JP2023522326A - 条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む人工多能性細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、条件付きで不死化可能な、細胞、例えば、成体幹細胞から形成される人工多能性幹細胞に関する。特に、本発明は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む幹細胞株から形成される人工多能性幹細胞、およびそれらの人工多能性幹細胞の後代、例えば、造血系の細胞に関する。人工多能性幹細胞、それらの多能性細胞由来の造血後代細胞、それらの細胞を含む組成物、それらの細胞のすべてを生成する方法、およびそれらの細胞のすべての使用も記載されている。

Description

本発明は、条件付きで不死化可能な、細胞、例えば、成体幹細胞から形成される人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)に関する。特に、本発明は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む細胞から形成される人工多能性幹細胞、およびそれらの人工多能性幹細胞の後代、例えば、造血系の細胞に関する。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、生体に見られるあらゆる細胞タイプに分化できる特性である多能性の特性によって定義される。これらは、初期胚（胚盤胞、受精後およそ６．５日）の内部細胞塊由来の胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ならびに特定の転写因子のトランスダクションおよび外因性発現により体細胞を多能性表現型にリプログラミングすることによって形成される人工多能性細胞（ｈｉＰＳＣ）を含む。

多能性にリプログラミングすることができるような転写因子の基本セットがＯＫＳＭ（ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ－ＭＹＣ）として知られているが、Ｏ、Ｋ、ＳもしくはＭの代わりになり得るか、またはリプログラミング、確率過程が生じる効率を調節することができる他の因子も知られている。

一般に、低継代一次細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形成するリプログラミングのための好ましい基体となる。そのような細胞は、より高継代の細胞よりも速く分裂する傾向があるという利点を有し、非分裂細胞はリプログラミングを受けにくい。これらはまた、正倍数体である可能性が高い。成体幹細胞（ＡＳＣ）も多能性にリプログラミングするための有望な基礎をもたらし、リプログラミング因子（例えば、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４）の内因性発現および（多／複）能性と関連するよりオープンなクロマチン構造のため、より少数の転写因子およびより穏やかなリプログラミング事象のみを必要とする場合が多い。

一次細胞よりむしろ不死の哺乳動物細胞から形成されるｉＰＳＣのいくつかの例（一般にＥＢＶ不死化血液細胞）が存在する。そのような細胞は、一般にＥＢＶまたはがん遺伝子、例えば、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原の安定なゲノムの組み込みによって不死化されるため、その臨床的有用性は不確実である。例えば、２９３ＦＴ細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定して発現し、リプログラミング転写因子のトランスフェクション時に表現型が変化するが、これは、真のｉＰＳＣよりもむしろ異常なコロニーを形成する。国際公開第２０１４／１８６７６６号パンフレットは、不死化体細胞からｉＰＳＣを形成する別の例について記載しており、ここでは、体細胞は、ＣＭＶ－ｈＴＥＲＴの感染によって不死化され、体細胞自体は、ｉＰＳＣから分化させられた。同様に、中国特許出願公開第１１０６２８８２１号明細書は、早老ウェルナー症候群の患者から採取した線維芽細胞からｉＰＳＣを作り出す方法について記載しており、ここでは、採取された線維芽細胞のｈＴＥＲＴ不死化は、疾患のインビトロ研究のためにこうした患者のｉＰＳＣの集団を形成するために使用される。

したがって、そのような不死化細胞由来のｉＰＳＣ株は、一般に、疾患モデリング、薬物の発見および発生的研究などのインビトロ用途に限定される。

さらに、Ｓｋｖｏｒｔｓｏｖａらによる研究（Oncotarget, 2018, Vol.9 (No.81), pp35241-35250）は、不死化マウス線維芽細胞株が多能性状態へのリプログラミングに不応性であること、および不死化と関連する異数性およびインビトロ選択がそのような不応性の原因ではなさそうであることを報告している。したがって、多能性状態へのリプログラミングに適した細胞を特定しようとする場合、重大な技術的課題があり、少なくとも一部の不死化細胞はリプログラミングに対して不応性である。

多能性幹細胞は、安定であり、インビトロにおいて無制限に培養され得る。しかしながら、その奇形腫形成の能力などの臨床用途に対する課題および大半の分化プロトコルが所望のエンドポイントに対して１００％未満の分化をもたらすという問題がある。したがって、治療用集団において残存する多能性細胞からの奇形腫形成の型式上のリスク、および望ましくない細胞タイプを患者にともに移植する問題が依然としてある。そのような望ましくない部分集団は、治療の効率の低下だけであっても、不明確または負の影響がある可能性もある。これは、所望の治療用細胞タイプが、多くの場合、慢性または急性の減少が患者における病状の原因となる高分化細胞タイプではなく、むしろ、患者の適した組織において最終の細胞タイプを生じる後期組織前駆細胞／成体幹細胞集団であるという事実によって悪化する。後期前駆細胞集団は、インビトロ培養では安定でない場合が多いため、上記の純度問題に加えて、理論において多能性細胞からのその生成が事実上無制限であっても、臨床的使用に許容できるレベルの純度でのスケーラブルな生成は少なからぬ課題である。

そのような前駆細胞集団はまた、一般に取り扱いが非常に難しい。それらの細胞が移植に先立って患者または別の人のいずれかから単離される場合（例えば、骨髄細胞）、材料の非常に制限された利用可能性、両人が同時に同じ場所での操作に応じられる要件、適した（例えば、免疫適合性の（immunocompatible））ドナーが得られること、細胞の混合集団、移植される材料純度およびＱＣの欠如のすべてに関連する困難がそのような処置の一般化を制限するのに寄与する。理論上は、ｈｉＰＳＣなどのｈＰＳＣを分化させることによってそのような細胞集団を形成する可能性は、そのような問題を改善するであろうが、その他の課題を提示する。重要な点として、前駆細胞集団は、インビトロで取り扱うのが難しく、時間とともに安定でなくなる。したがって、その均一でＧＭＰに準拠したスケーラブルな生成は、ＧＭＰ（医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則）品質のｉＰＳＣが利用可能であっても、一般に不可能である。大半の分化プロトコルは、１００％の効率ではないため、汚染部分集団が治療用細胞集団に存在する可能性がある。

特に、治療用途の造血系の細胞が特に対象となる。造血系（haematopoietic system）は、感染症またはがんに対する自然および獲得免疫の両方、血液凝固ならびに赤血球の産生を含む、さまざまな機能を有する細胞タイプの大きな群からなる。これらの細胞タイプのすべては、最終的に骨髄に存在する多能性(multipotent)の成体幹細胞タイプ（ＡＳＣ）である造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する単一の系列を含む。造血系細胞は、がんに対する免疫療法ならびに自己免疫疾患、貧血、および外傷の処置を含む、さまざまな状態に対する治療薬として有用である。

造血系の細胞は、さまざまな状態に対する治療として使用される。これらとしては、抗腫瘍治療薬としてのキラー細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、おそらく特に腫瘍細胞を標的とする遺伝子操作したレセプターをもつキラー細胞（例えば、キメラ抗原レセプターＴ細胞）、自己免疫性障害の処置のためのＴ－Ｒｅｇ、ならびに血小板、例えば、特定のがん患者または外傷患者などの凝固障害のある患者のための血小板、赤血球、例えば、貧血の処置および戦場または外傷医療のための赤血球、ならびにがんを含むさまざまな状態の処置のため、または抗体の産生のためのＢリンパ球、がんの処置のための樹状細胞（例えば、プロベンジ（シプロイセルＴ））ならびにその他の使用が挙げられる。これらの細胞タイプのすべては、造血系の一部を含み、最終的に造血幹細胞、ＨＳＣに由来する。ＨＳＣは、骨髄のニッチに存在する希少な細胞タイプであり、例えば、がんに対する放射線療法処置後の致命的な放射線を受けた（完全に免疫系が除去された）動物の免疫系を再構成する能力によって定義される。これらは、表面レセプターＣＤ３４およびＫＩＴ（ＣＤ１１７）などのタンパク質マーカーの存在、ならびにＴ細胞レセプターなどの成熟造血性マーカーおよびＢリンパ球によって成熟した抗原特異的抗体分子を産生することができる再構成された遺伝子座の両方の不在によって特定することができる。

ＨＳＣの臨床利用は些細なことではない。これは、成人では希少で、インビトロで単離するのが難しく、一般に増殖速度が遅い。能力がさまざまなＨＳＣのいくつかのサブタイプがあることが知られているが、すべてが易感染性生物の免疫系を完全に再構成することができる訳ではないようである。

したがって、ＨＳＣは、ある範囲の疾患の処置に有用な、治療に有用な製品を形成するメディエーターとしておよび調査ツールとして有用な広い範囲の造血系細胞を形成することができる。ＨＳＣは、自家療法をもたらすために患者特異的なソースから形成することができ、あるいは（任意のまたは広い範囲の患者を処置するための）同種異系細胞療法として使用するために単一の細胞株が発生させられる場合、同種異系の人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）から形成されてもよい。しかしながら、今までＨＳＣは、有意な数および純度で患者から単離するのが難しく、その後も、生物の外で安定な形態で回収および維持するのが難しかった。安定で増殖可能なＨＳＣあるいはそのようなＨＳＣの系列依存的な分化した後代を、単一の安定で増殖可能な細胞系または細胞株として維持するのが望ましいであろう。これは、免疫療法をもたらすため、ならびに処置におよび調査ツールとして使用するための生物製剤のための産生細胞として商業的および臨床的に有益であろう。今までそのような細胞株は、広範囲にわたる努力にもかかわらず、ｉＰＳＣからそのようなものをなかなか形成できないことがわかった。

臨床的有用性を有する幹細胞、特に、造血系の幹細胞を形成することに対するニーズが依然としてある。

本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術が、条件付き不死化細胞、特に、条件付き不死化幹細胞からｉＰＳＣを形成することによって改善され得るという驚くべき認識に基づくものである。本発明の特定の態様において、ｉＰＳＣは、その後、造血系に向けられる。したがって、いくつかの態様は、条件付き不死化カセットをもつ哺乳動物のｉＰＳＣ、例えば、ＣＴＸ－ｉＰＳＣから造血幹細胞を形成し、任意にこれらのＨＳＣをさらに特定の運命、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞または好中球に向かう系列にさらに分化させる方法に関する。

本発明の第１の態様は、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む人工多能性幹細胞を提供する。制御可能な導入遺伝子は、一般に人工多能性幹細胞由来の下流の（より分化した）細胞を条件付きで不死化することができる。こうした下流の細胞は、一般に造血系の細胞である。こうした下流の細胞は、そうでなければ取り扱うのが難しいこともあるため、条件付き不死化導入遺伝子の存在が改善点である。

特定の実施形態において、造血系の細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋造血幹細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＣＤ５６^ｈｉｇｈＣＤ１６^±ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｌｏｗＣＤ１６^ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、骨髄系樹状細胞、プラズマ細胞様樹状細胞、または好中球であってもよい。

いくつかの実施形態において、造血系の細胞は、ＣＤ４９ＦおよびＣＤ９０も陽性で、マーカーＣＤ３８およびＣＤ４５ＲＡが陰性であるＣＤ３４＋細胞であってもよい。

いくつかの実施形態において、造血系の細胞は、長期造血幹細胞（「ＬＴ－ＨＳＣ」）であってもよい。

本発明の第２の態様は、条件付き不死化細胞、一般に条件付き不死化幹細胞から得ることができるか、または得られる多能性幹細胞を提供する。この多能性幹細胞は、造血系の細胞を含む、他の細胞の有用なソースである。

本発明の第３の態様は、多能性幹細胞を生成する方法であって、条件付き不死化細胞、一般に条件付き不死化幹細胞をリプログラミングするステップを含む、方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞からさまざまな細胞タイプを形成する、一般に造血系の細胞を形成する続くステップをさらに含んでもよい。下記の実施例６は、特に人工多能性幹細胞からの造血幹細胞の形成、およびその後さらに造血系へ、例えば、Ｔ細胞運命へのＨＳＣの分化を示している。

特定の実施形態において、第３の態様の方法は、多能性細胞をＨＳＣに、任意にさらに造血系に分化させるステップを含む。特定の実施形態において、この方法は、（ｉ）アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＢＭＰ４を含む培地において培養して、中胚葉細胞を形成した後、（ｉｉ）中胚葉細胞をＦＬＴ３、ＳＣＦ、ＢＭＰ－４、ならびにインターロイキン３および６の存在下において培養して、ＨＳＣを形成することによってＨＳＣに分化させられる多能性細胞を含んでもよい。

得られたＨＳＣは、その後、いくつかの実施形態において、（ｉ）培養物にＤＬＬ－１もしくはＤＬＬ－４タンパク質を供給して、ＨＳＣにおけるＮＯＴＣＨシグナル伝達を活性化すること、または（ｉｉ）間質細胞と、任意にＮｏｔｃｈリガンドＤＬＬ１もしくはＤＬＬ４を発現するよう操作された間質細胞とＨＳＣとを共培養すること、または（ｉｉｉ）結合したＶＣＡＭおよびＤＬＬ４タンパク質の単層上でＨＳＣを培養することによって、Ｔリンパ球の運命に分化させられてもよい。分化のための培養期間は、少なくとも７日、少なくとも１４日または少なくとも２１日、例えば、２５日以上であってもよい。他の細胞の運命への分化については本明細書に記載されており、当業者には明らかであろう。

一実施形態において、ＣＴＸ－ＨＳＣから前駆Ｔ細胞を形成する方法は、ＨＳＣを、ＨＳＣにＶＣＡＭおよびＤＬＬ４を提示する結合したキメラタンパク質の層上で１４日の期間培養することによって提供される。１４日の期間の終わりに、付着および懸濁細胞の不均質な集団が得られる。この細胞集団は、一般にＣＤ３（Ｔ細胞レセプター関連タンパク質）、ＣＤ４３（白血球マーカー）、ＣＤ５（リンパ球、主に初期Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ７（未成熟Ｔ細胞マーカーおよびＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ２５（インターロイキン２レセプター）を発現する場合もある。成熟Ｔ細胞よりもむしろＴ前駆細胞表現型の解釈と一致して、ＣＤ５およびＣＤ７の発現に加えて、この実施形態の細胞はＴ細胞レセプター自体も関連分子ＣＤ４もしくはＣＤ８も発現しない。

結合したＦｃ－ＤＬＬ４およびＦｃ－ＶＣＡＭタンパク質上におけるＴリンパ球前駆細胞（progenitor T lymphocyte cell）の長期間の培養は、より均質になりより成熟した表現型を有する細胞集団をもたらすことができる。そのような細胞は、より均一（例えば、６０％を超える細胞が白血球マーカーＣＤ４３を発現した）であり、それらが、ＣＤ３に加えてＣＤ８も発現したが、ＣＤ５およびＣＤ７の発現は失われた、より成熟したリンパ球集団となるという解釈と一致し得る。

条件付き不死化ｈｉＰＳＣ由来のＨＳＣからより成熟したリンパ球集団を作り出すために分化の代替的な方法も使用されてきた。ヒトＮＯＴＣＨリガンドＤＬＬ１を発現するように操作されたマウスＭＳ５間質細胞とのＣＴＸ－ＨＳＣの共培養またはＭＳ５－ＤＬＬ１細胞の単層上でのＣＴＸ－ＨＳＣの共培養は、小さな非付着性細胞集団において高い増殖を引き起こした。この集団は、分化の過程で成熟して、ＣＤ３４発現を失ったが、初期マーカーＣＤ５およびＣＤ７発現レベルが低下したものの、ＣＤ８発現は観察されなかった。したがって、この方法によって生成されたＴ細胞前駆細胞は、おそらく（上記の）結合タンパク質アプローチによって生成されるものよりもＴ細胞の発生の早い段階を表す。これらの結果は、例えば、図１７、１８、２０および２１において見ることができる。

本発明のさらなる態様は、本発明の任意の方法によって生成される細胞、特に、造血系の細胞、および任意のこれらの細胞によって産生される細胞外小胞に関する。

本発明者らは、条件付き不死化細胞、例えば、幹細胞、例えば、ＣＴＸ０Ｅ０３またはＳＴＲ０Ｃ０５細胞株由来の細胞の多能性へのリプログラミングが、他の成体幹細胞または組織前駆細胞集団の形成を可能にすることを発見した。多能性細胞が一旦形成されると、任意の所望の系列、例えば、外胚葉、内胚葉または中胚葉系の細胞を得るために、従来の分化プロトコルが使用できる。中胚葉系は造血細胞を生じ、本発明によると典型的である。特定の実施形態において、多能性細胞は、元の条件付き不死化幹細胞の系列とは異なる系列に向けられる。特定の実施形態において、人工多能性細胞は、間葉系幹細胞、または神経幹細胞へ分化させることができる。

一般に、人工多能性細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、好中球および樹状細胞などの免疫系の細胞へのさらなる分化を含む、造血幹細胞に分化させられる。これらの細胞は、中胚葉起源のものである。

特定の実施形態において、人工多能性細胞は、体細胞（成体）幹細胞、多能性細胞、少能性細胞もしくは単能性細胞、または高分化細胞に分化させられてもよい。これらの細胞のすべては、一般に造血系のものである。

