CN114686430A - 一种制备til的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备TIL的方法。具体地，本发明提供一种制备TIL细胞的方法，所述的方法包括步骤：对含TIL细胞的初始细胞群与feeder细胞进行共培养后得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，然后将所述第一扩增细胞群与第二feeder细胞进行共培养获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群。本发明所述的方法能够从极少量的易获取的肿瘤样本中快速培养得到大量TIL。

Description

一种制备TIL的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备TIL的方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗的第三次革命，给了无数晚期癌症患者新的希望。其中T细胞过继性回输疗法是备受瞩目的方法，该疗法目前主要包括CAR-T，TCR-T和TIL三种，相对于CAR-T在血液瘤治疗有效却在实体瘤治疗中不尽如人意的现状，TIL对实体瘤的治疗有效性从一开始黑色素瘤临床试验结果披露之后就受到了多方面研究并被推广到肺癌，宫颈癌，头颈癌等其他癌症的临床试验。但是TIL治疗有一个很大的瓶颈，就是必须受限于癌症组织样本，并且培养的时间很长。使得很多晚期的无法手术的病人没法获取培养TIL细胞的样本和等待TIL治疗的机会。
目前已有的TIL疗法主要针对的是大块的肿瘤组织，针对穿刺样本的受限于起始的TIL细胞数量，当前已有的TIL培养技术用大量的起始TIL细胞培养扩增到10的十次到十一次方，所以对于难以获取手术样本的病人来说是很大的制约。另外目前已有的从穿刺样本培养TIL的一份专利仍然对起始TIL细胞有限制，而且培养过程比较繁琐，最后所得细胞也受限。所以从极少量的样本中培养TIL需要创新的工艺。
因此，本领域需要开发一种能够从极少量的易获取的肿瘤样本中快速培养得到大量TIL的方法。
发明内容
本发明的目提供一种能够从极少量的易获取的肿瘤样本或极少量起始TIL细胞快速培养得到大量TIL的方法
本发明第一方面，提供一种制备TIL细胞的方法，所述的方法包括步骤：
(1)提供来自于肿瘤样本的含TIL细胞的初始细胞群，其中所述初始细胞群中所含TIL细胞数量为n0；
(2)任选地对所述初始细胞群进行预处理，所述预处理包括在IL7、IL15和/或IL21细胞因子存在下，培养时间6-36小时(较佳地8-30小时，更佳地10-24小时)，从而获得经预处理的初始细胞群；
(3)在第一培养容器中，将前一步骤获得的初始细胞群与第一feeder细胞在第一培养基中进行共培养一段时间t1，从而得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，其中，在所述的第一扩增细胞群中TIL细胞数量为n1，其中n1/n0为1000-10000，并且n1≥1×107；
(4)将所述第一扩增细胞群转移到第二培养容器，并与第二feeder细胞在第二培养基中进行共培养一段时间t2，从而获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群，其中，在所述的第二扩增细胞群中TIL细胞数量为n2，其中n2/n1为4000-10000，并且n2≥1×1010。
在另一优选例中，t1为7-16天，较佳地9-14天。
在另一优选例中，t2为10-16天，较佳地12-14天。
在另一优选例中，所述第二扩增细胞群中TIL细胞的纯度P≥90％，按所述第二扩增细胞群中的细胞总数计。
在另一优选例中，所述的纯度P≥92％，更佳地P≥94％，最佳地P≥95％或更高。
在另一优选例中，步骤(3)和(4)的总扩增率(n1×n2)/n0为0.1×107至20×107，较佳地1×107至10×107。
在另一优选例中，所述的n0为≥2000。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述的第一培养基包括基础培养基、血清或血清替代物、L-谷氨酰胺以及含有选自下组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、OKT3抗体、anti-41BB、antiOX40，anti-PD-1，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(3)中，在所述共培养开始时，所述初始细胞群中的TIL细胞和第一feeder细胞的细胞数量比R1为1:10-1:10000。
