CN116179486B - 一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法 - Google Patents

一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗肿瘤细胞制备领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：(1)将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，取淋巴细胞；(2)将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；(3)培养至第4日，添加rIL‑2、rIL‑15、OKT3、OK432、抗4‑1BB抗体继续培养，收获肿瘤浸润淋巴细胞。本发明的制备方法更好地促进TIL细胞增殖，增强TIL细胞的活性，节省了抗体的用量，降低了培养细胞成本。制备细胞需要时间短，获得比例更多的抗原特异性的效应T细胞。

Description

一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法
技术领域
本发明属于抗肿瘤细胞制备领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的重大疾病。传统的治疗方法包括手术、放疗、化疗等多种方式，对部分患者有一定疗效，但总体治疗效果并不理想。免疫治疗是新兴的肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是一种浸润在肿瘤组织里面能够有效识别肿瘤细胞新抗原的T细胞。具有能够高效杀死肿瘤细胞的能力，包括杀死由该病灶转移到其他部位的肿瘤细胞。
TIL疗法作为过继性免疫治疗的方法之一，对恶性肿瘤的治疗有着广泛的应用前景。TIL疗法是利用肿瘤中已经存在的肿瘤反应性T细胞，从患者自身的肿瘤组织(或腹水)中分离出来，在体外激活和扩增后重新输入患者体内，因其较强的杀瘤活性和靶向特异性，成为癌症生物免疫治疗的热点。
过继细胞转移治疗依赖于可靠的和可复制的方法产生肿瘤反应T淋巴细胞。作为将TIL治疗应用于临床的第一步，产生最佳肿瘤反应性足够数量的TIL是必不可少的。TILs细胞数量与病人的预后间存在相关性，在肿瘤组织内TILs高者预后更好，FOXP3+Tregs对生存率有负面影响。
TILs细胞实际上属于异质细胞群，包括T细胞、B细胞和NK细胞，但主要为CD3+T细胞，而CD3+T细胞可进一步分化成为CD8+的细胞毒T细胞(CTL)、记忆性T细胞(Tm)、辅助性T细胞(Th)。不同病人来源或不同组织来源的TILs细胞中各种细胞类型存在明显差异。提高CD8+的细胞毒T细胞(CTL)数量和比例是关键。高水平的CD8+、CD3+和CD4+TILs对提高患者总生存率和阻止复发都有预后意义。
高比例的CD8+T细胞和高数量的注入TILs是应答患者的特征。输注产品中CD8+T细胞的百分比与临床反应以及输注细胞数量与临床反应之间的关系已明确。
化疗和放疗的疗效有限，目前有治愈潜力的治疗方法需使用高剂量的白细胞介素IL-2和干扰素IFN-α。
建立和扩增TIL培养的复杂程序，高剂量IL-2的毒性也限制了这种治疗的实施。体外扩增需要高剂量的IL-2，但IL-2过高会导致培养的TIL中FOXP3+Treg数量增加，FOXP3+Tregs对生存率有负面影响。同时后续给患者回输的时候也必须要辅助注射高剂量的IL-2来维持这些细胞在体内的活性，引起不良反应。因此IL-2的剂量应控制在合适的范围内。
中国专利CN113577265A公开了一种产品，其为用于治疗肺癌的药物组合，由转基因的TIL细胞以及CTLA-4单克隆抗体和培美曲塞组成，所述TIL细胞采用如下方法制备获得：将新鲜肺癌肿瘤组织置于含抗生素的冷Hanks’液中浸泡30min，去除坏死、出血及脂肪组织，称重，剪成小块，加入消化酶液中消化，再加入透明质酸酶和DNA酶，完全消化后的组织过120目铜网，将分离的TIL在含10％人AB血清的RPMI1640完全培养基中培养，并加入IL-2，同时加OKT3和VC，孵箱培养，共培养20d，即得到目的TIL细胞。本发明提供了一种有效分离并制备的肿瘤浸润淋巴细胞，将所述细胞转TNF-α高表达后与制备的CTLA-4单克隆抗体和培美曲塞一起使用能够显著的抑制肺癌肿瘤的增殖，具有较好的效果。
目前的方案培养时间过长，因此需要研发新的方法缩短培养时间(获得年轻TIL)，同时增加输注TILs的肿瘤反应性：添加一些细胞因子或抗体可能增强肿瘤细胞的免疫原性，从而增加TIL产品中能够杀死肿瘤细胞的肿瘤特异性T细胞的比例。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，进一步提高肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞扩增的成功率。
本发明技术方案包括：
一方面，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，吸取淋巴细胞；