下記の実施例１～５は、さまざまな条件付き不死化細胞から本発明により形成されたｉＰＳＣが多能性であり、内胚葉、中胚葉および外胚葉系になることができることを示している。実施例は、成体幹細胞（ＭＳＣ）が本発明のｉＰＳＣから形成され得ることをさらに示している。これらのＭＳＣは、多能性であること、ならびに軟骨、脂肪および骨細胞に分化できることが示されている。

本発明の人工多能性細胞の、免疫系の機能細胞への分化も記載され、例示されている。これらの免疫細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞が挙げられる。当業者には理解されるであろうとおり、これらの細胞は、通常、造血系を介して到達することになる。Ｔ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞（「ヘルパーＴ細胞」と広く呼ばれることが多い）、マーカーＦｏｘＰ３によって特徴づけられることが多い制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球）を挙げることができる。造血系由来の別の細胞は好中球である。造血系由来のさらに別の細胞はマクロファージである。これらの細胞のそれぞれは、任意に遺伝子操作されていても、または別の方法で改変されていてもよい。特に、細胞は、キメラ抗原レセプターを発現して、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、または任意の他のＣＡＲ－改変免疫細胞を形成するよう改変されてもよい。キメラ抗原レセプターは、一般に標的細胞、通常、腫瘍細胞上のタンパク質または他のマーカーに向けられる。例は、ＣＤ１９であり、これは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、リンパ性白血病（急性（ＡＬＬ）および慢性（ＣＬＬ））ならびにリンパ腫を処置するためにＣＡＲ－細胞（例えば、ＣＡＲＴ－Ｔ細胞）によって標的とされる。本発明による造血系の対象の他の細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。治療に使用される場合、これらの細胞のそれぞれは一般に患者と同種異系のものである。それでもなお、状況によって細胞は、患者の自己由来のものであってもよく、例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ療法においてなど患者細胞が抽出され、操作され、再投与される。ＣＡＲ－ＮＫ細胞タイプの１つは、Li et al., 2018, Cell Stem Cell 23 181-92によって示されるｓｃＦｖ－ＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ細胞である。

本発明により生成され得る造血系の他の細胞は、赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））である。ドナー血液に対する絶え間ないニーズが依然としてあり、そのニーズのかなりの割合が赤血球成分に対するものである。単にバイオリアクターに前駆細胞の標準的なバイアルを播種することにより、ドナー血液として働くことができる赤血球を大量に供給する能力は極めて有利である。「ドナー」という語が示す場合、これらの赤血球は、レシピエントと同種異系のものである。

細胞、例えば、幹細胞は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子により条件付きで不死化可能にすることができる。この導入遺伝子は、表現型にいかなる変化も与えることなく増殖および細胞分裂を促進する４－ヒドロキシタモキシフェンを細胞培養培地に添加することによって、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３およびＳＴＲ０Ｃ０５などの幹細胞株の安定でスケーラブルな生成を可能にすることが既に示された。

条件付き不死化幹細胞は、一般に、体細胞の幹細胞とも呼ばれる成体幹細胞である。例えば、それは、ＣＴＸ０Ｅ０３幹細胞株などの神経幹細胞である場合もあるであろう。ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株は、本出願人（ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によってＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫに寄託され、ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１を有する。他の実施形態において、神経幹細胞株は、「ＳＴＲ０Ｃ０５」細胞株、「ＨＰＣ０Ａ０７」細胞株（これも本出願人によってＥＣＡＣＣに寄託された）またはMiljan et al Stem Cells Dev. 2009に開示されている神経幹細胞株であってもよい。

条件付き不死化幹細胞は、多能性にリプログラミングされる。多能性表現型を誘導することは、一般に特定のセットの多能性関連遺伝子の生成物、または「リプログラミング因子」を所与の細胞タイプに導入することを伴う。リプログラミング因子の元のセット（山中因子とも呼ばれる）は、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。リプログラミング因子は、当該技術分野において周知であるとおり、一般にウイルスまたはエピソームベクターを使用して、細胞中に導入される。

リプログラミング因子を細胞に導入するのに適したウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルスおよびセンダイウイルスが挙げられる。リプログラミング因子を導入するための他の技術としては、ｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。

驚くべきことに、ＣＴＸ０Ｅ０３などの特定の条件付き不死化幹細胞を多能性にリプログラミングするためにたった１つの転写因子しか必要とされないことが確認された。例えば、図２Ｂ～Ｄは、ＯＣＴ４単独でＣＴＸ０Ｅ０３の多能性を誘導することができることを示す。多能性を実現することが確認された転写因子の組み合わせとしては、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣが挙げられる。したがって、これらの組み合わせを含むか、またはそれからなるリプログラミング因子が本発明に使用するために提供される。図２Ｃにおいて多能性を首尾よく誘導する因子の組み合わせのそれぞれが、本発明の個々の実施形態として提供される。条件付き不死化幹細胞を多能性に誘導する際に使用するためのリプログラミング因子は、例示された組み合わせを含むか、またはそれからなってもよい。

他の不死化因子も当該技術分野において知られており、当業者には明らかであろう。因子の任意の適した組み合わせが使用されてもよく、これは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、小分子阻害剤によるリプログラミングは、当該技術分野において知られており、同時に、ＮＡＮＯＧおよびＴＥＴ１が他の適したリプログラミング因子として知られている。例として、Ｔｈｏｍｓｏｎおよび同僚は、ＯＫＳＭの代替物としてＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＬＩＮ２８を使用した。別の例において、ＴＥＴ１は、ＯＣＴ４の代わりにすることができることが示された。

ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子の活性は、細胞のＭＹＣ活性を再現するため、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ誘導性不死化幹細胞をリプログラミングする場合、ＭＹＣがん遺伝子を発現するベクターは必須でなく、その理由は、必要とされる場合、この活性は、培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ融合タンパク質を活性化することができるからである。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＹＣ（例えば、ＭＹＣリプログラミングベクター）は、別個のリプログラミング因子として使用されない。当業者は、ＭＹＣ以外の遺伝子を使用する条件付き不死化システムが、それらをリプログラミングするために外因性ＭＹＣを必要とする場合もあることを当然認識するであろう。

人工多能性細胞は、任意の所望の細胞タイプに分化させることができる。細胞系列または細胞タイプを判定するための技術は、当該技術分野において周知である。一般に、これらの技術は、細胞表面（および／またはＯｃｔ４などの多能性のマーカーの不在）または細胞内のいずれかの分化のマーカー、例えば、系列特異的な転写因子、細胞形態および機能の存在の判定を伴う。例えば、多能性幹細胞は、一般にカノニカル多能性転写因子ＯＣＴ４、および細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４が陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１を発現しない。

内胚葉系のマーカーとしては、ＧＡＴＡ６、ＡＦＰまたはＨＮＦ－αが挙げられる。他の内胚葉マーカーとしては、クローディン－６、サイトケラチン１９、ＥＯＭＥＳ、ＳＯＸ７およびＳＯＸ１７の１つ以上を挙げることができる。

中胚葉系のマーカーとしては、ＢＭＰ２、ブラキュリまたはＶＥＧＦが挙げられる。他の中胚葉マーカーとしては、アクチビンＡ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－３、およびＴＧＦ－βのうちの１つ以上を挙げることができる。

外胚葉系のマーカーとしては、ＰＡＸ６、ネスチンまたはＴｕｂＩＩＩが挙げられる。他の外胚葉マーカーとしては、ノギン、ＰＡＸ２およびコーディンのうちの１つ以上を挙げることができる。

さまざまな系列への分化は、例えば、図３Ｄに示される。ＣＴＸ－ｉＰＳＣおよびＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣの内胚葉、中胚葉および外胚葉系への分化は、実施例２（図７）および実施例３（図９）にも示される。実施例２は、以下のマーカーを使用する。

多能性細胞は、任意の所望の細胞タイプに分化させることができる。これは、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または造血幹細胞を含むことがある。別の実施形態において、体細胞（成体）幹細胞は、本発明の人工多能性細胞の分化から生じる。他の実施形態において、本方法によってもたらされる細胞は、多能性細胞、少能性細胞または単能性細胞である。この実施形態の例は、前駆細胞、例えば、神経前駆細胞の生成であろう。神経前駆細胞は、PloS One (2011) vol. 6 e20692においてＮｉｓｔｏｒおよび同僚によって、場合によって神経変性疾患の処置に使用するものであると記載されている。もたらされる細胞はまた、分化のための既知の技術を使用して、高分化細胞に完全に分化させることができる。この実施形態の例は、Ｃａｒｒｉおよび同僚（２０１３年）によって示されるとおり、ハンチントン病において脱落している中型有棘ニューロンへの分化およびそのスケーラブルな生成である。Stem Cell Review and Reports, DOI 10.1007/s12015-013-9441-8を参照。特定の実施形態において、造血幹細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／または樹状細胞に分化させることができる。したがって、Ｔ細胞は、一実施形態として提供される。ナチュラルキラー細胞は、別の実施形態として提供される。樹状細胞がさらに提供される。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣの間葉系幹細胞への分化は、実施例１および図５において示されている。この例において、ＭＳＣ表現型は、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が存在するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５は存在しないことによって特定される。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣの軟骨、脂肪および骨細胞への分化は、実施例３および図１０において示されている。

（必要に応じて）ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子の再活性化に続く４－ＯＨＴの培地への添加は、誘導される細胞集団の無限の増殖を可能にするはずである。ＣＴＸ０Ｅ０３自体と類似していることから、これは、事実上無制限の量の治療に有用な細胞集団のインビトロにおけるスケーラブルな生成を可能にすることが予想され、これは、細胞療法が存在しないか、または組織ドナーの利用可能性もしくはｈＰＳＣからの分化プロトコルの技術的な制約によって制限されるかのいずれかの、急性または慢性の細胞損失によって特徴づけられる任意の状態のための「すぐに利用できる（off-the-shelf）」療法として使用することができる。

本発明の方法は、所望の生成物を得るために必要な場合もある処理、培養または製剤化ステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、本発明の方法は、典型的には方法の終わりに、以下のステップの１つ以上を含んでもよい：
本方法の結果もたらされる細胞を培養するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を継代するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を収集するステップもしくは回収するステップ、
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の容器に包装するステップ、および／または
本方法の結果もたらされる細胞を１つ以上の賦形剤、安定剤もしくは保存料とともに製剤化するステップ。

条件付き不死化幹細胞、リプログラミングの結果もたらされる多能性細胞、および多能性細胞から得ることができるさらに分化した細胞は、一般に単離または精製される。これらの細胞のいずれかによって産生される細胞外小胞、例えば、エクソソームも、一般に単離または精製される。

分化後にもたらされる細胞、およびそれらによって産生される細胞外小胞は、治療に使用することができる。治療は、一般にそれを必要とする個体の疾患または障害のものになる。患者は、一般にヒトになる。

さらなる態様において、本発明は、条件付き不死化幹細胞；リプログラミングの結果もたらされる多能性細胞；多能性細胞から得ることができるさらに分化した細胞；または任意のこれらの細胞によって産生される細胞外小胞、例えば、エクソソーム；および薬学的に許容される賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む組成物を提供する。