在另一优选例中，在步骤(4)中，在所述共培养开始时，所述初始细胞群中的TIL细胞和第二feeder细胞的细胞数量比R2为1:2-1:400。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本为离体的样本。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本为极少量肿瘤样本。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本包括但不限于穿刺样本和/或手术样本。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本为从肿瘤患者获得(如穿刺获得)。
在另一优选例中，所述的TIL细胞包括解离后经筛选等方法得到的少量起始细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本包括但不限于肺癌、宫颈癌、卵巢癌等实体瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤样本的重量为0.01-0.05g或更多，更佳地0.02-0.04g，例如0.02g、0.03g或0.04g。
在另一优选例中，n0为1000-50000个，较佳2000-50000个，更佳地2000-10000个，更佳地3000-10000个。
在另一优选例中，n1为0.1×108-3.0×108，较佳地0.3×108-2.0×108
在另一优选例中，n2为1×1010-2×1011。
在另一优选例中，n2为1.0×1011-2.0x1011。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述的肿瘤样本经解离液解离得到含TIL细胞的初始细胞群；
所述的解离液包括胶原酶II、胶原酶IV、DNase和透明质酸酶和细胞等渗液。
在另一优选例中，所述的细胞等渗液包括但不限于培养基，DPBS等。
在另一优选例中，在所述的解离液中，胶原酶II浓度为0.1g/ml-10g/ml；胶原酶IV浓度为0.1g/ml-10g/ml；DNase浓度为0.1g/ml-10g/ml；透明质酸酶浓度为10U/ml-1000U/ml。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，IL7细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml；和/或
所述步骤(2)中，IL15细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml；和/或
所述步骤(2)中，IL21细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述初始细胞群中的TIL细胞和第一feeder细胞的细胞数量比为1:10-1:10000，较佳地1:100-1:600，更佳地1:200-1:400。
在另一优选例中，所述的第一培养基含有选自下组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、OKT3抗体、anti-41BB、antiOX40，anti-PD-1，或其组合。
在另一优选例中，所述的第一培养基为液体培养基。
在另一优选例中，所述的第一培养基为完全培养基。
在另一优选例中，所述的第一培养基中，所述OKT3的浓度为3-100ng/ml。
在另一优选例中，所述的第一培养基中，所述IL2的浓度为300-10000IU/ml。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述的培养过程中，控制TIL细胞密度范围在0.2-4M/ml。
在另一优选例中，所述的细胞密度通过换液或补液进行控制。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述的第一feeder细胞为经辐照后的第一feeder细胞。
在另一优选例中，Feeder来源包括但不限于PBMC和/或抗原递呈细胞等。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述的培养在G-Rex10M中进行。
在另一优选例中，，所述步骤(3)中，所述的培养在Prodigy中进行。
在另一优选例中，所述步骤(3)结束，细胞冻存等需要的时候进入步骤(4)扩增。
在另一优选例中，所述步骤(4)中，所述TIL细胞的接种的细胞量＞20×106个。
在另一优选例中，所述的第二培养基为液体培养基。
在另一优选例中，所述的第二培养基为完全培养基。
在另一优选例中，所述的完全培养基包括基础培养基、血清或血清替代物、L-谷氨酰胺和细胞因子。
在另一优选例中，所述基础培养基但不限于：AIM-V、RPMI-1640、optimizer CTS Tcell expansion basal medium,X-vivo 15,TexMACS，或其组合。
在另一优选例中，血清或血清替代物包括但不限于：Human AB Serum、CTS immunecell SR。
在另一优选例中，L-谷氨酰胺包括但不限于：L-glutamine 100×、SG-200StableL-Glutamine Dipeptide。
