CN113853204A

CN113853204A - 适用于移植组合疗法的扩增nk细胞组分的扩增及其用途

Info

Publication number: CN113853204A
Application number: CN202080037287.9A
Authority: CN
Inventors: 托尼·佩莱德
Original assignee: Gamida Cell Ltd
Current assignee: Gamida Cell Ltd
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-12-28
Also published as: JP2022525928A; WO2020188573A1; US20220249555A1; AU2020243703A1; CA3133419A1; EP3941489A1; EP3941489A4; IL286482B1; SG11202110261QA; IL286482A

Abstract

提供多种扩增用于移植到一受试者的一自然杀手(NK)细胞组分的方法，且特别是提供可移植的NK细胞组分及其使用方针的方法，可以应用于细胞移植及输液中，特别是与抗CD20抗癌抗体的组合疗法，用于治疗癌症及其它疾病。

Description

适用于移植组合疗法的扩增NK细胞组分的扩增及其用途

相关申请案

本申请要求2019年3月21日申请的美国临时专利申请案第62/821,535号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域和背景技术

本发明涉及扩增自然杀手(NK)细胞的方法，选择用于移植到有需要的受试者的扩增NK细胞群，以及使用合适的体外扩增的NK细胞组分的治疗性用途，以供在临床环境中进行移植，用于治疗血液系统恶性肿瘤(恶性血液病)，包括与癌症免疫疗法相结合。本发明还设想了包括所述扩增NK细胞组分的套件。

自然杀手(以下简称“NK”)细胞是参与免疫反应的淋巴细胞。这些细胞具有多种功能，尤其是杀死活体内的肿瘤细胞、发生致癌转化的细胞和其他异常细胞，是先天免疫监视机制的重要组成部分。NK细胞过继免疫疗法的临床经验强调需要更好的方法来有效和高效地扩增NK细胞群，同时维持甚至增强它们的在体内的功能(杀伤能力、运送、定位、持久性和增殖)。

与T细胞不同，自然杀手(NK)细胞不需要特定肿瘤抗原的存在即可杀死癌症细胞；相反，它们对目标的识别是通过激活和抑制信号之间的平衡来调节的。自然杀手(NK)细胞无需识别肿瘤特异性抗原即可杀死肿瘤细胞的这种能力提供了优于T细胞的优势，并使它们作为免疫疗法的效应子(effector)而受到研究。近年来，NK细胞作为一种有前途的工具，作为治疗各种难治性血液系统恶性肿瘤和转移性实体瘤患者的免疫疗法而引起了广泛关注。然而，尽管NK细胞能够独立于抗原识别杀死癌症细胞，但基于NK细胞的免疫疗法的全部治疗性潜力尚未实现。迄今为止，实验性方针的结果主要限于部分响应，边际效力主要归因于注入的NK细胞数量相对较少，其体内持久性短，及/或体内功能性较差。因此，开发能够有效地扩增所述NK群体且增加过继注入的NK细胞在体内的功能的体外NK培养方法对于提高NK细胞免疫留法的临床适用性至关重要。

已经研究了几种体外扩增和活化NK细胞的方法。这些包括用细胞因子过夜和长期培养从PBMC中富集的NK细胞，或将NK细胞与饲养细胞共培养，如PBMC、基因修饰的K562细胞(参见Malmberg等人的US 20150224143)，以及Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞系(参见例如Lee等人的US20150152387)。其他繁殖NK细胞的方法已被描述：Frias等人(ExpHematol2008；36:61-68)用无血清培养基在基质细胞层上培养选自脐带血的NK祖细胞(CD7+CD34-Lin-CD56-)，用SCF、IL-7、IL-15、FL和IL-2诱导NK分化，产生更多数量的细胞毒性培养的NK细胞。Harada等人(Exp Hematol.2004；32:614-21)在来自Wilm的肿瘤细胞系的细胞上培养NK细胞。Waldmann等人(US20070160578)描述了使用IL-15/R-配体激活剂的复合物增强培养物中来自全血、骨髓或脾细胞的NK和CD8-T细胞的增殖，以减少不良细胞因子的产生。Campana等人(US20090011498)描述了在存在表达IL-15和4-1BB且MHC-I或II表达较弱或不存在的白血病细胞的情况下，NK细胞的离体培养和活化，用于移植。Childs等人(US20090104170)描述了在IL-2存在的情况下，通过与受辐射的EBV转化的淋巴母细胞共培养，NK细胞的体外增殖和活化。使用另一种方法，Tsai(US20070048290)通过离体培养永生化NK祖细胞和经辐照的3T3衍生的OP-9S细胞，从造血干细胞产生连续的NK细胞系，用于研究和潜在的治疗应用(所有上述参考文件均通过参照并入本文)。

扩增NK细胞治疗性群体的使用已完成40多个主动、募集或授权的临床试验(见clinical trials(dot)gov网站)调查NK细胞通过不同的方针扩增的应用，用于治疗各种癌变的病症，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤。已经发现了扩增NK细胞群，一般来说，可以维持细胞毒性。还提出了将NK细胞与化疗剂、抗癌生物制剂和其他癌症疗法结合使用的辅助疗法：例如，US2017/0137783的Li教授了表达嵌合抗原受体(CAR)表达的免疫细胞的扩增及其与癌症治疗的附加疗法联合给药。Bedoya等人的US 2017/0137783教授扩增的CAR表达的免疫细胞与其他疗法，包括抗肿瘤生物制剂相结合。

然而，迄今为止的结果突显了设计NK扩增和疗法方针的难度，这些药物不仅安全，而且在针对不同形式的恶性肿瘤方面足够有效。本发明人已经描述了用细胞因子和NAD前体烟酰胺培养的NK细胞的有效体外扩增和增强的功能，报告增加的定位和移植物NK细胞对目标器官(例如，脾脏、骨髓和外周血)在动物模型中(参见PCT公开第WO2011/080740号和Frei等人，Blood，2011；118：4035)。其他相关参考文献包括，除其他之外，PCT申请第IB2018/057475号和中国专利申请第201811129572.4号。

发明内容

根据本发明实施例的一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的一血液学疾病的方法，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)；

(b)向所述受试者施用至少一免疫抑制剂；

(c)移植一扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分(expanded CD3-depletedhaploidentical or mismatched NK cell fraction)到有需要的所述受试者，其中所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分已经通过以介于1.0mM至10mM之间的一量的营养素、血清、IL-15及烟酰胺进行体外培养被扩增；以及

(d)向所述受试者施用IL-2，

从而治疗所述受试者的所述血液学疾病。

根据本发明的一些实施例，所述受试者及所述NK细胞组分是一人类受试者及一人类NK细胞组分。

根据本发明的一些实施例，所述免疫抑制剂是一化疗免疫抑制剂及/或辐照。

根据本发明的一些实施例，所述血液学疾病是一恶性血液病。

根据本发明的一些实施例，所述血液学疾病是一CD20-阳性[CD20-positive(CD20+)]恶性血液病。在一些实施例中，所述血液学疾病是一CD20-阳性淋巴恶性肿瘤。

根据本发明的一些实施例，所述血液学疾病是一多发性骨髓瘤。

根据本发明的一些实施例，所述多发性骨髓瘤以下列至少一个为特征：

(a)在第一次自体干细胞移植后2至18个月之间的复发疾病；

(b)在没有主动移植物抗宿主病(GVHD)的证据下，异体干细胞移植后至少4个月的复发疾病复发疾病；

(c)在至少两条线的疗法之后的复发/难治性疾病，所述疗法包括蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物(IMiD)；

(d)血清IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M-protein)大于或等于0.5g/dL；以及

(e)尿液M-protein大于或等于200mg/24小时收集量。

根据本发明的一些实施例，所述血液学疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

根据本发明的一些实施例，所述非霍奇金淋巴瘤是CD20阳性B细胞NHL。

根据本发明的一些实施例，所述NHL以下列至少一个为特征：

(a)传统性疗法失效的复发/难治性疾病；

(b)在自体干细胞移植之后至少60天的复发疾病；

(c)在没有主动移植物抗宿主病的证据下，异体干细胞移植之后至少4个月的复发疾病；以及

(d)大于或等于1.5厘米直径的可测疾病。

根据本发明的一些实施例，执行所述步骤(a)三次。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(d)包含施用所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的一第一剂，接着2天后施用所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的一第二剂。

根据本发明的一些实施例，执行所述步骤(a)三次：在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的所述第一剂之前9-11天、在所述第一剂之前3天以及在所述第一剂之后11天。

根据本发明的一些实施例，所述NK细胞组分包含介于1X10⁷个/公斤及5X10⁸个/公斤的扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。

根据本发明的一些实施例，所述结合的所述第一剂和所述第二剂包含2X10⁷个/公斤至2X10⁸个/公斤的总扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。

根据本发明的一些实施例：

(a)所述NK细胞组分的所述第一剂和所述第二剂中的每一剂都包含1X10⁷个/公斤的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，于一总剂量为2X10⁷个/公斤的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，或

(b)所述NK细胞组分的所述第一剂和所述第二剂中的每一剂都包含5X10⁷个/公斤的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，于一总剂量为1X10⁸个/公斤的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，或

(c)所述NK细胞组分的所述第一剂和所述第二剂中的每一剂都包含1X10⁸个/公斤扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，于一总剂量为2X10⁸个/公斤的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞。

根据本发明的一些实施例，在提供所述组分用于移植之后不大于1小时且在所述组分释放最终产物之后不大于10小时将所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分施用于所述受试者。

根据本发明的一些实施例，通过不具有一过滤器或泵的输液，将所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分施用于所述受试者，持续不小于15分钟且不大于60分钟的一持续时间。

根据本发明的一些实施例，所述至少一免疫抑制剂包含环磷酰胺(cyclophosphamide)及/或氟达拉滨(fludarabine)。

根据本发明的一些实施例:

(i)所述至少一免疫抑制剂包含40毫克/公斤的环磷酰胺及25毫克/平方米的氟达拉滨中的两者；以及

(ii)其中在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞的输血之前5天施用所述环磷酰胺，以及在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞的输血之前的第5、4、3天中的每一天施用所述氟达拉滨。

根据本发明的方法的一些实施例，所述方法还包含在所述扩增CD3-耗尽NK细胞的输血之后施用6X10⁶单位的IL-2：

(i)在所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或错配的NK细胞的输血的当日；以及

(ii)在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞的输血之后2天；以及

(iii)所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞的输血的4天中。

根据本发明的一些实施例，所述方法还包含所述可移植的NK细胞组分通过以下步骤准备：

(a)为所述受试者获得一CD3-耗尽NK细胞组分HLA-单倍相合或HLA-错配；

(b)在允许细胞增殖的条件下进行体外培养所述CD3-耗尽NK细胞组分，其中所述条件包含提供介于1.0mM至10mM之间的一量的营养素、血清、IL-15以及烟酰胺(nicotinamide)；

(c)在步骤(b)之后以新鲜的营养素、血清、IL-15以及烟酰胺补充所述CD3-耗尽NK细胞组分8至10天，以制造一扩增CD3-耗尽NK细胞组分；

(d)在步骤(b)之后14至16天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分；以及

(e)清洗并浓缩步骤(d)的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分；

从而制造一可移植的NK细胞组分以供所述受试者移植。

根据本发明的一些实施例，所述CD3-耗尽NK细胞组分是一人类NK细胞组分。

根据本发明的一些实施例，所述CD3-耗尽NK细胞组分来自血液成分分离(apheresis)。

根据本发明的一些实施例，所述体外培养缺乏一饲养层。

根据本发明的一些实施例，所述血清是人类血清。

根据本发明的一些实施例，允许细胞增殖的所述条件包含提供10％的人类血清。

根据本发明的一些实施例，所述IL-15包含20ng/ml的IL-15。

根据本发明的一些实施例，所述烟酰胺包含5.0mM烟酰胺。

根据本发明的一些实施例，所述方法包含提供包含最小必要细胞培养基的营养素。

根据本发明的一些实施例，所述NK细胞组分来自一HLA-单倍相合或HLA-错配的供体，具有至少：

(a)HLA以中间分辨率匹配于至少2/4的1类等位基因的A和B基因位点的基于DNA的Class 1分型(HLA matching at intermediate resolution DNA-based Class 1typingof the A and B locus of at least 2/4class 1allele)；以及

(b)缺少受体供体-特异性的抗-HLA抗体，即MFI<1000。

根据本发明的一些实施例，步骤(a)的所述NK细胞包含至少40至90％的CD56+/CD3-细胞。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(d)的收获包含在所述步骤(b)之后14天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的一第一部分，以及在所述步骤(b)之后16天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的一第二部分。

根据本发明的一些实施例，所述第一部分包含大约50％的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分以及所述第二部分包含所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的剩余部分。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(e)产生的所述被清洗及浓缩的扩增NK细胞组分以下列参数为特征：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性(Gram-positive)微生物。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(b)的所述培养是在每个烧瓶有200至300X10⁶个细胞的多个烧瓶中受影响。

根据本发明的一些实施例的一方面，提供根据本发明的方法所制备的一可移植的NK细胞组分。

根据本发明的一些实施例，所述可移植的NK细胞组分以下列参数为特征：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