ＣＴＸ細胞の多能性表現型へのリプログラミングを示す図である。（Ａ）ＣＴＸリプログラミングプロセス（ＨＰＳＣ培地：Ｅ８／Ｓｔｅｍｆｌｅｘ；ｈＰＳＣ基質：ＬＮ－５２１／ビトロネクチン－ＸＦ）およびリプログラミングに使用され得るＯＫＳＭＬを発現させるエピソームプラスミド（Ｅｐｉ５キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の概略図。ＣＴＸ培養培地は、所望の場合、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子によりＭＹＣ活性を得るために、４－ＯＨＴが加えられても、または加えられなくてもよい。トランスフェクションは、リポフェクション、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによってなど、さまざまな方法で実現されてもよい。（Ｂ）ＥＧＦＰシグナルは、トランスフェクションの２４時間後におけるトランスフェクション効率を示す。 ＣＴＸ細胞の多能性表現型へのリプログラミングを示す図である。（Ｃ）コロニー周辺の親ＣＴＸ細胞とは非常に異なる細胞およびコロニー形態を示す、トランスフェクションの１５日後のｈＰＳＣ表現型を有するリプログラミングされたＣＴＸ細胞の日の浅いコロニーの例。（Ｄ）２１日目の終了点のｈＰＳＣ表現型の（アルカリホスファターゼ陽性、赤く染色された）コロニーを示す６ウェルプレートの例。 ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す図である。（Ａ）１つの因子を発現するベクター、ｐＣＥ－ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ＳＯＸ２およびｐＣＥ－ＫＬＦ４；４－ＯＨＴ供給はｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭによりＭＹＣを模倣する。 ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す図である。（Ｂ）挿入図：コロニーカウントのための例のＡＰ染色プレート。中心の画像：転写因子ＯＣＴ４単独によりリプログラミングされたコロニー。 ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す図である。（Ｃ）さまざまな因子の組み合わせにより得られたコロニー数（Ｓ－Ｋ：ｐＣＥ－ＳＫ、Ｍ－Ｌ：ｐＣＥ－ＵＬ、Ｓ：ｐＣＥ－ＳＯＸ２、Ｋ：ｐＣＥ－ＫＬＦ４、Ｍ：４－ＯＨＴ→ｄ１４）。（Ｄ）組み合わせの効果を示すベン図（数：ｘ個のコロニーが得られた；ゼロ：コロニーなし）。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を示す図である。（Ａ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣの細胞およびコロニー形態、（ｉｉ、ｉｉｉ）は、ｈＰＳＣに典型的な目立つ核小体を有する小さな緊密に詰め込まれた細胞の高密度のコロニーを再現し、親ＣＴＸ細胞（ｉ）の神経細胞表現型とは著しく異なる、人工多能性ＣＴＸ細胞株の２つの例である。（Ｂ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は、酵素マーカーアルカリホスファターゼ（ピンク染色）を発現する。確立されたＣＴＸ由来ｈＩＰＳＣ株のアルカリホスファターゼ染色。ピンクの着色は、細胞が多能性マーカーＴＮＡＰに関して陽性であることを示すため、インビトロにおける酵素触媒による変色反応を実施することができる。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を示す図である。（Ｃ）フローサイトメトリーは、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株が、転写因子ＯＣＴ４、ならびに細胞表面抗原ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０を含む多能性関連マーカーを発現するが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１は発現しないことを示す。（ｉ）いくつかのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株に関する集計表、（ｉｉ）１つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株に関するデータの例：上の行、左から右：ＳＳＥＡ－１、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ－４；下の行、左から右：ＴＲＡ－１－６０、前方散乱対側方散乱、ＳＳＥＡ－４。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を示す図である。（Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、内胚葉、中胚葉および外胚葉へのインビトロ分化時の系列特異的なマーカーのアップレギュレーションを示す（個々のＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は色によって示される）。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおいて導入遺伝子座を評価する図である。（Ａ）Ｇ４１８における親ＣＴＸ０Ｅ０３細胞（一番上、４日目、２行目、１０日目）および４日目の５つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（３～７行目）のギムザ染色は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ関連ＮｅｏＲ遺伝子の発現活性を示す。（Ｂ）ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子を駆動するＣＭＶ－ＩＥプロモーターのバイサルファイト変換は、その座位におけるシトシンメチル化状態を示す（白丸、非メチル化ＣｐＧ；黒円、メチル化ＣｐＧ；カンマ、不確定な読み取り）。 例となるＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の治療用細胞集団の生成を示す図である。（Ａ）ｍＴｅＳＲ１培地のラミニン－５２１上の多能性ＣＴＸ－ｉＰＳＣ（インビトロにおいて多能性を保護するための標準的な培養条件）。（Ｂ）ＭＳＣ培地（α－ＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）において（Ａ）の細胞由来のプラスチック付着性の候補間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。（Ｃ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリーは、それらが、ＩＳＣＴ基準に従って、ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しないことを示す（青、染色；赤、アイソタイプ対照）。 多能性へのＣＴＸの細胞リプログラミングは、多能性および神経系発生において重要な役割を有する遺伝子の発現調節の例によってここでは示される、遺伝子発現における劇的なゲノム全体での変化をもたらすことを示す図である。シングルセルＲＮＡ配列（トランスクリプトーム）データを、（色調、左上パネルを参照）ＣＴＸの３つのサンプル（緑）、３つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ細胞株（青）および皮質系列に沿って分化を経た同じＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（赤）に関して示す。後者の場合、選択されたセットの神経外胚葉遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって定義されるとおり、最も厳密にＣＴＸ自体を再現する時点で分化を中止させた。それぞれのパネルは、シングルセル遺伝子発現データの「ｔＳＮＥプロット」であり、「雲状のもの」のそれぞれの点は１つの細胞を示す。グレー：発現なし、オレンジ：中程度の発現；赤：高発現。プロットは、ＣＴＸにおいて不活性の多能性遺伝子：ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１、ＴＥＴ１、ＤＰＰ４、ＴＤＧＦ１、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＡＬが、リプログラミングされた細胞では活性化されたことを示す。重要なことに、これらの遺伝子のうち、ＰＯＵ５Ｆ１のみがリプログラミングの間に外因的に与えられ、リプログラミング時の内在性遺伝子の活性化を明確に確認する。反対に、ＣＴＸによって発現されるいくつかの神経系遺伝子は、多能性へのリプログラミング時、ダウンレギュレートされ（ＮＯＧＧＩＮ、ＡＤＡＭ１２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＸ６）、ＣＴＸ細胞によって強く発現される遺伝子であるＯＣＩＡＤ２も同様である。ＧＬＩ３およびＰＡＸ６などの神経外胚葉発生に重要ないくつかの遺伝子は、それらが、神経外胚葉の運命を選択するため、多能性細胞の皮質分化時にアップレギュレートされる。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣが多能性であることのさらなる確認を示す図である。３つの一次胚細胞系列、内胚葉、中胚葉および外胚葉を特定する転写因子などのタンパク質マーカーに対する免疫染色。 別の条件付き不死化成体幹細胞タイプのリプログラミングを示す図である。この図は、別の条件付き不死化成体幹細胞（ＡＳＣ）株、胎児の線条体細胞由来のＳＴＲ０Ｃ０５の成功したリプログラミングを示す。パネル：Ａ、リプログラミング因子によるトランスフェクションの２４日後のリプログラミングされたＳＴＲ０Ｃ０５細胞のコロニー；Ｂ、いくつかの細胞が多能性マーカー、アルカリホスファターゼを発現し始めたことを示す、リプログラミングの初期のアルカリホスファターゼ（赤）染色ＳＴＲ０Ｃ０５細胞；Ｃ、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株；Ｄ、さまざまなトランスフェクション条件に供されたウェルにおいてＡＰ陽性コロニーがさまざまな頻度で出現する；陽性コロニーのないウェル１は、対照としてＧＦＰ（非リプログラミング）プラスミドでトランスフェクションされ、リプログラミングされた細胞がないが、ウェル４および６は、少数の生存細胞があった；Ｅ、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株は、アルカリホスファターゼ陽性であり、Ｆ、多能性マーカーＳＳＥＡ４も陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ１は陰性である。 ＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣの多能性の確認を示す図である。３つの一次胚細胞系列を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現を確認する免疫染色によって示される内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の成体幹細胞の多能性の確認の図である。候補ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の間葉系幹細胞（ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）は、多能性である。定義されたパネルの細胞表面マーカータンパク質の発現および組織培養プラスチックへの付着に加えて（本出願の主要部分を参照）、この図は、軟骨（グリコサミノグリカンのアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）へ分化する能力を確認する。 条件付き不死化細胞のリプログラミングによって結果として作り出されたｉＰＳＣから分化した成体幹細胞における条件付き不死化導入遺伝子の機能を示す図である。４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の存在下または非存在下において高継代（２０継代）まで培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリープロフィール。この細胞株は、ＤＮＡメチル化データが脱メチル化Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭプロモーターを有することを示唆し、その結果、プロモーターが活性であることを意味するものである。この細胞株は、細胞周期が４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ系により誘導されるとき、その細胞表面マーカープロフィールをよりよく維持するようである。ＣＤ９０およびＣＤ１０５発現は、より一定でより高度に発現され、陰性マーカーＣＤ１４、２０、３４および４５は、より一貫して低い。第２のパネルにおいて、４－ＯＨＴ処理細胞は、分化時に骨を形成するのにより有効であるようであり、４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭにより駆動される細胞周期が、そうでなければ、細胞周期からの逸脱時に生じるであろう分化および関連する能力の喪失をいくぶん阻害することを示唆する。 ４－ＯＨＴの非存在下または存在下において培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株の例の図であり、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子が活性である（４－ＯＨＴが存在する）ときに向上したより一貫した長期にわたる増殖挙動を示す。 ４－ＯＨＴの非存在下または存在下において培養されたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株の第２の例の図であり、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子が活性である（４－ＯＨＴが存在する）ときに向上したより一貫した長期にわたる増殖挙動を示す。 中胚葉の形成を示す図である。これは、インビトロでのｈＰＳＣからの造血系細胞の生成における最初の必須のステップを示し、これによって、アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＢＭＰ４を補充した市販の培地は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ分化を中胚葉に誘導する。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の中胚葉の造血幹細胞（ＨＳＣ）への分化を示す図である。これは、図１４ＢのＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の中胚葉細胞からＨＳＣが形成されたことを示す。 Ｔ細胞のインビトロ形成を示す図である。これは、２つの共培養方法を使用してＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＨＳＣがＴリンパ球細胞運命へ分化させられたことを示す。 ＤＬＬ４／ＶＣＡＭコーティング上におけるＴ前駆細胞の発生を示す図である。図１７Ａは、ＣＴＸ－ＨＳＣを、ＨＳＣにＶＣＡＭおよびＤＬＬ４を提示する結合キメラタンパク質の層上で１４日の期間培養することによってＣＴＸ－ＨＳＣから前駆Ｔ細胞を形成する方法を示す。１４日の期間の終わりに、付着および懸濁細胞の不均質な集団が得られた。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって（図１７Ｂ）、前駆リンパ球集団を含むより小さな懸濁細胞（「単一細胞２」集団、図１７）と区別することができた。 （図１７－１の続き） ＤＬＬ４／ＶＣＡＭコーティング上におけるＴ前駆細胞の発生を示す図である。結合したＦｃ－ＤＬＬ４およびＦｃ－ＶＣＡＭタンパク質上におけるＴリンパ球前駆細胞の長期間の培養（図１８Ａ、２５日、１４日とは対照的）は、いくぶんより均質になり（図１８Ｂ）、より成熟した表現型に達した（図１８Ｃ～Ｅ）細胞集団をもたらした。 （図１８－１の続き） オルガノイドを使用したＴ細胞の発生を示す図である。ＣＴＸ－ＨＳＣを、ヒトＮｏｔｃｈリガンドＤＬＬ１を発現するように操作されたマウスＭＳ５間質細胞と共培養する。 ヒトＤＬＬ－１を発現するＭＳ５細胞の単層上におけるＴ細胞の発生を示す図である。ＭＳ５－ＤＬＬ１細胞の単層上でのＣＴＸ－ＨＳＣの共培養は、小さな非付着性細胞集団の高い増殖を引き起こした（図２０Ｂ）。この集団は、分化の過程で成熟して、ＣＤ３４発現を失った（図２０Ｃ）が、初期マーカーＣＤ５およびＣＤ７発現レベルが低下したものの、ＣＤ８発現は観察されなかった（図２０Ｄ～Ｆ）。 （図２０－１の続き） （図２０－２の続き） Ｔ細胞の発生－キメラタンパク質対ＭＳ５－ｈＤＬＬ－１単層を示す図である。図２０の方法によって生成されるＴ細胞前駆細胞は、おそらく上記の結合タンパク質アプローチによって生成されるものよりもＴ細胞の発生の早い段階を表す。これは、ＤＬＬ４／ＶＣＡＭコーティング上での培養の２５日の間のＴ細胞の発生が、ｈＤＬＬ－１を発現するＭＳ５の単層を使用するよりも有効であったことを示す。 ＮＫ細胞の潜在性：本発明により形成されるｉＰＳＣ、中胚葉細胞およびＨＳＣ上のＮＫ細胞マーカーＣＤ５６（ＮＣＡＭ）の発現を示す図である。 造血系の細胞の概要を示す図である。 Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭシステムに対する代替物であるＬ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭウイルスの概略図を示す図である。 ＣＴＸ－ｉＰＳＣの造血分化が、ＨＳＣ、リンパ系前駆細胞およびエフェクターを生成する。（Ａ）胚様体は、単一細胞懸濁液を非付着性マイクロウェルプレートに播くことによってＣＴＸ－ｉＰＳＣから生成された。（Ｂ）ＥＢを、中胚葉促進培地（mesoderm-promoting medium）の存在下において（３日目まで）培養した後、造血系規定培地（haematopoietic specification medium）において（１０日目まで）培養して、（Ｃ）ＣＤ３４＋細胞を形成し、そのおよそ５％がＣＤ３４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＬＴ－ＨＳＣであった。（Ｄ）このように誘導されたＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ３４磁気ビーズを用いて単離した後、さらに１４日間分化させて、（Ｅ）ＣＤ７＋リンパ球前駆細胞を形成し、これは、いくらか低下した多能性を保持し、その結果、それぞれ１４または２１日間分化させることができ、ナチュラルキラーまたはＣＤ４－ＣＤ８＋ＴＣＲαβ細胞傷害性Ｔ細胞を生成した。 （図２５－１の続き）

本発明者らは、驚くべきことに、条件付き不死化細胞が多能性幹細胞表現型にリプログラミングされ得ることを明らかにした。これは、既存の人工多能性幹細胞を超えた利点を提供する。特に、インビトロにおける不死化および長期培養にもかかわらず、驚くべきことに、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３およびＳＴＲ０Ｃ０５が外因性転写因子によってリプログラミングされ得ることが示された。さらに、条件付きで制御される遺伝子がリプログラミング後も、依然として活性化および発現停止可能なままであることも驚きであったので、リプログラミング前に、ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の添加時に転写され得る同じ機能的な条件付き不死化遺伝子、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭをリプログラミングされた細胞に与える。これの利点は、リプログラミングされた細胞も、細胞培養において他の場合に可能である細胞よりも長い間安定して増殖するよう制御可能であることであり、単一のバッチでより多くの患者を処置するためまたは細胞の任意の副生成物の収率を増加させるための工業的スケールアップに適したリプログラミングされた細胞を生産する。

有利にも、条件付き不死化細胞のリプログラミングは、標準的な（条件付きで不死化されていない）細胞においてよりも少ないリプログラミング因子により達成できることが多い。特定の実施形態における成体幹細胞の使用は、同様の利点をもたらす。

さらに、細胞の条件付き不死化の性質は、細胞および不死化システムにわたって有益な制御性を提供する。いくつかの実施形態において、これらの利点は、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ条件付き不死化システムによってもたらされる。理論に縛られることを望まないが、多能性にリプログラミングするためのソースとしての条件付き不死化細胞の使用は、不死化（すなわち、永続的に不死化された）細胞を使用した以前の試みを超える、実証された利点をもたらすと考えられる。

ｈｉＰＳＣは、（Heo et al., 2018, Cell Death Dis 9 1090. “Reprogramming method influences efficiency of generating haematopoietic progenitors by differentiation”）核移植胚由来のｈＥＳＣよりも有効でないことが示された。これは、従来のｉＰＳＣ技術を造血系用途に適用することに対する問題を示すが、この問題は本発明の細胞によって回避されるものであり、非常に不十分な（非効率な）分化システムであっても、貯蔵および患者移植に先立って、より運命拘束された、またはされていない前駆細胞および成体幹細胞（例えば、ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ／４－ＯＨＴシステムによって均質の集団として増殖させられた「部分的に分化した」細胞）を増殖させる能力において有用であり得る。

実施例のＣＴＸ－ｉＰＳＣおよびＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣなどの本発明の人工多能性細胞は、非常に有用な臨床的供給源である。これらは、所望の系列に沿って分化させて、組織前駆細胞タイプまたは成体幹細胞集団などの標的集団を形成することができる。典型的には、本明細書に記載されているｉＰＳＣは、造血系に分化させられる。その結果、継続的な増殖を促進し、細胞周期逸脱および関連するさらなる分化を防ぐための不死化剤（例えば、４－ＯＨＴ）の供給は、毎回、細胞療法生成物の新しいバッチが必要とされる、原材料からの繰り返される細胞単離なく、または人工多能性幹細胞から再び分化プロトコルを繰り返すことなく、以前は実現不可能だった臨床的に関連した部分集団の定型化したスケーラブルな生成を可能にするであろう。これは、例えば、同種異系細胞療法、例えば、同種異系Ｔ細胞療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、ＮＫ療法もしくはＣＡＲ－ＮＫ細胞療法用、あるいは抗体の産生のためのＢ細胞、または治療用ワクチンの形成のための好中球もしくは樹状細胞のすぐに利用できる細胞供給源の可能性を提供する。

同種異系のすぐに利用できる成体幹細胞療法用集団、特に、造血系の集団を大規模に生成するために誘導性不死化を再適用する能力が、特に有益であることが予想される。

特定の態様において、本発明は、有利にも商業または臨床関連スケールで培養可能な、安定な造血系細胞が形成される条件付き不死化ｉＰＳ細胞を提供する。

ＣＡＲ－Ｔ療法を使用したがんの処置など、以前は自家療法が唯一の利用可能な認可された処置であった場合での同種異系細胞療法の提供は、際立った利点である。本発明による細胞のクローン増殖可能なバンクは、自家細胞療法と比較して、工業的製造および臨床利用を向上させる。これは、各患者ベースで新たに生成される自家療法よりも、生成過程におけるより大規模バッチ、１人の患者よりもむしろ任意の数の患者への広い適用、向上した分布およびアベイラビリティ、患者を処置するための短い所要時間、より低コスト、ならびに優れた一貫性、品質および安全性プロフィールをもたらす能力を含む。

元の条件付き不死化細胞（例えば、ＣＴＸ０Ｅ０３）自体は適していない条件に対するすぐに利用できる処置の大規模生成のために、クローニングまたは精製ステップを使用して、多かれ少なかれ均質でない分化培養物から所望の治療タイプの純粋な集団を形成することができ、分化プロトコルの効率が不十分な技術に見られる欠点を回避する。これは、細胞自体または、ＣＴＸ細胞自体によって産生されるものに対する代替レパートリーのペイロード分子を有するさまざまな細胞タイプによって産生される細胞外小胞（例えば、エクソソーム）部分の両方に当てはまる。

さらに、これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の亜株は既に臨床安全性試験（clinical phase safety trial）に合格した細胞株（ＣＴＸ）から誘導されるため、新しい適応症における効力に関する臨床試験への移行が加速される可能性がある。

特定の態様において、本発明は、皮質組織および線条体組織由来でそれぞれが異なるヒトドナーに由来するＣＴＸ０Ｅ０３またはＳＴＲ０Ｃ０５神経幹細胞株などの、条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含むさまざまな神経幹細胞から形成される人工多能性幹細胞、ならびにそれらの人工多能性幹細胞の後代に関する。

造血系の細胞
本発明は、特に、多能性細胞からの造血系の細胞の生成に関する。造血系は、本明細書中の別の場所で詳細に記載されているとおりに特定可能である中胚葉（mesoderm germ layer）から誘導される。

造血系（haematopoietic system）は、感染症またはがんに対する自然および獲得免疫の両方、血液凝固ならびに赤血球の産生を含む、さまざまな機能を有する細胞タイプの大きな群からなる。これらの細胞タイプのすべては、最終的に骨髄に存在する多能性成体幹細胞タイプ（ＡＳＣ）である造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する単一の系列を含む。造血系細胞は、がんに対する免疫療法ならびに自己免疫疾患、貧血、外傷および感染症の処置を含む、さまざまな状態に対する治療薬として有用である。

この系列由来の細胞の治療用途としては、抗腫瘍治療薬としてのキラー細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、おそらく特に腫瘍細胞を標的とする遺伝子操作レセプターをもつキラー細胞（例えば、キメラ抗原レセプターＴ細胞）、自己免疫性障害の処置のためのＴ－Ｒｅｇ、ならびに血小板、例えば、特定のがん患者または外傷患者などの凝固障害のある患者のための血小板、赤血球、例えば、貧血の処置および戦場または外傷医療のための赤血球、ならびにがんを含むさまざまな状態の処置のため、または抗体の産生のためのＢリンパ球、がんの処置のための樹状細胞、例えば、プロベンジ（シプロイセルＴ）ならびにその他の使用が挙げられる。これらの細胞タイプのすべては、造血系の一部を含み、最終的に造血幹細胞、ＨＳＣに由来する。ＨＳＣは、骨髄のニッチに存在する希少な細胞タイプであり、例えば、がんに対する放射線療法処置後の致命的な放射線を受けた（完全に免疫系が除去された）動物の免疫系を再構成する能力によって定義される。これらは、表面レセプターＣＤ３４およびｃ－ＫＩＴ（ＣＤ１１７）などのタンパク質マーカーの存在、ならびにＴ細胞レセプターなどの成熟造血性マーカーまたはＢリンパ球によって成熟した抗原特異的抗体分子を産生することができる再構成された遺伝子座の両方の不在によって特定することができる。

図２３は、造血系の細胞の概要を示す。この図において言及されるすべての細胞タイプは、明確に本発明の一部として提供され、本明細書に記載されている方法により生成することができる。