在另一优选例中，细胞因子包括但不限于：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21，或其组合。
在另一优选例中，IL-2的浓度范围在300-10000IU/ml。
在另一优选例中，IL-7、IL-15和/或IL-21的浓度范围在10ng/ml～100μg/ml。
在另一优选例中，所述的第二培养基还含有选自下组的组分：OKT3、CD3Dynabeads、CD3/28Dynabeads，或其组合。
在另一优选例中，所述的第二培养基中，所述OKT3浓度为10ng/ml～100μg/ml。
在另一优选例中，所述的第二培养基中，所述的CD3 Dynabeads的使用量(数量)为接种TIL细胞量的1-3倍。
在另一优选例中，所述的第二培养基中，所述的CD3/28Dynabeads的使用量(数量)为接种TIL细胞量的1-3倍。
在另一优选例中，所述步骤(4)中，所述的培养在Prodigy，WAVE，G-rex等培养容器中进行。
在另一优选例中，将含有TIL细胞和的第一细胞群和第二feeder细胞接种于XuriW25的细胞袋中。
在另一优选例中，所述的细胞袋的容积为2-50L。
在另一优选例中，所述的Xuri W25的包括选自下组的一种或多种参数：
参数 设置范围
Rocking Speed(摇摆速度) 2-20rpm
Angle(摇摆角度) 2-12°
CO<sub>2</sub>比例 3-8％
O<sub>2</sub>比例 15％-50％
温度 25-37℃
Gas Flow(气体流速) 0.05-0.5L/min。
在另一优选例中，所述TIL在Xuri W25中进行扩增时，培养体积范围在300ml-25000ml。
在另一优选例中，所述TIL在Xuri W25中进行扩增时，TIL细胞密度范围在0.01×106/ml-50×106/ml。
在另一优选例中，所述TIL在Xuri W25中进行扩增时，培养过程中的灌流程序如下所示：
Figure BDA0002879771380000051
Figure BDA0002879771380000061
备注：V为培养体系体积。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(5)：
对所述的第一TIL细胞扩增群进行再次扩增，得到TIL细胞；
所述的步骤(5)中，所述的再次扩增在Prodigy，WAVE，G-rex等培养体系进行。
在另一优选例中，所述步骤(5)中，再次扩增后进洗涤浓缩，所述的洗涤浓缩在LOVO/Sefia/Sepax C-Pro/Sepax 2/CS5+/CSE等中进行。
在另一优选例中，LOVO/Sefia/Sepax C-Pro/Sepax 2/CS5+/CSE的参数(包括洗涤浓缩的参数)如下：
可处理样本体积范围在50ml-22000ml；
样本流入腔体的速率范围在50ml/min-200ml/min；
样本流出腔体的速率范围在50ml/min-200ml/min；
洗涤循环次数范围在1-5次；和/或
细胞洗涤浓缩后输出体积范围在50ml-2000ml。
在另一优选例中，所述的洗涤的洗涤液选自下组：0.9％氯化钠注射液、复方电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液，或其组合。
在另一优选例中，所述的洗涤液还含有0.1％-5％人血清白蛋白。
在另一优选例中，所述的步骤(4)中，再次扩增后进行分装。
在另一优选例中，所述的分装采用Cell Connect分装管路、Sepax 2、Sepax C-pro或Sefia分装设备进行。
在另一优选例中，所述的分装在洗涤浓缩之后。
在另一优选例中，所述的洗涤浓缩的参数包括：
可处理样本体积范围在5ml-500ml；
分装输出体积范围在5ml-400ml；和/或
添加完冻存液的细胞样本中DMSO的浓度范围在0％-10％。
本发明第二方面，提供一种如本发明第一方面所述的方法制备的TIL细胞。
本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的方法制备的TIL细胞用于制备抗肿瘤药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为极少量样本TIL扩增示意图。
图2为极小量样本TIL扩增的工艺流程图。
图3为第一次扩增所得的TIL细胞冻存复苏前后对比。
图4为第一次扩增和第二次扩增的TIL扩增曲线。
图5为第一次扩增(1st REP)和第二次扩增(2nd REP)所得TIL细胞表达marker。
图6为用Prodigy第一次扩增的细胞生长曲线图。
图7为第一次扩增中，添加的细胞因子对TIL细胞增殖和分化的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种能够从极少量的易获取的肿瘤样本中快速培养得到大量TIL的方法。在本发明所述的方法中，将极少量肿瘤组织解离后通过两次扩增，实现极少量TIL细胞的快速大量制备，且能够通过进一步配合Prodigy/Grex/Wave等细胞扩增系统和LOVO/Sefia/Sepax C-Pro/Sepax 2/CS5+/CSE等封闭化系统进行TIL洗涤灌装，提高生产产能、适用于工业化生产。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“TIL细胞”为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