根据本发明的一些实施例，在一氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋内提供所述可移植的NK细胞组分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与普通技术人员对本发明有关的技术领域中所通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文描述的那些方法与材料可以用在本发明实施例的实践或测试中，示例性方法及/或材料仍进行说明如下。在冲突的情况下，专利说明书，包括定义，将控制。此外，材料、方法和举例仅是说明性的，非意指其必要限制。

附图说明

本文仅通过举例的方式，参照随附的图式描述本发明的一些实施例。现以具体参照附图详细说明，以及为了发明实施例的说明讨论的目的，通过举例的方式且不一定按比例来强调所示细节。在这点上，结合附图所做的描述会使得本领域的技术人员明确可知可以如何实施本发明的实施例。

在附图中：

图1是以外加的外生的烟酰胺(5mM)培养2周扩增，且染色细胞表面标记物CD16及CD56的CD3-/CD56+NK细胞的一流式细胞荧光分选技术图(FACS plot)。注意高百分比(>75％)的双阳性CD16+/CD56+细胞在所述烟酰胺-扩增的NK群中；

图2A至2B是直方图，显示被烟酰胺-扩增，由抗-CD20抗体奥比妥珠单抗及利妥昔单抗(Rituximab)介导的NK细胞的CD20+BL2细胞的“细胞杀伤(cell killing)”。注意所述烟酰胺-扩增的NK细胞及所述抗-CD20单克隆抗体奥比妥珠单抗优越的细胞杀伤功能。2A和2B是两组独立的实验。

具体实施方式

本发明是扩增一自然杀手(NK)细胞组分的方法，所述自然杀手细胞组分用于移植到一受试者，同时，在体外及/或体内保持或改进所述细胞的功能。在一实施例中，以一烟酰胺及/或其他烟酰胺部分体外培养NK细胞以及NK细胞生长因子促进了使用作为一治疗性的体外扩增NK细胞制备的NK细胞群的制造，其包括具有适合于输液到一受试者的多个参数的功能性NK细胞的一扩增群体(例如NK细胞靠着一减少的CD3+T细胞组分的稳健扩张)。具体来说，在这方面，本发明可用来提供可移植的NK细胞组分及其使用方针，可应用于细胞移植、输液等治疗癌症及其他疾病。非限制的应用包括结合免疫疗法与抗癌抗体、同种异体过继免疫疗法以及结合致敏剂与其他抗癌模式。在特别实施例中，本发明可以提供可移植的NK组分用于结合免疫疗法与抗-CD20单克隆抗体。

参考所附描述可以更好地理解本发明的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明在其应用上不一定限于以下描述中阐述及/或在附图及/或实施例中说明的组件的结构及/或布置及/或方法的细节。本发明能够有其他实施例或能够以各种方式实践或实施。

自然杀手(以下简称“NK”)细胞是参与免疫反应的淋巴细胞，对肿瘤细胞表现出自发的非MHC限制性细胞毒活性。因此，开发临床级方针(例如，无间质层，最小的细胞因子)以有效地在体外扩增活的NK细胞的数量且有效地改进它们的功能，以及归巢到淋巴结的可能性及其输液后在体内稳态增殖，可提高采用NK细胞的过继免疫疗法治疗癌变的状态，如实体瘤、造血系统恶性肿瘤等的成功率。

本发明提供了用于制备和表征适于移植的临床适当条件，在临床设置中，基于具有高于一定浓度的以烟酰胺培养的NK细胞，如本文进一步详述。因此，在其实施例中，本发明提供了临床上合适的培养条件，用于制造功能上成熟的NK细胞的可移植的NK细胞组分，而不伴随非NK细胞(例如CD3+)增殖的诱导，可移植的NK组分和其选择准则，以及用于治疗癌变的疾病，尤其是血液系统恶性肿瘤的临床方针。

因此，根据本发明的一实施例的一方面，提供了一种制备一可移植的NK细胞组分以供移植到有需要的一受试者的方法，所述方法包含：

(b)在允许细胞增殖的条件下进行体外培养所述CD3-耗尽NK细胞组分，其中所述条件包含提供介于1.0mM至10mM之间的一量的营养素、血清、IL-15以及烟酰胺

(e)清洗并浓缩步骤(d)的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，

从而制造一可移植的NK细胞组分以供所述受试者移植。

如本文所用，术语自然杀手(NK)细胞是指参与先天免疫反应的大颗粒淋巴细胞。在功能上，NK细胞通过胞质颗粒的胞吐作用对多种目标物表现出溶细胞活性，胞质颗粒含有多种蛋白质，包括穿孔素和颗粒酶蛋白酶。杀伤是在一接触依赖的非吞噬过程中触发的，该过程不需要预先对一抗原致敏。人类NK细胞的特征在于存在细胞表面标志物CD16和CD56，并且缺少T细胞受体(CD3)。人类骨髓衍生的NK细胞进一步以CD2+CD16+CD56+CD3-表型为特征，进一步含有所述T细胞受体zeta链[zeta(ζ)-TCR]，并且通常以NKp46、NKp30或NKp44为特征。非NK细胞，如NKT细胞或CD8NKT，具有T细胞和NK细胞的特征和细胞表面标志物。在一实施例中，本发明的方法用于从多个细胞的一群体体外繁殖成熟的NK细胞。如本文所用，术语“成熟的NK细胞”被定义为一定型的NK细胞，具有特征性表面标志物和NK细胞功能，并且缺乏进一步分化的潜力。如本文所用，成熟的NK细胞包括但不限于CD56^bright细胞，其可以增殖并产生丰富的细胞因子，CD56^dim细胞，表现出强大的细胞毒性，CD56^brightCD94^high和CD56^dimCD94^high细胞。在另一个实施例中，繁殖NK祖细胞或NK祖细胞和成熟的NK细胞的混合群。CD56、CD3、CD94和其他标志物的细胞表面表达可以例如通过FACS分析或免疫组织学染色技术来确定。

如本文所用，术语“祖细胞(progenitor)”是指能够分裂及/或经历分化为一或多种成熟效应子细胞的未成熟细胞。淋巴细胞祖细胞包括，例如，能够产生B细胞、T细胞和NK谱系的成熟的细胞的多能造血干细胞。在B细胞谱系中(即在产生成熟的B细胞的发育途径中)，祖细胞还包括以免疫球蛋白基因重排和表达为特征的祖B细胞(pro-B cell)和前B细胞(pre-B cell)。在T和NK细胞谱系中，祖细胞还包括骨髓衍生的双能T/NK细胞祖细胞[例如，CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+)和CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-)CD10(+)细胞]，以及胸腺内祖细胞，包括双阴性(相对于CD4和CD8)和双阳性胸腺细胞(T细胞谱系)和定型NK细胞祖细胞。

本发明的NK细胞可以衍生自包含这种细胞的任何来源。NK细胞存在于许多组织中，并且可以从例如淋巴结、脾脏、肝脏、肺、肠、落叶获得并且也可以从iPS细胞或胚胎干细胞(ESC)获得。通常，含有异质的淋巴细胞群的脐带血、外周血、流动的外周血和骨髓，为研究和临床使用提供大量的NK细胞。

NK细胞移植的临床经验表明，同种异体NK细胞可以成功移植到宿主体内，移植物抗宿主病(GVHD)的发生率较低。当已知移植候选者的身份(例如“受试者”)时，可以确定如HLA-匹配(兼容性)等参数并作为一选择准则。

因此，根据具体实施例，所述NK细胞组分来自一HLA-单倍相合或HLA-错配的供体。所述NK细胞供体可以是相关的，也可以是不相关的供体。

在特别实施例中，被选为体外扩增的供体的NK细胞是来自供体HLA-匹配的4个HLAI类(HLA-A和HLA-B基因位点的中间分辨率基于DNA的I类分型)中的至少2个，4个HLA I类(HLA-A和HLA-B基因位点的中间分辨率基于DNA的I类分型)中的至少3个，或4个HLAI类(HLA-A和HLA-B基因位点的中间分辨率基于DNA的I类分型)中的4个基因位点与受试者。根据某些实施例，血液成分分离单元来自具有4个HLA I类(HLA-A和HLA-B基因位点的中间分辨率基于DNA的I类分型)中的至少2个及缺少(平均荧光强度(MFI)<1000)受体(宿主，受试者)供体特异性抗HLA抗体的供体。MFI值代表抗体的数量或滴度。通常，所述NK细胞上的I类HLA(或主要组织相容性复合体，MHC)抗原是通过一微细胞毒性试验，使用针对特定HLA的同种抗血清、针对细胞毒性的补体和用于鉴定被杀死细胞的染料来测定。HLA II类通常由混合淋巴细胞反应(MLR)来确定，测量混合淋巴细胞群培养之后的淋巴细胞增殖。可以通过B细胞抗血清以一富集的B细胞在一微细胞毒性试验中鉴定HLA DR抗原。抗血清可以用特定的单克隆抗体来代替。

另一种常见的血液组分采集方法是血液成分分离，其中将全供体血液分离成血液成分(例如血浆、白细胞和红细胞)，通常通过离心分离，抽取选定的成分进行操作(例如白细胞组分的培养)以及剩余部分返回到所述供体。血液成分分离的优点是可以大量提供特定的血液组分(例如，白细胞组分)，而不会消耗体液(例如血浆)和其他血液成分。血液成分分离可以基于连续流动离心，其需要一个低的体外体积，或基于血液的间歇流动离心，其在循环中分离成分，但通常更耗时，且其特点是所述供体血液具有更大的体外体积。许多合适的血液成分分离装置可商购获得。通常，血液成分分离适用于从所述供体的外周血中分离血液成分。

因此，根据本发明的一实施例的一方面，所述方法包括培养一CD3-耗尽NK细胞组分，其中所述NK细胞组分来自血液成分分离。在具体的实施例中，所述NK细胞组分来自使用一PCS2或MCS8150Haemonetics血液成分分离机(Haemonetics，Boston，MA)从供体所获得的血液成分分离单元。在某些实施例中，所述NK细胞组分来自从所述供体的外周血所获得的血液成分分离单元。

在一些实施例中，NK细胞可以从新鲜的细胞群中培养，而另一些实施例中，NK细胞可以从储存的细胞群(例如冻存和解冻细胞)或先前培养的细胞群中培养。

可以处理淋巴细胞组分，例如“血沉棕黄层(buffy coat)”或血液成分分离单元，以富集或纯化或单离具体定义的细胞群。术语“纯化(purify)”和“单离(isolate)”不需要绝对的纯度；相反，这些只是作为相对性的术语。因此，例如，一纯化的淋巴细胞群是其中特定细胞比其源组织中的此类细胞更富集的一个细胞群。可以富集基本上纯的淋巴细胞的制剂，使得所需细胞占所述制剂中存在的总细胞的至少50％。在某些实施例中，一基本上纯的细胞群代表所述制剂中所述总细胞的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多。

淋巴细胞的富集与单离方法是本领域公知的，可以基于所需要的群体选择合适的方法。例如，在一种方法中，通过去除红血液细胞来富集源材料中的淋巴细胞。基于密度将红血液细胞从淋巴细胞和其他细胞分离。然后可以选择性地回收富含淋巴细胞的组分。淋巴细胞及其祖细胞也可以通过使用分离介质如可从各种商业来源获得的标准淋巴细胞分离培养基(LSM)进行离心来富集。或者，可以使用各种基于亲和力的程序来富集淋巴细胞/祖细胞。许多抗体介导的亲和制备方法是本领域已知的，例如抗体共轭的磁珠。淋巴细胞富集也可以使用商业上可获得的制剂进行，以负选择不想要的细胞，例如FICOLL-HYPAQUE^TM和其他密度梯度基质，用于富集完整的淋巴细胞、T细胞或NK细胞。

从血液、骨髓、淋巴细胞制剂(例如血液成分分离单元)或组织样品中选择NK细胞的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Litwin等人的美国专利第5,770,387号)(其全部内容通过参照并入本文)。通常在单核细胞分层分离，以及非NK细胞如CD3+、CD34+、CD133+等的耗尽之后，最常用的是基于CD56+细胞的单离和纯化的方针。可以使用两种或多种方针的组合从非NK污染物提供更高纯度的NK细胞群。NK细胞制剂的纯度对临床应用具有重要意义，因为非NK细胞，如T细胞和NKT细胞，对抗原特异性反应，如GVHD有所贡献，损害了NK细胞移植的潜在益处。用于单离NK细胞的市售套组包括一步程序(例如，来自Miltenyi Biotec,Auburn CA的CD56微珠和CD56+、CD56+CD16+单离套组)和多步程序，包括CD3+的耗尽或部分耗尽或用非NK细胞抗体识别和去除T细胞的耗尽(例如OKT-3)、B细胞、干细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞和红细胞。因此，在某些实施例中，所述NK细胞群被选择或富集用于NK细胞，并且可以是一CD3-耗尽NK细胞组分。在一些实施例中，所述CD3-耗尽组分包含CD56+CD16+CD3-细胞及/或CD56+CD16-CD3-。在具体实施例中，选择用于培养的所述NK细胞包含至少40％的CD56+/CD3-细胞、至少50％的CD56+/CD3-细胞、至少60％的CD56+/CD3-细胞、至少70％的CD56+/CD3-细胞细胞，至少80％的CD56+/CD3-细胞或至少90％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施例中，选择用于培养的所述NK细胞包含40％至90％之间的CD56+/CD3-细胞、50％至80％之间的CD56+/CD3-细胞、55至75％之间的CD56+/CD3-细胞、60％至70％之间的CD56+/CD3-细胞。在一些实施例中，选择用于培养的所述NK细胞包含40％至90％之间的CD56+/CD3-细胞。