造血系の細胞またはそれらの後代は、少なくとも以下のものを含む：多能性造血幹細胞（「ＨＳＣ」、血球芽細胞としても知られている）；骨髄系共通前駆細胞（骨髄芽球、単芽球、赤芽球および巨核芽球を生じることができる）；骨髄芽球（顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）になる）；単芽球（組織においてマクロファージおよび樹状細胞に分化することができる単球になる）；リンパ系共通前駆細胞；リンパ芽球；巨核球；血小板；赤芽球；赤血球；マスト細胞；好塩基球、好中球、好酸球を含む骨髄芽球由来細胞；単芽球由来細胞、例えば、単球およびマクロファージ；リンパ芽球由来細胞；大型顆粒リンパ球、例えば、ナチュラルキラー細胞（一般に、ＣＤ５６＋）；小リンパ球、例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球；プラズマＢ細胞；ならびに樹状細胞（ＤＣ）、例えば、骨髄系ＤＣ（例えば、ｍＤＣ－１もしくはさらにまれなｍＤＣ－２）またはプラズマ細胞様ＤＣ。

特定の実施形態において、造血系の細胞は、任意に骨髄芽球、リンパ芽球、巨核球、血小板、赤血球、マスト細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ＣＤ５６^ＤＩＭナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^{ＢＲＩＧＨＴ}ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｈｉｇｈＣＤ１６^±ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｌｏｗＣＤ１６^ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ１６１を発現するＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリＴ細胞、Ｂ－２細胞、Ｂ－１細胞、メモリＢ細胞、プラズマＢ細胞、骨髄系樹状細胞、またはプラズマ細胞様ＤＣから選択される。

ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプ、Ｔｈ２タイプ、Ｔｈ１７タイプ、Ｔｈ９タイプ、Ｔｈ２２タイプ、またはＴｆｈタイプのものであってもよい。制御性Ｔ細胞も、一般にＣＤ４＋である。

一実施形態において、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞が提供される。

特定の実施形態において、造血系の細胞は、例えば、実施例７に示されるとおりの長期造血幹細胞（Long Term repopulating Haematopoietic Stem Cell）（ＬＴ－ＨＳＣ）である。これらのＬＴ－ＨＳＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ ＬＴ－ＨＳＣであってもよい。

いくつかの実施形態において、造血系の細胞は、ＣＤ７＋リンパ系前駆細胞である。これらの前駆細胞は、それぞれ１４または２１日間分化させられて、ナチュラルキラーまたはＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＴＣＲ＋細胞傷害性Ｔ細胞を生成し、これも特定の実施形態において提供される。

ＣＤ８＋ Ｔ細胞がいくつかの実施形態において提供される。これらは、ＣＤ８＋エフェクター細胞またはＣＤ８＋メモリ細胞であってもよい。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の例は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋エフェクター細胞、例えば、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^－ＣＣＲ７^－ＣＤ４５ＲＯ^－細胞である。ＣＤ８＋メモリＴ細胞の例は、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋細胞である。

いくつかの実施形態において、造血系の細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲ＋細胞傷害性Ｔ細胞である。

ナチュラルキラー細胞は、特定の実施形態では、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ＤＩＭナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^{ＢＲＩＧＨＴ}ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｈｉｇｈＣＤ１６^±ナチュラルキラー細胞、またはＣＤ５６^ｌｏｗＣＤ１６^ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＩＬ２－ＲβおよびＣＤ９４が陽性である。

Ｂ細胞は、未成熟Ｂ細胞または成熟Ｂ細胞であってもよい。未成熟Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５Ｒを発現するが、ＩｇＭは発現しない。最も成熟したＢ細胞に関する重要なマーカーとしては、ＩｇＭおよびＣＤ１９が挙げられる。活性化Ｂ細胞は、アポトーシスの制御因子であるＣＤ３０を発現する。プラズマＢ細胞は、ＣＤ１９発現を失うが、ＣＤ７８を得、これは、これらの細胞を定量するために使用される。メモリＢ細胞は、ＣＤ２０およびＣＤ４０発現を使用して免疫表現型が決定可能である。細胞は、細胞表面に存在する免疫グロブリンのタイプにかかわらず、ＣＤ８０およびＰＤＬ－２を使用してさらに分類可能である（Zuccarino-Catania GV et al. Nat Immunol. 2014.）。

Ｂ細胞は、Ｂ－２細胞、Ｂ－１細胞、メモリＢ細胞またはプラズマＢ細胞であってもよい。Ｂ細胞（プラズマ細胞を除いて）は、一般にＩｇＭ＋ＣＤ１９＋である。活性化Ｂ細胞は、一般にＣＤ１９＋ＣＤ２５＋ＣＤ３０＋である。一部のプラズマ細胞は、ＩｇＧ、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８およびＣＤ３１９が陽性である一方で、他のプラズマ細胞は、ＩＬ－６が陽性であるか、またはＣＤ１３８が陽性であると特徴づけられる場合もある。さらなる実施形態において、細胞は、濾胞性Ｂ細胞（例えば、ＩｇＧ、ＣＤ２１、ＣＤ２２およびＣＤ２３が陽性）であってもよい。さらに別の実施形態において、Ｂ細胞は、制御性Ｂ細胞であり、これは、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＴＬＲ４が陽性である場合もあり、またはＩＬ－１０およびＴＧＦ－βが陽性である場合もある。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞は、メモリ細胞、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＰＤＬ－２が陽性のもの、またはＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５およびＣＸＣＲ６が陽性のメモリＢ細胞である。

造血系の典型的な細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。これらの細胞は、通常、ＣＤ３４＋多能性細胞であると定義される。ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ ＨＳＣも提供される。本発明の細胞は、ＨＳＣおよびＨＳＣから分化可能な細胞と特徴づけることができる。本発明の細胞は、骨髄系細胞またはリンパ球様細胞であってもよい。

ＨＳＣの骨髄芽球またはリンパ芽球への分化は、骨髄で起こる。

骨髄系共通前駆細胞は、単球（末梢血）、マクロファージ（組織）、ならびに骨髄芽球および得られる顆粒球（血液では好中球、好酸球、好塩基球であるが、組織ではマスト細胞が存在する）を含む骨髄系細胞を生じることになる。

リンパ芽球（リンパ系共通前駆細胞）は、リンパ球（ＴおよびＢ細胞）ならびにＮＫ細胞を形成することになる。ＣＤ７は、骨髄芽球に対する通常のマーカーではないが、Ｔ細胞の発生過程でそれが見られる。それは、骨髄性白血病において見られるため、その発現は、骨髄系細胞においては異常である。中でも一般的な骨髄系前駆細胞マーカーは、ＣＤ３６、ＣＤ１６３およびＣＣＲ２である。

免疫系の機能細胞は、造血系のものである。これらの免疫細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球および顆粒球が挙げられる。Ｔ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞（「ヘルパーＴ細胞」と広く呼ばれることが多い）、マーカーＦｏｘＰ３によって特徴づけられることが多い制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球）を挙げることができる。造血系由来の別の細胞は好中球である。造血系由来のさらに別の細胞はマクロファージである。これらの細胞のそれぞれは、任意に遺伝子操作されていても、または別の方法で改変されていてもよい。特に、細胞は、キメラ抗原レセプターを発現して、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、または任意の他のＣＡＲ－改変免疫細胞を形成するよう改変されてもよい。キメラ抗原レセプターは、一般に標的細胞、通常、腫瘍細胞上のタンパク質または他のマーカーに向けられる。一般的な標的タンパク質は、ＣＤ１９であり、これは、白血病を処置するためにＣＡＲ－細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を標的とする。本発明による造血系の対象の他の細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。治療に使用される場合、これらの細胞のそれぞれが一般に患者と同種異系のものである。それでもなお、状況によって、細胞は、患者の自己由来のものであってもよく、例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ療法においてなど患者細胞が抽出され、操作され、再投与される。

赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））も造血系の細胞である。

樹状細胞（ＤＣ）は、骨髄系ＤＣ、例えば、ｍＤＣ－１またはさらにまれなｍＤＣ－２であってもよい。ＤＣはまた、プラズマ細胞様ＤＣであってもよい。マーカーＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－３、およびＢＤＣＡ－４は、ＤＣタイプ間で識別するために使用することができる。リンパ系および骨髄系ＤＣは、それぞれリンパ系および骨髄系前駆細胞から進化するため、造血系起源のものである。

一実施形態において、本発明の細胞は、赤血球／骨髄およびＴリンパ系の潜在性を有するＣＤ３４＋細胞である。別の実施形態において、細胞は、赤血球／骨髄系前駆細胞であるＣＤ４３＋細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＣＤ４５＋白血球である。

一実施形態において、細胞は、ＣＤ５および／またはＣＤ７を発現しないＴ細胞である。他の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞前駆細胞であり、ＣＤ５および／またはＣＤ７を発現する。

造血系の細胞は、治療に有用である。例えば、がん治療に使用するためのＣＤ８＋ ＣＴＬおよびＮＫ細胞が知られている（特にＣＡＲを用いて改変された場合）。好中球は、がん処置および感染性疾患の処置を含む多くの治療において有用である。自己免疫療法のためのＴｒｅｇが開発中である。免疫細胞、例えば、ＣＤ８細胞、ＮＫならびにＢ細胞（およびそれによって産生された抗体）は、当然、細菌感染症、真菌感染症およびウイルス感染症を含む感染性疾患の処置にも有用である。

Ｔ細胞免疫は、多くのウイルス病原体の抑制に寄与するため、ウイルス特異的Ｔ細胞（ＶＳＴ）を用いた養子免疫療法は、特に、免疫不全患者において、深刻なウイルス性疾患と闘う論理的で、効果的な方法であった。いくつかの実施形態において、ウイルス、例えば、コロナウイルスまたは他のウイルス、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）およびＢＫウイルスは、Riddell and Greenberg “Principles for adoptive T cell therapy of human viral diseases” Annu Rev Immunol. 1995;13:545-86、およびさらに最近のOttaviano, Giorgio et al. “Adoptive T Cell Therapy Strategies for Viral Infections in Patients Receiving Haematopoietic Stem Cell Transplantation.” Cells vol. 8,1 47. 14 Jan. 2019に記載されている養子Ｔ細胞療法を使用して処置される。

ウイルス特異的Ｔリンパ球投与によるウイルス特異的な免疫の回復は、かなりの毒性または効果のない長期保護を特徴とする従来の薬物に対する魅力的な代案を提供した。大半の研究は、同種異系の幹細胞ドナー由来のウイルス特異的Ｔ細胞（ＶＳＴ）を使用し、部分的ＨＬＡ適合ドナー由来の貯蔵されたＶＳＴの使用は、多施設環境で有効性を示してきた。したがって、このアプローチは、患者がＶＳＴ療法を受ける時間を短縮することができ、よって利用しやすさを向上させた。生存転帰を向上させるために、抗ウイルス特異的Ｔ細胞療法が現在、臨床開発中である。

したがって、本発明の方法によりもたらされる抗ウイルスＴ細胞療法が提供される。これは、一般に、１つ以上のウイルス抗原によって刺激されたか、または一般にウイルス抗原を標的とするキメラ抗原レセプターを使用して、標的ウイルスを認識するよう操作された、本発明によるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞を含んでもよい。

本発明により作製されるＴ細胞は、任意にコロナウイルスを含んでもよい、複数の異なるウイルスに対して特異性を有してもよい。多ウイルス特異的Ｔ細胞は、当該技術分野において知られており、例えば、サイトカイン捕捉技術（Kallay et al, “Early experience with CliniMACS prodigy CCS (IFN-gamma) system in selection of virus-specific T cells from third-party donors for pediatric patients with severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation”. J Immunother. 2018;41(3):158-63）による直接的な単離を使用して生成され、さらにＣＤ１５４を発現する多病原体特異的Ｔ細胞が磁気細胞分離（Khanna et al “Generation of a multipathogen-specific T-cell product for adoptive immunotherapy based on activation-dependent expression of CD154”. Blood. 2011;118(4):1121-31）により直接単離されるプロトコルでも生成されてきた。

抗ウイルスＴ細胞は、一般に同種異系のものであり、大規模で生成および保管することができ、任意に例えば、凍結される場合は長期に保管することができ、これは、特に伝染性疾患のアウトブレイク、例えば、エピデミックまたはパンデミック時に非常に多くの処置を提供するのに有用である。

いくつかの実施形態において、処置は、コロナウイルスによる疾患（「Ｃｏｖｉｄ」）、例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９に対するものである。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、一般に、主要組織適合抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ）と結合したコロナウイルス由来のペプチドを認識し、それと結合することになる。このペプチドは、外部のペプチド、例えば、スパイクタンパク質、または内部のタンパク質、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質が可能であろう。したがって、この実施形態は、特にＣｏｖｉｄ－１９またはコロナウイルスが原因の他の疾患の処置における、治療的使用のためのウイルス特異的Ｔ細胞集団を提供する。

ＲｕｅｌｌａおよびＫｅｎｄｅｒｉａｎ（BioDrugs. 2017 Dec;31(6):473-481）によって述べられているとおり、同種異系のウイルス特異的Ｔ細胞を使用した成功実績は、同種異系のすぐに利用できるＣＡＲ－Ｔ細胞の開発に対する説得力のある論理的根拠を提供する。第三者の出願、すぐに利用できるウイルス特異的Ｔ細胞は、とりわけ、同種異系移植後のウイルス感染症の予防および処置における有効な戦略であることが証明された。したがって、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、抗ウイルス療法として使用されてもよい。

他の実施形態において、本発明のＮＫ細胞は、ウイルス性疾患、例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９などのコロナウイルスによる疾患を処置することができる。これらのＮＫ細胞は、任意に、コロナウイルスなどのウイルスを標的とするレセプターを含むＣＡＲ－ＮＫ細胞であってもよい。ＮＫ細胞は、例えば、ＩＬ－１５を発現するよう、さらに操作されてもよい。

いくつかの実施形態において、本発明によるｉＰＳＣ由来のＨＳＣから以下の細胞が生成される：
Ｔ細胞、任意にＣＤ８＋、ＣＤ４＋もしくは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、例えば、ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ；
Ｂ細胞；
ＮＫ細胞；
赤血球；
好中球；
樹状細胞または
マクロファージ。

いくつかの実施形態において、本発明のＨＳＣを含むプロセスにおいて血小板が形成される。

一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療用生成物が生成される。これは、同種異系のものであってもよい。ここでは、本方法の生成物として形成されたＴ細胞は、その後、改変される。別の実施形態は、例えば、同種異系療法用のＮＫ細胞の形成を提供する。本明細書に記載されている方法により生成されたＮＫ細胞は、任意に、例えば、遺伝子操作によって、改変される。一般に、所望の改変を有する適したＴ細胞またはＮＫ細胞クローンの選択に続いて、工業的サイズのバッチを生成するスケールでクローンを増殖させるための、条件付き不死化剤（例えば、ｃ－Ｍｙｃ－ＥＲの場合、タモキシフェンまたは４－ＯＨＴ）の添加を使用した細胞数のさらなる拡大が行われる。そのような細胞改変としては、以下のものが挙げられる：
ａ．キメラ抗原レセプター、例えば、任意に適したプロモーターの制御下でＣＡＲをコードする遺伝子をコードするベクターを使用した、本発明の形成されたＴ細胞のトランスフェクションにより発現される、以下に限定されないＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１またはＭＲ１を含むキメラ抗原レセプター
ｂ．ＣＡＲタンパク質の発現を制御するための改変
ｃ．患者に対する毒性を低減するための改変
ｄ．患者が投与後に重篤な有害事象、例えば、サイトカインストームに苦しむ場合に、自殺遺伝子を導入するための改変。

別の実施形態において、本明細書に記載されるとおりに、本発明のＨＳＣからＢ細胞が形成される。Ｂ細胞は、その後、抗体（または抗体フラグメント）を生成するために使用され、培養培地中に不死化因子（例えば、４－ＯＨＴ）を維持することによって不死化状態に維持される。

いくつかの実施形態において、本発明により生成される造血系の細胞は、目的とするタンパク質、糖タンパク質、またはペプチドを生成するために使用される。これは、生物学的治療薬である場合がある。

いくつかの実施形態において、本発明により生成される造血系の細胞は、細胞外小胞、一般にエクソソームを生成するために使用される。

いくつかの実施形態において、本発明により生成される造血系の細胞は、核酸薬物、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを生成するために使用される。

本明細書に記載されている任意の療法の組み合わせが提供される。単独、および互いに組み合わせた療法のそれぞれは、他の治療用薬剤と組み合わされてもよい。一実施形態において、本発明により生成される治療用細胞は、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体であってもよい異なる免疫療法と組み合わされる。

いくつかの実施形態において、がんを処置するための併用療法は、本発明により生成されるＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）およびチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。特定の併用療法としては、以下のものが挙げられる：ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗ＰＤ１抗体；ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗ＰＤＬ１抗体；ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗ＣＴＬＡ４抗体。他の併用療法としては、本明細書に記載されている他の免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞および抗ＰＤ１抗体；ＣＡＲ－ＮＫ細胞および抗ＰＤＬ１抗体；ＣＡＲ－ＮＫ細胞および抗ＣＴＬＡ４抗体；Ｔ細胞および抗ＰＤ１抗体；ＮＫ細胞および抗ＰＤ１抗体を挙げることができる。

一実施形態において、本発明によるＴｒｅｇは、別の治療用薬剤と組み合わされてもよい。Ｔｒｅｇは、一般にＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇである。併用療法の例は、免疫抑制薬または抗炎症薬と組み合わされるＴｒｅｇである。