如本文所用，术语“Feeder细胞”为饲养细胞。
如本文所用，术语“OKT3”为抗人CD3单克隆抗体。
如本文所用，术语“IL2”为白细胞介素2。
如本文所用，术语“Xuri W25”是指Xuri细胞扩增系统W25。
如本文所用，术语“完全培养基”由基础培养基、血清或血清替代物、L-谷氨酰胺、细胞因子组成。基础培养基包括但不限于：AIM-V、RPMI-1640、optimizer CTS T cellexpansion basal medium，X-vivo 15,TexMACS；血清或血清替代物包括但不限于：HumanAB Serum、CTS immune cell SR；L-谷氨酰胺包括但不限于：L-glutamine 100×、SG-200Stable L-Glutamine Dipeptide；细胞因子包括但不限于：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21，IL-2的浓度范围在300-6000IU/ml，IL-7、IL-15和IL-21的浓度范围在10ng/ml～100μg/ml。
方法
本发明提供一种制备TIL细胞的方法，所述的方法包括步骤：
(1)提供来自于肿瘤样本的含TIL细胞的初始细胞群，其中所述初始细胞群中所含TIL细胞数量为n0；
(2)任选地对所述初始细胞群进行预处理，所述预处理包括在IL7、IL15和/或IL21细胞因子存在下，培养时间6-36小时(较佳地8-30小时，更佳地10-24小时)，从而获得经预处理的初始细胞群；
(3)在第一培养容器中，将前一步骤获得的初始细胞群与第一feeder细胞在第一培养基中进行共培养一段时间t1，从而得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，其中，在所述的第一扩增细胞群中TIL细胞数量为n1，其中n1/n0为1000-10000，并且n1≥1×107；
(4)将所述第一扩增细胞群转移到第二培养容器，并与第二feeder细胞在第二培养基中进行共培养一段时间t2，从而获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群，其中，在所述的第二扩增细胞群中TIL细胞数量为n2，其中n2/n1为4000-10000，并且n2≥1×1010。
在本发明的一个优选例中，t1为7-16天，较佳地9-14天。
在本发明的一个优选例中，t2为10-16天，较佳地12-14天；
在本发明的一个优选例中，所述第二扩增细胞群中TIL细胞的纯度P≥90％，按所述第二扩增细胞群中的细胞总数计。
在本发明的一个优选例中，所述的纯度P≥92％，更佳地P≥94％，最佳地P≥95％或更高。
在本发明的一个优选例中，步骤(3)和(4)的总扩增率(n1×n2)/n0为0.1×107至20×107，较佳地1×107至10×107。
在本发明的一个优选例中，所述的n0为≥2000。
在本发明的一个优选例中，在步骤(3)中，在所述共培养开始时，所述初始细胞群中的TIL细胞和第一feeder细胞的细胞数量比R1为1:10-1:10000，
在本发明的一个优选例中，在步骤(4)中，在所述共培养开始时，所述初始细胞群中的TIL细胞和第二feeder细胞的细胞数量比R2为1:2-1:400。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤样本为离体的样本。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤样本包括但不限于肺癌、宫颈癌卵巢癌癌等实体瘤。
优选地，所述的肿瘤样本的重量为0.01-0.05g或更多，更佳地0.02-0.04g，例如0.02g、0.03g或0.04g。
优选地，n0为1000-50000个，较佳2000-50000个，更佳地2000-10000个，更佳地3000-10000个，
在本发明的一个优选例中，n1为0.1×108-3.0×108，较佳地0.3×108-2.0×108在本发明的一个优选例中，n2为1×1010-2×1011。
在本发明的一个优选例中，n2为1.0×1011-2.0x1011。
在本发明的一个优选例中，所述步骤(1)中，所述的肿瘤样本经解离液解离得到含TIL细胞的初始细胞群；
所述的解离液包括胶原酶II、胶原酶IV、DNase和透明质酸酶和细胞等渗液。
在另一优选例中，所述的细胞等渗液包括但不限于培养基，DPBS等。
在另一优选例中，在所述的解离液中，胶原酶II浓度为0.1g/ml-10g/ml；胶原酶IV浓度为0.1g/ml-10g/ml；DNase浓度为0.1g/ml-10g/ml；透明质酸酶浓度为10U/ml-1000U/ml。
