CN111902533A - 产生自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于产生自然杀伤(NK)细胞的方法。更具体地，本发明涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞与支持细胞一起增殖，并且在达到累积分裂次数特定数量的时间用支持细胞再刺激所述外周血单核细胞。本发明还涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。根据本发明的产生方法的优点在于，与现有方法相比，可以通过临床友好的方法在短时间段内以高纯度和高效率产生具有高细胞杀伤能力和细胞存活率的NK细胞，从而增加了NK细胞治疗剂的生产率。

Description

产生自然杀伤细胞的方法
技术领域
本申请涉及一种用于产生自然杀伤(NK)细胞的方法，更具体地涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞与饲养细胞一起增殖，并且在达到特定积累群体倍增水平的时间用饲养细胞再刺激所述外周血单核细胞。
本申请还涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是淋巴样细胞，其占血细胞的约10％并且在免疫应答中发挥重要作用。NK细胞具有许多功能。具体地，它们用于去除已经经历或正在经历肿瘤化的异常细胞，因为NK细胞具有杀伤癌细胞、被外来入侵的病原体感染的细胞等的能力。
大多数NK细胞通常以失活状态存在于体内。但是，为了出于治疗性目的而使用NK细胞，需要激活NK细胞。因此，积极地进行了关于激活来自正常血液或来自具有失活NK细胞的患者的血液的NK细胞的研究。
通过离体激活NK细胞实现的NK细胞的高细胞毒性证明了NK细胞用于免疫细胞疗法的可能性。据报告，离体激活的NK细胞在同种异体骨髓移植之后向患者给予时，对于各种癌症，特别是血液癌症诸如白血病具有治疗性作用(Blood Cells Molecules&Disease,33:第261-266页,2004)。
同时，虽然NK细胞可能作为治疗剂，但是体内存在的NK细胞的数量并不大，并且因此需要产生大量NK细胞同时维持足以用于治疗性目的的效率的技术。然而，NK细胞在体外的大量培养和增殖是不够的。因此，用于在可用水平下培养和扩增NK细胞的技术受到了关注，并且对其进行了许多研究。但是，研究结果仍不适用于临床。
已经进行了关于NK细胞培养的研究，不仅使用用于T细胞增殖/激活的IL-2，并且还使用IL-15(J.Immunol.,167(6):第3129-3138页,2001；Blood,106(1):第158-166页,2005,韩国专利公开号2009-0121694)、LPS(J.Immunol.,165(1):第139-147页,2000)和刺激CD3的OKT-3抗体(Experimental Hematol.,29(1):第104-113页,2001)来。然而，此类研究仅发现了使用IL-2和新增殖物的修改，但是并未提出划时代的增殖方法。通常已知的是，当使用IL-2或其他细胞因子或化学物培养NK细胞时，NK细胞的数量相对于NK细胞的初始数量仅增加约3-10倍。
一些研究人员报告，使用肿瘤细胞系作为饲养细胞来扩增NK细胞。据报告，使用白血病细胞系CTV-1作为饲养细胞显示很少的增殖改善(J.Immunol.,178(1):第85-94页,2007)，并且使用EBV-LCL培养21天使细胞数量增加平均约490倍(Cytotherapy,11(3):第341-355页,2009)。另外，使用通过在K562细胞中表达4-1BBL和膜结合的IL-15获得的人工抗原呈递细胞(APC)共培养NK细胞3周使NK细胞数量增加约227倍。最近，据报告，在用MICA、4-1BBL和IL-15转染的K562细胞中共培养NK细胞3周使NK细胞数量增加平均350倍(TissueAntigens,76(6):第467-475页,2010)，并且报告了，在用膜结合的IL-21转染的K562细胞培养NK细胞2周同时以7天间隔再刺激所述NK细胞时，细胞数量增加平均21,000倍。然而，因为使用癌细胞来增殖NK细胞，这些结果是使用不适合于保证安全性的方法获得的，安全性对于临床应用很重要。此外，因为使用特定癌细胞而非正常细胞作为饲养细胞，所以存在所得的NK细胞对于特定癌细胞具有引发特异性的限制。
通过从外周血白细胞(PBL)选择性富集NK细胞而不分离NK细胞获得的细胞与纯NK细胞相比具有较低的细胞杀伤能力，并且不仅含有NK细胞，并且还含有通过自体MHC分子识别自我细胞和非自我细胞的T细胞。因此，只要不去除T细胞，所述细胞的使用就受限于自体移植。
最近，已经开发了一种分离NK细胞并且通过使用饲养细胞施加合适的刺激扩增分离的NK细胞的方法，以及一种使用全PBL或外周血单核细胞(PBMC)选择性扩增NK细胞的方法。此外，报告了一种用于培养NK细胞的方法，其包括在外周血白细胞的存在下使用含有抗CD3抗体和白介素蛋白的培养基培养NK细胞的工艺(韩国专利公开号10-2010-0011586)。
用于NK细胞的同种异体应用的一般表达工艺以磁性耗尽CD3+细胞和富集CD56+NK细胞的两个顺序步骤开始。为了刺激NK细胞增殖，经常使用经辐照的饲养细胞诸如PBMC(Cytotherapy 12:750-763,2010)或Epstein-Barr病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL)。经辐照的饲养细胞通过体液因子和直接细胞与细胞接触两者来刺激NK细胞(Blood80:2221-2229,1992)。