(2)将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；
(3)培养至第4日，添加rIL-2、rIL-15、OKT3、OK432、抗4-1BB抗体继续培养，收获肿瘤浸润淋巴细胞。
优选地，所述步骤(1)中消化液选自胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶IV、透明质酸酶V、DNase、无酚红胰蛋白酶中的一种或多种。
进一步优选地，所述步骤(1)中消化液为胶原酶IV、透明质酸酶V和DNase组合使用。
再进一步优选地，所述胶原酶IV的浓度为0.01-0.5mg/mL；
更进一步优选地，所述胶原酶IV的浓度为0.1mg/mL；
再进一步优选地，所述透明质酸酶V的浓度为0.005-0.05mg/mL；
更进一步优选地，所述透明质酸酶V的浓度为0.01mg/mL；
再进一步优选地，所述DNase的浓度为5-15U/mL；
更进一步优选地，所述DNase的浓度为10U/mL。
具体的，所述胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量68-130KD，能消化多种组织。
具体的，所述透明质酸酶V是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。
具体的，所述DNase是指脱氧核糖核酸酶，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
具体的，所述胰蛋白酶是胰腺分泌的一种水解酶，能水解由肽链相连的氨基酸类化合物，具有酯酶活性。
优选地，所述步骤(1)中消化的温度为35-40℃；
进一步优选地，所述步骤(1)中消化的温度为37℃。
优选地，所述步骤(1)中消化的时间为60-120min。
优选地，所述步骤(1)中过滤是指过100μm滤网。
优选地，所述步骤(1)中收集单细胞悬液后离心是在1500rpm/min条件下，离心5min，离心后用PBS清洗2遍。
优选地，所述步骤(1)中加入分离液后离心是在2000rpm/min条件下，离心20min，离心后在两个界面各出现环状物，上环为肿瘤细胞，下环为淋巴细胞，吸取淋巴细胞，用PBS溶液洗两遍，即为TIL。
优选地，所述步骤(1)中分离液选自Percoll分离液、含聚蔗糖分离液、含泛影葡胺分离液中的一种或多种。
进一步优选地，所述步骤(1)中分离液为Percoll分离液。
再进一步优选地，所述Percoll分离液的比重为1.077g/ml。
优选地，所述步骤(2)中培养液包括人AB血清和rIL-2、两性霉素B的RPMI1640/AIM-V培养液；
进一步优选地，所述人AB血清的浓度为10％；
进一步优选地，所述培养液中rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
再进一步优选地，所述培养液中rIL-2的浓度为3000IU/ml。
进一步优选地，所述培养液中两性霉素B的浓度为1ug/ml。
优选地，所述步骤(2)的培养过程中，细胞密度为1×106个/ml。
优选地，所述步骤(2)中培养箱的温度为35-40℃，CO2的浓度为3％-5％；
进一步优选地，所述步骤(2)中培养箱的温度为37℃，CO2的浓度为5％。
优选地，所述步骤(3)中rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
进一步优选地，所述步骤(3)中rIL-2的浓度为3000IU/ml；
优选地，所述步骤(3)中rIL-15的浓度为500-800IU/ml；
进一步优选地，所述步骤(3)中rIL-15的浓度为600IU/ml；
优选地，所述步骤(3)中OKT3的浓度为10-50ng/ml；
进一步优选地，所述步骤(3)中OKT3的浓度为30ng/ml；
优选地，所述步骤(3)中OK432的浓度为5-20ug/ml；
进一步优选地，所述步骤(3)中OK432的浓度为10ug/ml；
优选地，所述步骤(3)中抗4-1BB抗体的浓度为5-20ug/ml；
进一步优选地，所述步骤(3)中抗4-1BB抗体的浓度为10ug/ml。
具体的，所述IL-2(Interleukin-2)是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th0和CTL的增殖，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。
具体的，所述IL-15即白细胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)，由多种细胞产生。IL-15是免疫调节细胞因子家族成员，是一种极具治疗潜力的分子，主要由骨髓细胞表达，同样在其他细胞类型中也有表达。IL-15具有多种功能，包括控制T细胞反应、调节组织修复和B细胞归巢、调节炎症和激活NK细胞。
具体的，所述IL-15与IL-15α受体(IL-15Rα)结合，通过信号级联反应最终促进T细胞向记忆性干细胞样T细胞(Tscm)和中央记忆型T细胞(Tcm)分化，同时促进T细胞增殖和细胞因子释放，而不诱导Treg细胞群的扩增，增强免疫细胞肿瘤杀伤功能。