在本发明的一个优选例中，所述步骤(2)中，IL7细胞因子浓度为10ng/ml-100μg/ml。
在本发明的一个优选例中，所述步骤(2)中，IL15细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml。
在本发明的一个优选例中，所述步骤(2)中，IL21细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述初始细胞群中的TIL细胞和第一feeder细胞的细胞数量比为1:10-1:10000，较佳地1:100-1:600，更佳地1:200-1:400。
在本发明的一个优选例中，所述的第一培养基含有选自下组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、OKT3抗体、anti-41BB、antiOX40，anti-PD-1，或其组合。
更具体地，所述制备TIL细胞的方法如上本发明第一方面所述。
本发明的主要优点包括：
1、本发明所述的方法能够针对极少量的肿瘤组织或经筛选得到的起始TIL细胞，在较短时间内培养到10的11次方以上的TIL细胞。本发明所述的方法能够更快更简单的刺激在极少量肿瘤样本中的微量TIL细胞，使之快速扩增并减缓分化，利用两轮扩增和feeder共培养，从而实现在短时间内完成10的十一次方细胞扩增任务同时仍然遏制细胞往Teff(效应T细胞)的方向分化。
2、在本发明所述的方法中，样本起始所需的TIL远比已有技术更少可以从几千个TIL细胞起始(≥2000)。整个方法所用时间仍然可保持在19-24天内。
3、在本发明所述的方法中，可以通过调节feeder的量使得在不同起始数量TIL在9-14天内扩增到至少30M。
4、在本发明所述的方法中，最终所得的TIL的量比已有技术更多可以得到1-2x1011细胞。
5、在本发明所述的方法中，先解离细胞，而不是直接培养组织，方法比已有技术更简单，分两步即可得到最终细胞。
6、在本发明所述的方法中，第一步扩增得到的细胞可以用少至2.5x107就能使得经过二次扩增后的细胞量达到10的十一次方以上。总的扩增倍数远超已有技术。
7、在本发明所述的方法中，在第一步扩增时使用IL7/15/21的组合使得Tcm的比例得到提高并且不影响细胞数量。
8、在本发明所述的方法中，在第一步极少量扩增时所加IL2的浓度可低至300-10000IU/ml。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
本实施例考察一种TIL细胞的制备方法，极少量肿瘤样本扩增示意图如图1所示，工艺流程图如图2所示，所述的方法如下：
1.肿瘤组织解离：
a.将肿瘤组织称重，DPBS润洗数次后转移至培养皿中，用一次性手术刀将肿瘤组织切碎成小块后，加入解离液，其中，以大约5-50ml/g为一组反应，将解离液和切碎的肿瘤组织小块一起放入一至多个反应容器中，包括但不限于GentleMACS的C-tube中或普通tube，转移袋和培养皿；
其中，解离液由胶原酶II，胶原酶IV，DNase和透明质酸酶和细胞等渗液组成，细胞等渗液包括但不限于培养基，DPBS等。其中胶原酶II浓度范围在：0.1g/ml-10g/ml；胶原酶IV浓度范围在：0.1g/ml-10g/ml；DNase浓度范围在：0.1g/ml-10g/ml；透明质酸酶浓度范围在：10U/ml-1000U/ml。
b.选择程序并运行，根据肿瘤样本的瘤种不同而选不同的程序。解离程序结束后，将C-tube管从组织处理器上取下，放置于离心机中离心，使所有组织解离碎片及悬液离至管底；
针对不同肿瘤组织，GentleMACS可使用37℃_h_TDK_1或37℃_h_TDK_2或37℃_h_TDK_3.或者使用37℃培养箱手动吹打，或者在37℃恒温条件震荡或旋转混匀。
c.将C肿瘤解离后的细胞悬液吸出，经细胞滤网(滤网孔径为20-70μm)过滤，获得含细胞的滤液，，离心后去上清得解离的细胞(初始细胞群)。
d.将所述初始细胞群重悬于TIL细胞培养基，加入IL7、IL15和IL21细胞因子培养6-36h(IL7、IL15和IL21细胞因子浓度均为10ng/ml～100μg/ml)，从而获得经预处理的细胞群。
2.feeder与TIL细胞共培养(第一次扩增)
a.将辐照后的feeder细胞根据TIL的量以一定比例重悬于细胞培养基(完全培养基)中，和上述已过夜的经预处理的含TIL细胞的细胞群混合，然后一并转移至G-Rex10M中，同时加入OKT3抗体、高浓度的IL2和其它相关因子或抗体。
TIL和feeder的细胞数量比例范围1:10-1:10000。
OKT3的浓度范围3-100ng/ml；
IL2的浓度范围300-10000IU/ml。
其他相关因子包括但不限于IL7/15/21及anti-41BB，antiOX40，anti-PD1等刺激T细胞的任意组合。
b.密切监控细胞生长和分化状态及时补液和换液。期间细胞取样计数，在达到预计细胞数量后可进入第一轮扩增，扩增后的细胞可以冻存保存进行第二轮扩增；
第一次扩增的参数如下：
补液范围2-100ml.
