CN102428173A - Nk细胞的扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在封闭的细胞培养系统中将NK细胞和NK样T细胞大规模扩增并同时激活的方法，其中该扩增的细胞表现为细胞毒性增强。

Description

NK细胞的扩增
技术领域
本发明涉及细胞培养和免疫疗法，特别是将NK细胞和NK样T细胞大规模扩增并同时激活以用于治疗。所述细胞在封闭的自动培养系统中扩增，例如使用生物反应器。
发明背景
自从20世纪80年代发现淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Grimm EA.等人，1982；Rosenberg S.，1985)，对抗癌症的细胞免疫疗法被彻底地研究。
进行实验最多的研究之一是自体或同种异体的细胞毒性效应物(cytotoxiceffector)的过继性转移，该效应物具有肿瘤细胞杀灭潜能以触发移植物抗肿瘤(graft-vs-tumor，GvT)效应。在多种具有潜在抗肿瘤效应的效应物群体中间，自然杀伤细胞(NK细胞)和NK样T细胞(NK-like T cells)以其高的细胞毒性能力而突出(Sutlu T and Alici E.，2009)。
NK细胞和NK样T细胞正常地仅以少数存在于外周血液单个核细胞(PBMCs)和效应细胞制品(preparations)(如LAK细胞)中。因此，使用从健康捐赠者(Carlens S.等人，2001 and US 10/242,788)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者(Guven H.等人，2003)和多发性骨髓瘤(MM)患者(Alici E.等人，2008)得到的PBMCs，使多克隆NK细胞和NK样T细胞在细胞培养瓶中扩增的涉及符合现代优良生产实践(cGMP)要素的方法得以开发。在体外以及人类肿瘤实验模型(Guimaraes F.等人，2006)中，这些细胞对新鲜的人类肿瘤细胞显示特异性的细胞毒活性，这开启了其在临床环境下进行研究的可能性。然而，常规的基于瓶的培养费事而繁琐，因此限制了实际可处理细胞的数量。此前公开的方案(例如Miller JS.等人，1994；Pierson BA.等人，1996；LuhrnJ.等人，2002；Klingemann HG and Martinson，2004)涉及效应细胞制品，也包括例如在培养前分离NK前体或CD56以及使用饲养细胞(feeder cell)或不符合cGMP的要素的步骤。这些缺点使得此前的方案不是最适宜的，且不足以支持大型临床研究。
另外，NK细胞在细胞培养瓶中的扩增，有暴露于外部试剂和污染物的内在风险。尽管所述风险在GMP实验环境中得以最小化，只要封闭自动系统提供充足数量的细胞，这种封闭自动系统的使用显然是优选的。
由于造血细胞对剪切(shear)相对敏感，可合理地设想高剪切方法(highshear processes)不适于离体扩增(Nielsen，1999)。因此，依赖外部滤器和高流速的搅拌槽(stirred-tank)生物反应器(Pierson.等人，1996)或灌注培养系统不太可能提供高效率。
用基于NK细胞和NK样T细胞的免疫疗法治疗癌症，有很多有前景的方法。然而，这些效应细胞在符合GMP的封闭系统下的离体(ex vivo)扩增和激活是促进临床频繁应用的关键因素。
其他研究者对离体扩增和/或激活NK细胞也进行了尝试，并且使用纯化/静息的、短期或高度纯化的和长期激活的NK细胞的治疗方案也正在研究。这些研究报道，NK细胞输注耐受性好并且部分地有效。然而，用于效应细胞制品的方案通常包括附加的步骤，例如NK前体或CD56在培养前的分离以及饲养细胞和/或不符合cGMP的要素的使用。这些缺点使得上述方案不是最适宜的并且不足以支持大型临床研究。
对于上述报道的彻底分析表明，对于优化的NK细胞的离体扩增的自动方法是需要的。常规的基于瓶的培养，其一个问题在于规模，也就是说细胞数量因繁琐的瓶处理而受到限制。此外，由于每次更换培养基或细胞分离时该系统暴露于环境中，因此感染的风险很高。其他需要解决的问题包括开发一种成本有效的、易操作的效应细胞扩增方法，且该方法包括良好限定的cGMP质量要素。优选地，该培养系统也无动物产品和饲养细胞。
发明概述
本发明涉及封闭系统，以大规模扩增并同时激活用作细胞治疗产品的自然杀伤(NK)细胞和NK样T细胞。本发明特别公开了一种大规模扩增并同时激活表型为CD3-CD56+的NK细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的方法，其中该扩增的细胞与使用常规方法(例如在相同或近似条件下使用瓶)培养的细胞相比，表现为细胞毒性增强。本发明方法将进一步在说明书、非限制性实施例以及权利要求中公开。