具体的，所述OKT3(Orthoclone OKT3)是抗人成熟T细胞共同分化抗原CD3的单克隆抗体。
具体的，所述OK432是一种作用于肿瘤的药物，是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用，OK432链球菌制剂作为刺激剂，可以直接激活TIL细胞，促进细胞扩增，提高细胞活性。
优选地，培养至第6日，添加150ml新鲜培养液继续培养，所述培养液中包括rIL-2、rIL-15、OKT3和OK432。
优选地，所述rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为3000IU/ml；
优选地，所述rIL-15的浓度为500-800IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-15的浓度为600IU/ml；
优选地，所述OKT3的浓度为10-50ng/ml；
进一步优选地，所述OKT3的浓度为30ng/ml；
优选地，所述OK432的浓度为5-20ug/ml；
进一步优选地，所述OK432的浓度为10ug/ml。
优选地，培养第8日，转移至培养袋中，添加300ml培养液继续培养，所述培养液中包括rIL-2和rIL-15。
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为3000IU/ml；
优选地，所述rIL-15的浓度为500-800IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-15的浓度为600IU/ml。
优选地，培养至第11日，添加500ml培养液，所述培养液中包括rIL-2；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为3000IU/ml。
优选地，培养至第14日，添加600ml培养液，所述培养液中包括rIL-2；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为1000-4000IU/ml；
进一步优选地，所述rIL-2的浓度为3000IU/ml。
又一方面，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞，采用上述的制备方法制得。
又一方面，本发明提供了上述的制备方法在制备肿瘤治疗剂中的应用。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明同时将rIL-2、rIL-15、OKT3、OK432、抗4-1BB抗体结合制备TIL，更好地促进TIL细胞增殖，增强TIL细胞的活性，满足临床需要。
(2)培养液添加rIL-15促进T细胞增殖和细胞因子释放，而不诱导Treg细胞群的扩增，增强免疫细胞肿瘤杀伤功能。
(3)OK432链球菌制剂作为刺激剂，可以直接激活TIL细胞，促进细胞扩增，提高细胞活性。
(4)节省了抗体的用量，降低了培养细胞成本。
(5)制备细胞需要时间短，制备的TIL细胞主要以CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞为主，其中以CD8+细胞占比更大，获得比例更多的抗原特异性的效应T细胞。
附图说明
图1为细胞毒检测的结果图；
图2为细胞上清IFN-γ的检测结果图，*p＜0.05。
具体实施方式
实验材料的购买厂家及货号：
胶原酶IV购自Sigma公司；货号为C4-22-1G；
透明质酸酶V购自Merck公司；货号为H1136；
DNase购自Merck公司；货号为10104159001；
percoll分离液购自GE公司；货号为17089101；
RPMI1640培养液购自Gibco公司；货号为12633012；
LDH检测试剂盒购自日本同仁化学公司；货号为CK12；
人IFN-γELISA测定试剂盒购自碧云天公司；货号为P1511；
仪器：流式细胞仪购自Beckman公司；
本发明的一些实施例中，使用的饲养层细胞来自健康供体，外周血单个核细胞PBMC经30Gy照射即得。
实施例1
1、TIL培养
TIL的培养包括以下步骤：
(1)取肿瘤组织，手术切除瘤组织，无菌条件下去除坏死组织及结缔组织，PBS冲洗两次。
(2)将组织剪碎，使用0.1mg/mL胶原酶IV、0.01mg/mL透明质酸酶V和10U/mL DNase在37℃恒温箱里消化60-120min。
(3)过100um滤网收集单细胞悬液。
(4)将单细胞悬液1500rpm/min离心5min，PBS洗2遍。
(5)在50ml离心管底部加比重为1.077g/ml的100％percoll分离液，其上加入等量用RPMI1640培养液稀释的75％percoll分离液，最上面一层加入等量细胞悬液。
(6)将离心管2000rpm/min离心20min。
(7)在两个界面各出现环状物，上环为肿瘤细胞，下环为淋巴细胞，轻轻吸取淋巴细胞，用PBS溶液洗两遍，即为TIL；