扩增收获TIL细胞数量为2x107～2x 108个。
冻存液包括但不限于CS10等。
3.第二步feeder与TIL细胞共培养(第二次扩增)
a.将步骤2所得新鲜TIL细胞(TIL细胞是以在步骤2培养液中存在)或冻存后静置培养1-3天的细胞与Feeder cell一起接种至细胞扩增系统，包括但不限于Prodigy/Wave/Grex等，冻存细胞复苏后的状态如图3所示，从图3中可以看出，冻存并不影响细胞的基本性能。并添加激活因子OKT3/CD3 Dynabeads/CD3/28Dynabeads进行快速扩增培养。
复苏后的TIL接种密度范围为0.5×106/ml-5×106/ml，静置培养12-72h；
TIL和Feeder cell接种数量比例范围为TIL：Feeder cell＝1:20-1:400，接种时TIL细胞量＞20×106个，激活因子OKT3浓度范围为10ng/ml～50μg/ml，CD3 Dynabeads和CD3/28Dynabeads的使用量(数量)为接种TIL细胞量的1-3倍。Xuri W25(2L/10L/20L/50LCellbag)实施例中Xuri W25参数设备范围见下表1：
表1 Xuri W25参数
Figure BDA0002879771380000121
Figure BDA0002879771380000131
TIL在Xuri W25(2L/10L/20L/50L Cellbag)中快速扩增时，培养体积范围在300ml-25000ml，TIL细胞密度范围在0.01×106/ml-50×106/ml，培养过程中的灌流程序见下表2：
表2灌流程序
细胞密度 灌流速率
细胞密度＜1×10<sup>6</sup>/ml 不进行灌流
1×10<sup>6</sup>/ml≤细胞密度＜5×10<sup>6</sup>/ml 灌流20％V/Day-40％V/Day
5×10<sup>6</sup>/ml≤细胞密度＜10×10<sup>6</sup>/ml 灌流40％V/Day-60％V/Day
10×10<sup>6</sup>/ml≤细胞密度＜15×106/ml 灌流60％V/Day-80％V/Day
15×10<sup>6</sup>/ml≤细胞密度＜50×10<sup>6</sup>/ml 灌流80％V/Day-200％V/Day
备注：V为培养体系体积。
所用培养基为完全培养基。
b.培养6-18天后采用LOVO/Sefia/Sepax C-Pro/Sepax 2/CS5+/CSE进行快速扩增后TIL的洗涤浓缩；
进行细胞的洗涤浓缩的设备包括但不限于LOVO/Sefia/Sepax C-Pro/Sepax2/CS5+/CSE。
可处理样本体积范围在50ml-22000ml；
样本流入腔体的速率范围在50ml/min-200ml/min；
样本流出腔体的速率范围在50ml/min-200ml/min；
洗涤循环次数范围在1-5次；
细胞洗涤浓缩后输出体积范围在50ml-2000ml；
洗涤液包括但不限于0.9％氯化钠注射液、复方电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液，其中需添加0.1％-5％人血清白蛋白。
c.采用Cell Connect分装管路、Sepax 2、Sepax C-pro、Sefia等分装设备或耗材进行步骤b处理后TIL的分装。
步骤c需先添加冻存液，然后进行细胞分装，分装系统包括但不限于Cell Connect分装管路、Sepax 2、Sepax C-pro、Sefia。
可处理样本体积范围在5ml-500ml
分装输出体积范围在5ml-400ml
添加完冻存液的细胞样本中DMSO的浓度范围在0％-10％。
实验结果
第一次扩增和第二次扩增的TIL扩增曲线如图4所示，从图4中可以看出，两次扩增均使得TIL细胞进行有效扩增。
第一次扩增(1st REP)和第二次扩增(2nd REP)所得细胞表达marker如图5所示，从图5中可以看出，扩增后TIL细胞能够有效表达。
第一次扩增中，添加的细胞因子对TIL细胞增殖和分化的影响如图7所示，从图7中可以看出，添加的细胞因子能够有效促进TIL细胞增殖和分化。
实施例1-5和对比例1-2
重复实施例1，不同点在于，采用来源于不同肿瘤病人的肿瘤穿刺样本。对比例1为不同预处理，对比例2为无OKT3且不直接接触feeder。
实施例1-5和对比例1-2的制备工艺区别及其扩增效果如下表3所示：
表3实施例1-5和对比例1-2的制备工艺区别及其扩增效果
