产品保存运输及产品稳定性等因素，作为一种实施方式，可将所述双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂制备为试剂盒，其中，使所述试剂盒包括1ml诱导液的、1ml的活化液、1ml的扩增液；使NK培养标准化、简易化。

具体地，在本实施例中，所述诱导液中，CD161、CD137和IL-2的有效浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、100IU/ml。所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度分别为400IU/ml、50IU/ml、10IU/ml和20IU/ml。所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为500IU/ml、100IU/ml。

构建本发明所述试剂及试剂盒的依据为：

根据本发明试剂盒所述的诱导液由CD161、CD137和IL-2组成，CDl61是NK细胞表达的特有标志，通过激活CD161的表达可有效诱导NK，在免疫调节中起重要作用；CD137/CD137L是近年新发现的TNFR/TNF超家族的新成员CD137，与其配体结合后介导的共刺激信号，可刺激NK细胞的增殖、细胞因子的分泌，这种激活的NK细胞通过和CTL的相互作用，增强CTL的杀伤活性，在细胞免疫调节中发挥着重要的作用。NK细胞表面的活化性受体种类繁多，单一受体的刺激并不能激活NK细胞，而是需要受体之间相互影响和相互协调，使活化信号大于刺激信号才能诱导活化NK细胞，IL-2联合CD137单抗和CD161同时作用于PBMC，可活化NK细胞，使活化信号升高，进一步获得更多以及纯度更高的NK细胞。

根据本发明试剂盒所述的活化液B液由IL-2、IL-12、IL-7、IL-15组成优化组合。NK细胞目前被认为是在骨髓内发育成熟，其发育过程中有IL-12的作用，IL-12能显著上调NKG2D和NKp46的表达使NK细胞对靶细胞的识别更加容易。而IL-2和IL-15的联合应用是体外扩增NK细胞的经典方案，IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的细胞因子；IL-15可以上调NK细胞表面受体的表达(如CD16和NKG2D)，同时产生大量的IFN-γ，促进CD56+细胞的扩增，除此之外，近年来发现IL-7同样可以调节NK细胞的活化以及分化。

根据本发明试剂盒所述的扩增液C液由IL-2、IL-21两种细胞因子组成，IL-21由活化的CD4⁺T细胞分泌，能激活并促进NK细胞增殖，在刺激NK细胞增殖及活化等方面与IL-2有许多相似性，都可以IL-2受体复合物β、γ链结合有关，然而IL-21还可结合于1个新的α链，即IL-21受体，故IL-21促进造血干细胞定向分化为NK细胞，并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活方面有显著的作用，能协同IL-15促进骨髓前体包增殖和NK细胞增殖、分化和细胞毒活性。IL-2、IL-21因子优化组合对促进NK细胞的活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。

作为另外一种实现，一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。所述诱导液中，CD161、CD137和IL-2的有效浓度分别为500ng/ml、100ng/m和50IU/ml。所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度分别为100IU/ml、10IU/m、1IU/ml和1IU/ml。所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度分别为100IU/ml、50IU/ml。所述诱导液、活化液、扩增液按照1:1:1的比例配置。制备方法同前。

作为又一种实现，一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。所述诱导液中，CD161、CD137和IL-2的有效浓度分别为1500ng/ml、1000ng/ml和500IU/ml。所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度分别为1000IU/ml、200IU/ml、50IU/ml和50IU/ml。所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为1000IU/ml、200IU/ml。所述诱导液、活化液、扩增液按照1:1:1的比例配置。制备方法同前。

本发明涉及的一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒制备方法：

(1)物料准备：准备配制包被液、诱导液、扩增液所需的各类原辅料。

(2)诱导液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-AC加入CD16、CD137、IL-2中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-AC冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-AC定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(3)活化液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-AC加入IL-2、IL-7、IL-12中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-AC冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-AC定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

(4)扩增液配制：在常温洁净环境下，按照各组分有效浓度需求取相应量的物质；取ALyS505NK-EX加入IL-2、IL-21中，用移液器将液体轻轻吹打，使原料完全溶解，完全溶解应为澄清透明、无沉淀物；将完全溶解的液体转移至血清瓶中；加入ALyS505NK-EX冲洗原瓶，并将液体回收入容量瓶中；用ALyS505NK-EX定容到，轻晃瓶身，使液体充分混匀；