发明者们调研了使用封闭系统进行NK细胞大规模扩增的可行性。使用健康捐赠者和患有MM患者的PBMCs，通过与常规的细胞培养瓶比较，对两个不同的封闭系统(细胞培养袋和自动生物反应器)进行了评价，其目的是开发自动的符合GMP的方案，以大规模生产用于免疫疗法中的NK细胞。
同时，发明者们在癌症患者中的I期临床试验中，成功地完成了同种异体环境(allogeneic setting)的该细胞产品的安全性评价(Barkholt L.等人，2009)。
根据本发明的第一个实施方案，提供了大规模扩增并同时激活一些细胞类型的方法，其中使用了封闭的细胞培养系统，且其中使用该方法所得的扩增的细胞经体外细胞毒性测试验证表现为细胞毒性增强。优选地，该细胞类型是表型为CD3-CD56+的NK细胞和/或表型为CD3+CD56+的NK样T细胞。
根据优选的实施方案，该方法包括以下步骤：将所述细胞加入所述封闭系统，该系统包括补充血清、白细胞介素-2(IL-2)和抗CD3抗体的生长培养基；搅拌和加热下在所述系统中扩增所述细胞，直到扩增细胞群中至少35％含有激活的NK细胞和NK样T细胞，并且所述扩增的细胞经体外细胞毒性测试表现为细胞毒性增强。
根据公开方法的一个具体实施方案，血清选自人血清和自体血清。培养基中补充有约50至约1500U/ml IL-2、约1至约50ng/ml抗CD3抗体和约1至约40％血清。
根据另一具体实施方案，所述搅拌和加热在如下条件下进行：温度约为36-40℃；CO2浓度约为4.7-5.1％；以一定速率和角度温和振摇，使细胞能够粘附于封闭细胞系统的表面。所述振摇在约4-8/分钟的振摇速率和约4-8°的振摇角度进行。
所述扩增优选地进行至细胞总数扩增至少约10倍，或该扩增细胞群的至少约50％分别含有激活的NK细胞和NK样T细胞。
用于扩增所述细胞的细胞样品优选为外周血液、细胞系或细胞因子刺激的外周血液的样品。最优选地，该细胞样品为外周血液单个核细胞(PBMC’s)的样品。
根据本方法的一个具体实施方案，该细胞样品从健康受试者收集。
根据另一具体实施方案，该细胞样品从携肿瘤的受试者收集，所述受试者优选地患有选自以下的肿瘤：血液肿瘤和实体瘤。
根据另一具体实施方案，所述细胞主要由表型为CD3-CD56+的NK细胞组成。
初始加入封闭细胞系统的细胞浓度优选为约0.5x106至约2x106/ml生长培养基。
在本发明的一个具体实施方案中，该方法还包括以下步骤：每日加入一定体积的补充血清和IL-2的培养基(相当于总培养体积约50％)，并且每日从该封闭细胞系统丢弃约相同体积的生长培养基。其中所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约50％时进行。
优选地，所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约300％时进行，但其中总培养体积的约75％被交换了。
或者，所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约500％时进行，但其中总培养体积的约100％被交换了。
根据另一具体实施方案，可自由地组合于上面公开的一个或多个具体实施方案，所述细胞孵育至少约10日。
根据一个具体实施方案，所述封闭细胞系统为预先灭菌的袋。
根据另一具体实施方案，所述封闭细胞系统为生物反应器。
本发明的另一具体实施方案是表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的悬液，其表现为细胞毒性增强。
优选地，这些细胞与在瓶中扩增的细胞相比，经体外细胞毒性测试验证表现为细胞毒性增强。
在本发明的表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的悬液中，该扩增细胞群的至少35％、优选至少50％含有激活的NK细胞。
本发明的上下文中，生物反应器是可重复利用的自动的室(chamber)系统，可指任何支持生物学活性环境的装置或系统。公开的发明范围内，术语“生物反应器”指细胞培养背景中使细胞或组织生长的装置或系统。生物反应器系统的一个非限制性实例是GE-Healthcare的Wave生物反应器系统2/10，但技术人员理解，可以从其他来源得到可选择的生物反应器，或者技术人员可以制造使发明的方法能够进行的生物反应器。
本发明的上下文中，封闭系统是由中心的细胞培养袋组成的细胞生长室系统，其中细胞可有效而迅速地离体增殖，不需任何其他传代步骤。
术语“细胞毒性”指对细胞有毒的性质。毒剂的实例包括化学物质或免疫细胞(例如细胞毒性淋巴细胞，如细胞毒性T细胞、NK细胞和NK样T细胞)。NK细胞和NK样T细胞以其高的细胞毒性能力而突出。