本発明によって生成可能な造血系の多くの他の細胞タイプが以下に示される。

骨髄系前駆細胞、例えば、骨髄系・赤血球系前駆細胞（Myeloid-erythroid progenitor）（ＭＥＰ、赤血球および単球の前駆細胞、以下）、および赤血球の単能性前駆細胞である赤芽球。赤芽球は、インビトロで増殖させるのが難しい。赤芽球のスケーラブルな増殖および凍結保存の後に続く輸血のための赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））への分化は、広範な医学的適用可能性を有し、現行の献血システムと関連する多くの問題を改善するであろう（Focosi and Amabile, 2018, in Cells v7 2；Bernecker et al,. 2019 Stem Cells Dev v28 1540-51によって概説される）。

血小板のための巨核球。血小板は、巨核球由来の小さな脱核した血液構造であり、止血に極めて重要な役割を有する。現在、これらは、がん化学療法もしくは放射線療法または供血からの大外傷などの状態が原因の出血性合併症の処置のために献血から回収される。しかしながら、これらは、非常に短い保存可能期間（５日）を特徴とし、このことは、供給の大規模な多数ドナーのシステムと相まって、利用可能性および安全性に関する問題につながる可能性がある。血小板の単能性前駆細胞である巨核球（ＭＫ）は、成体前駆細胞タイプの例であり、これは、骨髄における希少な部分集団である。巨核球は、ｉＰＳＣから作り出すことができ（Eto et al., 2010, J Exp Med, 207 2817-30）、凍結保存可能であるが、細胞増殖の低いレベルに関する問題が確認されている。ｈｉＰＳＣ由来のＭＫをスケーラブルに増殖させ、必要に応じた血小板生成のためにそれらを冷凍保存する能力は、著しい利益になるであろう。

骨髄芽球は好中球の起源となる。
ａ．好中球（およびそれらと骨髄芽球の間の前駆細胞）。好中球は、ｉＰＳＣのＣＤ３４＋ ＨＳＣへの分化（以下参照）の後、ＳＣＦ、ＩＬ－６、トロンボポエチン、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンドの存在下においてＯＰ９間質細胞上でＨＳＣを培養し、その後、ＯＰ９細胞上のそれらをＧ－ＣＤＦの存在下において成熟させることによって生成されてもよい（Brault et al, 2012, Bioresearch Open Access 3 311-26）。

単芽球は単球の起源となる。
ｂ．単球。単球（マクロファージの前駆細胞）は、多段階プロトコルを使用してｉＰＳＣから分化させられることが示されてきた。その多段階プロトコルによってアクチビン－Ａ、ＢＭＰ４およびＣＨＩＲ９９０２１の作用により多能性細胞から形成される中胚葉が、ＳＢ４３１５４２、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＳＣＦの添加によって造血性上皮（hemogenic epithelium）にさらに分化させられる。それに続くＴＰＯならびにインターロイキン－３、インターロイキン－６、およびＭ－ＣＳＦによる処理は、骨髄系前駆細胞へのさらなる分化を誘導し、その後、マクロファージを成熟させる（Cao et al., 2019, Stem Cell Reports 12 1282-97）。
ｉ．マクロファージ；例えば、ｉＰＳＣ由来の中胚葉を含む胚様体の形成に続く、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅおよび同僚（２０１８）によってMeth Mol Biol 1784 13-28に記載されているとおりの、Ｍ－ＣＳＦおよびインターロイキン－３の存在下における多段階インビトロ培養、または共培養（Brault et al, 2012, Bioresearch Open Access 3 311-26）もしくはバイオリアクター（Ackermann et al., 2018 Nature Comms 9 5088）を含む類似の方法による。
ｉｉ．ミクログリア（脳マクロファージ）。

ＮＫ細胞およびＴまたはＢリンパ球を生成するためのリンパ系前駆細胞（下記実施例を参照）。

さまざまな造血系の細胞を生成するための例となる方法の概要を下記表に示す。それぞれの細胞タイプを生成するためのこの表の各行に示される方法欄の情報は、本発明の実施形態として明確に示される。最後の欄の参考文献は、さらなる手引きを提供する。

例えば、ＮＫ細胞は、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ４とともに培養して、ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋細胞を作り出した後、ＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３リガンドとの培養、および人工ＡＰＣ上での増殖によって本発明のｉＰＳＣから分化させることができる。

別の例において、Ｔ細胞は、間質細胞（ＯＰ９）上での共培養し、その後、ＦＬＴ３－Ｌ、ＩＬ－７、ＳＣＦの存在下でのＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞に移して共培養することによって本発明のｉＰＳＣから誘導することができる。

さらなる例において、Ｂ細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－３、ＦＬＴ３－Ｌ、ＳＣＦの存在下、Ｎｏｔｃｈリガンドの非存在下において培養することによって本発明のｉＰＳＣから誘導することができる。

下記表から引用するさらに別の例において、赤血球は、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＧＦ－１、ＥＰＯ、デキサメタゾンの存在下において培養することによって本発明のｉＰＳＣから誘導することができる。

下記表に記載されている他の実施形態において、本発明の赤血球細胞、巨核球および骨髄系細胞は、それぞれＥＰＯ、ＩＬ－１βまたはＧ－ＣＳＦ（もしくはＧＭ－ＣＳＦ）の存在下においてＨＳＣを培養することによって本発明のＨＳＣから誘導することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のｉＰＳＣは、ＦＬＴ３－Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＳＣＦ、ＴＰＯのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべての存在下において培養して分化され、例えば、骨髄系細胞に分化される。

本発明の一部の実施形態において、ＣＤ３１＋／３４＋ ＨＥ細胞が提供される。これらは、ｉＰＳＣにおいてＧＳＫ３を阻害することによってもたらされてもよい。これらのＣＤ３１＋／３４＋ ＨＥ細胞は、ＦＬＴ３－Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＳＣＦ、ＴＰＯと培養することによって（例えば、骨髄系細胞に）またはＤＬＬ－４発現間質細胞、ＳＣＦ、ＦＬＴ３－Ｌ、ＩＬ－３およびＩＬ－７との共培養によって（例えば、リンパ球様細胞に）分化させることができる。

略語
ＨＥ 造血性内皮細胞（Hemogenic endothelium）
ＦＬＴ３－Ｌ ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３レセプターリガンド（ＦＬＴ３リガンド）
ＳＣＦ 幹細胞因子
ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞成長因子、（別名ＦＧＦ２）
ＴＰＯ トロンボポエチン
ＥＰＯ エリスロポエチン
ＩＬｘ インターロイキン、例えば、ＩＬ６：インターロイキン－６
ｕｃＨＳＣ 臍帯血造血幹細胞
ＨＳＣ 造血幹細胞
ｍＡｂ モノクローナル抗体
α 抗、例えば、α－ＣＤ３ｍＡｂ＝抗ＣＤ３モノクローナル抗体

多能性の誘導およびｉＰＳ細胞
高橋および山中が、同時に４つの遺伝子を導入することによってマウス線維芽細胞から胚性幹細胞と類似の特性を有する幹細胞を形成することができることを示したため、人工多能性細胞の形成は、当該技術分野において知られている（Cell. 2006; 126: 663-676）。この原理が２００７年にヒト細胞に適用された（Takahashi et al Cell. 2007; 131: 861-872；Yu et al Science. 2007; 318: 1917-1920）。最近の概説が、Shi et al, Nature Reviews Drug Discovery volume 16, pages 115-130 (2017)によって提供される。

ｉＰＳＣは、一般に、特定のセットの多能性関連遺伝子の生成物、または「リプログラミング因子」を所与の細胞タイプに導入することによって誘導される。リプログラミング因子の元のセット（山中因子とも呼ばれる）は、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。

ｉＰＳ細胞の形成は、誘導に使用される転写因子に依存する。Ｏｃｔ－３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）の特定の生成物は、誘導プロセスに関与する非常に重要な転写制御因子として特定され、それが存在しないと誘導が不可能になる。しかしながら、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８の特定のメンバーを含む付加的な遺伝子が誘導効率を高めることが特定された。

「ＰＯＵ５Ｆ１」、「ＯＣＴ４」および「ＯＣＴ３／４」は、同じ転写因子に対する同義語である。これは、当該技術分野において一般的にＯＣＴ４と呼ばれる転写因子であるが、さらに最近、ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵクラス５ホメオボックス１）と改名されている。これらの名称は、当業者には明白なとおり、本明細書においては同義に使用される。

リプログラミング因子は、細胞中に、当該技術分野において周知であるとおり、一般にウイルスまたはエピソームベクターを使用して導入される。細胞中にリプログラミング因子を導入するのに適したウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルスおよびセンダイウイルスが挙げられる。リプログラミング因子を導入するための他の技術としては、ｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。

例えば、Schlaeger et al Nat Biotechnol. 2015 Jan; 33(1): 58-63によって概説されるとおり、非組み込み型リプログラミング法が当該技術分野において知られている。センダイウイルスリプログラミングでは、リプログラミング因子のセットをコードする複製可能なＲＮＡを標的細胞に形質導入するためにセンダイウイルス粒子が一般に使用される。エピソームリプログラミングでは、長期のリプログラミング因子の発現は、一般に分裂細胞においてエピソームプラスミドＤＮＡ複製を促進するエプスタインバーウイルス由来の配列によって達成される。ｍＲＮＡリプログラミングでは、細胞は、一般にリプログラミング因子をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡによりトランスフェクションされ、外来性の核酸による自然免疫系の活性化を制限するために化学的手段が利用される場合が多い。ｍＲＮＡの半減期は非常に短いため、ｈｉＰＳＣを誘導するためには、毎日のトランスフェクションが必要とされることが多い。

リプログラミング因子のトランスフェクションは、当該技術分野において既知のさまざまな方法において、例えば、リポフェクション、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによって実現されてもよい。

下記の一実施例において、条件付きで不死のＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、「山中因子」、ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２、ならびにＬＩＮ２８をコードする標準的な非組み込み型エピソームベクターを使用して多能性にリプログラミングされた。別の実施例において、ＯＣＴ４単独でＣＴＸ０Ｅ０３の多能性を誘導することが示されている。多能性を実現することが同じく確認された転写因子の組み合わせとしては、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣが挙げられる。

特定の実施形態において、条件付き不死化細胞を多能性にリプログラミングするために、ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１、２、３または４つ、ならびにＬＩＮ２８が使用される。特定の実施形態において、ＯＣＴ４ならびにＬ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１つ以上、ならびにＬＩＮ２８が使用される。いくつかの実施形態において、これらの因子がｃＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ条件付き不死化システムと組み合わせて使用される。

下記の別の実施例（実施例３）において、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞は、転写因子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブインヒビターを発現するリプログラミングプラスミドｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬおよびｐＣＥｍＰ５３ＤＤによりリプログラミングされた。したがって、特定の実施形態において、本発明による使用のための転写因子は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を含んでも、またはそれらからなってもよい。当業者には明白であろうとおり、これらの１、２、３つ以上が除去されるか、または置き換えられてもよい。特定の実施形態において、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子のうちの１、２、３、４つ以上が、条件付き不死化細胞を多能性にリプログラミングするために使用される。いくつかの実施形態において、これらの因子がｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ条件付き不死化システムと組み合わせて使用される。

いくつかの実施形態において、ＭＹＣ活性は、リプログラミングされる幹細胞においてｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子を活性化するために培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、リプログラミングプロセスを促進する。したがって、特定の実施形態において、個別に添加されるＭＹＣは必要ない。

条件付き不死化細胞
本発明は、条件付き不死化細胞を採取し、それが多能性表現型を有するよう誘導する。条件付き不死化細胞は、一般に条件付き不死化幹細胞、例えば、条件付き不死化成体幹細胞である。

条件付き不死化細胞は、一般に哺乳動物のもの、より一般にヒトのものである。

幹細胞は、当該技術分野において知られている。幹細胞は、増殖する能力、生物の寿命を超えて自己維持または再生を示す能力およびクローン的に関連する後代を形成する能力を有する細胞である。本発明によりリプログラミングされた幹細胞は、一般に多能性細胞である。本発明によりリプログラミングされた幹細胞は、一般に成体（体細胞）幹細胞である。

本発明に使用するための幹細胞は、単離される。「単離される」という用語は、それが言及する細胞または細胞集団が天然の環境内にないことを示す。細胞または細胞集団は、周辺組織から実質的に分離されている。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、サンプルが少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％幹細胞を含む場合に、周辺組織から実質的に分離されている。言い換えると、サンプルは、サンプルが約２５％未満、いくつかの実施形態において、約１５％未満、およびいくつかの実施形態において、約５％未満の幹細胞以外の材料を含む場合に、周辺組織から実質的に分離されている。そのようなパーセンテージの値は、重量パーセンテージを指す。この用語は、細胞が由来する生物から取り出されて、培養物中に存在する細胞を包含する。この用語はまた、細胞が由来する生物から取り出されて、その後、その生物に再び挿入された細胞も包含する。再び挿入された細胞を含む生物は、細胞が取り出された同じ生物であってもよく、または異なる生物であってもよい。

幹細胞は、一般に本発明により生成される後代細胞の任意の将来的なレシピエントと同種異系である。

本発明は、不死化因子の発現が治療に有効な幹細胞の生成に悪影響を及ぼすことなく制御され得る条件付き不死化幹細胞、例えば、幹細胞株を使用する。これは、細胞が活性化薬剤を供給されない場合に不活性である不死化因子を導入することによって実現されてもよい。そのような不死化因子は、ｃ－ｍｙｃＥＲなどの遺伝子であってもよい。ｃ－ＭｙｃＥＲ遺伝子産物は、変異エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと融合したｃ－Ｍｙｃバリアントを含む融合タンパク質である。Ｃ－ＭｙｃＥＲのみが、合成ステロイド４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の存在下において細胞増殖を駆動する（Littlewood et al. 1995）。このアプローチは、インビトロにおける神経幹細胞の制御された増殖を可能にすると同時に、ｃ－Ｍｙｃまたは神経幹細胞株中のそれをコードする遺伝子の存在に起因するホストの細胞増殖に対するインビボでの望ましくない影響（例えば、腫瘍形成）を回避する。

Ｍｙｃがん遺伝子ファミリーの他のメンバーがｃ－Ｍｙｃと同等の様式で条件付き不死化剤として使用されてもよい。したがって、不死化因子は、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－ＭｙｃまたはＶ－Ｍｙｃを含んでもよい。Ｍｙｃがん遺伝子は、一般に、変異エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと融合されて、Ｌ－ＭｙｃＥＲ、Ｎ－ＭｙｃＥＲまたはＶ－ＭｙｃＥＲを形成することになる。本発明者らは、図２４に示される、Ｌ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭコンストラクトを首尾よく作り出した。

ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭコンストラクトに関する特有の利点は、制御性および関連する安全性の特徴である。

条件付き不死化のために使用可能な別の遺伝子は、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）である。また、条件付き不死化はＳＶ４０ラージＴ抗原およびその温度感受性バリアントを使用して首尾よく達成された。例えば、国際公開第０１／２１７９０号パンフレット（ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されているとおりのこれらのアプローチは、当該技術分野において知られている。

不死化遺伝子は、任意に、条件付きで不死化されるよう操作される細胞のゲノム内のセーフハーバー部位（safe harbour site）に組み込まれてもよい。セーフハーバーゲノム部位は、他の遺伝要素の発現に著しい変化を引き起こすことなく導入遺伝子が挿入され、発現され得る部位である。既知のセーフハーバー部位の例は、ヒト染色体１９上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られているＡＡＶＳ１である。セーフハーバーの別の例は、本明細書に記載されているＣＴＸ０Ｅ０３細胞株のｃ－ＭｙｃＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子に関する挿入部位であり、これは、ヒト染色体１３ｑ１２．１２上のＳＰＡＴＡ１３遺伝子内にある。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞における挿入の正確な位置は、Ｐ末端からヌクレオチド２４，０８３，３３１～３３２ｂｐの間の（ＧＲＣｈ３８）染色体１３ｑ１２．１２上である。ただし、例えば、その特定の部位の１０ｋｂ以内、もしくは５ｋｂ以内、２．５ｋｂ以内、例えば、１０００ｂｐ以内もしくは５００ｂｐ以内のそのおおまかな領域の部位が本発明により標的とされる場合、同等の結果が得られる可能性があることが予測される。特定の実施形態において、改変のために標的とされる遺伝子座は、ＳＰＡＴＡ１３遺伝子のイントロン内にある場合がある。さらなる実施形態において、遺伝子座は、ＳＰＡＴＡ１３遺伝子の第３のイントロン内にある。一般に、遺伝子座は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＸ６４８２４４のｃＤＮＡクローンの第３のイントロン内にある。さらに具体的には、遺伝子座は、染色体１３ｑ１２．１２上のＰ末端からヌクレオチド２４，０８３，２５０～４００ｂｐの間の任意の場所、Ｐ末端からヌクレオチド２４，０８３，３００～３５０ｂｐの間の任意の場所、またはＰ末端からヌクレオチド２４，０８３，３２５～３３５ｂｐの間の任意の場所にあってもよい。