针对NK细胞的大规模增殖和激活，本申请的发明人已经通过以下方式来制备CD3-CD16+CD56+NK细胞的高纯度群体：在CD3+细胞的磁性耗尽的单一步骤之后，在OKT3和IL-2的存在下，刺激去除T细胞的PBMC并且使它们与失活的饲养细胞一起重复增殖(韩国专利注册号1,644,984)。然而，所述方法限于获得大量高纯度的NK细胞。
因此，本申请的发明人一直在努力开发一种用于制备大量具有高杀伤能力的高纯度NK细胞的方法。因此，他们认识到，当通过与饲养细胞一起静置培养来刺激从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞，在外周血单核细胞的积累群体倍增水平(aPDL)达到2-6时的时间用饲养细胞再刺激，并且然后进行悬浮培养时，NK细胞的生长增强并且细胞回收率得以改善，并且完成本申请。
此外，本申请的发明人首先认识到，使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞明显提高所获得的NK细胞的量和所制备的NK细胞的杀伤能力，并且完成本申请，所述生物反应器允许控制培养基中的溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度、pH和温度、充分搅动、培养基的连续供应等。
发明内容
技术问题
本申请涉及提供一种产生NK细胞的方法，其通过在达到特定积累群体倍增水平时用饲养细胞再刺激细胞培养物中的单核细胞来允许明显增强的NK细胞生长和显著提高的NK细胞回收率。
本申请还涉及提供一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。
技术方案
一方面，本申请提供了一种产生NK细胞的方法，其包括：
(a)用饲养细胞刺激含有NK细胞的细胞培养物并且然后对其进行静置培养的步骤；
(b)对静置培养的细胞培养物进行悬浮培养的步骤；以及
(c)通过在细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激悬浮培养的细胞培养物并且然后对其进行悬浮培养的步骤。
另一方面，本申请提供了一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用搅动式生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。
附图说明
图1示出了根据静置培养和悬浮培养的NK细胞生长的变化。0rpm：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第12天，0→60rpm：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第7天，并且然后在60rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天，0→160rpm：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第7天，并且然后在160rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天，60rpm：在60rpm的搅动速度下对细胞进行悬浮培养，直至解冻之后第12天。
(a)示出了根据静置培养和悬浮培养的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的积累群体倍增水平。
(b)示出了根据静置培养和悬浮培养的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的倍数增加。
图2示出了根据转换至悬浮培养的时间的NK细胞生长的变化。0rpm：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第12天，0→80rpm(3天)：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第3天，并且然后在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天，0→80rpm(5天)：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第5天，并且然后在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天，0→80rpm(7天)：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第7天，并且然后在80rpm的搅动速度下对细胞进行悬浮培养，直至第12天。
(a)示出了根据转换至悬浮培养的时间的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的积累群体倍增水平。
(b)示出了根据转换至悬浮培养的时间的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的倍数增加。
图3示出了根据搅动速度的NK细胞生长的变化。0rpm：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第12天，0→80rpm(5天)：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第5天，并且然后在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天，0→160rpm(5天)：对细胞进行静置培养，直至解冻之后第5天，并且然后在160rpm的搅动速度下进行悬浮培养，直至第12天。
(a)示出了根据搅动速度的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的积累群体倍增水平。
(b)示出了根据搅动速度的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的倍数增加。