技术人员可用已有方法测定细胞毒性。测定细胞是否表现为细胞毒性增强的方法之一是使用体外分析，用标准的4小时51Cr释放试验分析细胞介导的对K562细胞的细胞毒性。或者可使用脱粒测试。这些方法都公开于附带的实施例中。
本发明的上下文中，术语“激活”和“激活的NK细胞”指收到激活信号的NK细胞。激活的NK细胞能够杀死MHC I类表达缺陷的细胞。
术语NK细胞和NK样T细胞的“同时激活”指细胞基本上同时被激活，优选在相同的细胞培养中。
由于其强大的细胞溶解活性以及自身反应的潜能，自然杀伤(NK)细胞活性受到严格调节。为了杀死MHC I类表达缺失或异常的细胞，NK细胞需要被激活。NK细胞必须收到激活信号，其可以来源于多种形式，最重要的形式是细胞因子、Fc-受体、激活和抑制性受体。
本发明的上下文中，术语“细胞扩增”指经历一系列细胞分裂步骤因而培养中存在的细胞数量得以扩增的细胞培养。因此，术语“NK细胞扩增”指经历一系列细胞分裂步骤因而培养中存在的细胞数量得以扩增的NK细胞培养。术语“扩增的NK细胞”指通过NK细胞扩增得到的NK细胞。更尤其是，在一个具体实施方案中，术语“扩增的NK细胞”指慢性激活的(chronicallyactivated)CD3-CD56+细胞以及表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的多克隆组(polyclonal group)，其在特定的cGMP等级环境与cGMP等级培养基中扩增。
本发明的上下文中，术语“效应细胞”指响应于刺激(例如免疫系统中的细胞)表现出特定功能的细胞。在一个具体实施方案中，效应细胞是一类淋巴细胞，其具有细胞毒性能力(即它们诱导其他细胞的死亡)。另一具体实施方案是，活跃地参与分泌抗体的淋巴细胞。效应细胞的非限制性实例是NK细胞、T细胞和NK样T细胞。
附图说明
图1A-D是显示在瓶和袋中(1A)及在瓶和生物反应器中(1B)的扩增倍数对比，以及在瓶和袋中(1C)及在瓶和生物反应器中(1D)终产物的纯度对比的图。
图2A-C是显示不同扩增方案后所扩增的细胞的表型(A和B)和细胞毒活性(C)对比的图表。
图3A-D是显示起始于生物反应器中与起始于瓶中的细胞培养物的扩增对比的图表。
图4A-B是显示分别直接在生物反应器和瓶中扩增的细胞功能对比的图表。
图5是显示分别直接在生物反应器和瓶中扩增的NK细胞的表型对比的图表。
发明详述
描述本发明之前，应理解因为本发明的范围仅仅是由附加的权利要求及其等值物所限定的，故此处所用的术语名词仅仅用于描述特定的具体实施方案，而且并非用于限制。
若未限定其他，此处所用的任何术语和科学术语名词具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
必须注意的是，在本详细说明和附加权利要求中，单数形式“一”、“一个”和“一种”包括复数形式，除非上下文另有清楚的指示。
另外，术语“约”用于表示与所给出的数值偏差在所述数值的+/-2％，优选+/-5％，且最优选+/-10％，如果适用的话。
将自然杀伤细胞(NK细胞)离体扩增和再输注于罹患恶性疾病的患者，为与这些疾病抗争提供了新的并且潜在有趣的治疗方法。其一个前提是，符合临床应用要求的NK细胞的扩增和使用的可能性。本发明者们出人意料地能够在临床应用中大规模扩增NK细胞。因此，这里提供了一种符合GMP的适用于临床环境的自动封闭培养系统，该系统可用于制备大规模富集NK和NK样T细胞的效应群(effector populations)。
如下面的实施例所述，本发明方法扩增与激活具有令人满意的细胞毒性能力(即它们诱导其他细胞的死亡)的NK细胞。可以很容易地测量NK细胞对其他细胞的细胞毒性，例如在暴露于活性NK细胞前后采用传统的细胞计数法。这些方法为本领域技术人员公知。
实施例
1.来自外周血液的NK细胞和NK样T细胞离体扩增
材料与方法
采样和分离血液单个核细胞(PBMCs)
通过在Karolinska大学医院(Huddinge)的血库从健康捐赠者或MM患者得到血沉棕黄层(Buffy coats)、外周血液和血浆分离置换(apheresis)产物。该实验方案经地方的学术研究伦理委员会批准。
使用淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Nyegaard，Oslo，Norway)，将外周血液单个核细胞(PBMCs)通过梯度离心分离。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco，Grand Island，NY，USA)将PBMCs洗涤两次，并且通过台盼蓝排斥法测定细胞活力。
生长培养基和细胞计数