根据表型选择NK细胞的方法包括但不排除免疫检测和FACS分析。在具体的实施例中，所述NK细胞组分是通过免疫磁性选择，例如使用一个CliniMACS T细胞耗尽组((LSDepletion set(162-01)Miltenyi Biotec)的CD3细胞耗尽。

在进一步的实施例中，所述CD3-耗尽NK细胞组分被处理以去除任何痕量红细胞。因此，在一些实施例中，在CD3细胞耗尽之后，所述NK细胞组分在培养之前经历红血液细胞(RBC)裂解。在具体实施例中，红血液细胞裂解是使用氯化铵钾(ACK)缓冲液(Gibco，ThermoFischer Scientific)来完成。

NK细胞可以通过短期或长期培养来进行体外培养。本发明人已经证明，NK细胞可以与生长因子及烟酰胺及/或其他烟酰胺部分一起培养，培养少至7天，或多至3周，导致所述培养的NK细胞的增强的、优先的增殖及/或功能性，与用细胞因子培养但小于0.1mM烟酰胺及/或其他烟酰胺部分(见PCT公开第WO2011/080740号)的细胞相比。在准备用于移植的临床上合适的NK细胞组分时，需要提供显着的体外NK细胞扩增，同时保持所述扩增NK细胞组分的治疗性有益功能性，而不需要长时间的治疗持续时间。

因此，在具体的实施例中，所述CD3-耗尽NK细胞组分被培养14至16天的一时间段。

根据本发明的这个方面，可以通过为NK细胞提供体外细胞增殖的条件，并用一烟酰胺部分对所述NK细胞进行体外培养，从而体外扩增NK细胞的所述群体。

如本文所用，“培养(culturing)”包括提供NK细胞维持和生长因子所需的化学和物理条件(例如，温度、气体)。在一实施例中，培养所述NK细胞包括为所述NK细胞提供NK细胞增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的示例包括但不限于缓冲液、营养素、血清、维生素和抗生素以及细胞因子和其他生长因子，它们通常被提供在生长(即培养)培养基中。在一特别的实施例中，细胞增殖的条件包含营养素、血清和细胞因子。在一实施例中，所述NK培养基包括一最小必需培养基(MEM)，例如MEMα(BI，Bet HaEmek，Israel)和血清。在一些实施例中，以培养基的2-20％、5-15％或5-10％提供血清。在具体的实施例中，所述血清是人类血清，以培养基的10％提供。在一个特别的实施例中，所述培养基是包含10％人类AB血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的MEMα。适用于本发明的其他培养基包括但不限于格拉斯科培养基(Glascow's medium，Gibco Carlsbad CA)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich，StLouis MO)或DMEM(Sigma-Aldrich，St Louis MO)。值得注意的是，许多培养基都含有烟酰胺作为一维生素补充物，例如，MEMα(8.19μM烟酰胺)、RPMI(8.19μM烟酰胺)、DMEM(32.78μM烟酰胺)和格拉斯科培养基(16.39μM烟酰胺)，然而，本发明的方法涉及外生添加的烟酰胺，以补充任何介质的配方所含有的烟酰胺及/或烟酰胺部分，或者是介质成分浓度的整体调整所产生的烟酰胺及/或烟酰胺部分。

根据本发明的一些实施例，在允许细胞增殖的条件下培养NK细胞包括为细胞提供营养素、血清和细胞因子。在一些实施例中，所述至少一生长因子包括细胞因子及/或趋化因子(chemokines)。细胞因子和其他生长因子通常以0.5至100ng/ml，或1.0至80ng/ml，更通常是5至750ng/ml，再更通常是5.0至50ng/ml的浓度来提供(高达10倍的此类浓度可以被考虑)，并且可以从商业上获得，例如，从Perpo Tech,Inc.,Rocky Hill,NJ,USA获得。在一实施例中，允许细胞增殖的条件包括提供所述细胞因子白细胞介素15(IL-15)。在具体的实施例中，所述CD3-耗尽NK细胞与20ng/ml的IL-15一起培养。

此外，将意识到在这方面不断发现新的细胞因子，其中可能在本发明的NK细胞增殖的方法中找到用途。对于将细胞引入(或重新引入)一人类受试者的应用，通常最好使用无血清制剂，例如用于淋巴细胞培养的AIM V.^RTM无血清培养基或MARROWMAX.^RTM骨髓培养基。此类培养基配方和补充剂可从商业来源获得，例如Invitrogen(GIBCO)(Carlsbad,Calif)。培养物可以用氨基酸、抗生素及/或细胞因子来促进最佳活性、增殖、功能性及/或和存活。

根据一实施例，所述NK细胞组分与营养素、血清、一细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺及/或一烟酰胺部分一起培养。如本文所用，术语“烟酰胺部分(nicotinamide moiety)”是指烟酰胺以及源自烟酰胺、其衍生物、类似物及代谢物的产品，例如，NAD、NADH和NADPH，它们能够有效且优先增强NK细胞增殖及/或激活。烟酰胺衍生物、类似物及代谢物可以通过添加到如下所述维持的NK培养物、添加到功能性分析(如杀伤和运动性分析)或以本领域熟知设计用于高通量的试验的自动化筛选方针进行筛选和评估，以评估它们在培养中对体外NK增殖的作用。

如本文所用，短语“烟酰胺类似物”是指已知在上述或类似分析中与烟酰胺类似的任何分子。烟酰胺类似物的代表性示例可包括但不限于苯甲酰胺(benzamide)、烟碱硫酰胺(nicotinethioamide，烟酰胺的硫醇类似物)、烟酸(nicotinic acid)和α-氨基-3-吲哚丙酸(α-amino-3-indolepropionic acid)。

短语“烟酰胺衍生物”进一步是指烟酰胺本身或烟酰胺类似物的任何结构衍生物。此类衍生物的示例包括但不限于取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺和烟碱硫酰胺和N-取代的烟酰胺及烟碱硫酰胺、3-乙酰吡啶(3-acetylpiridine)及烟酸钠(sodium nicotinate)。在本发明的一具体实施例中，所述烟酰胺部分是烟酰胺。

适合用于本发明一些实施例中的烟酰胺或烟酰胺部分的浓度通常在约0.5mM至约50mM、约1.0mM至约25mM、约1.0mM至约25mM、约2.5mM至约10mM、约5.0mM至约10mM的范围内。基于这些烟酰胺的浓度对增殖和NK细胞功能的影响，示例性的烟酰胺有效浓度可以是约0.5至约15mM、1.0-10.0mM，通常为2.5或5.0mM。根据本发明的一些实施例，烟酰胺以约0.5、约0.75、约1.0、约1.25、约1.5、约1.75、约2.0、约2.25、约2.5、约2.75、约3.0、约3.25、约3.5、约3.75、约4.0、约4.25、约4.5、约4.75、约5.0、约5.25、约5.5、约5.75、约6.0、约6.25、约6.5、约6.75约7.0、约7.25、约7.5、约7.75、约8.0、约8.25、约8.5、约8.75、约9.0、约9.25、约9.5、约9.75、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0、约14.0、约15.0、约16.0、约17.0、约18.0和约20.0mM的范围内的一浓度被提供。考虑了所有有效的中间浓度。在具体的实施例中，允许增殖的条件包含介于1.0至10.0mM烟酰胺。在其他实施例中，允许增殖的条件包含5.0mM烟酰胺。

根据NK增殖及/或活性的任何试验，例如细胞培养或功能，可以确定所述烟酰胺及/或烟酰胺部分的合适浓度。与烟酰胺含量低于0.1mM的“对照”培养物相比并从相同的NK细胞源(例如脐带血、骨髓或外周血制剂)，在相同的试验中且在相似的培养条件下(暴露于烟酰胺的持续时间、暴露于烟酰胺的时间)进行测试，烟酰胺的合适浓度是将其用于培养物“增强”或导致培养物中的NK细胞的增殖及/或功能的一净增加的一浓度。

在一些研究中，通过以营养素、血清、细胞因子和烟酰胺培养的纯化NK细胞的体外扩增不需要补充培养基或在培养期间进行操作，而其他研究则主张在所述NK细胞培养过程中的不同时间间隔对培养基进行补充(“再喂养”)。在本发明的某些实施例中，所述NK细胞组分在培养期间被“再喂养”。因此，在具体的实施例中，制备所述可移植的NK细胞组分以供移植包括在体外培养起始(步骤(b))之后8-10天用新鲜的营养素、血清IL-15及烟酰胺补充所述CD3-耗尽NK细胞组分。在一些实施例中，在开始所述体外培养之后8-9天之间、在开始所述体外培养之后9-10天之间或在开始所述CD3-耗尽NK细胞培养之后8-10天之间提供补充。在一些实施例中，补充(或“再喂养”)包括去除NK细胞组分培养物的约30-80％、约40-70％或约45-55％的培养基，并用新鲜培养基的一相似的(例如等量的)体积替换，所述新鲜培养基具有与被去除的培养基相同组成及水平的营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺。在一些实施例中，补充(或“再喂养”)包括去除约50％的NK细胞组分培养物的培养基，并用新鲜培养基的一相似的(例如等量的)体积替换，所述新鲜培养基具有与被去除的培养基相同组成及水平的营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺。在其他实施例中，再喂养后的培养体积达到所述NK细胞培养开始(“接种”)时原始培养体积的大约两倍。

可以使用多种方法和设备培养NK细胞群。培养器具的选择通常基于培养的规模和目的。细胞培养的放大优选涵盖使用专用设备。大规模、临床级的NK细胞制造的器具在例如Spanholtz等人(PLoS ONE 2010；5:e9221)和Sutlu等人(Cytotherapy 2010,Early Online1-12)中有详细说明。在一些实施例中，在烧瓶中以每个烧瓶100-4000X10⁶个细胞的一细胞密度培养所述NK细胞组分(例如方法的步骤(b)及/或(c))。在具体的实施例中，在烧瓶中以每个烧瓶200-300X10⁶个细胞的一细胞密度培养所述NK细胞组分(例如开始体外培养及/或“再喂养”)。在某些实施例中，所述烧瓶是包含一透气膜的烧瓶，例如G-Rex培养装置(G-Rex100M或封闭系统G-Rex MCS，WolfWilson，St Paul MN)。

应当理解，培养瓶中的细胞的密度随着培养期间细胞的增殖而增加。因此，在一些实施例中，在培养扩增的过程中，所述NK细胞组分的NK细胞以每瓶100-4000X10⁶个细胞、每瓶100-4000X10⁶个细胞、每瓶100-4000X10⁶个细胞、每瓶100-4000X10⁶个细胞、每瓶200-3000X10⁶个细胞、每瓶300-2000X10⁶个细胞、每瓶400-1000X10⁶个细胞、每瓶250-800X10⁶个细胞、每瓶100-600X10⁶个细胞或每瓶150-500X10⁶个细胞。在具体的实施例中，在烧瓶中培养的持续时间内，所述NK细胞组分的所述NK细胞以每瓶100-3000X10⁶个细胞的一细胞密度进行培养。

可以在有或没有饲养细胞或一饲养细胞层的情况下培养所述NK细胞。无饲养层的体外培养对于培养细胞，包括NK细胞，的临床应用非常有利。因此，根据一实施例，在没有饲养层或饲养细胞的情况下培养NK细胞的群体。

在某些实施例中，在开始所述NK细胞培养之后14-16天从所述培养物中收获所述CD3-耗尽NK细胞(步骤(b))。细胞的收获可以手动进行，通过释放附着的细胞(例如“刮擦”培养容器表面)或通过一细胞收获装置进行，所述装置设计用以有效率地将细胞从其培养容器中清除并自动收集细胞。在具体的实施例中，通过一细胞收获装置(例如G-Rex MCS，WolfWilson，St Paul MN的收获装置)从所述培养容器中收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分。

在一些实施例中，从培养物中收获新的NK细胞从培养容器中移除大部分或几乎所有细胞。在其他实施例中，可以分两步或多步进行收获，让未收获的细胞继续培养，直到一稍后时间的收获。在某些实施例中，所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分是分两步收获的，包括收获一第一部分的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，然后是收获一第二部分的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分。收获两个部分可以在收获所述第一部分和第二部分之间间隔数小时、数天或更长时间进行。收获的两个部分可以包含大约相等部分的培养物(例如相等量的所述培养的NK细胞)，或者多个部分中的一部分可以包含比另一部分更大组分的所述培养的NK细胞)。在某些实施方案中，收获包括在步骤(b)(开始培养)后约14天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞的一第一部分，以及在约2天后收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞的一第二部分。在一具体实施例中，所述第一部分是在开始体外培养后14天收获，所述第二部分是在开始体外培养后16天收获。

