JP2012521215A - Nk細胞の増殖 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養および免疫療法、特に、治療に使用するためのナチュラルキラー細胞(以下、NK細胞と記す)およびナチュラルキラー様T細胞(以下、NKT細胞と記す)細胞の大規模増殖および同時活性化に関する。該細胞を、閉鎖型自動化培養システム、例えばバイオリアクターを用いて増殖させる。
癌に対する細胞免疫療法の使用は、1980年代半ばにリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞が導入されて以来、徹底して調査されている(Grimm EA. et al., 1982; Rosenberg S., 1985)。
本発明は、細胞治療薬として使用されるべき、NK細胞およびNKT細胞の大規模増殖および同時活性化のための閉鎖型システムに関する。特に、本発明は、表現型CD3−CD56+のNK細胞および表現型CD3+CD56+のNKT細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖細胞が、同一または類似の条件下で、例えばフラスコのような常套法を用いて培養された細胞と比較して、増加した細胞傷害性を示す方法を開示する。本発明の方法は、発明の詳細な説明、非限定的実施例および特許請求の範囲にさらに開示され得る。
本発明を記載する前に、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物でのみ限定され得るから、本明細書で用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的でのみ用いられ、限定すべきことを意図しないことが、理解されるべきである。
1.末梢血由来のNK細胞およびNKT細胞のエクスビボ増殖
材料および方法
末梢血単核球細胞(PBMC)のサンプリングおよび単離
バフィーコート、末梢血および血液成分(apheresis product)を、Karolinska University Hospital, Huddingeの血液バンクに登録された健常なドナーまたはMM患者から得た。実験プロトコールは、倫理委員会の承認を得た。
全てのシステムに関して、5%ヒト血清(Biowhittaker−Cambrex, Walkersville, MD, USA)および500U/ml rhIL−2(Proleukin(商標), Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ, USA)を添加したCellGro SCGM血清不含有培地(CellGenix, Freiburg, Germany)を増殖培地として用いた。培養開始時、培地に、モノクローナル抗CD3抗体(Orthoclone OKT−3, Ortho Biotech, Raritan, NJ, USA)を終濃度10ng/mlでさらに添加した。全細胞数を、培養0日、5−6日、9−10日、14−15日および21日目にトリパンブルー色素を用いて細胞を染色して評価した。最終製品を、安全性、純度および同一性(細胞生存能および表現型)について評価した。細胞の絶対数を、全細胞数とフローサイトメトリー(BD FacsCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)により決定されたこれらの亜集団の割合を乗ずることにより計算した。
細胞培養フラスコ中での細胞傷害性細胞の増殖のための培養条件は、健常な個体由来のPBMC(Carlens S. et al., 2001)に対して予め最適化した。簡単には、PBMCを、T25フラスコ(TPP, Trasadingen, Switzerland)中で、初め0.5x106細胞/mlの濃度で培養した。5日後、培養を、培養が終了するまでの間、5%ヒト血清およびIL−2(500U/ml)を含むがOKT−3を含まない新鮮な培地を2−3日毎に補充して行った。細胞増殖の接触阻止を阻止するため(Heiskala M. et al., 1987)、細胞を、より大きなフラスコ(T75 または T150: TPP, Trasadingen, Switzerland)に移すか、または必要なとき、複数のフラスコに移した。培地の補充において、細胞濃度を、10日目までは0.5x105細胞/mlに、10日目以降は1x106細胞/mlに合わせた。時には、細胞の一部を、扱いやすいフラスコ数に維持するために凍結した。
Waveのバイオリアクターは、温度およびCO2が制御された、振とう加熱プラットホーム上に置く使い捨ての滅菌バッグ内で細胞を増殖させる細胞培養システムである。発明者らは、Waveのバイオリアクターシステム 2/10 (GE Healthcare, Somerset, NJ, USA)を用いた。このシステムでの本発明者らの以前の結果は、低容量および少数の細胞で培養を開始したとき不十分な効率を示した。しかし、ドナーの末梢血サンプル中の細胞数は、該バイオリアクターで直接培養を開始するのを可能にしない。故に、本発明者らは、最初の最適化実験においてフラスコ中で培養を開始し、十分な細胞数に達した時点のおよそ5日目に該細胞をバイオリアクターに移した。この日のバイオリアクター培養は、800ml中に、2x106細胞/mlで開始した。