对所有系统，CellGro SCGM无血清培养基(CellGenix，Freiburg，Germany)中加入5％人血清(Biowhittaker-Cambrex，Walkersville，MD，USA)和500U/mlrhlL-2(ProleukinR，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ，USA)，将这一培养基用作生长培养基。培养之初，将该培养基另外补充单克隆抗CD3抗体(Orthoclone OKT-3，Ortho Biotech，Raritan，NJ，USA)，使其最终浓度为10ng/ml。在培养的第0、5-6、9-10、14-15和21日，用台盼蓝染料将细胞染色，测定总细胞数。对最终产物的安全性、纯度和身份(细胞活力和表型)进行评价。通过将细胞总数与流式细胞术(BD FacsCalibur；BD Biosciences，SanJose，CA，USA)测定的这些亚子集的百分比相乘，计算绝对细胞计数。
在细胞培养瓶中扩增
细胞毒性细胞在细胞培养瓶中扩增的培养条件，已预先用来自健康个体的PBMCs优化(Carlens S.等人，2001)。简言之，初始在T25瓶(TPP，Trasadingen，Switzerland)中，在0.5x106细胞/ml的浓度培养PBMCs。五日后，每2-3日在将培养物补充含5％人血清和IL-2(500U/ml)但不含OKT-3的新鲜培养基，直到培养结束。为防止细胞生长的接触抑制(Heiskala M.等人，1987)，将该细胞转移至更大的瓶(T75或T150：TPP，Trasadingen，Switzerland)或必要时传代至多个瓶中。培养基补充过程中，将细胞浓度调整至0.5x105细胞/ml到第10日，第10日后调整至1x106细胞/ml。偶尔将某一部分细胞冷冻以保持可处理的瓶数。
在摇动式生物反应器系统中扩增
摇动式生物反应器(Wave bioreactor)是一种细胞培养系统，其中细胞在置于摇动的加热平台上、温度和CO2可控、一次性使用的无菌培养袋中生长。发明者们使用摇动式生物反应器系统2/10(GE Healthcare，Somerset，NJ，USA)。根据我们此前使用该系统的经验，起始于低体积和低细胞数时显示亚最佳的效率。并且，捐赠者外周血液样品的细胞数量并不允许直接在生物反应器中起始。因此，在初始优化实验中，发明者们在瓶中开始培养，当细胞达到充足数量时(第5日左右)将该细胞转移至生物反应器中。这一日的生物反应器培养在800ml中以2x106细胞/ml起始。
在最终的验证实验中，获得了来自捐赠者的一整个单位的外周血液或血浆分离置换产物，且从第0日起直接开始在生物反应器中培养。在所有时间，生物反应器的设置如下：温度37℃，CO2：5％，气流：0.1，振摇速率：6/分钟，振摇角度：6°。每隔一日将细胞采样和计数，不进行其他的喂养(feeding)，直到细胞密度达到3x106细胞/ml。自此，每天用500ml培养基(50ml/枪)喂养所述培养物。当细胞达到6x106细胞/ml的密度时，将喂养增加到750ml/日，达到1x107细胞/ml后增加到1000ml/日。
在VuelifeTM培养袋中扩增
VuelifeTM(American Fluoroseal Corporation，MD，USA)是一种无菌的细胞培养袋，由生物学、免疫学和化学惰性的氟化乙烯-丙烯制成。其对于气体渗透性高，光学透明。在Vuelife培养袋中的培养，在60ml培养基使用72mlVuelife培养袋以5x105细胞/ml的浓度起始。将培养袋在加潮湿孵育箱(humidified incubator)中在37℃和5％CO2孵育。每2-3日加入新鲜培养基，调节其浓度至1x106细胞/ml直到第10日，在第10日后调节浓度为2x106细胞/ml。当需要时将细胞分至更大的培养袋。
2.通过流式细胞术分析淋巴细胞子集和表型
材料和方法
通过流式细胞术，在培养的第0、5-6、9-10、14-15和20日，使用与抗CD3、CD14、CD19、CD45和CD56的单克隆抗体(mAbs)结合的荧光染料，以标准操作程序分析细胞表型和亚群百分比。
在初始的优化实验中，将各个扩增条件下第0日和第20日的细胞进行更详细的免疫表型分析。为避免采样之间的变化，将所有冷冻的样品同时解冻，以通过流式细胞术进行NK细胞子集详细的表型表征。该组包括与抗以下表面抗原的单克隆抗体结合的荧光染料：购自BD Biosciences(San Jose，CA，USA)的CD11a(HI111)、CD3(UCHT-1)、CD7(M-T701)、CD14(MOP9)、CD16(3G8)、CD19(HIB19)、CD25(M-A251)、CD27(M-T271)、CD56(B159)、CD57(NK-1)、CD226(DX11)、NKB1(DX9)和CD62L(DREG56)；来自BeckmanCoulter Inc.(Fullerton，CA，USA)的CD244(2B4)(C1.7)、NKG2D(ON71)、NKp30(Z25)、NKp44(Z231)、NKp46(BAB281)；来自R&DSystems(Minneapolis，MN，USA)的NKG2A(131411)、NKG2C(134591)、KIR2DL1(143211)、KIR2DL3(180701)。