4.半成品质检：分别对上述包被液、诱导液、扩增液取样，进行PH、渗透压、内毒素检测；

5.分装：符合质检要求后用无菌针头式滤器过滤，按1ml/支分装于无菌冻存管内；

6.包装：经质量检测后将诱导液、刺激液、活化液、扩增液各1支装入包装盒中。

试剂/试剂盒质量检测

1.内毒素检测

本发明中试剂/试剂盒内毒素检测凝胶法鲎试剂及相关消耗品购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，鲎试剂规格为0.1ml/支，λ＝0.06，内毒素标准品规格为15EU/支。

内毒素检测操作步骤

取细菌内毒素工作标准品一支配制2λ内毒素标准溶液，阴性对照液，

浓度为2λ的内毒素标准溶液做为阳性对照液。取出鲎试剂，分别用除热源吸头加入0.1ml检查用水，轻摇使鲎试剂完全溶解；在溶解的鲎试剂安瓿瓶内分别加入0.1ml的阴性对照液、阳性对照液和供试品液，用封口膜封闭管口轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温器中孵育60min±2min，期间避免振动。

内毒素检测结果判定

孵育结束，将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不成凝胶或者虽呈凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记为(-)；只有当阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，实验方为有效，否则无效。

内毒素检测结果见表1

2.支原体检测

将本试剂/试剂盒产品各组分，取100ul到支原体液体培养液内，微需氧环境，35-37℃培养3～7天，观察液体培养液是否变浑浊。

若液体培养液变浑浊再转种支原体固体培养液，微需氧环境，35-37℃继续培养3-7天，观察生长菌落，进行支原体确认。

支原体检测结果见表1。

3.真菌及细菌检测

将本试剂/试剂盒检测样品试剂接种于硫乙醇酸盐流体培养液及胰酪大豆胨液体培养液中，置于35～37℃条件下，培养3～7天观察结果；

结果判定：若样品检测管7天均澄清无菌生长，判供试品符合规定；若样品检测管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供若样品检测不符合规定。

检测结果：真菌及细菌检测见表1

实施案例一结果:

检测项目	诱导液	活化液	扩增液	判定	技术要求
						内毒素	<0.06EU/ml	<0.06EU/ml	<0.06EU/ml	合格	<0.25EU/ml
支原体	阴性	阴性	阴性	合格	阴性
						真菌	阴性	阴性	阴性	合格	阴性
细菌	阴性	阴性	阴性	合格	阴性

表1

实施例二：试剂盒稳定性检测

1.自然杀伤细胞(natural killer cell，简称NK)制备

(1)单个核细胞分离

随机抽取3名健康志愿者，用肝素钠抗凝管采集健康志愿者外周血20ml，两个小时内进行细胞分离。在15ml的淋巴分离液上，慢慢倒上20ml的新鲜血液，800xg离心20min，慢升慢降。离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第2层)、分离液(第3层)和红细胞层(底层)构成。先用无菌吸管采集上层的血浆，收集至离心管，请勿误吸单个核细胞层，血浆需在56℃加热30min，室温下，1200xg离心10min，用吸管将上清液采集至新的离心管，4℃保存，直至使用前取出。在取完第一层血浆后，再用吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管，加入一定量的PBS稀释细胞悬液，500xg离心10min，去上清，连续洗三遍，收集沉淀，加入一定量的培养基进行稀释，计数。

(2)NK细胞培养

Day0吸取1ml诱导液加入19ml ALyS505NK-AC培养基内配制成INDM诱导培养基；单个核细胞用20ml含10％自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，将细胞密度调整为1.3-1.5×10⁶cells/ml，置于T-75cm²的培养瓶中培养，并在37℃5％CO₂培养箱培养；Day2加入活化液0.5ml继续培养1d；Day3吸取0.5ml活化液加入180ml ALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM活化培养基；并补加40ml ACTM无血清细胞培养基，置于37℃5％CO₂培养箱中培养；Day5补加140ml ACTM无血清细胞培养基，并更换培养瓶(T225)后，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

吸取1ml扩增液按加入2L ALyS505N-0内配制成EXPM；培养到Day7转到2个细胞培养袋扩大培养，每两天(即第Day9、Day11、Day13天)补加含EXPM扩增培养基500、800、1000ml(两个培养袋均分)，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，进行细胞数量、活率检测。加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪检测CD3^-CD56⁺的比例。检测方法同实施例三中的CD3^-CD56⁺NK细胞表型检测步骤。

2、实施案例二结果(表2)