在某些实施例中，所述第一部分和第二部分大致相等，即所述第一(收获)部分包含所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的约50％，而所述第二(收获)部分则包含所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分。

为了准备用于移植的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，需要对收获的细胞进行培养基的清洗，评估关键参数并在一临床上合理的时间段内将体积调整到适合输液的一浓度。

在收获之后，可以手动清洗干净培养基的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，或者，优选用于临床应用，使用采用一封闭系统的自动化装置进行清洗。清洗细胞可以用一输液溶液重新建构(例如，一种示例性输液溶液包含8％w/v的HSA和6.8％w/v的Dextran-40)。在一些实施例中，所述重新建构在一封闭系统中进行。在一些实施例中，筛选与本发明的方法和组合物一起使用的适用性的所述输液溶液。选择合适的输液溶液的示例性准则包括安全测试表明无细菌、酵母菌或霉菌生长，内毒素含量低于0.5Eu/ml，且具有一清洁、无异物的外观。

如本文所用，术语“繁殖(propagation)”或“增殖(proliferation)”是指生长，例如细胞生长和细胞数量的倍增。如本文所用，繁殖和增殖涉及在潜伏期内累积的NK细胞数量的增加。显示NK细胞的表型的细胞的体外或体内繁殖在它们的刺激之后是一种已知的现象，例如用IL-2、Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞系等。

本领域众所周知的细胞增殖试验，包括但不限于克隆试验，其中细胞以低密度接种和生长，并计数集落，机械试验[流式细胞术(例如，FACS^TM)，碘化丙啶]，其机械测量细胞数量、代谢试验(例如四唑盐(tetrazolium)的合并，例如XTT、MTT等)，其测量活细胞的数量，直接增殖试验(例如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine)、胸苷掺入(thymidineincorporation)等)，其测量增长的群体的DNA合成。在一实施例中，以一有效浓度的烟酰胺及/或其他烟酰胺部分一起培养的NK细胞的群体的细胞增殖根据本发明在接种NK细胞于培养物中之后的一预先确定的时间进行测量(例如，约10小时、12小时、约1、2、3、4、5、6、7天、约1、2、3、4、5周、2个月或更长时间)通过FACS分析确定，使用抗CD56和抗CD3标记物来鉴定和定量所述群体的所述CD56+CD3-NK细胞组分。与培养前的原始NK细胞组分相比，NK细胞的增殖可以表达为NK细胞的倍数增加(例如，扩增或倍数扩张)。在一些实施例中，根据本发明，暴露于有效浓度的烟酰胺的NK细胞的群体具有所述NK细胞群的一倍数增加至少2倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150X，至少250倍和至少500倍或更多，在约5、约7、约12、约14、约16、约18、约21、约25、约30或多天培养。在另一个实施例中，由FACS^TM确定的NK细胞的群体的倍数扩增，暴露于有效浓度的烟酰胺至少约1.2X、约1.3X、约1.5X、约1.75X、约2X、约2.25X、约2.5X、约2.75X、约3.0、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X，超过在鉴定条件中以低于0.1mM的烟酰胺及/或其他烟酰胺部份培养的NK细胞的倍数。

如本文所用，术语“功能”或“NK细胞功能”是指任何归因于NK细胞的生物学功能。NK细胞功能的一非限制性列表包括，例如，细胞毒性、细胞凋亡的诱导、细胞运动性、定向迁移、细胞因子和其他细胞信号反应、细胞因子/趋化因子的制造和分泌、体外活化和抑制性细胞表面分子的表达、一被移植宿主中的细胞归巢和移植物植入(体内保留)，以及体内疾病或疾病过程的改变。在一些实施例中，NK细胞功能通过暴露于烟酰胺及/或其他烟酰胺部分而增强，包括至少一CD62L表面标记物的提高表达、升高的迁移反应和所述NK细胞的更大细胞毒活性，以及输注的NK细胞的升高的归巢及体内保留。

粘附和迁移分子例如CD62L、CXCR-4、CD49e等的测定，对于归巢/移植物植入和移植中的细胞保留很重要，在本领域中是众所周知的。细胞中CD62L表达可以通过例如流式细胞术、免疫检测、定量cDNA放大、杂交等来测定。在一实施例中，通过将细胞暴露于一荧光标记的特异性抗人类CD62L单克隆抗体[例如，CD62L PE，Cat.No.304806来自BioLegend(SanDiego,CA,USA)]，并通过荧光激活细胞分选(FACS)来分选细胞。

细胞迁移的测定是本领域公知的。细胞的迁移可以例如，通过反式迁移试验或间隙闭合试验来测定。在反式迁移试验中，例如两室技术，细胞通过一屏障(例如，过滤器)与一刺激物分离，并通过从源头计数细胞的损失、跨越所述屏障的细胞积累，或两者，以特定时间间隔来检测细胞的迁移。在所述间隙闭合试验中，细胞被放置在一可见间隙的外围(有划痕的琼脂板，围绕一个圆圈等)并与一刺激物一起培育。使用细胞计量术、免疫检测、显微镜/形态计量学等可视化由细胞运动性施加的细胞之间的空间的闭合，以响应一刺激物。在一实施例中，通过“Transwell”^TM反式迁移试验，响应于SDF(250ng/ml)，来确定不同群体的NK细胞的迁移潜力。

用于输血或移植细胞的归巢和原位保留的分析是本领域公知的。如本文所用，术语“归巢(homing)”是指输血或移植的细胞到达一宿主目标器官并在其中存活的能力。例如，NK细胞目标器官可以是淋巴组织，肝细胞目标器官可以是肝脏薄壁组织，肺泡细胞目标器官可以是肺薄壁组织等。如本文所用，术语“体内保留(in-vivo retention)”(也公知为“移植物植入”)指输入或移植的细胞在目标器官中增殖并保持活力的能力。用于分析移植的NK细胞的归巢和体内保留的动物模型包括但不限于免疫缺陷的小型哺乳动物(例如SCID和IL2Rγ^null小鼠等)。SCID-Hu小鼠模型采用C.B-17scid/scid(SCID)小鼠移植人胎胸腺(human fetal thymus)和肝组织或胎儿BM组织，且为评估移植人类NK细胞的保留和治疗性潜力提供了一个合适的模型。移植细胞的归巢和体内保留也可以在人类宿主受试者中进行评估。在一实施例中，在辐照的NOD/SCID小鼠中测定了归巢和体内保留，例如，大约15X10⁴个、大约15X10⁵个、大约15X10⁶个、大约15X10⁷个或更多个人类NK细胞，这些细胞是根据本发明的一有效浓度的烟酰胺进行培养的，并在输血后的一预先确定的时间被牺牲(例如约5小时、10小时、12小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、输血后2、3、4个月或更长时间)。在牺牲小鼠时，使用人类特异性Abs通过FACS评估脾脏、骨髓、外周血和其他器官的人类NK细胞(CD56+CD45+)的存在。体内保留百分比表示为显示所述供体表型(例如，人类细胞的CD45)的器官的细胞百分比。

细胞毒性分析(“细胞杀伤”)是本领域公知的。用于重定向杀伤试验的合适目标细胞的示例是癌症细胞系、原代癌症细胞实体瘤细胞、白血病细胞或病毒感染细胞。特别地，可以使用K562、BL-2、colo250和原代白血病细胞，但可以使用大量其他细胞类型中的任何一种并且是本领域公知的(参见，例如，Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.186:1129-1136；Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.187:2065-2072；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188:953-960；Neri et al.al.(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.8:1131-1135)。细胞杀伤通过细胞活性试验(例如，染料排斥法、铬释放、CFSE)、代谢测定(例如，四唑盐)和直接观察进行评估。

用于移植的细胞组分中同种异体T(CD3+)细胞的存在是有问题的，因为它们会大大增加GVHD的风险。因此，对于可移植的扩增NK细胞组分的适应性的一重要参数是CD3+细胞的数量或分额。因此，在特别实施例中，通过本发明的方法产生的被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的特征在于每公斤病患体重有1.0X10⁵至1.0X10⁶个CD3+细胞。在进一步的实施例中，通过本发明的方法产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的特征在于每公斤病患体重少于7.0X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于6.5X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于6.0X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于5.5X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于5.0X10⁵个CD3+细胞，每公斤病患体重少于4.5X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于4.0X10⁵个CD3+细胞、每公斤病患体重少于3.5X10⁵个CD3+细胞或每公斤病患体重少于3.0X10⁵个CD3+细胞。在一实施例中，通过本发明的方法产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的特征在于每公斤病患体重少于7.0X10⁵个CD3+细胞。注意的是，由本发明的方法产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的CD3+份额、部分或含量的计算，以每公斤病患体重表示，涉及被移植(例如输注)到所述病患体内(即受试者)的CD3+细胞的总量。通过本发明方法的步骤(e)产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的份额、部分或量也可以被表示为CD56+/CD3-与CD3+细胞的比率，或表示为通过本发明的方法产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的一体积分数(例如CD3+细胞数/mL)或重量分数(CD3+细胞/100g)。CD3+细胞标记物的鉴定在上文中有详细描述。

通过监测内毒素含量以及特别是细菌、真菌、病毒和支原体污染等的存在，确保用于移植的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的无菌性和安全性。在一些实施例中，选择用于移植的所述扩增NK细胞组分在清洗和浓缩后具有不超过5Eu/ml的一内毒素含量。在一些实施例中，用于移植的所述扩增NK细胞组分的特征在于在清洗及浓缩后不含微生物(例如，革兰氏阳性微生物)。

在一些实施例中，适于移植的所述扩增NK细胞组分的特征在于约50％至约85％的活性。在一些实施例中，选择具有约55％、约60％、约63％、约65％、约68％、约70％、约75％、约78％、约80％、约82％、约83％、约84％至约85％或更大的活性的扩增NK细胞组分。在一进一步的实施例中，选择用于体外扩增的所述NK细胞组分具有至少70％的活细胞。在进一步的实施例中，适于移植的所述扩增NK细胞组分的特征在于在清洗和浓缩之后至少70％的活细胞。在进一步的实施例中，适合移植的所述扩增NK细胞组分具有至少85％的活细胞。

如本文所用，术语“活性”是指活细胞和非活细胞之间的区别。细胞活性可以通过形态变化或膜通透性的变化及/或从排除某些染料或其他染料的吸收和保留推断出的生理状态来判断。细胞活性评估是本领域公知的，包括但不限于各种试验(例如，染料排斥法、铬释放)、代谢测定(例如，四唑盐)和直接观察(Coder,D.,Current Protocols inCytometry,1997,John Wiley and Sons,Inc.,Unit 9.2,9.2.1-9.2.14)。

在一些实施例中，在NK细胞培养之前、NK细胞培养期间、收获第一部分及/或第二部分之后，及/或清洗和浓缩所述扩增NK细胞组分之后，监控在样品中的CD56+/CD3-细胞组分的所述参数、CD3+细胞份额、活性、内毒素及微生物含量。在一些实施例中，在处理前(100x10⁶个细胞)、柱后(CD3耗尽)预培养样品(10x10⁶个细胞)、扩增后预清洗(10ml样品)、在第一次输液当天(第0天)最终扩增、清洗和浓缩NK细胞产物(10x10⁶个细胞)和在第二次输液当天(Day+2)最终扩增、清洗和浓缩NK细胞产物(10x10⁶个细胞)，或其任意组合之前从所述血液成分分离单元的任何一个抽出所述样品。

因此，根据具体实施例，通过本发明的方法产生的所述被清洗和浓缩的扩增NK细胞组分的特征在于以下参数：

(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

符合上述准则的扩增CD3-耗尽NK细胞组分可用于移植到有需要的受试者(例如病患)中。上文描述的用于移植的NK细胞组分的任何体外扩增(培养)、选择和制备方法，以及它们单独或以各种组合采取的每个实施例都可以用于影响在本节和以下各节中描述的移植扩增NK细胞组分的方法。

因此，在一些实施例中，提供了根据本文所述的用于制备一可移植的NK细胞组分的任何方法所制备的一可移植的NK细胞组分。在具体实施例中，所述可移植的NK细胞组分具有以下参数的特征：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

在一些实施例中，在清洗和浓缩之后，所述可移植的NK细胞组分被转移到一容器中(例如转移到移植点(输液))。在一些实施例中，所述容器是一培养袋。培养袋由惰性材料制成，具有高透气性和低失水性、柔韧性和高透光性是理想的。在具体的实施例中，在一氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中提供所述可移植的扩增NK细胞组分。

在其他实施例中，提供了一种可移植的人类NK细胞组分，其特征在于以下参数：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