图4示出了根据用饲养细胞再刺激的时间的NK细胞生长的变化。aPDL2-3：在积累群体倍增水平达到2-3时用饲养细胞再刺激细胞，aPDL 3-4：在积累群体倍增水平达到3-4时用饲养细胞再刺激细胞，aPDL 4-5：在积累群体倍增水平达到4-5时用饲养细胞再刺激细胞，aPDL 5-6：在积累群体倍增水平达到5-6时用饲养细胞再刺激细胞。从总计5个供体获取细胞。
(a)示出了根据用饲养细胞再刺激的时间的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的积累群体倍增水平。
(b)示出了根据用饲养细胞再刺激的时间的NK细胞的生长，示为解冻之后第12天的倍数增加。
图5示出了根据供体和用饲养细胞再刺激的时间，解冻之后第12天的积累群体倍增水平的预测刻画器(prediction profiler)。
图6示出了根据搅动式生物反应器的搅动速度的NK细胞生长的变化。每单位体积的搅动功率为0.3W/m3、4.8W/m3、20.6W/m3或54.6W/m3，并且比较从总计2个供体获取的细胞。
(a)示出了根据搅动式生物反应器的搅动速度的NK细胞的生长，示为培养结束时的积累群体倍增水平。
(b)示出了根据搅动式生物反应器的搅动速度的NK细胞的生长，示为培养结束时的倍数增加。
(c)示出了根据搅动式生物反应器的搅动速度的NK细胞的生长，示为培养结束时的滴度(细胞杀伤能力)。
图7示出了根据搅动式生物反应器的温度、pH、接种细胞浓度和靶细胞浓度，培养结束时的积累群体倍增水平、细胞浓度、滴度(10:1)和滴度(3:1)的预测刻画器。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。还将理解，诸如常用字典中定义的那些的术语应当被解释为具有与它们在相关领域和本申请的情况下的含义一致的含义。
本申请提供了一种产生NK细胞的新性方法，用于解决产生高纯度NK细胞的现有方法难以大规模生产NK细胞并且产生的NK细胞的杀伤能力较低的问题。
一方面，本申请提供了一种产生NK细胞的方法，其包括：
(a)用饲养细胞刺激含有NK细胞的细胞培养物并且然后对其进行静置培养的步骤；
(b)对静置培养的细胞培养物进行悬浮培养的步骤；以及
(c)通过在细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激悬浮培养的细胞培养物并且然后对其进行悬浮培养的步骤。
在本申请中，在步骤(c)之后还可以包括获得培养的NK细胞的步骤(d)。
在本申请中，步骤(c)的悬浮培养可以进行1-30天，具体地5-21天，但是不限于此。此外，步骤(c)的悬浮培养可以在步骤(a)中用饲养细胞刺激之后3-7天，更具体地4-6天，最具体地5天开始。
另外，在本申请中，步骤(c)中用饲养细胞进行的再刺激可以在积累群体倍增水平(aPDL)达到2-6，具体地3-5，更具体地4-5，更具体地4.1-4.6，最具体地4.3时开始，但是不限于此。
在本申请中，步骤(c)中的悬浮培养可以在30-300rpm，具体地60-160rpm的搅动速度下进行。例如，它可以在70-90rpm的搅动速度下进行。
在本申请中，饲养细胞可以是失活的外周血单核细胞，并且含有NK细胞的细胞培养物中饲养细胞与单核细胞(种子细胞)的比率可以是5:1-1:15，具体地2:1-1:10，更具体地1:1-1:8，最具体地1:4-1:6，但是不限于此。
在本申请中，步骤(a)的细胞培养物可以是含有从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞的培养物。在这种情况下，外周血单核细胞可以是种子细胞。
在本申请中，步骤(a)的培养可以在向其添加抗CD3抗体的培养基中进行，并且抗CD3抗体可以是选自OKT3、UCHT1和HIT3a的一种或多种。另外，在本申请中，步骤(a)的培养可以在向其添加IL-2的培养基中进行。
在本申请中，静置培养是指在反应器中在不搅动或摇动的情况下进行培养，并且悬浮培养是指通过通气、搅动等，在细胞不附着到反应器的底部或侧表面的情况下，以悬浮状态培养细胞。
可以用于本申请中的静置培养的反应器可以是摇瓶、方瓶(T-flask)、一次性细胞培养袋等，但是不限于此。并且，可以用于本申请中的悬浮培养的反应器可以是摇瓶、摇动反应器、方瓶、一次性细胞培养袋等，但是不限于此。然而，本申请所属领域的普通技术人员可以容易地选择的任何反应器可以用作适于实现本申请的目的的生物反应器。
用于静置培养的反应器和用于悬浮培养的反应器可以彼此相同或不同。例如，当用于静置培养的反应器和用于悬浮培养的反应器相同时，在完成静置培养之后，可以通过额外地供应包含必要营养素诸如细胞因子等的培养基，在同一反应器中进行悬浮培养。并且，当使用不同类型的反应器时，在完成静置培养之后，可以在将培养物转移至用于悬浮培养的反应器中之后进行悬浮培养。
用于悬浮培养的反应器的例子包括GE Healthcare的Wave生物反应器、ThermoFisher的一次性生物反应器(SUB)、Xcellerex的一次性XDR生物反应器、Sartorius的Biostat
Figure BDA0002696904970000071
Nipro的细胞培养袋、PBS Biotech的PBS系列生物反应器(PBS Mini、PBS3、PBS15、PBS80、PBS500等；参见WO 07/111677A、WO08/133845A、WO 09/132192A等)、Fujimori Kogyo的细胞培养袋、Erlenmeyer的一次性摇瓶等，但是不限于此。例如，可以使用PBS Biotech的PBS系列生物反应器。