挿入部位は、「ＧＲＣｈ３８：１３：２４０８３３３１～２４０８３３３２」と言及される。当業者には明白であろうとおり、ＧＲＣｈ３８は、ＵＣＳＣブラウザによって現在使用されているヒトゲノムリファレンスのバージョンを指す。

特定の実施形態において、条件付き不死化幹細胞は、以下のものであってもよい：
間葉系幹細胞、任意に骨髄由来幹細胞、子宮内膜再生細胞、間葉系前駆細胞または多能性成体前駆細胞から選択される；
神経幹細胞；
造血幹細胞、任意にＣＤ３４＋細胞および／または臍帯血から単離されたか、あるいは任意にＣＤ３４＋／ＣＸＣＲ４＋細胞である；
非造血性臍帯血幹細胞（non-haematopoietic umbilical cord blood stem cell）；あるいは
脂肪組織由来の間葉系幹細胞。

これらの実施形態のそれぞれにおいて、細胞は、一般に哺乳動物のもの、より一般にヒトのものである。

一般に、条件付き不死化幹細胞は、神経幹細胞、例えば、ヒト神経幹細胞である。

神経幹細胞は、発生の過程においてニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞を生じ、成体の脳において多くの神経系細胞を置き換えることができる。本発明による特定の態様に使用するための典型的な神経幹細胞、とりわけ、神経系の表現型マーカー、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、ネスチン、ＮｅｕＮ、クラスＩＩＩ β－チューブリン、ＧＦＡＰ、ＮＦ－Ｌ、ＮＦ－Ｍ、微小管結合タンパク質（ＭＡＰ２）、Ｓ１００、ＣＮＰａｓｅ、グリピカン、（とりわけ、グリピカン４）、神経型ペントラキシンＩＩ、神経型ＰＡＳ１、神経成長関連タンパク質４３、神経突起成長伸長タンパク質（neurite outgrowth extension protein）、ビメンチン、Ｈｕ、インターネキシン、０４、ミエリン塩基性タンパク質およびプレイオトロフィンのうちの１つ以上を呈する細胞である。

神経幹細胞は、幹細胞株、すなわち、安定して分裂する幹細胞の培養物由来であってもよい。幹細胞株は、単一の定義されたソースを使用して大量で増殖させられてもよい。

好ましい条件付き不死化神経幹細胞株としては、ＣＴＸ０Ｅ０３、ＳＴＲ０Ｃ０５およびＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株が挙げられ、これらは、本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄによって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧに受託番号０４０９１６０１（ＣＴＸ０Ｅ０３）；受託番号０４１１０３０１（ＳＴＲ０Ｃ０５）；および受託番号０４０９２３０２（ＨＰＣ０Ａ０７）で寄託された。これらの細胞の由来および起源は、欧州特許第１６４５６２６号明細書および米国特許第７４１６８８８号明細書に記載されており、ともに参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

ＣＴＸ０Ｅ０３（ＥＣＡＣＣ寄託番号０４０９１６０１）
ＣＴＸ０Ｅ０３は、虚血性脳卒中および肢損傷の治療としての臨床試験中の神経幹細胞株である。これは、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭ融合タンパク質の組み込みによって制御可能に不死化され、この融合タンパク質は、ＥＲ^ＴＡＭドメインの合成エストロゲン誘導体４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）との結合時に核に移動し、そこでＣ－ＭＹＣドメインが無限の細胞周期を助長する。Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭの発現は、細胞表現型に影響を及ぼさないようである。したがって、無制限に多くの患者が、「すぐに利用できる」同種異系療法としてＣＴＸにより処置可能である。導入遺伝子は、４－ＯＨＴの除去時および／または患者への送達の除去時に発現停止することが示された。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、以下の培養条件において培養されてもよい：
・ヒト血清アルブミン ０．０３％
・トランスフェリン、ヒト ５μｇ／ｍｌ
・プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ
・インスリンヒト組み換え型 ５μ／ｍｌ
・プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ
・Ｌ－グルタミン ２ｍＭ
・亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）および４－ヒドロキシタモキシフェン（１００ｎＭ）。細胞は、４－ヒドロキシタモキシフェンの除去によって分化させることができる。一般に、細胞は、５％ ＣＯ_２／３７℃または５％、４％、３％、２％もしくは１％ Ｏ_２の低酸素条件下のいずれかで培養することができる。これらの細胞株は、首尾よく培養するために血清を必要としない。血清は、多くの細胞株の順調な培養に必要とされるが、多くの混入物を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３、ＳＴＲ０Ｃ０５もしくはＨＰＣ０Ａ０７神経幹細胞株、または血清を必要としない任意の他の細胞株の別の利点は、血清による汚染が回避されることである。本発明の一部の実施形態において、例えば、リプログラミングのステップおよび人工多能性幹細胞の培養のステップのためにＥ８培地を使用することによって、系内に血清がない状態を維持することができる。

ＣＴＸ培養培地は、所望の場合、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子によりＭＹＣ活性を得るために、４－ＯＨＴが加えられても、または加えられなくてもよい。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、元は１２週ヒト胎児の大脳皮質由来の多能性細胞である。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株に関する単離、製造およびプロトコルは、Ｓｉｎｄｅｎらによって詳細に記載されている（米国特許第７，４１６，８８８号明細書および欧州特許第１６４５６２６号明細書）。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、「胚性幹細胞」ではない。すなわち、それらは、胚盤胞の内部細胞塊由来の多能性細胞ではない。元の細胞の単離は、胚の破壊を招かなかった。増殖培地では、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、ネスチン陽性で、ＧＦＡＰ陽性細胞は低いパーセンテージである（すなわち、集団は、ＧＦＡＰに関して陰性である）。

ＣＴＸ０Ｅ０３は、レトロウイルス感染によって送達されたｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子の単一コピーを含むクローン細胞株であり、４－ＯＨＴ（４－ヒドロキシタモキシフェン）によって条件付きで制御される。Ｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子は、４－ＯＨＴの存在下において細胞増殖を刺激する融合タンパク質を発現するため、４－ＯＨＴの存在下で培養される場合、制御された増殖を可能にする。この細胞株は、クローンであり、培養において急速に増え（倍加時間５０～６０時間）、正常なヒト核型（４６ＸＹ）を有する。これは、遺伝学的に安定で、大量に増殖させることができる。この細胞は、安全で、腫瘍形成性ではない。成長因子および４－ＯＨＴの非存在下では、この細胞は、増殖停止を受けて、ニューロンおよび星状細胞に分化する。虚血性損傷脳に移植されると、これらの細胞は、組織損傷の領域にのみ遊走する。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の開発は、臨床的使用のための一貫した生産のスケールアップを可能にした。保存された材料からの細胞の生産は、商業用途用の量で細胞を形成することを可能にする（Hodges et al, 2007）。

ＣＴＸ０Ｅ０３医薬品は、生細胞の得られたばかりのものとして（ＰＩＳＣＥＳ試験の場合と同様に）または米国特許第９２６５７９５号明細書に記載され、ＰＩＳＣＥＳ ＩＩ試験に使用されたとおり、凍結懸濁液として提供されてもよい。医薬品は、一般に≦３７の継代のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を含む。

ＣＴＸ臨床医薬品は、一般に何か月もの品質保持期間を有する、溶媒を含まない賦形剤中の「すぐに利用できる」凍結保存製品（例えば、米国特許第９２６５７９５号明細書に記載されているとおり）として製剤化される。この製剤は、一般にトロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｌ^－、Ｈ_２ＰＯ_４ ^－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオナート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン－４０、アデノシンおよびグルタチオンを含む。これらの賦形剤のうちの１つ以上、例えば、２、３または４つが任意に除去されても、または置き換えられてもよい。一般に、本製剤は、両性非プロトン溶媒、特に、ＤＭＳＯを含まない。

幹細胞製品に対する臨床発売基準は、一般に無菌性、純度（細胞数、細胞生存率）、ならびに臨床製品発売のため、または規制当局に要求される情報のために必要とされる同一性、安定性、および効力の多くの他の試験の基準を含む。ＣＴＸ０Ｅ０３に利用される試験の概要を、下記表１に示す。

ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株は、ヒトＰＢＭＣアッセイを使用して免疫原性でないことが以前に証明された。免疫原性がないことは、細胞がホスト／患者免疫系による排除を回避するのを可能にし、それによって有害な免疫および炎症応答なくその治療効果を発揮する。

Pollock et al 2006は、脳卒中のラットモデル（ＭＣＡｏ）におけるＣＴＸ０Ｅ０３の移植が、移植後６～１２週に感覚運動機能および粗大運動の非対称性の両方において統計学的に有意な改善をもたらしたことを示している。これらのデータは、ＣＴＸ０Ｅ０３が治療用細胞株として開発するために必要な適した生物学的および製造特性を有することを示す。

Stevanato et al 2009は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび４－ＯＨＴ除去後インビトロにおいて、およびＭＣＡｏラット脳に移植後インビボにおいての両方でｃ－ｍｙｃＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子発現をダウンレギュレートしたことを確認している。インビボにおけるｃ－ｍｙｃＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子のサイレンシングは、潜在的な臨床用途に対してＣＴＸ０Ｅ０３細胞のさらなる安全性の特徴をもたらす。

Smith et al 2012は、脳卒中（一過性中大脳動脈閉塞）のラットモデルにおけるＣＴＸ０Ｅ０３の前臨床効力試験について記載している。この結果は、ＣＴＸ０Ｅ０３移植が、行動機能障害を３か月の時間枠にわたって大きく回復させ、この効果は、その移植の部位に特異的であることを示す。病変のトポロジーが、回復における潜在的に重要な要素であり、線条体に限られた脳卒中はより大きな領域の損傷と比較して良好な予後を示す。

ＳＴＲ０Ｃ０５（ＥＣＡＣＣ寄託番号０４１１０３０１）
このｃ－ＭｙｃＥＲ^ＴＡＭ形質導入神経幹細胞株は、１２週胎児の線条体由来であった。この株は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよび４－ヒドロキシタモキシフェンの存在下の合成無血清「ヒト培地」を使用して、ラミニンコーティング培養フラスコにおいて維持される。通常の培養において、この細胞株は、３～４日の倍加時間を有するが、短期間培養では、２０～３０時間の倍加時間が見られた。

増殖培地において、この細胞は、ネスチン陽性、ベータ－ＩＩＩチューブリン陰性であり、ＧＦＡＰ陽性細胞は低いパーセンテージである。７日間の分化後、ベータＩＩＩチューブリンの低レベル発現およびＧＦＡＰの高発現を伴いネスチンがダウンレギュレートされ、これは、この細胞株の大部分が星状細胞になること示唆する。

この細胞株は、遺伝学的に正常、男性ＸＹで、５０集団倍加にわたって安定なものである。

ここに記載される株は、臨床的使用に指定された株を発展させるのに適した品質が保証された条件下で誘導された。ソース材料として、ヒト神経幹細胞は、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンによる酵素消化によって、妊娠１２週の胎児ＧＳ００６の線条体から死後に単離された。培養において確立されると、これらの一次神経系細胞は、ｃ－ＭｙｃＥＲ^ＴＡＭがん遺伝子によるレトロウイルストランスダクションによって形質転換され（上でＣＴＸ０Ｅ０３細胞株に関して記載されているとおり）、ある範囲のクローン性および混合性集団細胞株が単離された。この系統のすべての株は、ラミニンコーティング培養製品において、ヒト培地（ＨＭ）；ＤＭＥＭ：Ｆ１２プラス以下に示される指定された補充物を使用して誘導された。

ヒト培地（ＨＭ）
以下に列挙される成分を加えたＤＭＥＭ：Ｆ１２：
ヒト血清アルブミン ０．０３％。
トランスフェリン、ヒト １００μｇ／ｍｌ。
プトレシン二塩酸塩 １６．２μｇ／ｍｌ。
インスリン、ヒト組み換え型 ５μｇ／ｍｌ。
Ｌ－チロキシン（Ｔ４） ４００ｎｇ／ｍｌ。
トリヨードサイロニン（Ｔ３） ３３７ｎｇ／ｍｌ。
プロゲステロン ６０ｎｇ／ｍｌ。
Ｌ－グルタミン ２ｍＭ。
亜セレン酸ナトリウム（セレン） ４０ｎｇ／ｍｌ。
ヘパリン、ナトリウム塩 １０単位／ｍｌ。
コルチコステロン ４０ｎｇ／ｍｌ。
加えて、細胞増殖のための塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）。

ＳＴＲ０Ｃ０５増殖特性
通常の培養条件下において、細胞は、Ｔ１８０培養フラスコ中で凍結ストック、一般には２～４百万細胞から増殖させる。数回の培地変更後、コンフルエントなときに細胞を継代する。経過記録から、ＳＴＲ０Ｃ０５に関する集団倍加時間は、下記グラフに示されるとおり３～４日と推定された。この倍加時間は、対数期増殖よりもゆっくりであり、継代中の細胞喪失も含む。

ＳＴＲ０Ｃ０５に関する対数期増殖のより代表的な評価として、Ｃｙｑｕａｎｔ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した細胞増殖アッセイを設定した。細胞数をＴｅｃａｎ Ｍａｇｅｌｌａｎ蛍光プレートリーダー（励起４８０ｎｍ、蛍光５２０ｎｍ）を使用して測定する。

ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を継代し、ＨＭ＋成長因子中に再懸濁させ、ラミニンコーティング９６ウェルストリップウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播いた。毎日プレートからストリップを取り出し（各時点につきｎ＝１６ウェル）、培地を除去し、－７０℃で細胞を凍結することによって、経時的研究を行った。

時間経過の終わりに、凍結したすべてのストリップをプレートに一緒に戻し、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイにより分析した。簡単に言えば、細胞を溶解バッファーに溶解させた後、Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を添加し、暗所に５分間置いた。各ウェルの１５０ｕｌのサンプルを、その後、Ｔｅｃａｎ Ｍａｇｅｌｌａｎプレートリーダーにおける読み取りのために黒色のＯｐｔｉｌｕｘプレートに移した。数値平均化のためにＥｘｃｅｌスプレッドシートにデータをエクスポートし、解析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにさらにエクスポートした。

これらの結果は、細胞が７日間にわたり着実に増殖し、推定される倍加時間が２０～３０時間であったことを示した。

ＳＴＲ０Ｃ０５表現型
神経幹細胞マーカー、ネスチンを染色するため、および分化の成熟マーカー、β－ＩＩＩチューブリン（神経細胞）およびＧＦＡＰ（星状細胞）を染色するために免疫細胞化学を使用してＳＴＲ０Ｃ０５の表現型をプロファイリングした。

ＳＴＲ０Ｃ０５の表現型を、成長因子＋４－ＯＨＴの存在下および非存在下において判定した。細胞を、最初はＳＴＲ０Ｃ０５ワーキングストックから得た。細胞を継代し、９６ウェルプレートに播いた。

細胞を、４％パラホルムアルデヒド中において室温で１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００／ＰＢＳで１５分間透過処理をした。非特異的結合を、その後、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で室温において１時間ブロッキングした。細胞を、その後、ネスチン（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、β－ＩＩＩチューブリン（１：５００；Ｓｉｇｍａ）およびＧＦＡＰ（１：５０００；ＤＡＫＯ）に対する抗体を用いて室温で一晩プローブ付けした(probed)。ＰＢＳで洗浄した後、それらを、その後、１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中に溶解させたろ過済みＡｌｅｘａ Ｇｏａｔ α Ｍｏｕｓｅ ４８８（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｇｏａｔ α Ｒａｂｂｉｔ ５６８（１：２５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により室温で１時間処理した。それらを、その後、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡において分析する前にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）で２分間対比染色した。

培地からの成長因子および４－ＯＨＴの除去が、細胞における形態的および表現型の変化を誘導し、これは、ネスチンのダウンレギュレーションに付随して起こる。特に、小さな割合の細胞が神経細胞マーカー、β－ＩＩＩチューブリンに関して陽性になり、樹状／軸索突起に延びる丸い細胞体を有する神経細胞の形態を獲得する。しかしながら、より主要な表現型変化は、ＧＦＡＰのアップレギュレーションであり、これは、星状細胞系列の優勢を示唆する。

クローン性
ＳＴＲ０Ｃ０５に対するサザンブロット
２つの別々の実験では、他の細胞株に見られる明らかなバンドとは対照的にプローブハイブリダイゼーションの証拠がない。

細胞集団
本発明は、単離された幹細胞の集団を使用し、それに関し、この集団は、基本的に本発明の幹細胞のみを含み、すなわち、幹細胞集団は実質的に純粋である。多くの態様において、幹細胞集団は、全細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約７５％、または少なくとも８０％（他の態様において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％）の本発明の幹細胞を含む。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、全細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％純粋な神経幹細胞が存在することを意味する。したがって、「実質的に純粋な」という用語は、約２５％未満、いくつかの実施形態において、約１５％未満、およびいくつかの実施形態において、約５％未満の神経幹細胞ではない細胞を含む本発明の幹細胞の集団を指す。