本发明的扩增NK细胞组分可用于移植到有需要的受试者。

如本文所用，术语“移植”，在细胞疗法、过继转移、细胞免疫疗法等的上下文中是指将对一受试者施用具有一预期治疗效果的细胞，优选地对有需要的一受试者施用，例如，治疗一病患的疾病或病症。由于这种细胞疗法包含通过一血管连接将所述治疗性的细胞组分引入到所述受试者的体内，如本文所用，NK细胞的“移植”和“施用”等同于“输液”。通常，治疗性的细胞组分是通过一中心静脉导管(例如Hickman导管)以静脉输注到所述受试者体内。输注到所述受试者的治疗性的细胞组分的输液速率可以由一泵控制，也可以是无辅助的，由重力供给，并且通过所述细胞组分与入口导管的高度差来调节。在一些实施例中，所述扩增NK细胞组分是通过重力供给静脉内移植(注入、给药)，而无一泵或多个泵及/或无过滤器。

在一些实施例中，有需要移植的所述受试者患有一血液学疾病。在一些实施例中，所述受试者患有一恶性血液病。在一些实施例中，所述恶性血液病是一CD20-阳性(CD20+)恶性血液病。在一些实施例中，需要移植的所述受试者患有一CD20-阳性淋巴恶性肿瘤。在具体的实施例中，使用本文所述的所述扩增NK细胞组分或方法来治疗的血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。

因此，在一些实施例中，提供了一种治疗有需要的一受试者的一血液学疾病的方法，所述方法包含：

(a)向所述受试者施用一抗癌单克隆抗体；

(b)向所述受试者施用至少一免疫抑制剂；

(c)移植一扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分到有需要的所述受试者，其中所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分已经通过以介于1.0mM至10mM之间的一量的营养素、血清、IL-15及烟酰胺进行体外培养被扩增；以及

(d)向所述受试者施用IL-2，

从而治疗所述受试者的所述血液学疾病。

在具体实施方式中，所述抗癌单克隆抗体是一抗CD20单克隆抗体。特别是，所述抗癌单克隆抗体可以是奥比妥珠单抗(obinutuzumab，如

)。

如本文所用，一“受试者”或“病患”可以是任何哺乳动物，例如人类、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼。在一具体的实施例中，所述受试者是一人类。在进一步的实施例中，所述受试者是人类并且所述NK细胞组分是一人类NK细胞组分。

如本文所用，一个“有需要的受试者(subject in need thereof)”是需要移植、输血、输液或植入本发明的所述NK细胞组分以治疗或改善一疾病、紊乱或病症一受试者。在一实施例中，所述受试者已经(确诊)或患有一血液学疾病。在一些实施例中，所述血液学疾病是一细胞增殖性疾病。在其他实施例中，所述血液学疾病是一恶性血液病。

如本文所用，术语“…的风险”或“…的概率”是指发生的可能性。在一些实施例中，一个体中发生(例如NK细胞组分的植入或未植入、非复发死亡率等)的风险或概率是指从接受治疗的组与未接受相同治疗的组之间的比较数据所计算的风险。在一些实施例中，增加或减少的风险或概率反映了治疗组和对照组之间关于所考虑的结果的差异。在一些实施例中，特定发生或状况的风险或概率的增加或减少仅是相对的，而不以数值表示。

如本文所用，术语“细胞增殖性病症(cell proliferativedisorder)”是指其中细胞的不受调节或异常生长或两者可导致不想要的病症或疾病的发展的病症，其可能是也可能不是癌变的。本发明的示例性细胞增殖性疾病包括其中细胞分裂失调的多种病症。如本文所用，术语“快速分裂细胞(rapidly dividing cell)”定义为以超过或大于相同组织内相邻或并列的细胞中所预期或观察到的速度进行分裂的任何细胞。一细胞增殖性疾病包括一癌症前或一癌变前的病症。一细胞增殖性疾病包括癌症。在具体实施例中，本文提供的方法用于治疗或减轻癌症的症状。术语“癌症”包括实体瘤以及血液肿瘤和/或恶性肿瘤。在具体实施例中，所述恶性血液病为非霍奇金淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施例中，本发明的方法和组合物和套组可用于治疗所有年龄组的受试者。在具体的实施例中，所述受试者或患者大于18岁且小于70岁。

在一些实施例中，有需要的受试者可具有多发性骨髓瘤。在进一步的实施例中，所述多发性骨髓瘤(MM)的特征在于以下准则中的至少一个：(a)在第一次自体干细胞移植后2-18个月之间的复发疾病，(b)在没有主动移植物抗宿主病(GVHD)的证据下，异体干细胞移植后至少4个月的复发疾病，(c)在至少两条线的疗法之后的复发/难治性疾病，所述疗法包括蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物(IMiD)，(d)血清IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M-protein)大于或等于0.5g/dL；以及(e)尿液M-protein大于或等于200mg/24小时收集量。在一些实施例中，所述多发性骨髓瘤的特征还在于血清IgE骨髓瘤蛋白(M-protein)大于或等于0.5g/dL，并且在NK治疗开始前不少于4周进行血浆血液成分分离。在一些实施例中，有需要的受试者具有多发性骨髓瘤，其特征在于本文所述的标准中的一个以上。

有需要的受试者可患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是一种CD20阳性B细胞NHL，具有CD20表达通过流式细胞术或免疫组织化学确认。在进一步的实施例中，所述NHL的特征在于以下特征中的至少一个：(a)传统疗法已经失效的复发/难治性疾病，(b)在自体干细胞移植后至少60天有复发疾病，(c)在没有主动移植物抗宿主病的证据下，异体干细胞移植后至少4个月的复发疾病，并且(d)大于或等于1.5厘米直径的可测疾病。在一些实施例中，有需要的所述受试者具有以多于一个本文描述的准则为特征的NHL。

在一些实施例中，还可以根据以下准则进一步定义有需要的受试者：Karnofsky至少有60％的表现评分，以及足够的器官功能定义为：a.心脏功能：通过超声心动图、放射性核素扫描或心脏MRI检查左心室射血分数[Left ventricular ejection fraction(LVEF)]≥40％；b.肺功能：室内空气的氧饱和度至少为90％，肺功能测试表明FVC和FEV1≥50％的预测年龄和cDLCO>预测的50％；c.肾功能：肌酐清除率测试(通过Cockcroft-Gault方程)≥40mL/min或肌酐<1.5mg/dL，d.肝功能：肝总胆红素<1.5X机构正常上限，肝转氨酶(ALT和AST)<3x机构正常范围上限；e.血液学：总白血液细胞(WBC)计数≥3000个/μL，绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1000个/μL，血小板计数≥75,000个/μL和血红蛋白≥8.0g/dL(如果异常是由于疾病相关的骨髓受累，可以免除)，和f.钙(仅适用于多发性骨髓瘤患者)：入组治疗前2周内校正钙<11.5mg/dL。

在一些实施例中，有资格的受试者应该能够在NAM-NK细胞输液之前至少3天停止泼尼松(prednisone)或其他免疫抑制药物(排除预备处方前药物)。可能要求性活跃的有生育能力的女性和有生育能力的伴侣的男性同意在疗法期间和完成疗法后的4个月内使用有效的避孕措施。

在一些实施例中，可从以下任何一项治疗的考虑排除受试者：

1.高滴度的供体特异性抗HLA抗体(MFI>1000)；

2.主动的、未经治疗的中枢神经系统受累(CNS involvement)；

3.慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，或高级别淋巴瘤(伯基特淋巴瘤/淋巴母细胞淋巴瘤((Burkittt’slymphoma/Lymphoblastic lymphoma))；

4.怀孕或哺乳期；

5.对于多发性骨髓瘤的受试者：生育期妇女必须在开始治疗后14天内(开始抗癌抗体给药前24小时)出现阴性血清或尿妊娠试验(最低敏感度25IU/L或HCG等效单位)；

6.QT/QTc间期的显着基线延长(例如证明QTc间隔大于500毫秒)；

7.II类或更高纽约心脏协会功能分类标准(附录III)或可能增加细胞因子疗法心脏并发症风险的严重心律失常(如室性心动过速、频繁的室性心律失常或需要慢性病程的室上性心动过速)；

8.需要免疫抑制疗法的活动性自身免疫性疾病；

9.重度哮喘病史，目前正在服用慢性药物(需要吸入类固醇的轻度哮喘病史符合条件)；

10.筛查胸部X光或胸部CT扫描时出现新的或进行性肺部浸润[除非经肺科专家批准进行研究。适当疗法1周后，归因于感染的浸润必须稳定/改善(伴有相关的临床改善)(推定或记录的真菌感染为4周)]；

11.活动性不受控制的细菌、真菌或病毒感染—所有先前的感染必须在最佳疗法后得到解决；

12.已知对本发明方法中使用的任何治疗剂过敏；

13.仅针对MM患者：在施用本发明的所述NK细胞组分之前2周内的先前放射疗法，4周内的手术或3周内的化疗疗法(美法仑(melphalan)为6周，或单克隆抗体)；

14.在开始用NK细胞组分治疗前14天内接受过研究药物；

在一些实施例中，根据以下准则选择NK细胞供体(例如，血液成分分离的候选物，鉴定为HLA-单倍相合或HLA-错配，相关或不相关)：

1.HLA-单倍相合或错配的相关供体/受体，基于A和B基因位点(至少2/4I类等位基因)的中间分辨率基于DNA的Class I分型的一最小值)和缺少(MFI≤1000)受体针对所选供体的抗HLA抗体；

2.12至70岁，应优先考虑年龄(<35岁)，其次是HLA匹配(单倍相合，如果没有则完全配错供体)；

3.至少40公斤体重；

4.由评估医疗提供者确定的总体健康状况良好；

5.足够的器官功能定义为：血液学：血红蛋白、WBC、血小板在正常测试范围上下限的10％以内(基于血红蛋白的性别)，肝脏：ALT<2x正常上限和肾脏：血清肌酐<1.8mg/dL；

6.完成供体传染病筛查小组，包括CMV抗体、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗体、丙型肝炎抗体、HIV PCR、HIV1/2抗体、HTLVA1/2抗体、Rapid Plasma(RPR)Treponema,Trypanosoma Cruzi(T.Cruzi)、HCV by NAT、HIV by NAT和WNV(West Nile Virus)或根据当前面板检测，必须对HIV和活动性乙型肝炎呈阴性；

7、未怀孕—有生育能力的女性必须在血液成分分离后7天内进行妊娠试验阴性；

8.能够并愿意接受血液成分分离；

9.自愿书面同意(如果供体<18岁，则使用同意书)。

在一些实施例中，有需要受试者接受清髓疗法或调理方案。在具体的实施例中，在移植或施用本发明的组合物之前、同时和之后，受试者经受清髓性或调理方案。清髓疗法或调理疗法可包括全身辐照(TBI)、免疫疗法和化学疗法及/或免疫抑制疗法。

在一些实施例中，本发明的组合物的移植或给药可作为其他治疗性措施或组合物的辅助或组合提供。

组合疗法

在一些实施例中，使用本文描述的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分结合额外的癌症疗法来治疗有需要的所述受试者。在一些实施例中，所述额外的癌症疗法包括一细胞毒剂及/或非细胞毒剂。一“细胞毒剂(cytotoxic agent)”是指抑制或防止细胞功能及/或导致细胞破坏的一种物质。所述术语旨在包括放射性同位素(例如¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re)、化疗试剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或合成毒素或其片段。一非细胞毒剂是指不抑制或阻止细胞功能及/或不引起细胞破坏的一种物质。一“非细胞毒剂(non-cytotoxic agent)”可包括可被激活为具有细胞毒性的药剂。一非细胞毒性剂可以包括一珠子、脂质体、基质或颗粒(参见，例如，美国专利公开第2003/0028071和2003/0032995，其通过引用并入本文)。此类药剂可以与本文所述一扩增CD3-耗尽NK细胞组分组合物相结合、耦合、连接或关联。

在一些实施例中，常规癌症药物与本文所述的组合物一起施用。在一些情况下，使用本文所述的扩增CD3-耗尽NK细胞组分与一或多种针对目标癌症细胞的其它药剂结合治疗有需要的所述受试者。高度合适的药剂包括那些在癌症细胞中促进DNA损伤的药剂，例如细胞DNA中的双股断裂。可以使用本领域技术人员已知的任何形式的DNA损伤剂。DNA损伤通常可以通过放射疗法及/或化学疗法产生。DNA损伤剂也称为基因毒性剂。如本文所用，“与…结合”是指将所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分与一或多种附加疗法同时(同时或分别但接近地)施用于一受试者，施用之前或在施用一或多种附加疗法之后。

放射疗法的例子包括但不限于外部放射疗法和内部放射疗法(也称为短距离放射疗法)。外部放射疗法的能量源包括X射线、伽马射线和粒子束，内部放射疗法中使用的能量源包括放射性碘(碘125或碘131)、锶89或磷、钯、铯、铟、磷酸盐或钴的放射性同位素。给予放射疗法的方法是本领域技术人员公知的。

可能特别有用的DNA损伤剂的例子包括但不限于：白消安(Busulfan，Myleran)、卡铂(Carboplatin，Paraplatin)、卡莫斯丁(Carmustme，BCNU)、氯丁酸(Chlorambucil，Leukeran)、顺铂(Cisplatin，Platmol)、环磷酰胺(Cyclophosphamide，Cytoxan，Neosar)、达卡巴嗪[Dacarbazme(DTIC-Dome)]、异环磷酰胺(Ifosfamide，Ifex)、洛莫司汀(Lomustme，CCNU)、二氯甲二乙胺(Mechlorethamme，氮芥，Mustargen)、美法仑(Melphalan，Alkeran)和甲基苄肼(Procarbazine，Matulane)。