在本申请中，“饲养细胞”是指缺乏分裂能力但具有代谢活性并因此通过产生若干代谢物来帮助靶NK细胞增殖的细胞。可以在本申请中使用的饲养细胞包括引入基因的动物细胞、用各种细胞因子或化学物处理的外周血白细胞(PBL)、自体或同种异体外周血白细胞(PBL)、T细胞、B细胞、单核细胞等，特别是自体外周血单核细胞，但是不限于此。显然，可以不受限制地使用本申请所属领域中通常已知的其他饲养细胞，只要它们与本申请的目的一致即可。
用作饲养细胞的自体外周血单核细胞可以是失活的以确保安全性。对于失活，可以使用本领域已知的一般方法。例如，可以使用γ射线辐照。失活的饲养细胞包括分离的T细胞。根据本申请的使NK细胞与饲养细胞一起增殖的方法的优点在于，由于NK细胞是纯净分离并且然后增殖的，因此之后仅纯NK细胞增殖。
在本申请中，抗CD3抗体是与CD3抗原特异性结合的抗体，所述CD3抗原是与T细胞受体(TCR)结合并形成抗原识别复合物的分子。CD3分子用于与TCR结合，并且在细胞内转运抗原识别信号。
可以在本申请中使用的抗CD3抗体可以是但不限于与CD3结合的任何抗体。例如，可以使用选自OKT3、UCHT1和HIT3a中的一种，但是不限于此。
在本申请中，可以包含在培养基中的细胞因子可以是选自白介素的一种或多种。白介素共同地是指由免疫细胞诸如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等产生的基于蛋白质的生物活性物质。可以在本申请中使用的白介素可以是选自白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和白介素-21(IL-21)中的一种或多种，特别是IL-2，但是不限于此。然而，对于本申请所属领域的普通技术人员而言明显的是，也可以不受限制地使用其他细胞因子，只要它们与本申请的目的一致即可。
用于本申请中的静置培养和悬浮培养的培养基中抗CD3抗体的浓度可以是0.1-1,000ng/mL，具体地1-100ng/mL，更具体地5-20ng/mL，并且培养基中细胞因子的浓度可以是10-2,000IU，具体地100-1,000IU，更具体地约200-700IU。
在本申请中，“刺激”是指通过添加饲养细胞等来诱导NK细胞的增殖，并且可以一起使用抗CD3抗体。
在本申请中，“再刺激”是指经过某一培养阶段之后，通过向培养基中添加饲养细胞和/或抗CD3抗体来再诱导NK细胞的增殖。
作为根据本申请的产生NK细胞的培养基，可以使用用于动物细胞培养的一般培养基，诸如CellGro培养基(Cellgenix)、AIM-V培养基、RPMI1640培养基、XVIVO 20等。如果需要，可以在用于动物细胞培养的培养基中补充选自以下的一种或多种组分：从人外周血分离的NK细胞、外周血单核细胞、抗CD3抗体和白介素。
具体地，在本申请的产生NK细胞的方法中，为了在悬浮培养期间维持细胞和细胞因子的浓度恒定，可以以预定的时间间隔测量细胞和细胞因子的浓度，并且可以根据测量结果提供含有细胞因子的培养基。
此外，培养基可以含有血清或血浆以及支持淋巴细胞增殖的其他增殖因子。
添加到培养基中的血清或血浆没有特别限制，并且可以使用来源于各种动物的可商购获得的血清或血浆。具体地，可以使用人来源的自体血清或血浆。例如，可以使用普通技术人员已知的方法，诸如添加来自外周血单核细胞的使淋巴细胞增殖的细胞因子、刺激淋巴细胞增殖的凝集素等的组合。
通过根据本申请的方法制备的NK细胞可以与适当赋形剂和添加剂一起作为治疗组合物来提供。可以向需要治疗的患者给予组合物以达到治疗效果。
另外，由于NK细胞的产生中维持细胞的浓度，所以可以防止细胞过度生长，并且可以维持最佳细胞状态。具体地，可以保留细胞的功能，并且可以维持高细胞存活率和细胞杀伤能力，甚至在将细胞冷冻之后解冻时也是如此。因此，细胞可以在不进行进一步处理过程的情况下，以液态或冷冻状态储存和供应。
通过根据本申请的方法产生的NK细胞和含有所述NK细胞的组合物可以用于治疗肿瘤和感染性疾病。通过根据本申请的方法产生的NK细胞适用于所有类型的肿瘤，包括实体癌和血液癌。与血液癌不同，实体癌是指在器官中形成为肿块的癌症，并且包括在大多数器官中发生的癌症。可以使用根据本申请的NK细胞治疗的肿瘤没有特别限制，并且包括胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓性白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌、淋巴瘤等，但是不限于此。在本申请中，感染性疾病是指由病毒或病原体感染引起的疾病，并且包括可以通过呼吸器官、血液、皮肤接触等感染的所有疾病。感染性疾病的非限制性例子包括乙型肝炎和丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)感染、巨细胞病毒感染、病毒性呼吸疾病、流感等，但是不限于此。
另一方面，本申请涉及一种产生NK细胞的方法，其包括将包括NK细胞的细胞培养物接种到生物反应器的步骤。
在本申请中，“生物反应器”是指允许连续控制影响细胞生长的条件，诸如溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度、pH、温度等的培养装置。
具体地，可以在本申请中使用的生物反应器可以是搅动式生物反应器。例如，Storius的Biostat可以用作生物反应器，但是不限于此。在本申请中，“搅动式生物反应器”是指除了连续控制以上所述的培养条件之外还允许充分搅动，即控制搅动功率的生物反应器。具体地，它可以是还允许连续供应培养基的生物反应器。更具体地，可以在本申请中使用的生物反应器可以是可以通过反应器的叶轮等的旋转实现对培养基的搅动的生物反应器，但是不限于此。
使用搅动式生物反应器允许控制适当的培养条件，例如培养基的足够或最佳的溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度和pH。另外，当使用生物反应器在特定的每单位体积的搅动功率下在培养温度范围内产生NK细胞时，获得的NK细胞的数量及其杀伤能力明显提高。