TIL细胞计数：使用显微镜计数TIL细胞；
接种：使用含有10％人AB血清和rIL-2(3000IU/ml)、两性霉素B(1μg/ml)的RPMI1640/AIM-V培养液，接种至T75培养瓶(与饲养细胞比例为1:100)，密度为1×106个/ml，体积为30ml；
培养：置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(8)第4天，分7组培养：
组1(实施例1)：添加20ml新鲜培养液及rIL-2(3000IU/ml)，rIL-15(600IU/ml)，OKT3(30ng/ml)、OK432(10ug/ml)，抗4-1BB抗体(10ug/ml)。
组2(实施例2)：添加20ml新鲜培养液及rIL-2(2000IU/ml)，rIL-15(500IU/ml)，OKT3(20ng/ml)、OK432(10ug/ml)，抗4-1BB抗体(10ug/ml)。
组3(实施例3)：添加20ml新鲜培养液及rIL-2(1000IU/ml)，rIL-15(500IU/ml)，OKT3(10ng/ml)、OK432(5ug/ml)，抗4-1BB抗体(20ug/ml)。
组4(实施例4)：添加20ml新鲜培养液及rIL-2(4000IU/ml)，rIL-15(800IU/ml)，OKT3(50ng/ml)、OK432(20ug/ml)，抗4-1BB抗体(20ug/ml)。
组5(对比例1)：与组1的区别在于不添加OK432，其余皆相同。
组6(对比例2)：与组1的区别在于不添加rIL-15，其余皆相同。
组7(对比例3)：与组1的区别在于不添加OKT3，其余皆相同。
(9)第6天，分7组培养：
组1(实施例1)：转移至T225培养瓶，再添加150ml新鲜培养液rIL-2(3000IU/ml)、rIL-15(600IU/ml)、OK432(10ug/ml)OKT3(30ng/ml)。
组2(实施例2)：转移至T225培养瓶，再添加150ml新鲜培养液rIL-2(2000IU/ml)、rIL-15(500IU/ml)、OK432(5ug/ml)、OKT3(20ng/ml)。
组3(实施例3)：转移至T225培养瓶，再添加150ml新鲜培养液rIL-2(1000IU/ml)、rIL-15(500IU/ml)、OK432(5ug/ml)、OKT3(10ng/ml)。
组4(实施例4)：转移至T225培养瓶，再添加150ml新鲜培养液rIL-2(4000IU/ml)、rIL-15(800IU/ml)、OK432(20ug/ml)OKT3(50ng/ml)。
组5(对比例1)：与组1的区别在于不添加OK432，其余皆相同。
组6(对比例2)：与组1的区别在于不添加rIL-15，其余皆相同。
组7(对比例3)：与组1的区别在于不添加OKT3，其余皆相同。
(10)第8天，分7组培养：
组1(实施例1)：1瓶T225转移至1只2L的培养袋中，添加300ml培养基，培养基中包括rIL-2(3000U/ml)和rIL-15(600IU/ml)。
组2(实施例2)：1瓶T225转移至1只2L的培养袋中，添加300ml培养基，培养基中包括rIL-2(2000U/ml)和rIL-15(500IU/ml)。
组3(实施例3)：1瓶T225转移至1只2L的培养袋中，添加300ml培养基，培养基中包括rIL-2(1000U/ml)和rIL-15(500IU/ml)。
组4(实施例4)：1瓶T225转移至1只2L的培养袋中，添加300ml培养基，培养基中包括rIL-2(4000U/ml)和rIL-15(800IU/ml)。
组5(对比例1)：与组1的区别在于不添加OK432，其余皆相同。
组6(对比例2)：与组1的区别在于不添加rIL-15，其余皆相同。
组7(对比例3)：与组1的区别在于不添加OKT3，其余皆相同。
(11)第11天，各组添加500ml培养基，培养基中含有rIL-2(3000U/ml)。
(12)第14天，各组添加600ml培养基，培养基中含有rIL-2(3000U/ml)。
(13)第16天，收获各组细胞。
2、肿瘤细胞培养：
肿瘤细胞的培养包括以下步骤：
调整肿瘤细胞密度为2×105cells/mL，接种于T75培养瓶。每瓶加入RPMI1640培养基10ml，含10％FCS。培养后用作靶细胞检测制备的TIL的杀伤效应。
实验例1质量检测控制与表型鉴定
TIL细胞的表型鉴定：
用流式细胞仪检测TIL细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达。
取扩增后的各组TIL细胞，离心重悬，经PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1.0×106个/mL，每管100μL。分别加入10ul荧光素标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD56及同型对照IgG1的单克隆抗体，混匀后室温避光孵育30min，PBS缓冲液洗2次，最后加入4％的多聚甲醛固定，于流式细胞仪上进行检测。检测结果如下表1所示：
表1.