単離された幹細胞は、特定のマーカーに関する特有の発現プロフィールによって特徴づけることができ、他の細胞タイプの幹細胞と識別される。マーカーが本明細書に記載されている場合、その有無が神経幹細胞を識別するために使用されてもよい。

神経幹細胞集団は、いくつかの実施形態において、集団の細胞が、マーカー、ネスチン、Ｓｏｘ２、ＧＦＡＰ、βＩＩＩチューブリン、ＤＣＸ、ＧＡＬＣ、ＴＵＢＢ３、ＧＤＮＦおよびＩＤＯのうちの１、２、３、４、５つ以上、例えば、すべてを発現することを特徴としてもよい。

一般に、神経幹細胞は、ネスチン陽性である。

「マーカー」とは、生体分子を指し、その存在、濃度、活性、またはリン酸化状態を検出することができ、細胞の表現型を特定するために使用することができる。

本発明の細胞は、一般に集団の細胞の少なくとも約７０％が検出可能なレベルのマーカーを示す場合に、マーカーをもつと見なされる。他の態様において、集団の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９７％または少なくとも約９８％以上が検出可能なレベルのマーカーを示す。特定の態様において、集団の少なくとも約９９％または１００％が、検出可能なレベルのマーカーを示す。マーカーの定量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の使用により、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により検出することができる。当然のことながら、このリストは例として提供されたものに過ぎず、限定することを意図しない。一般に、本発明の神経幹細胞は、集団の細胞の少なくとも約９０％が、ＦＡＣＳによって検出される検出可能なレベルのマーカーを示す場合に、マーカーをもつと見なされる。

「発現される」という用語は、細胞内のマーカーの存在を示すために使用される。発現されると見なされるためには、マーカーは、検出可能なレベルで存在しなければならない。「検出可能なレベル」とは、マーカーが、ｑＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲ、ブロッティング、マススペクトロメトリーまたはＦＡＣＳ分析などの標準的な実験室的手法のうちの１つを使用して検出することができることを意味する。遺伝子は、発現が３５以下のクロッシングポイント（ｃｐ）値（ｑＲＴ－ＰＣＲアレイに対する標準的なカットオフ）で適度に検出できる場合に、本発明の細胞の集団によって発現されると見なされる。Ｃｐは、増幅曲線が検出閾値と交差する点を表し、交差閾値（crossing threshold）（ｃｔ）として報告される場合もある。

「発現する」および「発現」という用語は、対応する意味を有する。このｃｐ値未満の発現レベルでは、マーカーは、発現されていないと見なされる。本発明の幹細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば、間葉系幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの間の比較は、好ましくは、同じ種から単離された２つの細胞タイプを比較することによって行われてもよい。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくは、この種はヒトである。そのような比較は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）実験を使用して都合よく行える。

本明細書中で使用される場合、マーカーに関して使用されるとき、「著しい発現」という用語またはその同等の用語「陽性」および「＋」は、細胞集団において、細胞のうちの２０％超、好ましくは、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超またはさらにはすべての細胞が前記マーカーを発現することを意味するものと解釈される。

本明細書中で使用される場合、マーカーに対して使用されるとき、「陰性」または「－」は、細胞集団において、細胞の２０％未満、１０％未満、好ましくは、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満が前記マーカーを発現するか、または発現していないことを意味するものと解釈される。

細胞表面マーカーの発現は、特定の細胞表面マーカーに対するシグナルがバックグラウンドシグナルよりも大きいかどうかを判定するために、例えば、従来法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野において知られている標準的なプロトコルとともに使用されるＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ ＦＡＣＳシステム）を使用した特定の細胞表面マーカーに対するフローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって判定されてもよい。バックグラウンドシグナルは、各表面マーカーを検出するために使用される特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体によって形成されるシグナル強度と定義される。陽性と見なされるマーカーに対して観察される特定のシグナルは、一般にバックグラウンドシグナル強度と比較して、２０％超、好ましくは、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、５００％超、１０００％超、５０００％超、１００００％超またはそれ以上大きい。目的とする細胞表面マーカーの発現を分析するための代替的な方法としては、目的とする細胞表面マーカーに対する抗体を使用した電子顕微鏡法による視覚的分析が挙げられる。

幹細胞培養および生成
幹細胞培養用の単純なバイオリアクターは、一般的に使用されるＴ－１７５フラスコ（例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）１７５ｃｍ^２細胞培養フラスコ、７５０ｍｌ、組織培養処理ポリスチレン、ストレートネック、青いプラグシールスクリューキャップ、ＢＤ製品コード３５３０２８）などのシングルコンパートメントフラスコである。

条件付き不死化幹細胞は、一般にＴ－１７５またはＴ－５００フラスコ中で培養される増殖性幹細胞から採取されてもよい。

バイオリアクターはまた、当該技術分野において知られているとおり複数のコンパートメントを有してもよい。これらのマルチコンパートメントバイオリアクターは、一般に気体および／または培養培地を収容する１つ以上のコンパートメントから細胞を収容するコンパートメントを分離する１つ以上の膜または仕切りによって分離された少なくとも２つのコンパートメントを含む。マルチコンパートメントバイオリアクターは、当該技術分野において周知である。マルチコンパートメントバイオリアクターの例は、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣｅＬＬｉｎｅバイオリアクターであり、これは、１０ｋＤａ半透膜によって分離された培地コンパートメントおよび細胞コンパートメントを含み、この膜は、任意の阻害性廃棄物の同時除去とともに細胞コンパートメントへの栄養素の継続的な拡散を可能にする。コンパートメントの個々へのアクセス性は、培養を機械的に妨げることなく新しい培地を細胞に供給することを可能にする。シリコーン膜は、細胞コンパートメント底部を形成し、細胞コンパートメントに短い拡散経路を与えることによって最適な酸素供給および二酸化炭素レベルの制御をもたらす。任意のマルチコンパートメントバイオリアクターを本発明に従って使用することができる。

「培養培地」または「培地」という用語は、当該技術分野において認識され、一般に生細胞の培養に使用される任意の物質または調製物を指す。細胞培養を言及する際に使用される「培地」という用語は、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は、固体、液体、気体または相および材料の混合物であってもよい。培地としては、液体増殖培地ならびに細胞増殖を持続しない液体培地が挙げられる。培地としてはまた、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン状の培地も挙げられる。例となる気体培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で増殖している細胞が曝露される気相が挙げられる。「培地」という用語はまた、それが、まだ細胞と接触させられていなくても細胞培養への使用が意図される材料も指す。言い換えると、培養のために調製される栄養素が豊富な液体が培地である。同様に、水またはその他の液体と混合されたときに細胞培養に適するようになる粉末混合物が「粉末培地」と呼ばれる場合もある。「合成培地」は、化学的に定義された（通常、精製された）成分から生成される培地を指す。「合成培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスなどの十分に特徴づけられていない生物抽出物を含まない。「富栄養培地」は、特定の種のほとんどまたはすべての生存可能な形態の増殖を助けるよう設計された培地を含む。富栄養培地は、複雑な生物抽出物を含む場合も多い。「高密度培養の増殖に適した培地」は、他の条件（温度および酸素移動速度など）がそのような増殖を可能にする場合、３以上のＯＤ６００に達する細胞培養を可能にする任意の培地である。「基本培地」という用語は、いかなる特別な栄養補助剤も必要としない、多くのタイプの微生物の増殖を促進する培地を指す。大半の基本培地は、一般に４つの基本的な化学物質のグループ：アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミンから構成される。基本培地は、一般に、血清、バッファー、成長因子、脂質などの補充物が添加されるより複雑な培地の基礎としての役割を果たす。一態様において、増殖培地は、本発明の細胞の増殖および拡大を助けると同時にその自己再生能力を維持する必須の成長因子を含む複合培地であってもよい。基本培地の例としては、イーグル基本培地、最小必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０およびＨａｍ’ｓ Ｆ－１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭ／Ｆ－Ｉ ２、ＲＰＭＩ １６４０、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の多能性細胞およびそれらの後代によって産生される細胞外小胞
本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、細胞外小胞を産生することになる。一態様において、本発明は、本発明の人工多能性幹細胞から、またはそれらのｉＰＳ細胞から形成される分化細胞から得ることができる細胞外小胞を提供する。これらの微粒子は、治療に使用することができる。

本発明の細胞から得られる細胞外小胞はまた、外来性カーゴのための送達ビヒクルとしても使用することができる。カーゴは、いくつかの実施形態において、外来性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特に、ＲＮＡｉ薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは化学修飾ｓｉＲＮＡ）、外来性タンパク質（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、シグナル伝達タンパク質、またはタンパク質薬物）であってもよい。例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、カーゴを細胞外小胞に直接入れることができることが当該技術分野において知られている。細胞外小胞を産生する細胞を操作することにより細胞外小胞の内容物を変えることができることも知られている。

細胞外小胞の性質、内容物および特徴は、それらを産生する細胞の影響を受ける。したがって、本発明は、有利にも単一の十分に特徴づけられた出発材料（すなわち、条件付き不死化細胞）から産生される多様な範囲の細胞外小胞を提供する。例えば、細胞外小胞は、ｉＰＳ細胞、または内胚葉、中胚葉もしくは外胚葉系になった細胞などのその細胞由来の任意のさらに分化した細胞から単離することができる。これは、単一の既知の開始細胞からの多くの異なる細胞外小胞の供給を可能にする。

「細胞外小胞」（過去の公報では、一般用語「微粒子」によって言及される場合もある）は、細胞から放出される直径３０から１０００ｎｍの脂質二重膜粒子である。これは、生体分子を封入する脂質二重膜によって限定される。「細胞外小胞」という用語は、当該技術分野において知られており、膜粒子、膜小胞、微小胞、エクソソーム様小胞、エクソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソームまたはエキソベシクル（exovesicle）を含む、多くの異なる種の細胞外小胞を包含する。さまざまな異なるタイプの細胞外小胞は、直径、細胞内起源、スクロース中におけるその密度、形状、沈殿速度、脂質組成物、タンパク質マーカーおよび分泌の様式（すなわち、シグナルに従う（誘導型）か、または自然に（構成型）か）に基づいて識別される。細胞外小胞の３つの主要なタイプは、現在、一般に生合成および小胞のサイズに基づいて認識されている：１）エクソソーム、２）微小胞（微粒子として知られている場合もある）および３）アポトーシス小体。

一般的な細胞外小胞およびそれらの際だった特徴を下記表１に記載する。特定の実施形態において、細胞外小胞は、エクソソームである。

細胞外小胞は、直接的および間接的なメカニズムによりドナー細胞とレシピエント細胞の間でビヒクルの役割を果たすことによって細胞間伝達に関与すると考えられる。直接的なメカニズムは、レシピエント細胞による細胞外小胞およびそのドナー細胞由来の成分（タンパク質、脂質または核酸など）の取り込みを含み、その成分は、レシピエント細胞において生物学的活性を有する。間接的なメカニズムは、微小胞－レシピエント細胞表面相互作用、およびレシピエント細胞の細胞内シグナル伝達の調節をもたらすことを含む。したがって、細胞外小胞は、レシピエント細胞による１つ以上のドナー細胞由来の特性の獲得をもたらすこともある。動物モデルにおける幹細胞療法の効力にもかかわらず、幹細胞は、ホストに生着しないようであることが確認された。したがって、幹細胞療法が有効なメカニズムは、明らかでない。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、神経幹細胞によって分泌される細胞外小胞がそれらの細胞の治療有用性に関与し、したがって、それら自体が治療的に有用であると考える。

本発明の細胞外小胞は、細胞に関して本明細書中で定義されるとおり単離される。

本発明は、本発明の細胞によって産生される単離された幹細胞細胞外小胞の集団を提供し、その集団は、基本的に本発明の細胞外小胞のみを含み、すなわち、細胞外小胞集団は、純粋である。多くの態様において、細胞外小胞集団は、少なくとも約８０％（他の態様において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％）の本発明の細胞外小胞を含む。

特定の実施形態において、細胞外小胞は、エクソソームである。エクソソームの脂質二重膜は、一般にコレステロール、スフィンゴミエリンおよびセラミドが豊富である。エクソソームはまた、１つ以上のテトラスパニンマーカータンパク質を発現する。テトラスパニンとしては、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ８２およびＣＤ３７が挙げられる。ＣＤ６３は、典型的なエクソソームマーカーである。エクソソームはまた、成長因子、サイトカインおよびＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡを含む場合もある。エクソソームは、一般にマーカーＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ１０９、ｔｈｙ－１およびＣＤ１３３のうちの１つ以上を発現する。Ａｌｉｘ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＵＭ４）、ＴＳＧ１０１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９９８１６）ならびにテトラスパニンタンパク質ＣＤ８１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ６００３３）およびＣＤ９（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２１９２６）は、特徴的なエクソソームマーカーである。

Ａｌｉｘは、エンドソームの経路マーカーである。本発明のエクソソームは、一般にＡｌｉｘが陽性である。微小胞は、一般にＡｌｉｘが陰性である。

いくつかの実施形態において、エクソソームなどの細胞外小胞は、外来性カーゴを搭載できる。外来性カーゴは、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、薬物、プロドラッグ、ホルモン、診断用薬剤、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ薬剤、またはＤＮＡもしくはＲＮＡベクター）、炭水化物あるいは他の目的とする分子が可能である。カーゴは、例えば、エレクトロポレーションもしくはトランスフェクションによってエクソソームに直接入れることができ、またはエクソソーム放出前に細胞がカーゴをエクソソームにカプセル化するようにエクソソームを産生する細胞を操作することによってエクソソームに入れることができる。カーゴをエクソソームなどの細胞外小胞に入れることは、当該技術分野において知られている。

医薬組成物
本発明の多能性幹細胞は、治療に有用であり一般に造血系のものである細胞を形成するために分化させられてもよく、したがって、医薬組成物として製剤化することができる。本発明の多能性幹細胞、およびそれらの細胞から形成される分化細胞は、本明細書中の別の場所に記載されているとおり細胞外小胞を産生することになり、それも治療に有用であるため、医薬組成物として製剤化することができる。特に、事実上無制限の量の造血系の細胞、特に、本明細書に記載されている免疫系細胞のスケーラブルな生成は、これらの細胞の配合物をすぐに利用できる医薬製品にすることができる。例えば、細胞は、多くの患者の迅速な「すぐに利用できる」同種異系の処置用に一定分量（例えば、個々の投与量）で凍結保存されてもよい。この用途に特に適した細胞としては、高分化細胞、例えば、特定の操作された腫瘍レセプターをもつＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＨＳＣもしくはさまざまな範囲の能力および増殖潜在性を有する系列前駆細胞の両方が挙げられる。

特定の実施形態において、医薬組成物は、凍結されている。

特定の実施形態において、医薬組成物は、凍結保存されている。

特定の実施形態において、医薬組成物は、凍結乾燥されている。

医薬組成物が、凍結、凍結保存または凍結乾燥されている場合、これは、一般に患者への投与に先立って、必要に応じて解凍、または復元される。

いくつかの実施形態において、非高分化細胞の集団が、保管、例えば、凍結される。一実施形態において、これは、後で患者に移植される好中球を形成するために、必要とされるときに適切な提供された試薬を用いて短期間で（例えば、病院またはクリニックにおいて）解凍および培養される骨髄芽球である場合もあるであろう。下記実施例において示されるとおり、一部の筋芽細胞は、ＣＤ７およびＣＤ３４を発現する。好中球は、がん処置および感染性疾患の処置を含む多くの治療において有用である。

多量に生成するのが難しいことの多い成体幹細胞または組織前駆細胞タイプのスケーラブルな増殖が本発明の特有の利点である。例えば、骨髄芽球は、それ自体が全造血系を形成することができる多能性ＨＳＣの下流の少能性ＡＳＣタイプであり、したがって、特に有用であることが予想される。

好中球に関して、これらの細胞内の顆粒は、壊れやすく、好中球を凍結／解凍した後の脱顆粒の潜在的な問題は、処置のために患者に投与する直前に解凍し、凍結されていた骨髄芽球を分化させることによって回避することができる。好中球は、ＳＣＦおよびＧ－ＣＳＦを使用して条件付きＨｏｘｂ８不死化前駆細胞からインビトロで分化させることができる。

薬学的に許容される組成物は、一般に、治療用細胞または細胞外小胞に加えて少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクルおよび／または賦形剤を含む。適した担体の例は、乳酸リンゲル液である。そのような成分の十分な解説は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472に示されている。

「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激症状、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なく、釣り合いのとれた妥当な利益／リスク比で、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すよう本明細書において利用される。

本組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤も含んでもよい。本組成物は、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡから商業的に入手可能なＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）などの保存培地を含んでもよい。適した医薬担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E W Martinに記載されている。そのような組成物は、予防または治療有効量の予防または治療用幹細胞を、好ましくは、精製された形態で、対象への投与に適した形態を提供されるよう適した量の担体とともに含むことになる。製剤は、投与様式に適合させるべきである。好適な実施形態において、医薬組成物は、無菌で、対象、好ましくは、動物対象、より好ましくは、哺乳動物対象、および最も好ましくは、ヒト対象への投与に適した形態である。