试剂盒效期	细胞数量	细胞活率	CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>
				一个月	1.0×10<sup>10</sup>	>95％	80％
三个月	9.6×10<sup>9</sup>	>95％	79％
				六个月	9.3×10<sup>9</sup>	>95％	82％
九个月	9.4×10<sup>9</sup>	>95％	81％

注：上表数据为3次实验结果取平均值。

表2

实施案例三

采集1名健康志愿者人外周血，分离单个核细胞，进行本发明NK细胞试剂盒培养方法(简称实验组)与NK细胞培养常规方法(简称常规组)同时进行细胞培养，观察两种方法在细胞增殖倍数、NK细胞表型及杀瘤活性差异。

本发明培养方法包括以下步骤：

(1)制备PMBC(人外周血单个核细胞)：采集30ml外周血，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4-8℃备用。用PBS(磷酸缓释液)按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次，最后一次洗涤前需要进行计数。

步骤(1)中外周血为人外周血，血浆为人血浆，灭活方式采用水浴灭活或者恒温加热仪(BASO)灭活，本实施例采用恒温加热仪灭活，减小污染风险；相对离心力优选2000xg，离心时间优选为5min，充分去除变性的补体蛋白等成分。优选CSTI生产的无钙、镁离子的PBS；淋巴细胞分离液无特殊要求，选用操作人员常用产品即可；离心机品牌及离心环境无特殊要求，选用操作人员常用、熟知的即可。洗涤细胞时，为最大限度保证细胞的活性及安全性，可作为一种实现方式，也可选用ALyS505NK-AC无血清培养基(CSTI)洗涤三次；这会使细胞培养时的背景更为干净、清晰。

(2)NK细胞诱导：吸取1ml诱导液加入19ml ALyS505NK-AC培养基内配制成INDM诱导培养基。单个核细胞用20ml含10％自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，使单个核细胞细胞密度范围为1.3-1.5×10⁶个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

步骤(2)中为了模拟细胞在机体内的温度环境，更好地启动细胞生长，ALyS505NK-AC无血清细胞培养基在使用前需要回温处理，本实施例回温条件为35～37℃30min，并添加5％的自体血浆。所述诱导液成分包含CD161抗体、CD137、IL-2，有效浓度范围分别为500ng/ml～1500ng/ml、100ng/ml～1000ng/ml和50IU/ml～500IU/ml。本实施例中优选浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、100IU/ml，所含成分均优选临床用药级别。

(3)吸取0.5ml活化液加入180ml ALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM活化培养基；Day2补加活化液B 0.5ml，Day3补加40ml ACTM和Day5补加140ml ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，其中更换培养瓶(T225)。

步骤(3)中的活化液成分包含IL-2、IL-12、IL-7、IL-15，有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/m、1IU/ml～50IU/ml和1IU/ml～50IU/m。本实施例中优选浓度分别为400IU/ml、50IU/ml、10IU/ml和20IU/ml，所含成分均优选临床用药级别。

(4)吸取1ml扩增液加入2.3L ALyS505NK-EX内配制成EXPM扩增培养基，Day7将培养瓶中的细胞悬液转移至2个1L的细胞袋中进行培养，每两天(即第Day9、Day11、Day13天)补加EXPM扩增培养基500、800、1000ml(两个培养袋均分)，使细胞密度维持在5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。如图1、2、3所示依次为Day3、Day5和Day7细胞生长图。

步骤(4)中的扩增液成分包含IL-2、IL-21，有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、50IU/ml～200IU/ml。本实施例中优选浓度分别为500IU/ml、100IU/ml，所含成分均优选临床用药级别。Day7将细胞转到2个细胞培养袋中扩大培养，是为了保证细胞生长过程中气体交换，满足细胞生长需要，本实施例优选用日本NIPRO株式会社生产的细胞培养袋；同时优选日本细胞科学研究所株式会社生产的ALyS505N-0为扩大培养用培养基。

(5)细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，进行细胞数量、活率检测。加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪进行表型检测，检测CD₃ ^-CD₅₆ ⁺比例。同时还可以进行杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测；除表型检测外，其他检测项目所用的试剂和仪器不作特定要求，按照实际情况及操作员熟练技术进行检测即可。

NK细胞培养常规方法，包括以下步骤：

(1)采集40ml外周血小心地将注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃水浴锅内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用。吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次，最后一次洗涤需要进行计数。