用于流式细胞术的所有抗体染色根据下述方案进行。细胞用PBS洗涤一次，并用适当量的抗体在4℃孵育30分钟。再将标记的细胞用PBS洗涤并在数据采集之前固定在4％PFA中。用FACSCalibur(BD)或CyFlow ML(PartecGmbH，Munster，Germany)进行数据采集，并用CellQuest或FloMax软件分析数据。对于所述分析，使用CD14-CD19-淋巴细胞群附近的适当的SSC/FSC门(gate)。NK细胞作为CD3-CD56+群来门选。NK样T细胞和T细胞分别作为CD3+CD56+和CD3+CD56-群来门选。
对于每个分析的细胞表面受体，计算了第0日和第20日样品的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)值。为估算受体表达的变化，发明者们计算了每个受体的MFI比(MFI第20日/MFI第0日)。当第20日样品的MFI高于第0日样品时，MFI比大于1，表示该受体上调的相对程度。同样，小于1的MFI比解释为该受体的表达的下调。
3.细胞介导的细胞毒性的评价
材料和方法
针对K562细胞，用标准的4小时51Cr-释放试验在体外评价最终产物的细胞毒性能力(Aktas E.等人，2009；Alter，G.等人，2004)。简言之，K562靶细胞在37℃用100μCi的51Cr标记1小时，用PBS洗涤两次，并重新混悬于RPMI培养基。将在100μl RPMI培养基中的总量为3x104的靶细胞一式三份置于V底96孔板中并与100μl效应细胞在适当的浓度孵育4小时，得到效应物∶靶的比为1∶3至10∶1。部分上清液使用Packard Cobra Auto-Gamma5000 Series计数系统(Meridien，CT，USA)计数。根据下式计算特异性51Cr释放百分比：特异性释放(specific release)百分数＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]x100。
NK细胞脱粒的分析
圆底96孔板中，将扩增产物与K562靶细胞以1∶1的比例、终体积200μl在37℃和5％CO2共同孵育6小时。测试开始时加入荧光染料结合的抗CD107a单克隆抗体或相应的IgG1同种型对照。共同孵育1小时后，以1∶100的稀释比加入Monensin(GolgiStop，Becton Dickinson)。用抗CD3和抗CD56单克隆抗体在冰上孵育细胞30分钟以完成表面染色。然后洗涤该细胞，重新混悬于PBS中并立即进行流式细胞术分析。
4.统计学分析
用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.CA，USA)完成数据分析、图表绘制和统计学对比。
结果
细胞培养袋和生物反应器进行NK细胞扩增的评价
在使用封闭培养系统进行NK细胞的扩增的尝试中，发明者们在初始阶段用来自五名健康捐赠者的PBMCs比较了细胞培养袋与瓶。图1A显示了每名捐赠者的整批细胞(bulk cells)、NK和NK样T细胞在扩增期结束时的扩增倍数(fold expansion)。在袋中平均整批细胞扩增为530倍，而瓶产生了平均1100倍的扩增。NK扩增在袋中相比瓶中表现得令人印象深刻，特别是对于五名捐赠者中的三名。然而，当考虑到NK细胞在最终产物中的百分比(图1C)时，可见袋中的扩增并不与瓶中的扩增相关，并可导致最终NK细胞的低纯度。袋中的终产物平均有31％的NK细胞，而瓶的最终产物平均NK百分比为53％。
为寻找导致与瓶收率相当和相关的封闭扩增系统，发明者们相比于瓶中的扩增评价了自动的生物反应器系统的使用，其使用来自五名健康捐赠者的PBMCs。发明者们观察到整批细胞的扩增(平均扩增：瓶：770倍，生物反应器：77倍)，而NK细胞优先地得以扩增，并且在两种条件下都增加了其数量比例。尽管从扩增倍数(图1B)看，五名捐赠者中的四名的NK细胞扩增倍数低于瓶，但这些亚群在最终产物中的百分比与瓶扩增更相当和相关(图1D)。该扩增方案的终产物，生物反应器中NK细胞的中位数为38％而在瓶中有44％NK细胞和16％。
相比于前述的袋中的结果，在生物反应器中NK细胞的百分比高于在袋中，即使尽管该组捐赠者在瓶扩增中得到较差的NK细胞纯度。总之，上述结果表明NK细胞的扩增倍数在袋中更好，而在生物反应器中纯度则稍好一些。
由于NK细胞扩增使用不同的捐赠者组以及个体间的高度差异，不可能直接看出袋和生物反应器系统的相对有效性。由于这些不同组五名捐赠者中的两名实际上是相同的个体(捐赠者1和2)，发明者们有机会直接比较扩增效率。尽管其具有较低的成倍扩增率，生物反应器在最终产物中的NK细胞的百分比(64％)与瓶(74％)相当，而高于袋(47％)。在NK样T细胞的情况下，所有三个系统中百分比都非常接近5％。