在用于使用搅动式生物反应器产生NK细胞的方法中，培养条件的pH可以是6.5-7.6，具体地6.8-7.2，具体地6.9-7.1，最具体地7.0-7.07，并且培养温度可以是25℃-40℃，具体地33℃-40℃，更具体地34℃-38℃，最具体地35℃-37.5℃，但是不限于此。
此外，每单位体积的搅动功率可以是0.1-100W/m3，具体地0.3-80W/m3，更具体地5-60W/m3，最具体地10-30W/m3，但是不限于此。
用于使用生物反应器产生NK细胞的方法可以通过以下方式来进行：将通过依次进行静置培养和悬浮培养获得的细胞培养物接种到生物反应器，并对其进行培养。
刚接种之后生物反应器中NK细胞的浓度，即接种时生物反应器中NK细胞的浓度可以是0.1-2.0x106个细胞/mL，具体地0.2-1.5x106个细胞/mL，更具体地0.8-1.2x106个细胞/mL，最具体地0.9-1.1x106个细胞/mL，但是不限于此。
在培养阶段期间，靶细胞浓度(添加添加剂之后的细胞浓度，或饲养靶细胞密度)可以是0.4-1.0x106个细胞/mL，具体地0.55-0.85x106个细胞/mL，更具体地0.6-0.8x106个细胞/mL，最具体地0.65-0.75x106个细胞/mL，但是不限于此。
在生物反应器中培养NK细胞期间，随着添加剂诸如额外的培养基等被添加至培养基以及培养基的体积增加，NK细胞被稀释并且其浓度降低。靶细胞浓度是指添加添加剂诸如培养基等之后，培养基中NK细胞的浓度。
具体地，用于生物反应器的接种的细胞培养物可以是通过本申请的产生NK细胞的方法产生的NK细胞的培养物，但是不限于此。
发明模式
在下文中，将通过实施例详细描述本申请。然而，以下实施例仅用于说明性目的，并且对于本领域普通技术人员明显的是，本申请的范围不应当被解释为受实施例限制。
实施例1.研究通过悬浮培养进行的NK细胞生长
(1)NK细胞的培养
为了在从健康供体收集的外周血单核细胞(PBMC)中去除CD3阳性细胞并获得饲养细胞(PBMC)，将细胞转移到新的50mL管中，每个管5x107个细胞。然后，将细胞在1,200rpm和4℃下离心10分钟。离心之后，将回收的饲养细胞(1x108个细胞)分配到小瓶中并在液氮罐中冷冻。使用之前将冷冻的细胞解冻。
为了获得从其去除CD3阳性细胞的PBMC，将400μL的MACS运行缓冲液(MiltenyiBiotech，韩国)和100μL的CD3磁珠(Miltenyi Biotech，韩国)添加到由5x107个细胞组成的细胞沉淀物中，并使其在4℃下反应20分钟。然后，将细胞用20mL的MACS运行缓冲液，在1,200rpm和4℃下离心10分钟，并且然后再次悬浮在2mL的MACS运行缓冲液中。通过加载在配备有VarioMACS(Miltenyi Biotech，韩国)的CS柱(Miltenyi Biotech，130-041-305)中，从悬浮液中分离细胞，并且洗涤柱以达到20mL的最终体积，从而回收去除了CD3阳性细胞的PBMC。将2x107个回收的细胞分配到小瓶中并在液氮罐中冷冻。使用之前将冷冻的细胞解冻。
在37℃的水浴中将具有CD3阳性细胞的冷冻PBMC解冻之后，对细胞数量进行计数。将约2x107个细胞转移到新的50mL管中，并且在1,200rpm和4℃下离心10分钟。将通过离心获得的细胞沉淀物悬浮在含有10mL的2vol％血浆的10mL的CellGro培养基(Cellgenix，美国)中。
在37℃下在37℃的水浴中将冷冻的饲养细胞解冻之后，对细胞数量进行计数。将约1x108个细胞转移到新的50mL管中，并且在1,200rpm和4℃下离心10分钟。将细胞沉淀物悬浮在含有2vol％血浆的10mL的CellGro培养基(Cellgenix，美国)中，并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活。
对于失活的饲养细胞与从其去除CD3阳性细胞的PBMC的共培养，在向容纳饲养细胞的管中添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将含有20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL的1vol％血浆的CellGro培养基(Cellgenix，美国)添加到摇瓶中，并且将细胞在37℃的反应器中培养5天。
在通过向摇瓶中添加60mL的含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基(Cellgenix，美国)稀释细胞之后，在合适的培养反应器中培养细胞。
培养开始之后第7天，对细胞数量进行计数。用含有1vol％血浆的CellGro培养基将细胞稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后培养2天。
(2)研究通过静置培养和悬浮培养进行的NK细胞生长
为了研究通过静置培养和悬浮培养进行的NK细胞生长的差异，将NK细胞在37℃和5％CO2的条件下在反应器中生长。在表1中所述的静置培养和悬浮培养条件下培养细胞。
对于条件#1，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行静置培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在静置培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后静置培养2天。
对于条件#2和条件#3，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行静置培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。对于条件#2，在60rpm的搅动速度下进行悬浮培养，并且对于条件#3，在160rpm的搅动速度下进行悬浮培养。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