CD3(％) CD4(％) CD8(％) CD56(％)
实施例1 91.9 36.6 58.1 11.3
实施例2 83.3 31.2 46.8 23.9
实施例3 70.5 27.8 43.1 26.6
实施例4 76.6 30.4 50.6 13.1
对比例1 61.2 23.8 34.9 31.5
对比例2 52.3 19.6 30.1 36.6
对比例3 40.4 26.6 23.9 46.8
从表1中可以看出实施例1-4的TIL细胞表面标志CD3+细胞的比例高于对比例1-3，以CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+为主，CD3+CD56+细胞的比例较低，其中，实施例1的TIL细胞表面标志CD3+细胞的比例最高，为91.9％，而对比例-3的CD3+CD56+细胞比较较高。显示本发明制备的TIL细胞以CD4和CD8为主，TIL细胞快速增殖，所扩增出的细胞90％为成熟的T细胞。说明本发明的制备方法可以获得更多抗原特异性的效应T细胞。在癌症患者免疫状况与预后的研究中，癌症组织内浸润的CD8+细胞的数量与患者预后呈正相关，其数量越多，预后就越好，说明本发明有极大的临床应用价值。
细胞毒检测：
取各组扩增后的TIL细胞悬液，离心后PBS洗涤2遍，调整细胞密度为1.0×106个/mL，作为效应细胞。消化的肿瘤细胞，调整细胞密度为5.0×104个/mL，作为靶细胞。
按照效靶比为30:1、10:1和5:1比例混合细胞，培养于96孔板内，每孔总体积200uL。于96孔圆底板内进行培养，同时设置自发释放孔和最大释放孔。靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％TritonX-100各100μL，放入培养箱中18-24h。然后将96孔培养板以250g离心5min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应5min，每孔加入30μL HCl(1mol/L)，在酶标仪490nm处测定吸光度值。
按照试剂盒说明书的方法计算杀伤活性。
计算公式：靶细胞杀伤率＝(实验组OD值-靶细胞自然释放孔OD值)/(靶细胞最大释放孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值)×100％。
结果如图1所示，从图1可以看出制备的TIL与肿瘤细胞共孵育后，实施例1-4对靶细胞的杀伤毒性高于对比例1-3，差异显著。在30:1和10:1的条件下，杀伤率都在80％以上。采用本发明的方法，TIL在体外成功进行了培养扩增，并具有显著的抗肿瘤活性。
3、IFN-γ的检测
通过细胞因子分泌测定TIL活性和特异性。
各组TIL和酶解获得的肿瘤细胞按1:1的比例(各1×105个细胞)在96孔底圆板中培养过夜。24h后收集上清。采用人IFN-γELISA法测定试剂盒检测INF-γ。
在450nm处测量各孔的光密度，根据标准曲线计算IFN-γ浓度。IFN-γ浓度≥100pg/ml为反应性临界值。
结果如图2所示，从图2中可以看出实施例1-4制备的TIL与肿瘤细胞共培养后分泌的细胞因子INF-γ含量高于对比例1-3，差异显著(实施例1-4vs对比例1-3，*p＜0.05)，其中，实施例1制备的TIL与肿瘤细胞共培养后分泌的细胞因子INF-γ含量最高，差异显著。说明本发明制备的TIL具有独特的优势。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将组织用消化液消化，过滤，收集单细胞悬液，离心，加入分离液，离心，吸取淋巴细胞；
（2）将淋巴细胞接种至培养瓶中，培养；
（3）培养至第4日，加入含有rIL-2、rIL-15、OKT3、OK432、抗4-1BB抗体的培养液继续培养；
（4）培养至第6天，加入含有rIL-2、rIL-15、OKT3、OK432的培养液继续培养；
（5）培养至第8天，添加培养基，培养基中含有rIL-2和rIL-15；
（6）培养至第11天，添加培养基，培养基中含有rIL-2；
（7）培养至第14天，添加培养基，培养基中含有rIL-2；
（8）第16天，收获肿瘤浸润淋巴细胞；
所述步骤（3）中：
rIL-2的浓度为2000IU/ml；
rIL-15的浓度为500IU/ml；
OKT3的浓度为20ng/ml；
OK432的浓度为10 ug/ml；
抗4-1BB抗体的浓度为10ug/ml；或者；
所述步骤（3）中：
rIL-2的浓度为3000IU/ml；
rIL-15的浓度为600IU/ml；
OKT3的浓度为30ng/ml；
OK432的浓度为10 ug/ml；
抗4-1BB抗体的浓度为10ug/ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中消化液选自胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶IV、透明质酸酶V、DNase、无酚红胰蛋白酶中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中消化液为胶原酶IV、透明质酸酶V和DNase组合使用；所述胶原酶IV的浓度为0.01-0.5mg/mL；所述透明质酸酶V的浓度为0.005-0.05mg/mL；所述DNase的浓度为5-15U/mL。
4.一种肿瘤浸润淋巴细胞，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制得。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法在制备肿瘤治疗剂中的应用。
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