为了观察受体表达的改变模式，将源自这两名捐赠者的扩增产物进行进一步的表型的分析。尽管个体间差异照常存在，在不同最终产物中受体表达水平的变化是很相似的(图2A和2B)。可清楚地看到，给定受体上调或下调的程度是相同的，不管使用哪个培养方案。
为了阐明不同系统最终产物中的NK细胞是否保持相同的激活状况并显示相当的细胞毒性，发明者们评价了最终产物对NK-敏感细胞系K562的细胞毒活性(图2C)。发明者们观察到不同条件下扩增的细胞制品的细胞毒活性并没有显著的不同。这些结果确证了所述方法全都足以制备细胞毒性能力增加的细胞制品。
在生物反应器中NK细胞扩增方法的验证
论述了使用生物反应器用于扩增方法的可行性后，发明者们继续验证生物反应器中cGMP条件下的扩增方法，该方法使用血浆分离置换产物或全单位(whole-unit)外周血液以从第0日起开始直接在生物反应器中培养。使用来自两名健康捐赠者和两名MM患者的PBMCs用于该验证方法。出于比较的目的，起始物质(PBMCs)用瓶平行扩增。图3给出了对于所有捐赠者在生物反应器和瓶中整批细胞和淋巴细胞亚群的扩增曲线。在生物反应器的扩增中，细胞总数达到更高，其平均纯度为37.5％，而在瓶中纯度为43％。尽管生物反应器中NK细胞纯度稍低，但NK细胞的最终数量十分可观，足以促进扩增的NK细胞在癌症免疫治疗环境中的临床应用。
在生物反应器中扩增的NK细胞表现出更高的细胞毒性能力
此前的实验中，扩增是在瓶中起始的，并且随后转移至生物反应器中，发明者们并没有检测到最终产物的细胞毒性能力或表型与瓶扩增相比时的不同。有趣的是，发明者们观察到当扩增直接在生物反应器中起始时，对于四名捐赠者中的三名，其最终产物对K562细胞的细胞毒活性显著地高于瓶扩增的最终产物(图4A)。为了更好地认识这一现象，发明者们进行了针对K562细胞的脱粒分析，并测定了每一淋巴细胞亚群中脱粒细胞的百分比(图4B)。惊人地，发明者们观察到在所有四名捐赠者中，生物反应器扩增的NK细胞部分中观察到的脱粒的程度显著高于瓶扩增的NK细胞。同样，在四名捐赠者的三名中，NK样T细胞部分的脱粒显著更高。总之，这些结果表明在生物反应器中进行的扩增方法在关于评价NK细胞的细胞毒性能力方面表现地更好。
为尝试解释从生物反应器和瓶扩增的最终产物细胞毒性能力的不同，发明者们使用多色流式细胞术进行了详细的NK细胞的表型表征。图5A显示从生物反应器和瓶扩增的NK细胞上多种表面受体的表达，且总结了所有捐赠者的结果，并给出了生物反应器和瓶扩增之间的表型对比的总体图。总的说来，不管使用哪个扩增系统最终产物中的NK细胞看起来都相似，而在CD11b、NKG2D和NKp44的表达水平中有轻微但注意得到的不同。NKp44的上调是细胞毒性能力提高的关键因素之一。
本研究对比地评价了细胞培养瓶、袋和生物反应器用于源自人类捐赠者的整批PBMCs的NK和NK样T细胞的离体扩增，以尝试研究在封闭自动系统中生产GMP质量的效应细胞的可行性。
发明者们此前报道了符合GMP的培养基，其促进了激活的NK细胞在细胞培养瓶中的选择性富集(Carlens S.等人，2001)。在此，发明者们给出优化GMP质量的自动封闭培养系统以生成大规模富集NK细胞的效应物群(其适用于临床环境)的最后步骤(Miller JS.等人，1994；Luhm J.等人，2002；Klingemann HG and Martinson J.，2004；Koehl U.等人，2005)，和/或饲养细胞系的使用(Ishikawa E.等人，2004；Torelli GF，等人，2005)在此前的报道中已广泛地用于NK细胞扩增。本研究中，发明者们没有利用任何分离步骤，而是使用整批(bulk)PBMCs用于培养，这使得生成富集NK细胞的细胞群，其在NK细胞含量和抗肿瘤活性两方面(Bordignon C.等人，1999)不同于LAK(Ramsdell FJ and Golub SH.，1987)和细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(Chan JK.等人，2006；Lu PH and Negrin RS.，1994)。
发明者们阐明了，袋和生物反应器系统都提供NK细胞的扩增。本研究中对两封闭系统的扩增率和终产物纯度进行的整体比较表明，与袋相比，生物反应器系统提供了充足数量的纯度更高的NK细胞，并且最终产物中T细胞要少得多。