对于条件#4，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中在60rpm的搅动速度下进行悬浮培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行悬浮培养。在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
条件#1-4的总培养阶段为12天。
在图1中作为积累群体倍增水平(aPDL)和倍数增加比较了已经培养12天的细胞的生长。细胞的积累群体倍增水平(aPDL)意指解冻之后细胞分裂的次数，并且倍数增加意指解冻之后细胞生长的倍数。与静置培养12天(条件#1)的那些细胞相比，静置培养7天并且然后进行悬浮培养(条件#2和#3)的细胞显示更好的细胞生长。然而，解冻之后立即进行悬浮培养(条件#4)的细胞未显示良好的结果。静置培养7天之后进行悬浮培养的细胞显示根据搅动速度的细胞生长差异。在160rpm(条件#3)下实现最高的细胞生长。
[表1]
Figure BDA0002696904970000141
Figure BDA0002696904970000151
(3)研究根据转换为悬浮培养的时间的NK细胞生长
为了研究是否存在根据转换为悬浮培养的时间的NK细胞生长的差异，将NK细胞在37℃和5％CO2的条件下在孵育器中培养。
表2中总结了关于转换为悬浮培养的时间的培养条件(条件#1-4)。解冻之后，将细胞静置培养3天、5天或7天，并且然后进行悬浮培养。在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养。
如下进行培养。
对于条件#1(对照组)，不进行悬浮培养。在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行静置培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
对于条件#2，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养3天。
在培养3天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养4天。
然后对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
对于条件#3，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养2天。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
对于条件#4，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行静置培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。将细胞在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
在条件#1-4下进行总计12天的培养之后，比较积累群体倍增水平和倍数增加。
如图2所示，与静置培养的细胞相比，自解冻之后第3、5和7天开始悬浮培养的细胞显示优异的细胞生长。用饲养细胞刺激之后5天实现最高的细胞生长，但是从刺激之后3-7天没有显著差异。
[表2]
Figure BDA0002696904970000171
Figure BDA0002696904970000181
(4)研究根据搅动速度的NK细胞生长
为了研究悬浮培养期间根据搅动速度的NK细胞生长，将NK细胞在37℃和5％CO2的条件下在孵育器中培养。
表3中总结了关于搅动速度的培养条件。
对于条件#1(对照组)，不进行悬浮培养。在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行静置培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。
在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
对于条件#2和条件#3，在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行悬浮培养2天。对于条件#2，在80rpm的搅动速度下进行悬浮培养，并且对于条件#3，在160rpm的搅动速度下进行悬浮培养。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
在进行总计12天的培养之后，比较积累群体倍增水平和倍数增加。结果在图3中示出。
结合实施例1(2)的结果，与静置培养的细胞相比，在60-160rpm的搅动速度下悬浮培养的细胞显示更高的细胞生长。在80与160rpm之间未观察到细胞生长的显著变化。
[表3]
Figure BDA0002696904970000191
实施例2.研究根据使用饲养细胞进行重复刺激(再刺激)的时间的NK细胞生长
为了研究在NK细胞培养期间开始用饲养细胞进行再刺激的时间，在达到特定积累群体倍增水平的时间用饲养细胞进行再刺激。如在实施例1(1)中，在37℃和5％CO2的条件下在反应器中进行培养，但是在分别达到2-3、3-4、4-5和5-6的积累群体倍增水平(aPDL)的时间而不是在培养开始之后第7天用饲养细胞进行再刺激(表4)。
如下进行培养。
在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中进行悬浮培养2天。