许多其他化疗药剂也可以单独或组合用于本文所述的方法。这些包括：甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱(vincristine)、阿霉素、顺铂、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、葡甲胺GLA、戊柔比星(valrubicin)、卡莫司坦(carmustaine)聚苯丙生(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂(RAS farnesyl transferase inhibitor)、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美特索(Lometexol)、格拉莫莱克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、海康汀/拓扑替康(Hycamtin/Topotecan)、PKC412、瓦尔斯波达尔(Valspodar)/PSC833、诺凡酮/米托蒽醌(Novantrone/Mitroxantrone)、梅塔雷/苏拉明(Metaret/Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马米司他(Marmistat)、BB2516/马米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、吡巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星、梅斯特朗(Metastron)/锶衍生物、特莫代尔(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂质体(Evacet)/脂质体多柔比星、紫杉醇(Yewtaxan/Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol/Paclitaxel)、截瘤达(Xeload/Capecitabine)、氟铁龙/去氧氟尿苷(Furtulon/Doxifluridine)、Cyclopax/口服紫杉醇(oral paclitaxel)、口服紫杉醇(Oral Taxoid)、SPU-077/顺铂(Cisplatin)、HMR 1275/氟哌啶醇(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT[替加氟/尿嘧啶(Tegafur/Uracil)]、麦角咪唑/左旋咪唑(Ergamisol/Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、坎普托/左旋咪唑(Campto/Levamisole)、坎普托沙/伊立替康(Camptosar/Irinotecan)、图莫得斯/雷力崔斯(Tumodex/Ralitrex)、亮司他汀/克拉屈滨(Leustatin/Cladribine)、帕克斯/紫杉醇(Paxex/Paclitaxel)、多西尔/阿霉素脂质体(Doxil/liposomal doxorubicin)、凯利克斯/阿霉素脂质体(Caelyx/liposomal doxorubicin)、氟达拉(Fludara)/氟达拉滨、药红霉素/表柔比星(Pharmarubicin/Epirubicin)、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/双萘二甲酰亚胺(Bis-Naphtalimide)、凯利克斯/脂质体多柔比星、氟达拉滨、吉西他滨(Gemzar/Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘种子，CDK4和CDK2抑制剂，PARP抑制剂、D4809/右磷酰胺(Dexifosamide)，异环磷酰胺(Ifes/Mesnex/Ifosamide)，Vumon/替尼泊苷(Vumon/Teniposide)、对铂/卡铂(Paraplatin/Carboplatin)、植物醇/顺铂(Plantinol/cisplatin)、Vepeside/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、泰素帝/多西他赛(Taxotere/Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲类烷化剂，如马法兰(melphalan)和环磷酰胺、氨基谷乙酰亚胺(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、白消安(Busulfan)、卡铂(Carboplatin)、氯霉素(Chlorombucil)、顺铂(cisplatin)、盐酸阿糖胞苷(Cytarabine HCl)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、磷酸钠达霉素(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷[Etoposide(VP16-213)]、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶[Fluorouracil(5-FU)]、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(羟基脲)[Hydroxyurea(hydroxycarbamide)]、异环磷酰胺、干扰素Alfa-2a、Alfa-2b、醋酸亮丙瑞林[Leuprolide acetate(LHRH释放因子类似物)]、洛莫司汀[Lomustine(CCNU)]、盐酸甲氯乙胺[Mechlorethamine HCl(氮芥)]、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司纳(Mesna)、米托坦[Mitotane(o.p'-DDD)]、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine HCl)、链脲佐菌素(Streptozocin)、他莫昔芬柠檬酸盐(Tamoxifen citrate)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、硫替哌(Thiotepa)、硫酸长春碱(Vinblastine sulfate)、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、促红细胞生成素(Erthropoietin)、六甲基三聚氰胺[Hexamethylmelamine(HMM)]、白介素2、米托瓜松Mitoguazone(methyl-GAG；methyl glyoxal bis-guanylhydrazone；MGBG)、喷司他丁[Pentostatin(2'deoxycoformycin)]、司莫司汀[Semustine(methyl-CCNU)]、替尼泊苷[Teniposide(VM-26)]和硫酸长春地辛(Vindesine sulfate)，但不限于此。

此外，以下药剂也可用于本发明：烷化剂，例如卡铂和顺铂，氮芥烷化剂，亚硝基脲烷化剂，例如卡莫司汀[carmustine(BCNU)]，抗代谢药，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、亚叶酸(folinic acid)、p尿类似物抗代谢物、巯嘌呤(mercaptopurine)、嘧啶类似物抗代谢物，如氟尿嘧啶[fluorouracil(5-FU)]和吉西他滨[gemcitabine

]，激素类抗肿瘤药，如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)和他莫昔芬(tamoxifen)，天然抗肿瘤药，如阿地白介素(aldesleukin)、白介素-2、多西紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷[etoposide(VP-16)]、干扰素α、紫杉醇[paclitaxel

]和维甲酸[tretinoin(ATRA)]、抗生素天然抗肿瘤药，例如博来霉素(bleomycin)、达克霉素(dactmomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素和丝裂霉素(mitomycins)，包括丝裂霉素C，以及天然长春碱生物碱如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、羟基脲(hydroxyurea)、丙酮、阿霉素(adriamycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依西他滨(enocitabine)、表硫醇(epitiostanol)、阿柔比星(aclarubicin)、安西他滨(ancitabine)、尼莫司汀(nimustine)、盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)、卡波醌(carboquone)、卡铂(carboplatin)、卡莫氟(carmofur)、色霉素A3(chromomycin A3)、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺

裂叶多糖(Schizophyllan)、阿糖胞苷(阿糖胞苷)[cytarabine(cytosinearabinoside)]、达卡巴肼(dacarbazine)、硫莫辛(thiomosine)、噻替哌(thiotepa)、替加氟(tegafur)、多拉司他汀(dolastatins)、阿糖胞苷类似物如耳他汀(auristatin)、CPT-11[伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitozantrone)、长春瑞滨(vinorelbine)、替尼泊苷(teniposide)、氨基蝶呤(aminopterin)、卡霉素(carbomycin)、埃斯霉素[esperamicins(参见，例如，美国专利第4,675,187号，通过引用并入本文)]、新制癌素(neocarzinostatin)、OK 432、博来霉素(bleomycin)、呋土隆(furtulon)、溴舒定(broxundine)、白消安(busulfan)、二磷酸已烯雌酚四钠(honvan)、培普霉素(peplomycin)、贝他汀[bestatin

]、干扰素-0、美匹司坦(mepitiostane)、米托溴索(mitobromtol)、马法兰(melphalan)、香豆素肽(laminin peptides)、香菇多糖(lentinan)、云芝提取物(Coriolus versicolor extract)、替加氟/尿嘧啶(tegafur/uracil)、雌莫司汀(雌激素/甲氯乙胺)[estramustine(estrogen/mechlorethamine)]、沙利度胺(thalidomide)和来那度胺[lenalidomide

]。

其他合适的化疗包括蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂会阻障蛋白酶体的作用、降解蛋白质的细胞复合物的作用，尤其是那些参与细胞维持、生长、分裂和细胞死亡的短寿命蛋白质。降解蛋白质的抑制剂的例子包括硼托米布[bortomib

]、乳胞素[lactacystin(AG Scientific,Inc,San Diego,CA)]、MG132(Biomol International,Pmouth Meeting,PA)PS-519、埃坡霉素(eponemycin)、环氧酶素(epoxomicin)、阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、二肽苯甲酰胺(dipeptide benzamide)、CVT-617和乙烯基砜三肽蛋白酶体抑制剂。

在一些实施例中，本文描述的方法与一或多种其他癌症治疗结合使用，包括癌症免疫疗法。癌症免疫疗法是利用免疫系统来拒绝癌症。主要前提是刺激所述受试者的免疫系统攻击导致疾病的肿瘤细胞。这可以通过对受试者进行免疫化，在这种情况下，所述受试者自身的免疫系统被赋予将肿瘤细胞识别为要被破坏的目标物，或者通过治疗性的给药，例如抗体，作为药物，在这种情况下，通过所述治疗性的药剂会募集所述受试者的免疫系统来破坏肿瘤细胞。癌症免疫疗法包括基于抗体的疗法和基于细胞因子的疗法。

基于细胞因子的癌症疗法利用一或多种细胞因子来调节一受试者的免疫反应。可用于癌症治疗的细胞因子的非限制性示例包括干扰素-α(IFN-alpha)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)]和白介素-12(IL-12)。

为了促进肿瘤靶向和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在一些实施例中，可以将疾病特异性单克隆抗体结合(例如，在扩增之前、同时或之后)在此描述的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分且施用于有需要的所述受试者。增加的CD3-NK细胞类型。

适合与本发明的方法一起使用的单克隆抗体和扩增CD3-耗尽NK细胞组分和组合物、它们的癌症细胞靶标和一些目前指定用于它们的特定疾病在下表1中提供。

因此，在一些实施例中，所述恶性血液病是多发性骨髓瘤，一或多种MM特异性单克隆抗体(例如埃罗妥珠单抗)被施用于有需要的所述受试者。可用于本发明的方法的埃罗妥珠单抗的一示例性剂量是10mg/每公斤体重的受试者(病患)。其中所述恶性血液病为NHL，对有需要的受试者施用一或多种NHL特异性单克隆抗体(如利妥昔单抗)。用于本发明方法的利妥昔单抗的一示例性剂量为375mg/m²所述受试者(病患)。

在一些特定的实施例中，其中所述恶性血液病是一B细胞恶性肿瘤(例如淋巴瘤、白血病)，所述B细胞特异性单克隆抗体是一抗CD20单克隆抗体。在特别实施例中，所述抗CD20单克隆抗体为奥比妥珠单抗。给药和剂量排程通常随治疗的疾病、严重程度、患者特征和治疗反应而变化，由治疗医师监测(有关当前做法，请参见“drugs(dot)com”网站的“剂量”和“奥比妥珠单抗”)，但奥比妥珠治疗的典型剂量为每输液100至1000毫克。奥比妥珠单抗的示例性给药可以是，例如，对于CLL，六个28天的治疗周期，

周期1，第1天：4小时内以25毫克/小时的速度静脉注射(IV)100毫克；不增加输液速率；在第2天进展到900毫克IV，在第8天和第15天进展到1000毫克IV；以及在整个周期2-6中1000mg IV。

滤泡性淋巴瘤的示例性给药也基于六个28天的周期，整个剂量为1000毫克IV。关于奥比妥珠单抗的术前用药和辅助治疗的具体信息可在药物说明书、制造商处和“drugs(dot)com”网站的“剂量”和“奥比妥珠单抗”下获得。在具体的实施例中，为患有复发/难治性淋巴瘤的受试者(病患)提供了奥比妥珠单抗的组合疗法。

因此，根据本发明的一些实施例，提供了一种在有需要的一受试者中治疗一血液学疾病的方法，所述方法包括将奥比妥珠单抗施用于有需要的一受试者中，向所述受试者施用至少一免疫抑制剂，并移植一扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分到有需要的所述受试者中，其中所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分已按照本发明的方法，通过以营养素、血清、IL-15和烟酰胺进行体外培养而被扩增，特别是，烟酰胺的一量介于1.0mM至10mM之间，从而治疗所述受试者中的所述血液学疾病。在进一步的具体实施例中，所述方法还包括将IL-2施用于所述受试者。

在其他具体实施例中，本发明的方法进一步包含通过为所述受试者获得一CD3-耗尽NK细胞组分HLA-单倍相合或HLA-错配，来制备所述可移植的NK细胞组分以与所述抗CD20单克隆抗体组合使用，在允许细胞增殖的条件下体外培养所述CD3-耗尽NK细胞组分，所述条件包含提供1.0mM至10mM之间的营养素、血清、IL-15和烟酰胺，在所述体外培养之后8-10天为所述CD3-耗尽NK细胞组分补充新鲜的营养素、血清、IL-15和烟酰胺，以制造所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，体外培养后14-16天，收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，以及清洗和浓缩所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，从而制造用于移植到所述受试者的所述可移植的NK细胞组分。

在具体的实施例中，疾病特异性单克隆抗体治疗包含以三个剂量施用所述单克隆抗体：第一剂在施用(输液，移植)所述NK细胞组分前10天，第二剂在所述NK细胞组分施用(输液，移植)前三天，以及第三最后一剂在所述NK细胞组分施用(输液，移植)后11天，以及在一些实施例中，施用(输液，移植)最后(第二)NK细胞组分之后大约1周。在某些实施例中，在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的第一剂前9-11天、第一剂前3天和第一剂后11天施用所述疾病特异性单克隆抗体。

遵循输液、监测反应和毒性的标准指南，以进行单克隆抗体给药。埃罗妥珠单抗是通常与包括地塞米松(dexamethasone)、一H1阻滞剂如二苯海拉明(diphenylhydramine)、一H2阻滞剂如雷尼替丁(ranitidine)和对乙酰氨基酚(acetaminophen)的术前用药方案一起施用，然后再开始输液。