Vuelife(商標)(American Fluoroseal Corporation, MD, USA)は、生物学的、免疫学的および化学的に不活性なフッ素化エチレン−プロピレン製の滅菌細胞培養バッグである。それは、高度にガス透過性であり、光学的に透明である。Vuelife バッグ中での培養を、72mlのVuelife バッグを用いて、培地60ml中に5x105細胞/mlで開始した。該バッグを、37℃および5%CO2で加湿インキュベーター中でインキュベートした。新鮮な培地を2−3日毎に添加して、10日目まで1x106細胞/mlの濃度に調節し、10日目以降、2x106細胞/mlの濃度に調節した。必要なとき、細胞をより大きなバッグに分割した。
表現型の分析
材料および方法
細胞の表現型および亜集団の割合を、CD3、CD14、CD19、CD45およびCD56に対するmAbsと結合した蛍光色素を用いて、標準法により、培養0日目、5−6日目、9−10日目、14−15日目および20日目にフローサイトメトリーによって分析した。
材料および方法
最終産物の細胞傷害能を、K562細胞に対する標準的な4時間の51Cr−放出アッセイを用いてインビトロで評価した(Aktas E. et al., 2009; Alter, G. et al., 2004)。簡単には、K562標的細胞を、37℃で1時間かけて100μCiの51Crで標識し、PBSで2回洗浄し、RPMI培地に再懸濁した。100μlのRPMI培地中、全量3x104の標的細胞を、V底型の96ウェルプレートにトリプリケートで播種し、エフェクター:標的比が1:3ないし10:1となるよう適当な濃度で100μlのエフェクター細胞と共に4時間インキュベートした。上清のアリコートを、Packard Cobra Auto−Gamma 5000 Series Counting System (Meridien, CT, USA)を用いてカウントした。特異的な51Cr放出の割合を、式に当てはめて計算した:特異的放出割合=[(実験による放出−非特異的放出)/(最大放出−非特異的放出)]x100。
増殖産物を、丸底96ウェルプレート中で、37℃および5%CO2で6時間、終量200μl中に1:1比でK562標的細胞と共にインキュベートした。蛍光色素結合抗CD107a mAbまたは対応するIgG1イソ型対照を、アッセイの開始時に添加した。1時間、共にインキュベーション後、Monensin (GolgiStop, Becton Dickinson)を、1:100希釈して添加した。表面染色を、抗CD3および抗CD56 mAbsと共に氷上で30分間インキュベートして行った。その後、細胞を洗浄し、PBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで直ちに分析した。
データ分析、グラフの作成および統計比較を、GraphPad Prism ソフトウェア(GraphPad Software Inc. CA, USA)を用いて行った。
細胞培養バッグおよびバイオリアクターのNK細胞増殖に関する評価
NK細胞の増殖に関して閉鎖型培養システムを利用する試みにおいて、本発明者らは、初めに、5名の健常なドナー由来のPBMCを用いて、細胞培養バッグとフラスコを比較した。図1Aは、増殖期の最後での各ドナー由来のバルク細胞ならびにNKおよびNKT細胞の増殖倍率を示す。平均バルク細胞増殖は、バッグにおいて530倍であり、一方、フラスコにおいて平均1100倍の増殖が得られた。バッグ中でのNK細胞増殖は、とりわけ、5名中3名のドナーで、フラスコでの培養と比較したとき有利に見えた。しかしながら、最終産物中のNK細胞の割合を考慮したとき(図1C)、バッグ中での増殖は、フラスコ中での増殖と相関せず、培養終了時点でより低いNK細胞純度となり得ることが分かった。バッグ中の最終産物は、NK細胞を平均31%含み、一方で、フラスコの最終産物中のNK細胞割合は53%であった。
増殖法へのバイオリアクターの使用可能性を明らかにした後、本発明者らは、0日目からバイオリアクターで直接培養を開始するために、血液成分または末梢血全体を用いるcGMP条適合件下で、バイオリアクターでの増殖法の検討を継続した。2名の健常なドナーおよび2名のMM患者由来のPBMCを、この検討で用いた。比較のために、出発物質であるPBMCを、フラスコを並行して用いて増殖させた。図3は、バイオリアクターおよびフラスコ中の全てのドナーについてのバルク細胞およびリンパ球サブ集団の増殖曲線を示す。達した全細胞数は、バイオリアクター増殖で非常に多く、平均37.5%純度であるが、フラスコでは43%純度であった。NK細胞純度はバイオリアクターでわずかに低かったが、達したNK細胞の最終的な数は、癌の免疫療法設定における増殖したNK細胞の臨床使用を容易にするのに十分である。
上記の実験において、増殖をフラスコで開始し、その後バイオリアクターに移したとき、本発明者らは、フラスコでの増殖と比較して、最終産物の細胞傷害能および表現型に相違を検出しなかった。興味深いことに、発明者らは、バイオリアクターで直接増殖を開始したとき、K562細胞に対する最終産物の細胞傷害活性が、4名中3名のドナーで、フラスコで増殖させた最終産物と比較して顕著に高かったことを見いだした(図4A)。この現象をよく調べるために、本発明者らは、K562細胞に対する脱顆粒アッセイを行い、各リンパ球サブ集団中の脱顆粒細胞の割合を測定した(図4B)。驚くことに、本発明者らは、バイオリアクター増殖からのNK細胞画分にて観察される脱顆粒の程度が、4名全てのドナーにおいてフラスコ増殖からのNK細胞よりも顕著に高いことを見いだした。同様に、NKT細胞画分の脱顆粒は、4名中3名のドナーで顕著に高かった。纏めると、これらの結果は、バイオリアクターで行われる増殖法が、NK細胞の細胞傷害能を上げる点で、より良いことを示唆する。