在对细胞进行计数之后，当积累群体倍增水平(aPDL)分别达到2-3、3-4、4-5和5-6时，用含有1vol％血浆的CellGro培养基将细胞稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。然后，比较积累群体倍增水平和倍数增加(表4)。
积累群体倍增水平是解冻之后细胞分裂次数的量度，并且倍数增加意指解冻之后细胞生长的倍数。
如图4所示，当在aPDL 4-5下用饲养细胞再刺激时，所有供体(供体A至E)显示最高的细胞生长。与在aPDL 4-5下用饲养细胞再刺激时相比，当在aPDL 5-6下用饲养细胞再刺激时，细胞生长下降。
从作为输入值的供体、用饲养细胞进行再刺激的时间(基于积累群体倍增水平)和用饲养细胞进行再刺激的平方项(基于积累群体倍增水平)导出回归模型。回归模型的输出值是培养之后第12天的积累群体倍增水平，并且使用JMP13作为用于导出回归模型的统计程序。回归模型的R2和R2 adj值分别为0.90和0.88，并且0.001或更小的P值在统计上是显著的。0.001或更小的用饲养细胞进行再刺激的时间和用饲养细胞进行再刺激的时间的平方项的P值在统计上也是显著的。使用如图5所示的预测模型来获得刻画器。用饲养细胞进行再刺激的时间显示顶点在4.3左右的抛物曲线，从而表明存在基于积累群体倍增水平的用饲养细胞进行再刺激的最佳时间。
[表4]
Figure BDA0002696904970000211
实施例3.搅动式生物反应器工艺的开发和表征
在此实施例中，开发了能够在均匀环境下大量培养NK细胞的生物反应器工艺，并且对其特性进行了分析。
(1)研究根据搅动式生物反应器的搅动速度的NK细胞生长
将培养约12天的NK细胞接种到搅动式生物反应器，并且然后通过分批补料培养法培养长达21天。
如下进行培养。
将冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC解冻，并且然后静置培养5天。然后，将细胞培养转换为悬浮培养(搅动速度160rpm)。将细胞培养总计12天。
在解冻冷冻的饲养细胞和冷冻的从其去除CD3阳性细胞的PBMC并且通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活之后，将500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3添加到容纳饲养细胞的管中，以便对失活的饲养细胞和从其去除CD3阳性细胞的PBMC进行共培养。然后，通过向摇瓶中添加20mL饲养细胞、20mL从其去除CD3阳性细胞的PBMC和20mL含有1vol％血浆的CellGro培养基，在37℃的反应器中进行静置培养5天。
在培养5天之后，通过向摇瓶中添加60mL含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基来稀释细胞，并且然后在适当的培养反应器中在160rpm的搅动速度下进行悬浮培养2天。
在培养开始之后第7天，对细胞进行计数，并且用含有1vol％血浆的CellGro培养基稀释至2x105-5x105个细胞/mL的细胞浓度。对于用饲养细胞进行再刺激，制备5倍饲养细胞并将其悬浮在含有1vol％血浆的CellGro培养基中。在通过使用γ射线辐照器以约2000cGy辐照来使饲养细胞失活并添加500-1,000IU的IL-2和10ng/mL的OKT-3之后，将制备的两种细胞(已共培养7天的细胞和针对再刺激制备的饲养细胞)额外共培养3天以用于再刺激。在悬浮培养3天之后，对细胞进行计数，用含有500-1,000IU的IL-2和1vol％血浆的CellGro培养基稀释至5-10x105个细胞/mL，并且然后悬浮培养2天。
将已经培养12天的NK细胞接种到搅动式生物反应器，并且然后分批补料培养长达21天。
将搅动式生物反应器设置为37℃的培养温度、pH 7.05和DO 50％，并且接种细胞浓度为0.5x106个细胞/mL。在接种之后，以1至3天的间隔添加培养基至1.0x106个细胞/mL的细胞浓度。基于每体积的功率(P/V)，将生物反应器的搅动速度设置为0.3W/m3、4.8W/m3、20.6W/m3和54.6W/m3。在培养8天之后，终止培养，并且比较积累群体倍增水平和倍数增加，如图6所示。根据搅动速度，细胞生长显示显著的差异，最高生长在20.6W/m3下。另外，在培养结束时，根据(2)的方法测量培养的NK细胞的滴度(细胞杀伤能力)。在20.6W/m3下观察到最高滴度。
(2)体外细胞杀伤能力的测量
在回收靶肿瘤细胞(K562，ATCC CCL-243)之后，将3x106个细胞转移到15mL管中，并且在1,200rpm和4℃下离心5分钟。将通过离心获得的细胞沉淀物悬浮在RPMI培养基中至1x106个细胞/mL的浓度，并且然后将1mL肿瘤细胞转移到新的15mL管中。在添加30μL的1mM钙黄绿素-AM(Molecular Probes，C34852)之后，将15mL管用铝箔覆盖并在37℃孵育器中染色1小时。在通过添加10mL的RPMI培养基洗涤用钙黄绿素-AM染色的肿瘤细胞，接着在1,200rpm和4℃下离心5分钟之后，将细胞沉淀物悬浮在10mL的RPMI培养基中，至1x105个细胞/mL的细胞浓度。
在解冻冷冻的NK细胞并转移到15mL管中，接着在1,200rpm和4℃下离心10分钟之后，将细胞沉淀物以相对于靶肿瘤细胞的所需比率悬浮在RPMI培养基中。将100μL制备的靶肿瘤细胞和NK细胞混合并铺板在圆底96孔板上。每个孔以一式三份制备并取平均值。在使板在37℃孵育器中在遮光的情况下反应4小时之后，将板在2,000rpm和4℃下离心3分钟。在将每孔中的100μL培养物转移到96孔黑色板上之后，使用荧光光谱仪在激发(485nm)/发射(535nm)的条件下测量荧光，持续0.1秒。
(3)搅动式生物反应器工艺的优化