在一些实施例中，有需要的所述受试者在施用(输液、移植)所述NK细胞组分之前接受免疫抑制疗法的一制备方案。合适的免疫抑制剂包括但不限于烷化剂、p尿类似物、抗代谢物等。一些免疫抑制剂也被认为是化疗免疫抑制剂。在具体的实施例中，所述免疫抑制疗法包括给予环磷酰胺和氟达拉滨。可用于本发明方法的环磷酰胺的一示例性剂量为40mg/Kg受试者(病患)重量，以急用于本发明方法的氟达拉滨的一示例性剂量为25mg/m²的所述受试者(病患)。在具体的实施例中，环磷酰胺在施用(移植、输液)之前5天施用扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞，而在施用(移植、输液)所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞之前第5、4和3天的每一天施用所述氟达拉滨。或者，可以调整氟达拉滨和环磷酰胺的给药方式，使最后一剂的所述免疫抑制剂在NK细胞组分给药开始前2或3天完成。

根据本发明的方法，在一些实施例中，所述NK细胞组分以两剂的方式给药到有需要的受试者中。在具体的实施例中，施用所述NK细胞组分包含施用一第一剂扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分，然后两天后施用一第二剂的所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分。

在一些实施例中，用于施用于所述受试者(患者)的所述NK细胞组分包括1X10⁷个/kg至5X10⁸个/kg、2X10⁷个/kg至2X10⁸个/kg、5X10⁷个/kg至1X10⁸个/kg、或2X10⁷个/kg和5X10⁷个/kg的扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。在一些实施例中，组合的所述第一和所述第二剂NK细胞组分包括2X10⁷个/kg至2X10⁸个/kg总扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。在一些实施例中，所述第一剂与第二剂的所述NK细胞组分每个都包含1X10⁷个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，总剂量为2X10⁷个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞。在其他实施例中，所述第一剂与第二剂的所述NK细胞组分每一剂都包括5X10⁷个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，总剂量为1X10⁸个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞。在又一个实施例中，所述NK细胞组分的所述第一剂和第二剂每一剂都包含1X10⁸个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞，总剂量为2X10⁸个/kg的扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞。

NK细胞组分的施用通常作为一住院程序进行。这里描述的NK细胞组分的施用是通过输液，在具体的实施例中，NK细胞组分在所述可移植的NK细胞组分到达后1小时内注入到受试者(患者)中，并且不能更晚于所述被清洗及浓缩的扩增CD3-耗尽NK细胞组分的最终产物释放后的10小时。在特定的实施例中，在室温下保持所述被清洗和浓缩的扩增CD3-耗尽NK细胞组分，直至给药，并且在使用前不冷藏。

因此，在一些实施例中，在提供供移植的所述NK细胞组分之后不大于1小时，且在所述NK细胞组分的最终产物释放之后不大于10小时，对所述受试者施用所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分。在一些实施例中，所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分通过静脉输液方式对所述受试者施用，不使用一过滤器或泵，每次输液的一持续时间不少于15且不超过60分钟。

在一些实施例中，有需要的受试者在NK细胞组分施用之后接受白(细胞)介素2(IL-2)的一支持疗法。

在一些实施例中，IL-2在初始NK细胞组分给药(移植、输液)当天以6MU的一剂量皮下(SC)给药(对于患者体重<45公斤的患者，IL-2剂量为3MU/m²)，在第二NK细胞组分给药(移植、输液)当天及所述第二NK细胞组分给药(移植，输液)之后两天，共3剂。在一些实施例中，在所述NAM-NK细胞输液的当天，在NAM-NK细胞之后不早于4小时施用IL-2。在某些实施例中，前两剂IL-2作为所述NK细胞输液住院的一部分施用。第三剂IL-2剂量可以在一门诊情况中给药。因此，在特定的实施例中，IL-2施用包含在扩增CD3-耗尽NK细胞的输血后给药6X10⁶单位IL-2：

(i)在所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或错配的NK细胞的输血当日，以及

(ii)在所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或错配的NK细胞的输血之后两天，以及

(iii)four days输血of said在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞的输血的四天中。

此外，如果患者在使用第一剂或第二剂时经历了2级或更高级别的IL-2输液相关毒性，则IL-2的剂量可以保持长达48小时。如果毒性在48小时内消退到1级或更好，IL-2可以与所有计划的剂量一起给药；然而，剩余剂量的施用间隔至少为24小时。

在一些实施例中，受试者可以接受以下任何或所有：输液支持[例如二苯海拉明(diphenylhydramine)或右旋氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、氢化可的松(hydrocortisone)和对乙酰氨基酚(acetaminophen)]、支持性细胞因子(例如G-CSF)、需要的血液制品、抗病毒、抗细菌、PCP和/或真菌预防、CMV、EBV和HHV6监测和需要的IV免疫球蛋白。

在一些实施例中，受试者接受任何或所有的所述血液学疾病的额外治疗。所述治疗可以是一种治疗，选自由免疫抑制治疗、化学疗法和放射疗法所组成的一族群。

因此，在一些实施例中，提供了一种治疗有需要的受试者中的一血液学疾病的方法，所述方法包括：

(i)为所述受试者获得一CD3-耗尽NK细胞组分HLA-单倍相合或HLA-错配；

(ii)在允许细胞增殖的条件下体外培养所述CD3-耗尽NK细胞组分，其中所述条件包含提供一量介于1.0mM至10mM之间的营养素、血清、IL-15及烟酰胺；

(iii)在步骤(ii)后8-10天以新鲜的营养素、血清、IL-15及烟酰胺补充所述CD3-耗尽NK细胞组分，以制造一扩增CD3-耗尽NK细胞组分；

(iv)在步骤(ii)之后14-16天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分；

(v)清洗及浓缩步骤(iv)的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分，从而制造用于移植到所述受试者的一可移植的NK细胞组分；

(vi)向所述受试者施用一抗癌单克隆抗体；

(vii)向所述受试者施用至少一免疫抑制剂；

(viii)将步骤(v)的所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分移植到有需要的所述受试者；以及

(ix)向所述受试者施用IL-2，

从而治疗所述受试者的所述血液学疾病。

在一些实施例中，将所述NK细胞输液溶液储存在袋中直至在8-20℃下使用(例如，移植、输液)。在一些具体实施例中，所述NK细胞组分的移植(给药，输液)之前，在NK细胞移植当天对有需要的受试者进行一安全评估，通常包括体检、CBC、血液化学(例如至少血清肌酐、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和镁)、生命体征：体重、体温、血压、脉搏和呼吸频率，以及伴随药物的给药，包括红细胞RBC和血小板输血。

将所述扩增NK细胞组分输注到有需要的所述受试者是通过患者的中心静脉导管完成输液，受试者需受个人现场实践的限制。

本发明的治疗血液学疾病的方法可用于治疗恶性血液病，包括但不限于MM和NHL。本文所称术语“治疗一血液学疾病”或“治疗一恶性血液病”是指减轻所述血液学疾病的症状或体征。在一些实施例中，根据但不排他地根据症状随时间减轻、临床参数改善、住院减少和降低复发或死亡风险来评估血液学疾病或一恶性血液病的治疗。

在一些实施例中，当与未根据本文所述的方法培养和/或施用的NK细胞的输液相比时，本文所述的扩增NK细胞组分的输液增加了注入的NK细胞的成功体外扩增的可能性。在一些实施例中，在输液之后的第7天和第14天测量体内扩增的成功。

在其他实施例中，与未根据本文培养和/或施用NK细胞的输注相比，本文所述的扩增NK细胞组分的输液增加了所述受试者的外周血中的所述NK细胞的功能。在一些实施例中，在输液后第7天和第14天测量NK细胞的功能。

根据本发明方法的一些实施例，与未根据本文所述方法培养及/或施用的NK细胞的输液相比，本文所述的扩增NK细胞组分的输液增加了响应所述NK细胞组分的输液有利的疾病反应的概率。在一些实施例中，在输液后第28天和一年时测量NK细胞的功能。在具体实施例中，所述恶性血液病为NHL，NHL的疾病反应准则根据NHL国际工作组(InternationalWorking Group)响应准则来评估(详见Cheson等，J Clin Oncol 2014；32:3059-68。在更具体的实施例中，所述恶性血液病为MM，MM的疾病反应准则根据以下准则进行评估：

浆细胞白血病统一响应准则

严谨完全响应(sCR)：

除了CR(定义如下)之外，sCR还需要以下所有条件：

·通过流式细胞术检测骨髓中缺少的恶性血浆细胞

·通过流式细胞术检测外周血中缺少的恶性血浆细胞

·正常游离轻链比率[Normal free light chain ratio(FLC)]

完全响应(CR)：

CR要求下列全部：

在一骨髓穿刺(bone marrow aspirate)中少于5％血浆细胞

·外周血中缺少血浆细胞

·通过常规电泳和免疫固定检测血清及尿液中缺少原始单克隆副蛋白

·缺少髓外疾病

很好的部分豁免(VGPR)

VGPR要求下列全部：

·在骨髓穿刺中少于5％的血浆细胞

·外周血中缺少血浆细胞

·大于或等于90％降低血清单克隆副蛋白加副蛋白<100mg/24hrs²

·缺少髓外疾病

部分响应(PR)

部分响应要求下列全部：

·在一骨髓穿刺中介于5％与25％之间的血浆细胞

·外周血中介于1％与5％之间的血浆细胞

·大于或等于50％降低的血清单克隆副蛋白及降低24小时尿液中的单克隆副蛋白，通过大于或等于90％加上小于200mg/24hr³

·大于或等于50％降低髓外疾病的大小

病情稳定(SD)

不符合sCR、CR、VGPR、PR或疾病进展(定义见下文)准则的患者被视为疾病稳定(SD)：

·如果血清和尿液M蛋白(M-Protein)无法测量，则还需要正常的血清kappa/lambda FLC比率。

·如果血清和尿液M蛋白无法测量，则需要将涉及和未涉及的FLC水平之间在差异中的减少大于或等于90％，而不是M蛋白。

·如果血清和尿液M蛋白无法测量，则涉及和未涉及的FLC水平之间在差异上的减少需要大于或等于50％，而不是M蛋白。

进行性疾病

从CR或sCR的进展要求下列的一或多个：

·一骨髓穿刺中的血浆细胞增加>25％，或一绝对增加大于等于10％

·在外周血中的血浆细胞>5％绝对增加

·增加in the level of the所述血清单克隆副蛋白的水平增加>25％，一绝对增加大于或等于5g/L

·24小时尿蛋白电泳增加>25％，具有一绝对增加为至少200mg/24小时

·高钙血症(Hypercalcemia)

·溶骨病变明显增加

·髓外疾病的大小或数量明显增加

在一些实施例中，本发明的制品、组合物或套组进一步包括用于施用适合于移植到有需要的一受试者中的所述扩增NK细胞组分的说明书。

在本发明的制品、组合物或套组的一些实施例中，适于移植到有需要的受试者中的所述扩增NK细胞组分包括至少7X10⁸个总存活NK细胞。在一些实施例中，适合移植到有需要的受试者中的所述扩增NK细胞组分包括至少8X10⁸个总存活NK细胞、至少10X10⁸个总存活NK细胞、至少15X10⁸个总存活NK细胞，至少20X10⁸个总存活NK细胞或至少25X10⁸个总存活NK细胞。

可提供本发明所选择的细胞群体本身，连同含有相同成分的培养基，从培养基中分离，并与医药学上可接受的载体以及可促进细胞移植及/或器官功能的其他药剂组合(例如，免疫抑制剂、抗生素、生长因子)。因此，本发明的细胞群体可以在药学上可接受的载体或稀释剂中施用，例如无菌盐水和缓冲水溶液。此类载体和稀释剂的使用是本领域公知的。

如果需要，本发明的组合物可存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒或制品，其可含有一或多种含有活性成分(例如细胞)的单位剂型。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如一泡罩包装。包装或分配器装置可附有给药说明。包装或分配器装置还可以附有由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，通知反映了该机构对人用或兽医用组合物形式的批准行政。例如，此类通知可能包括美国食品和药物管理局批准的处方药标签或批准的产品插页。还可以制备包含配制在药学上可接受的载体中的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定病症，如上文进一步详述。

根据本发明的方法制备的细胞可以本身给药于所述受试者，也可以与合适的载体或赋形剂混合的一药物组合物给药。

如本文所用，一“药物组合物”是指本文所述的含有一或多种活性成分与其他化学成分例如生理学上合适的载体和赋形剂的一制剂。一药物组合物的目的是促进将一化合物施用于一生物体。

在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显着刺激并且不会消除所施用的生物活性和特性的载体或稀释剂。这些短语包括一佐剂(adjuvant)。

在本文中，术语“赋形剂”是指加入到一药物组合物中以进一步促进活性成分的给药的一惰性物质。药物的配制和给药技术可以在“Remington’sPharmaceutical Sciences”的最新版本中找到，Mack Publishing Co.,Easton,PA，在此全文引入作为参考。

因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其促进将活性成分加工成可药用的制剂。适当的配方取决于所选择的给药途径。