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US 10/242,7881
Claims (25)
- 表現型CD3−CD56+のNK細胞および表現型CD3+CD56+のNKT細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖および活性化を閉鎖型システムで行い、得られた増殖細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す、方法。
- −細胞を、血清、インターロイキン−2(IL−2)および抗CD3抗体を添加した増殖培地を含む閉鎖型システムに加え;
−該システム内の細胞を、増殖した細胞集団の少なくとも35%が活性化NK細胞およびNKT細胞を含むまで振盪および加熱しながら増殖させる(ここで、該増殖した細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す。)、
手順を含む、請求項1記載の方法。 - 振盪および加熱を、約36℃ないし約40℃の温度;約4.7ないし約5.1%のCO2濃度;および、細胞が閉鎖型細胞システムの表面に接着する速度および角度でゆっくりと振盪するという条件下で行う、請求項2記載の方法。
- 振盪を、約4−8/分の振盪速度で行う、請求項2記載の方法。
- 振盪を、約4−8°の振盪角度で行う、請求項2記載の方法。
- 増殖を、全細胞数が、少なくとも約10倍に増殖するまで行う、請求項2記載の方法。
- 増殖を、増殖細胞集団の少なくとも約50%が、活性化NK細胞およびNKT細胞それぞれを含むまで行う、請求項2記載の方法。
- 細胞サンプルが、末梢血、細胞株、またはサイトカインで刺激した末梢血サンプルである、請求項1−7のいずれか一項記載の方法。
- 細胞サンプルが、末梢血単核球細胞(PBMC)である、請求項8記載の方法。
- 閉鎖型細胞システムに最初に添加される細胞濃度が、約0.5x106ないし約2x106/ml増殖培地である、請求項2記載の方法。
- 1日当たり、全培養量の約50%に相当する量の血清およびIL−2を含む培地を添加し、閉鎖型細胞システムからほぼ同量の増殖培地を捨てる工程を含み、該工程を、全細胞密度が、初期細胞密度の少なくとも約50%増加したときに行う、請求項1−10のいずれか一項記載の方法。
- 細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約300%増加したときに請求項11記載の工程を繰り返すが、全培地量の約75%を添加および破棄することを含む、請求項11記載の方法。
- 細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約500%増加したときに請求項11記載の工程を繰り返すが、全培地量の約100%を添加および破棄することを含む、請求項11記載の方法。
- 細胞を少なくとも約10日間インキュベートする、請求項1−13のいずれか一項記載の方法。
- 閉鎖型細胞システムが予め滅菌したバッグである、請求項1−14のいずれか一項記載の方法。
- 閉鎖型細胞システムがバイオリアクターである、請求項1ないし15のいずれか一項記載の方法。
- 血清が、ヒト血清および自家血清からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 培地に、約50ないし約1500U/mlのIL−2、約1ないし約50ng/mlの抗CD3抗体および約1ないし約40%血清を添加する、請求項2記載の方法。
- 細胞サンプルを、健常な対象から採取する、請求項1ないし19のいずれか一項記載の方法。
- 細胞サンプルを、腫瘍を有する対象から採取する、請求項1ないし19のいずれか一項記載の方法。
- 腫瘍が、血液系腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 細胞が、主に、表現型CD3−CD56+のNK細胞である、請求項1−21のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1−21のいずれか一項記載の方法により得られる、表現型CD3−CD56+のNK細胞および表現型CD3+CD56+のNKT細胞の懸濁液。
- インビトロ細胞傷害性試験により決定される通り、フラスコ中で増殖した細胞と比較して増加した細胞傷害性を示す、表現型CD3−CD56+のNK細胞および表現型CD3+CD56+のNKT細胞の懸濁液。
- 増殖した細胞集団の少なくとも35%、好ましくは少なくとも50%が活性化NK細胞を含む、表現型CD3−CD56+のNK細胞および表現型CD3+CD56+のNKT細胞の懸濁液。
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