(2)取50μg Anti-CD16在T75 cm²培养瓶中，加入4ml生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，让溶液在培养培养瓶表面扩散。在室温下，孵育1小时或者保存在4℃直到使用前取出。移除包被溶液，用生理盐水清洗培养瓶两次，洗过的培养瓶要立即使用。

(3)将单个核细胞接种到培养瓶，加入含IL-2(700IU/ml)、IL-15(20IU/ml)、IL-21(10IU/ml)和IL-7(20IU/ml)的ALyS505NK-AC无血清细胞培养液36ml，单个核细胞密度大于1.0×10⁶个/ml，加入4ml灭活自体血浆，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，Day3补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505NK-AC无血清细胞培养液，Day5将细胞转移到T175cm²培养瓶中补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505NK-AC无血清细胞培养液。Day7转入细胞培养袋中扩大培养，与Day9、Day11一样，都是补添加含IL-2、IL-15、IL-12和IL-7的ALyS505NK-EX无血清细胞培养液分别补添加。

(4)细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪检测CD₃ ^-CD₅₆ ⁺细胞的比例。

结果测试

收集由本实施例所述实验组及常规组培养Day14细胞用于各项测试，从以下几个方面比较这两种制备方法获得细胞的差异。

1、细胞增殖倍数的测定

收获培养Day14细胞，用台盼蓝染色并用血球计数板计算细胞总数，实际扩增倍数＝当前细胞总数/初始单个核细胞数，数值即为细胞扩增的增殖倍数，从附图4可看出实施例所述实验组及常规组明显差异，本发明试剂和培养方法所得到的NK细胞数量约为常规方法的4倍；完全能够满足临床应用。

2、CD₃ ^-CD₅₆ ⁺NK细胞表型检测

收获培养Day14细胞，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷个/ml，各取两个管分别加入100μl的细胞悬液，一管加10μl IgG1-APC及10μl IgG1-FITC作为同型对照，另一管加5μl CD₅₆-APC及10μl CD₃-FITC作为样品检测；共同避光孵育15min后检测。从附图5、6可看出实施例所述实验组及常规组明显差异，显示本发明试剂及培养方法NK细胞的培养优势。

3、NK细胞对MOLT-4细胞的杀伤效果

利用MTT法检测其细胞毒性，收集对数生长期的MOLT-4细胞离心计数并调整密度为1×10⁵个/ml。在试验孔中按5:1、10:1、20:1一一对应加入效应细胞及靶细胞各100μl，37℃、5％CO₂培养箱共培养15h，然后每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)继续培养4h，弃掉上清并每孔加入Formazan(甲

)溶解液110μl/孔，置于摇床低速振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处检测吸光值。计算公式为：细胞毒作用(％)＝[1-(实验组值-单独效应细胞值)/单独靶细胞值]×100％。从附图7可看出实施例所述实验组及常规组NK细胞对MOLT-4细胞杀伤效果有明显差异，三个实验组效靶比都比相应常规组高，说明本发明一提供的NK培养试剂及培养方法所得到的NK细胞展现出较高杀瘤活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度范围分别为500ng/ml～1500ng/ml、100ng/ml～1000ng/ml、100～500ug/ml、50IU/ml～500IU/ml。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、300ug/ml、100IU/ml。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/ml、1IU/ml～50IU/ml和1IU/ml～50IU/ml。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的浓度分别为400IU/ml、50IU/ml、10IU/ml和20IU/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、50IU/ml～200IU/ml。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的浓度分别为500IU/ml、100IU/ml。

8.一种利用权利要求1-7中任意一项所述试剂的试剂盒，主要由诱导液1ml、活化液1ml、扩增液1ml组成。

9.一种利用权利要求1-7中任意一项所述试剂培养NK细胞的培养方法，包括下列步骤：

(1)制备PBMC：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血20ml-30ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用；

(2)制备INDM诱导培养基：吸取1ml诱导液加入19ml ALyS505NK-AC培养基内配制成INDM诱导培养基；单个核细胞用20ml含10％自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，使细胞密度范围为1.3-1.5×10⁶个/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃5％CO₂培养箱培养；

(3)制备ACTM活化培养基：吸取0.5ml活化液加入180ml ALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM活化培养基；Day2补加活化液0.5ml，Day3补加40ml ACTM和Day5补加140ml ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml；

(4)制备EXPM扩增培养基：吸取1ml扩增液加入2LALyS505NK-EX内配制成EXPM；Day7转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM扩增培养基，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养；