对于注射剂，所述药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，例如汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’ssolution)或生理盐水缓冲液。

适用于本发明上下文中的药物组合物包括其中含有一有效量的活性成分用以实现预期目的的组合物。更具体地说，一“治疗有效量”是指有效预防、缓解或改善一疾病(例如白血病、多发性骨髓瘤)症状或延长被治疗的受试者的生存。

确定一治疗性的有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

本文描述的活性成分的毒性和治疗性的功效可以通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。从这些体外和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可用于制定一系列用于人类的剂量。剂量可根据所采用的剂型和所采用的给药途径而变化。确切的配方、给药途径和剂量可由个别医师根据患者的状况选择(参见，例如，Fingl,E.等人(1975)，“The Pharmacological Basis of Therapeutics,"Ch.1,p.1.)。

根据待治疗病症的严重性和反应性，给药可以是单次或多次给药。一组合物的量将理所当然地取决于待治疗的受试者、痛苦的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。

如在本文中所使用的术语“约(about)”是指±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其词形变化意指“包括但不限于(including but notlimited to)”。

术语“由…组成(consisting of)”意指“包括且限于(including and limitedto)”。

术语“基本上由...组成(consisting essentially of)”意指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。

如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数参考，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。

在整个申请中，本发明的各种实施例可以一范围的形式被呈现。但应当理解的是，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明的范围的一硬性限制。因此，一范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及范围内的个别数值。例如，一范围的描述如“从1至6”应视为已经具体公开子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在所述范围内的个别数值，例如1、2、3、4、5及6。不论范围的宽广度皆适用。

每当本文指出一数值范围，其意在包括在指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。在第一指示数字和第二指示数字的短语“范围(ranging)/范围之间(rangesbetween)”，以及“范围(ranging)/范围从(ranges from)”一第一指示数字“到(to)”一第二指示数字，在本文中可互换地使用，并且意在包括所述第一和第二指示数字，以及其间的所有分数和整数。

如本文所使用的术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或很容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

可以理解的是，本发明的某些特征，为了清楚起见在分开的实施例的上下文中描述，也可以在单个实施例中被组合提供。相反地，本发明的各种特征，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述，也可以单独地或以任何合适的子组合，或如适用于本发明的任何其他描述的实施例提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不应被认为是所述实施例的必要特征，除非所述实施例在没有所述元件的情况下是无法作用的。

上文描述的和下文权利要求中所要求保护的本发明的各种实施例和方面在以下示例中得到实验支持。

示例

现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施例。

通常，本文中使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth inU.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III ColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"SelectedMethods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫试验，参见例如，美国专利第3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771及5,281,521号；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,andHiggins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and HigginsS.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"ImmobilizedCells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1,2,317,Academic Press；"PCRProtocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些都以引用方式并入，就像在此完全阐述一样。本文档中提供了其他一般参考资料。其中的程序被认为是本领域公知的并且是为了读者的方便而提供的。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。

材料和实验程序

血细胞样本和T细胞耗尽

在第0天，通过血液成分分离从健康供体中收集血液细胞。红血液细胞(RBC)通过使用ACK缓冲液(Gibco,Dublin,Ireland)清洗来裂解。根据制造商的建议，使用CliniMACS和CD3试剂(Miltenyi，273-01，Miltenyi Biotec Bergisch，Gladbach，Germany)将CD3+细胞耗尽。

体外培养：

CD3+耗尽NK细胞被接种在含有核苷(HyClone，South Logan，UT)的MEMa中，该MEMa含有庆大霉素[gentamicin(Octapharma，Lachen，瑞士)]、2mM L-谷氨酰胺[L-glutamine(Biologica industries)]、10％AB人类血清(Gemini Bio Products，West Sacramento,CA)，5mM烟酰胺和20ng/mL IL-15(Miltenyi，Gladbach，德国)。将280x10⁶个细胞接种在含有800mL培养基的G-REX100MCS细胞培养瓶(Wilson Wolf,St.Paul,MN)中，并在5％CO₂和37℃加湿培养箱中培育。在第8天，通过摇动烧瓶并将一半体积转移到新鲜的G-REX100MCS细胞培养瓶(Wilson Wolf)来分裂细胞群。每个G-REX100MCS培养瓶中加入400mL新鲜制备的培养基。在第14天，收获细胞并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Biological Industries，Israel)中用0.5％HAS(人类血清白蛋白)(Octapharma)清洗。在收获时，通过FCS Canto II(BD,SanJose,CA)评估，细胞悬液由>90％CD56+(clone B159,BD,San Jose,CA)细胞组成。

目标细胞：

BL2细胞系来自一名7岁男性伯基特淋巴瘤(Burkitt’s Lymphoma)患者，为CD20+。有关BL2细胞系的更多详细信息，请参阅cellosaurus(slash)CVCL1966下的expasy(dot)org网站。

BL2细胞在5％CO₂及37℃培养箱中培养，培养基为：RPMI1640(Biologicalindustries)、10％FBS、庆大霉素(Octapharma)、T瓶中的L-谷氨酰胺(BI)。细胞每周传代两次以达到～1x10⁶个细胞/mL。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)检测：

根据制造商的建议，以1:1的比例与先前用紫罗兰色CFSE(Invitrogen，ThermoFisher，Waltham，MA)标记的BL2细胞(靶细胞)一起孵育被收获的扩增NK细胞(效应子细胞)。NK和BL2细胞在有或没有抗CD20抗体的情况下在5％CO₂及37℃培养箱中共孵育3小时。在FCS Canto II(BD Biosciences)采集之前立即进行通过碘化丙啶(PI)(Sigma)染色对靶细胞的杀伤进行评估。用FACS DIVA软件(BD Biosciences)进行FACS数据分析，由NK细胞裂解的BL2细胞表示为来自总BL2 CFSE+细胞的双阳性(PI+/CFSE+)BL2细胞的百分比。

结果

示例I：烟酰胺改进在NK细胞上的Fc受体(CD16)表达

NK细胞表面Fc受体(FCgammaRIII)，也称为CD16，识别被抗体包覆的细胞，导致外周血NK细胞直接的细胞杀伤及细胞因子的产生。添加外生的烟酰胺(5mM)培养的NK细胞表面CD16的表达的FACS分析，表明CD3-/CD56+NK细胞群中的CD16表达丰富(见图1-CD56+/CD16+组分＝>75％)。

示例II：在以烟酰胺扩增的NK细胞中抗-CD20抗体依赖性细胞毒性(ADCC)

CD20是一种B细胞肿瘤表面标记物，对血液系统癌症(例如淋巴瘤和白血病)和B细胞自身免疫疾病的免疫疗法具有越来越大的临床意义。许多CD20靶向的单克隆抗体已被批准于临床使用。

本发明人先前已经表明(参见PCT公开WO 2011/080740)，添加外生的烟酰胺的培养物增强了培养物中的NK细胞增殖，并增强了NK细胞运动及增强迁移(CXCR4)、粘附(CD49e)和运输(CD62L)受体在培养的脐带血衍生NK细胞中的表达。

为了评估CD20介导的“细胞杀伤”功能对烟酰胺扩增NK细胞的功效，将用烟酰胺扩增的NK细胞与BL2(Burkitt’s Lymphoma cells,CD20+)和抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗和奥比妥珠单抗在一ADCC试验中一起培育。

虽然抗CD20抗体均介导了对BL2靶细胞的NK杀伤，但发现烟酰胺扩增的NK细胞与抗CD20单克隆抗体奥比妥珠单抗的组合远优于与利妥昔单抗组合。如图2A和2B所示，抗CD20单克隆抗体中任一种的存在显着增强了NK细胞毒性(细胞裂解通过基于PI染色的FACS分析测量)在测试的整个抗体浓度范围内(两个数量级-0.5至50.0ng/mL)。然而，在所有浓度下，奥比妥珠单抗对BL2细胞的CD20-介导的NK细胞毒性比瑞妥昔单抗(Retuximab)高3倍。

所有在此说明书中所述的公开刊物、专利以及专利申请案在此并入它们的全文于本说明书中，以供参照至每一个单一公开文件、专利或专利申请案所特定且单一指示于此并入参照的相同范围。此外，任何参照资料的援引文献或定义在此申请中不应被解释为承认这个参照资料可作为本发明的已知技术。关于其章节标题被使用的情况下，不应被解释为必要的限制。此外，本申请的任何优先权文件在此以其全文引用的方式并入本文。

Claims

1.一种治疗有需要的一受试者的一血液学疾病的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

(a)向所述受试者施用奥比妥珠单抗；

(b)向所述受试者施用至少一免疫抑制剂；

(d)向所述受试者施用IL-2，

从而治疗所述受试者的所述血液学疾病。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受试者及所述NK细胞组分是一人类受试者及一人类NK细胞组分。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述免疫抑制剂是一化疗免疫抑制剂及/或辐照。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血液学疾病是一恶性血液病。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血液学疾病是一CD20-阳性淋巴恶性肿瘤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血液学疾病是一多发性骨髓瘤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多发性骨髓瘤以下列至少一个为特征：

(a)在第一次自体干细胞移植后2至18个月之间的复发疾病；

(b)在没有主动移植物抗宿主病的证据下，异体干细胞移植后至少4个月的复发疾病；

(c)在至少两条线的疗法之后的复发/难治性疾病，所述疗法包括蛋白酶体抑制剂及一免疫调节药物；

(d)血清IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白M-protein大于或等于0.5g/dL；以及

(e)尿液M-protein大于或等于200mg/24小时收集量。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血液学疾病是非霍奇金淋巴瘤NHL。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述非霍奇金淋巴瘤是CD20阳性B细胞NHL。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述非霍奇金淋巴瘤以下列至少一个为特征：

(a)传统性疗法失效的复发/难治性疾病；

(b)在自体干细胞移植之后至少60天的复发疾病；

(d)大于或等于1.5厘米直径的可测疾病。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：执行所述步骤(a)三次。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(c)包含施用所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的一第一剂，接着2天后施用所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的一第二剂。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：执行所述步骤(a)三次：在所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分的所述第一剂之前9-11天、在所述第一剂之前3天以及在所述第一剂之后11天。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NK细胞组分包含介于1X10⁷个/公斤及5X10⁸个/公斤的扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述结合的所述第一剂和所述第二剂包含2X10⁷个/公斤至2X10⁸个/公斤的总扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞。

16.如权利要求12所述的方法，其特征在于：

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在提供所述组分用于移植之后不大于1小时且在所述组分释放最终产物之后不大于10小时将所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分施用于所述受试者。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于：通过不具有一过滤器或泵的输液，将所述扩增CD3-耗尽单倍相合或错配的NK细胞组分施用于所述受试者，持续不小于15分钟且不大于60分钟的一持续时间。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述至少一免疫抑制剂包含环磷酰胺及/或氟达拉滨。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(d)包含在所述扩增CD3-耗尽NK细胞的输血之后施用6X10⁶单位的IL-2：

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包含所述可移植的NK细胞组分通过以下步骤准备：

(b)在允许细胞增殖的条件下进行体外培养所述CD3-耗尽NK细胞组分，其中所述条件包含提供介于1.0mM至10mM之间的一量的营养素、血清、IL-15以及烟酰胺；

(e)清洗并浓缩步骤(d)的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分；

从而制造一可移植的NK细胞组分以供所述受试者移植。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述CD3-耗尽NK细胞组分来自血液成分分离。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述体外培养缺乏一饲养层。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述血清是人类血清。

26.如权利要求22所述的方法，其特征在于：允许细胞增殖的所述条件包含提供10％的人类血清。

27.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述IL-15包含20ng/ml的IL-15。

28.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述烟酰胺包含5.0mM烟酰胺。

29.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述营养素包含最小必要细胞培养基。

30.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述NK细胞组分来自一HLA-单倍相合或HLA-错配的供体，具有至少：

(a)HLA以中间分辨率匹配于至少2/4的1类等位基因的A和B基因位点的基于DNA的Class 1分型；以及

(b)缺少受体供体-特异性的抗-HLA抗体，即MFI<1000。

31.如权利要求22所述的方法，其特征在于：步骤(a)的所述NK细胞包含至少40至90％的CD56+/CD3-细胞。

32.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述步骤(d)的收获包含在所述步骤(b)之后14天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的一第一部分，以及在所述步骤(b)之后16天收获所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的一第二部分。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于：所述第一部分包含大约50％的所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分以及所述第二部分包含所述扩增CD3-耗尽NK细胞组分的剩余部分。

34.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述步骤(e)产生的所述被清洗及浓缩的扩增NK细胞组分以下列参数为特征：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

35.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述步骤(b)的所述培养是在每个烧瓶有200至300X10⁶个细胞的多个烧瓶中受影响。

36.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分以下列参数为特征：

(a)至少70％CD56+/CD3-细胞；

(b)至少70％活性；

(c)少于5.0X10⁵个CD3+细胞/每公斤病患体重，输液时；

(d)不多于5EU内毒素/每公斤病患体重，输液时；以及

(e)无革兰氏阳性微生物。

37.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在一氟化乙烯丙烯培养袋内提供所述扩增CD3-耗尽HLA-单倍相合或HLA-错配的NK细胞组分。