Figure BDA0002879771380000141
实施例6
重复实施例1，不同点在于，细胞是筛选后起始量为2000的细胞，第一次扩增是在Prodigy里进行，细胞增长曲线见图6.
讨论
本发明实施例制备的TIL细胞的方法与现有技术WO2019100023A1的比较如下表4所示：
表4
Figure BDA0002879771380000142
Figure BDA0002879771380000151
从表4中可以看出，本申请所述的方法能够对极少量的TIL细胞进行扩增生成大量的的TIL细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备TIL细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)提供来自于肿瘤样本的含TIL细胞的初始细胞群，其中所述初始细胞群中所含TIL细胞数量为n0；
(2)任选地对所述初始细胞群进行预处理，所述预处理包括在IL7、IL15和/或IL21细胞因子存在下，培养时间6-36小时，从而获得经预处理的初始细胞群；
(3)在第一培养容器中，将前一步骤获得的初始细胞群与第一feeder细胞在第一培养基中进行共培养一段时间t1，从而得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，其中，在所述的第一扩增细胞群中TIL细胞数量为n1，其中n1/n0为1000-10000，并且n1≥1×107；
(4)将所述第一扩增细胞群转移到第二培养容器，并与第二feeder细胞在第二培养基中进行共培养一段时间t2，从而获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群，其中，在所述的第二扩增细胞群中TIL细胞数量为n2，其中n2/n1为4000-10000，并且n2≥1×1010。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤样本包括但不限于肺癌、宫颈癌、卵巢癌等实体瘤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤样本的重量为0.01-0.05g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，n0为1000-50000个，较佳2000-50000个，更佳地2000-10000个，更佳地3000-10000个。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述的肿瘤样本经解离液解离得到含TIL细胞的初始细胞群；
所述的解离液包括胶原酶II、胶原酶IV、DNase和透明质酸酶和细胞等渗液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，IL7细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml；和/或
所述步骤(2)中，IL15细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml；和/或
所述步骤(2)中，IL21细胞因子浓度为10ng/ml～100μg/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一培养基含有选自下组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、OKT3抗体、anti-41BB、antiOX40，anti-PD-1，或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二培养基还含有选自下组的组分：OKT3、CD3 Dynabeads、CD3/28Dynabeads，或其组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(5)：
对所述的第一TIL细胞扩增群进行再次扩增，得到TIL细胞；
所述的步骤(5)中，所述的再次扩增在Prodigy，WAVE，G-rex等培养体系进行。
10.一种如权利要求1所述的方法制备的TIL细胞用于制备抗肿瘤药物。
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