惊人地，发明者们观察到，源自生物反应器的扩增产物的NK细胞活性显著高于瓶扩增的产物。受体表达水平与NK细胞对K562响应的相关性表明，CD132、CD25、CD57和NKG2C的表达水平与响应呈逆相关，而NKp30、NKp44和NKp46的表达水平是直接相关的。观察到与激活性NK细胞受体NKG2C的表达呈逆相关，这是反常的，但在本案中几乎没有任何意义，因为已知靶K562细胞缺少其配体HLA-E的表达(Khalil-Daher I.等人，1999)。与NK细胞响应相关的受体的统计学分析表明，NKp44不但与响应呈正相关，而且其在生物反应器产物中的表达水平显著高于瓶扩增产物。这至少可以部分地解释为何在生物反应器产物观察到了高细胞毒性能力。不像其他NCRs，NKp44(Vitale M.等人，1998)专一地表达于激活的NK细胞上，并且在体外IL-2刺激后上调(Biassoni R.等人，2002)。因此本案中，其可能作为一个代用的标记，标记着培养物中的IL-2如何被良好使用以及NK细胞群激活的程度是什么。因此，NKp44表达的增高为在生物反应器(而不是常规的细胞培养瓶)中实施的扩增方法提供了功能上的意义(functional significance)。
考虑到实用性，发明者们观察到所有所述系统都有某些优点和缺点。细胞培养瓶中的扩增有着暴露于外部试剂和污染物的固有风险。尽管所述风险在GMP实验室环境中得以最小化，封闭自动系统的使用显然是优选的，只要其提供充足数量的细胞。在瓶中培养的起始并不需要大量的细胞数，但由于细胞必须保持在一定的浓度(Heiskala M.等人，1987)，扩增期间将其分离入新的瓶将最终得到无法处理的瓶数量。培养还可在小袋中起始于少数细胞并得到良好的扩增，但NK细胞的纯度低于其他系统，并且细胞仍然需要被分离入多于一个的袋中。此外，袋中的扩增可容易地在标准的细胞培养实验室中得以优化，而不需要投资其他设备。使用袋可以同时进行多于一个扩增，其仅有的限制是孵育空间；然而生物反应器需要更多的投资以购买仪器，并且一次只能用于一个扩增。
生物反应器是最实用的方法，因为其需要最少的实际处理(hand-on)时间。然而，该系统的起始需要许多细胞并且扩增率更低。生物反应器持续的振摇运动确保了动态和均匀的培养环境，这种环境提供了许多优势，例如：均一的培养条件、容易采样以及更高质量的控制过程(如pH以及溶解氧的测量)。最有可能地，这种动态培养条件的使用，是促成细胞更集中地在生物反应器中生长的可行性的主要因素。这避免了培养基或添加成分的任何浪费，也就引人注目地降低了该方法的整体成本。使用每个方案的平均扩增曲线，发明者们估算：为获得相似数量的NK细胞，生物反应器系统所用的培养基成分是袋所用的1/10、瓶所用的1/25。在瓶中培养基和细胞因子的消耗甚至更高(约为袋的2.5倍)。
自然地，动态生物反应器系统用于离体培养，需要很多因素来进行仔细地评估。造血细胞对剪切相对敏感，可合理地设想高剪切方法不适于离体扩增(Nielsen LK.，1999)。因此，依赖外部滤器和高流速的搅拌槽生物反应器(Pierson BA.等人，1996)或灌注培养系统不太可能提供高效率。为了达到生物反应器完全的益处，需要使用低剪切应力生成系统(low shear stressproducing system)，其配有内部灌注滤器以除去培养基(Nielsen LK.，1999)；且本研究中使用的生物反应器系统可满足这些期望。
另一需要仔细考虑的因素是培养环境中所用的物质。仅仅很少的物质可以有效地支持造血细胞的生长，并且如清洁、灭菌和再使用等因素显著地影响了其性能(Laluppa JA.等人，1997)。因此，优选使用一次性使用的且预先灭菌的适当材料。本研究中使用的袋和生物反应器系统在这方面都是适于制造的。
观察到的一个不同是，生物反应器和袋的培养中最终产物的细胞活力略低于瓶中的最终产物。这最有可能是因为在瓶培养中当每隔2-3日更新培养基时死细胞持续地被洗掉，而封闭系统中不存在这样的程序。然而，总是可以在培养的最后、给药之前使用GMP质量清洗步骤。
所有所述系统都具有某些实际的优势和劣势。NK细胞在细胞培养瓶的扩增有暴露于外部试剂和污染物的固有风险。尽管所述风险在GMP实验室环境中得以最小化，封闭自动系统的使用显然是优选的，只要其提供充足数量的细胞。在瓶中培养可起始于很低的细胞数，但由于细胞必须保持在一定的浓度，扩增期间将其分离入新的瓶将最终得到无法处理的瓶数量。
培养还可在小袋中起始于少数细胞并得到良好的扩增，但NK细胞和NK样T细胞的纯度低于其他系统，并且细胞仍然需要被分离入多于一个的袋中。袋中的扩增可容易地在标准的细胞培养实验室中得以优化，而不需要投资其他设备。使用袋可以同时进行多于一个扩增，其仅有的限制是孵育空间；然而生物反应器一次只能用于一个扩增。
总之，在此呈现的结果清楚地阐明了，可在适当免疫治疗环境中使用的大量高度激活的效应细胞，可以在GMP条件下的封闭培养系统中生成。
尽管在此详细公开了特定的具体实施方案，其是通过只用于例证的实施例来完成的，并且其并非意在限制附带权利要求的范围。尤其地，发明者们预期，对本发明可以进行多种替代、变化和修改，而不脱离如权利要求所限定的本发明的精神和范围。