对于搅动式生物反应器工艺的优化，根据实施例3(1)中所述的方法将NK细胞培养约12天。将培养约12天的NK细胞接种到搅动式生物反应器，并且然后通过分批补料培养法培养长达22天。
表5中描述了此实施例中使用的培养条件。在添加影响NK细胞的细胞生长和滴度(细胞杀伤能力，实施例3(2))的添加剂之后，使用四个参数(即温度、pH、接种细胞浓度和靶细胞浓度)进行DOE分析(确定性筛选设计，9种条件，表6)。在培养阶段期间，以1-3天间隔添加添加剂，并且在8-10天之后完成培养。
[表5]
Figure BDA0002696904970000231
[表6]
Figure BDA0002696904970000232
Figure BDA0002696904970000241
实验完成之后，测量收获时的aPDL以及细胞浓度和滴度(10:1和3:1)，并且使用JMP11进行分析(P值阈值：P≥0.25)。R2和R2 adj值分别为0.90或更高和0.80或更高，并且0.05或更小的P值在统计上是显著的。
R2分析结果在表7中示出。0.05或更小的P值意指参数静态地显著影响结果(积累群体倍增水平和滴度)。发现全部四个工艺参数(温度、pH、接种细胞浓度和靶细胞浓度)均显著影响结果。如图7所示，基于分析结果创建了预测刻画器，并且鉴定了生物反应器工艺参数的最佳点。用于使积累群体倍增水平、滴度(10:1)和滴度(3:1)全部维持最高的培养条件为：接种细胞密度1.0x106个细胞/mL，靶细胞浓度0.7x106个细胞/mL，温度36℃和pH 7。
[表7]
Figure BDA0002696904970000242
尽管上文已经详细描述了本申请的特定方面，但是对于本领域的普通技术人员清楚的是，这种具体描述仅是关于特定示例性实施方案的，并且本申请的范围不受其限制。应当注意，本申请的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。
工业适用性
根据本申请的产生方法的优点在于，与现有方法相比，可以通过临床友好的方法在短时间段内以高纯度和高效率产生具有高细胞杀伤能力和细胞存活率的NK细胞，从而增加了NK细胞治疗剂的生产率。
尽管上文已经详细描述了本申请的特定方面，但是对于本领域的普通技术人员清楚的是，这种具体描述仅是关于特定示例性实施方案的，并且本申请的范围不受其限制。应当注意，本申请的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (16)

1.一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：
(a)用饲养细胞刺激包含NK细胞的细胞培养物，并且然后对其进行静置培养；
(b)对所述静置培养的细胞培养物进行悬浮培养；以及
(c)通过在所述细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激所述悬浮培养的细胞培养物，并且然后对其进行悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中在所述步骤(a)中用饲养细胞进行的所述刺激之后3-7天开始所述步骤(b)的所述悬浮培养。
3.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(c)的所述悬浮培养在30-300rpm的搅动速度下进行。
4.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(a)的所述培养在向其添加抗CD3抗体的培养基中进行。
5.根据权利要求4所述的产生NK细胞的方法，其中所述抗CD3抗体是选自OKT3、UCHT1和HIT3a的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(a)的所述培养在向其添加一种或多种选自白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和白介素-21(IL-21)的细胞因子的培养基中进行。
7.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述饲养细胞是失活的外周血单核细胞。
8.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(a)的所述细胞培养物包含从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞。
9.一种产生NK细胞的方法，所述方法包括将包含NK细胞的细胞培养物接种到生物反应器的步骤。
10.根据权利要求9所述的产生NK细胞的方法，其中所述生物反应器被控制为pH 6.5-7.6、25-40℃的培养温度和0.1-100W/m3的每单位体积的搅动功率。
11.根据权利要求9所述的产生NK细胞的方法，其中所述细胞培养物依次进行静置培养和悬浮培养。
12.根据权利要求9所述的产生NK细胞的方法，其中所述接种时所述生物反应器中NK细胞的浓度为0.1-2.0x106个细胞/mL。
13.根据权利要求9所述的产生NK细胞的方法，其中所述培养阶段期间的靶细胞浓度(添加添加剂之后的细胞浓度，或进料靶细胞密度)为0.4-1.0x106个细胞/mL。
14.根据权利要求9所述的产生NK细胞的方法，其中所述细胞培养物是通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法产生的NK细胞的培养物。
15.一种通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法产生的NK细胞。
16.一种通过根据权利要求9至14中任一项所述的方法产生的NK细胞。
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