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Claims (25)

1.大规模扩增并同时激活表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的方法，其中所述扩增和激活是在封闭系统中进行的，并且所得扩增的细胞经体外细胞毒性试验测定表现为细胞毒性增强。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-将所述细胞加入所述封闭系统，该系统含有补充了血清、白细胞介素-2(IL-2)和抗CD3抗体的生长培养基；
-搅拌和加热下在所述系统中扩增所述细胞，直到扩增的细胞群中至少35％含有激活的NK细胞和NK样T细胞，并且所述扩增的细胞经体外细胞毒性试验测定表现为细胞毒性增强。
3.权利要求2的方法，其中所述搅拌和加热在如下条件下进行：温度为约36至约40℃；CO2浓度为约4.7至约5.1％；以一定速率和角度温和振摇，使细胞粘附于封闭细胞系统的表面。
4.权利要求2的方法，其中所述振摇在约4-8/分钟的振摇速率进行。
5.权利要求2的方法，其中所述振摇在约4-8°的振摇角度进行。
6.权利要求2的方法，其中所述扩增进行至细胞总数扩增至少约10倍。
7.权利要求2的方法，其中所述扩增进行至该扩增的细胞群的至少约50％分别含有激活的NK细胞和NK样T细胞。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述细胞样品为外周血液、细胞系或细胞因子刺激的外周血液的样品。
9.权利要求8的方法，其中所述细胞样品为外周血单个核细胞(PBMCs)样品。
10.权利要求2的方法，其中初始加入封闭细胞系统的细胞浓度为约0.5x106至约2x106/ml生长培养基。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其进一步包括每日加入相当于总培养体积约50％的补充血清和IL-2的培养基，并且每日从该封闭细胞系统丢弃约相同体积的生长培养基的步骤，且所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约50％时进行。
12.权利要求11的方法，其包括当细胞密度比初始细胞密度至少增长约300％时重复权利要求11公开的步骤，但加入并丢弃总培养体积的约75％。
13.权利要求11的方法，其包括当细胞密度比初始细胞密度至少增长约500％时重复权利要求11公开的步骤，但加入并丢弃总培养体积的约100％。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞孵育至少约10日。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述封闭细胞系统为预先灭菌的袋。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述封闭细胞系统为生物反应器。
17.权利要求2的方法，其中所述血清选自人血清和自体血清。
18.权利要求2的方法，其中所述培养基中补充有约50至约1500U/mlIL-2、约1至约50ng/ml抗CD3抗体和约1至约40％血清。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞样品从健康受试者收集。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞样品从携肿瘤的受试者收集。
21.权利要求20的方法，其中所述肿瘤选自血液肿瘤和实体瘤。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞主要由表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞组成。
23.可通过权利要求1-21中任一项的方法获得的表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的悬液。
24.表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的悬液，其中与在瓶中扩增的细胞相比，所述细胞经体外细胞毒性试验测定表现为细胞毒性增强。
25.表型为CD3-CD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的悬液，其中扩增的细胞群的至少35％、优选至少50％含有激活的NK细胞。
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