本発明の医薬組成物は、さまざまな形態であってもよい。これらは、例えば、半固体、および液体剤形、例えば、凍結乾燥調製物、凍結調製物、液体溶液または懸濁液、注射可能および注入可能な溶液を含む。医薬組成物は、注射可能であるのが好ましい。

医薬組成物は、一般に水性形態になることになる。組成物は、保存料および／または酸化防止剤を含んでもよい。

張力を制御するために、医薬組成物は、ナトリウム塩などの生理的塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１～２０ｍｇ／ｍｌの間で存在してもよい。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが挙げられる。

本組成物は、１つ以上のバッファーを含んでもよい。典型的なバッファーとしては、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、またはクエン酸バッファーが挙げられる。バッファーは、一般に５～２０ｍＭの範囲の濃度で含まれることになる。本組成物のｐＨは、一般に、５から８の間、およびより一般に６から８の間、例えば、６．５から７．５の間、または７．０から７．８の間になる。

本組成物は、好ましくは無菌である。本組成物は、好ましくは、非発熱性である。

一般的な実施形態において、細胞または細胞外小胞は、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標））、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｌ^－、Ｈ_２Ｐ０_４ ^－、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオナート、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン－４０、アデノシンおよびグルタチオンから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の賦形剤を含む組成物中に懸濁している。一実施形態において、本組成物は、これらの賦形剤のすべてを含む。一般に、本組成物は、両性非プロトン溶媒、例えば、ＤＭＳＯを含まないことになる。適した組成物、例えば、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍａｓｏｌ（登録商標）－ＦＲＳは、商業的に入手可能である。そのような組成物は、細胞が長期間（何時間から何日間）４℃から２５℃で保管されるのを可能にするか、または凍結温度（cryothermic temperature）、すなわち、－２０℃より低い温度で保存されるのを可能にするため、有利である。解凍後のこの組成物中の幹細胞を、その後、投与することができる。

本発明は、理解を明確にするために詳細に記載されてきたが、一定の改変が添付の特許請求の範囲内で行われてもよい。本出願において引用されるすべての刊行物、受託番号、および特許文献は、それぞれが個別にそうであることが示されているのと同じ程度までその全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込んだものとする。２つ以上の配列が異なる時点の受託番号と関連づけられる限りにおいて、本出願の有効な出願日の時点の受託番号と関連づけられる配列が意図される。有効な出願日は、取り上げた受託番号を開示している最先の優先出願の日付である。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本発明の任意の要素、実施形態、ステップ、特徴または態様は、任意の他のものと組み合わせて実施されてもよい。

本発明は、以下の非限定的実施例に関してさらに記載されている。これらの実施例において、本発明者らは、まず最初に、条件付き不死化神経幹細胞（ＣＴＸ０Ｅ０３；本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄによって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０４０９１６０１で２００４年９月１６日に寄託された）が多能性にリプログラミングされ得ることを、いくつかの独立した反復実験に基づいて実証する。これらのｉＰＳＣは、その後、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に分化させられる。ＣＴＸ－ｉＰＳＣの遺伝子リプログラミングおよび多能性も確認される。

本発明者らは、その後、別の条件付き不死化成体幹細胞タイプの成功したリプログラミングを実証する。この株は、ＳＴＲ０Ｃ０５であり、胎児の線条体細胞由来である（さらに本特許出願の出願人、ＲｅＮｅｕｒｏｎ ＬｉｍｉｔｅｄによってＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０４１１０３０１で２００４年１１月３日に寄託された）。ＳＴＲ０Ｃ０５からのｉＰＳＣの形成およびそれに続くこれらＳＴＲ０Ｃ－ｉＰＳＣの内胚葉、中胚葉および外胚葉系への分化が示される。これらのデータは、本発明によって提供される利点が、本発明者らがそれを最初に証明したＣＴＸ細胞株に限定されず、任意の条件付きで不死化された成体細胞タイプに広く当てはまることを確認する。

実施例は、その後、リプログラミングされたｉＰＳＣ由来のＭＳＣ細胞のさらなる特徴付けを提供し、そのような細胞の通常の限界を超えて、これらのｉＰＳＣから誘導される成体幹細胞タイプを増やすことができ、それによって、そのような株から多くの患者の処置を可能にするという発見をより説得力のあるものにする。これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、軟骨（シアログリカン（sialoglycan）のアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）細胞に分化することが示される（図１０）。

最後に、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ細胞のさらにいっそう詳細な特徴づけが提供され、実施例６において、条件付きで不死化可能なｈｉＰＳＣから誘導される、ＨＳＣおよび高分化造血細胞を含む造血系が詳細に例示される。

[実施例１]
同種異系細胞療法の臨床スケール製造用のソースとしての誘導的に不死化された成体幹細胞由来のｉＰＳＣ
序論
・人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、細胞療法のソース材料として大きな可能性をもつ
・候補治療用集団は、一般に、高分化細胞ではなく成体幹細胞または組織前駆体（ＡＳＣ／ＴＰ）である
・ＡＳＣ／ＴＰは、培養および精製するのが難しいことが多い
・ＡＳＣ／ＴＰの条件付き不死化は、同種異系細胞療法のための細胞のスケーラブルな生成に有益であろう
・ＣＴＸは、虚血性脳卒中に対する臨床試験における神経幹細胞株である。これは、培養培地への４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の添加によって制御可能なｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子により不死化される

ＣＴＸ０Ｅ０３の多能性へのリプログラミング
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、「山中因子」（ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２、「ＯＫＳＭ」、ならびにＬＩＮ２８）をコードする標準的な非組み込み型エピソームベクターを使用して多能性にリプログラミングした（図１）。

ＣＴＸ細胞は、独立して、数回うまくリプログラミングされた。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣに典型的な多くの特徴を共有する。リプログラミング後、細胞形態は、ＣＴＸ細胞に典型的な伸長した突起を有する神経細胞の表現型から、目立つ核小体およびヒト多能性幹細胞に典型的な「細胞群」に高密度に詰め込まれた細胞間で識別が難しい区画を有する、１つの小さな丸い未分化細胞に劇的に変化する（図１Ｃ、図２）。ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、２１日目の終了点に組織非特異的なアルカリホスファターゼ酵素マーカーを発現する（図１Ｄ、図３）。

ＣＴＸリプログラミング要件を分析するためのさまざまな転写因子の組み合わせ。
図２は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞がさらに少数の因子によりリプログラミング可能であることを示す。（Ａ）１つの因子を発現するベクター、ｐＣＥ－ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ＳＯＸ２およびｐＣＥ－ＫＬＦ４；４－ＯＨＴ供給はｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭによりＭＹＣを模倣する。（Ｂ）挿入図：コロニーカウントのための例のＡＰ染色プレート。中心の画像：転写因子ＯＣＴ４単独によりリプログラミングされたコロニー。（Ｃ）さまざまな因子の組み合わせにより得られたコロニー数（Ｓ－Ｋ：ｐＣＥ－ＳＫ、Ｍ－Ｌ：ｐＣＥ－ＵＬ、Ｓ：ｐＣＥ－ＳＯＸ２、Ｋ：ｐＣＥ－ＫＬＦ４、Ｍ：４－ＯＨＴ→ｄ１４）。（Ｄ）組み合わせの効果を示すベン図（数：ｘ個のコロニーが得られた；ゼロ：コロニーなし）。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、古典的なｈＰＳＣと多くの特徴を共有する
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性表現型を図３に示す。

（Ａ）ＯＫＳＭＬ転写因子セットのトランスフェクションによる多能性へのリプログラミングによってＣＴＸ細胞から誘導された２つの異なる細胞株（ｉｉ、ｉｉｉ）についてのＣＴＸ－ｉＰＳＣの細胞およびコロニー形態評価は、これらのリプログラミングされた細胞株が、ｈＰＳＣに典型的な目立つ核小体を有する小さな緊密に詰め込まれた細胞の高密度のコロニーを再現し、親ＣＴＸ細胞（ｉ）の神経細胞の表現型とは著しく異なる。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は、図３Ｂに示されるとおり酵素マーカーアルカリホスファターゼ（ピンク染色）を発現する。

ヒト多能性幹細胞に関して予想されるとおり、フローサイトメトリーは、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、カノニカル多能性転写因子ＯＣＴ４、ならびに細胞表面抗原ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４が陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ－１は発現していないことを示している。（図３Ｃ）。

（Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、内胚葉、中胚葉および外胚葉へのインビトロ分化時の系列特異的なマーカーのアップレギュレーションを示す（個々のＣＴＸ－ｉＰＳＣ株は色調によって示される）。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおけるｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子の状態
ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおける導入遺伝子座の評価を図４に示す。

（Ａ）Ｇ４１８における親ＣＴＸ０Ｅ０３細胞（１行目、４日目、２行目、１０日目）および４日目の５つのＣＴＸ－ｉＰＳＣ株（３～７行目）のギムザ染色は、ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ関連ＮｅｏＲ遺伝子の発現活性を示す。

（Ｂ）ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子を駆動するＣＭＶ－ＩＥプロモーターのバイサルファイト変換は、その座位におけるシトシンメチル化状態を示す（白丸、非メチル化ＣｐＧ；黒円、メチル化ＣｐＧ；カンマ、不確定な読み取り）。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣからの治療用細胞集団の誘導
３つの生殖系列（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に沿った分化が達成されることをＲＴ－ｑＰＣＲを使用して示すことができる。ＣＴＸ－ｉＰＳＣの治療に関連した細胞タイプへの分化も確認できた。これは、成体幹細胞タイプ（間葉系幹細胞）に関して証明された。当業者には明白であろうとおり、他の細胞タイプも適した培養条件によって形成することができる。特に、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および樹状細胞などの免疫系の細胞は、Themeli et al. (2013) Nature Biotechnology (31), 928-933に開示されている方法によって分化させることができる。

図５は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の治療用細胞集団の生成を示す。（Ａ）ｍＴｅＳＲ１培地のラミニン－５２１上のＣＴＸ－ｉＰＳＣ。（Ｂ）ＭＳＣ培地（α－ＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）において（Ａ）の細胞から誘導されるプラスチック付着性の候補間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。（Ｃ）ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのフローサイトメトリーは、それらが、ＩＳＣＴ基準に従って、ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しないことを示す（青、染色；赤、アイソタイプ対照）。

結論
インビトロにおける不死化および長期培養にもかかわらず、驚くべきことに、神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３が外因性転写因子によってリプログラミングできることを示した。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、細胞形態、細胞表面の発現、転写因子および酵素マーカー、ならびに多能性によって定義される、低継代の一次細胞から形成される従来のｉＰＳＣと外見上、見分けがつかない。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣにおけるｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ遺伝子座は、少なくとも一部の株において依然として活性のままである。

臨床に関連する細胞タイプ（例えば、ＭＳＣ、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞）は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣから形成されてもよい。

ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣにおける４－ＯＨＴ／ｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ系による細胞周期の誘導は、同種異系療法用のスケーラブルな生成を可能にするであろう。

したがって、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは、非常に有用な臨床的資源である。これらは、所望の系列に沿って分化させて、組織前駆細胞タイプまたは成体幹細胞集団などの標的集団を形成することができ、その後、継続的な増殖を促進し、細胞周期逸脱および関連するさらなる分化を防ぐための４－ＯＨＴの供給が、原材料からの繰り返される細胞単離を伴わず、以前は実現不可能だった臨床に関連する部分集団の定型化したスケーラブルな生成を可能にするであろう。

ＣＴＸ自体は適していない条件に対するすぐに利用できる処置の大規模生成のために、クローニングまたは精製ステップを使用して、多かれ少なかれ均質でない分化培養物から所望の治療タイプの純粋な集団を形成することができ、分化プロトコルの効率が不十分な当該技術分野に見られる欠点を未然に防ぐ。これは、細胞自体または、ＣＴＸ細胞自体によって産生されるものに対する代替レパートリーのペイロード分子を有するさまざまな細胞タイプによって産生されるエクソソーム部分の両方に当てはまる。

さらに、これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の亜株は既に臨床安全性試験に合格した細胞株（ＣＴＸ）から誘導されるため、新しい適応症における効力に関する臨床試験への移行が加速される可能性がある。

[実施例２]
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣの特徴づけ
重要な遺伝子の発現の、リプログラミングにより誘導された調節が示され、これは、ＣＴＸ細胞の証拠が適切にリプログラミングされたことを確認する。

その結果を図６に示す。各パネルは、ＣＴＸから作成されたシングルセルトランスクリプトームデータの「ｔＳＮＥ」プロットである。左上の色調は、緑の「雲状のもの」がＣＴＸであり、ＣＴＸ－ｉＰＳＣは青であり、皮質分化プロトコルに供された後、そのトランスクリプトームがＣＴＸ自体に可能な限り近づいたときに分析されたＣＴＸ－ｉＰＳＣは赤であることを示す。それぞれの雲状のものは、１つの細胞を示す点からなる。グレー：発現なし、オレンジ：中程度の発現；赤：高発現。プロットは、ＣＴＸにおいて不活性の多能性遺伝子：ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１、ＴＥＴ１、ＤＰＰ４、ＴＤＧＦ１、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＡＬが、リプログラミングされた細胞では活性化されたことを示す。重要なことに、これらの遺伝子のうち、ＰＯＵ５Ｆ１のみが、リプログラミングの間に外因的に与えられた。反対に、ＣＴＸによって発現されるいくつかの神経系遺伝子は、多能性へのリプログラミング時に、ダウンレギュレートされる（ＮＯＧＧＩＮ、ＡＤＡＭ１２、ＯＣＩＡＤ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＸ６）。最後に、ＧＬＩ３（および大きな程度にＰＡＸ６）が、多能性細胞の皮質分化時にアップレギュレートされる。

人工多能性幹細胞の生殖系列分化およびその染色（図７および図９）
方法
１．ＣＴＸ－ｉＰＳＣまたはＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣを、必要に応じてヒトラミニン－５２１コーティング８ウェルチャンバースライドに播いた。その後、それらを、必要に応じて、適した分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５２３０）で５～７日間処理した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、免疫染色まで４℃で保存した。
２．ウェルを、以下のとおり免疫染色した：
１． １０％ ＮＧＳ／ＰＢＳ中において室温で３０分間インキュベーションすることによって正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロッキングした。
２． ウェルを、必要に応じて希釈された（下記表を参照）０．１％ ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００／ＰＢＳ）中の一次抗体：マウス抗－ｘおよびウサギ抗－ｙとともに、室温で２～４時間または４℃で一晩インキュベーションした。
３． ウェルを、ＰＢＳで１０分間、３回洗浄するか、またはＰＢＳ中４℃で一晩維持した。
４． ウェルを、ＰＢＳ中の二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－４８８（１：３００希釈）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５６８（１：２０００希釈）とともに室温で２時間インキュベーションした。
５． ウェルを、室温のＰＢＳで３回洗浄した。
６． ウェルを、ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈されたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で、５分間染色した。
７． ウェルを、ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。
８． ウェルを、スライドから取り除き、２滴のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加し、カバーガラスを上に置いた後、蛍光顕微鏡法によって調べた。
３．利用した抗体を下記表に示す。

結果：
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの多能性のさらなる確認は、３つの一次胚葉を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現によって示される内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化の証拠によって得られる。図７のこれらのデータは、先に示したＲＴ－ｑＰＣＲデータを補足するものである。

[実施例３]
胎児の線条体細胞のリプログラミング
別の条件付き不死化成体幹細胞タイプも、うまくリプログラミングされた。この株は、胎児の線条体細胞由来のＳＴＲ０Ｃ０５である。

方法－ＳＴＲ０Ｃ０５細胞の多能性へのリプログラミング
１．Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍによって販売されているＮｅｏｎエレクトロポレーション機器を使用して、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞に特異的なトランスフェクション条件の最適な範囲を特定した。この細胞株に適したトランスフェクション条件を特定するために、機器の製造業者によって推奨されているとおり、電圧、パルス持続時間などのさまざまなパラメーターの範囲を使用して、ＧＦＰ発現プラスミドを細胞にトランスフェクションした場合に得られた緑色の生細胞の発生頻度を評価した。
２．その後、ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を、（１）で特定した条件を使用して、Ｅｐｉ５リプログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１５９６０；転写因子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３のドミナントネガティブ阻害因子を発現するリプログラミングプラスミド、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬおよびｐＣＥｍＰ５３ＤＤを含む）のプラスミドでエレクトロポレーションし、ヒトラミニン－５２１上に播いた。インキュベーター内で作動するＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ自動化位相差顕微鏡により、ウェルを毎日観察した。
３．１週間後、その細胞を再播種するか、同じウェルに残し、培地をｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号８５８５０）に変えた。
４．多能性表現型コロニーが生じるまで、ウェルを観察した。
５．十分大きくなったら、個々のコロニーを、ピペットの先端でｈＬｎ－５２１でもコーティングされた２４ウェルプレートのウェルに採取し、凍結または分析まで増殖させた。
６．以前の研究と同様に、ともに製造業者の説明書に従って、アルカリホスファターゼ染色をＳｔｅｍｇｅｎｔアルカリホスファターゼ染色キット（カタログ番号００－００５５）で実施し、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＴＲＡ－１－６０抗体（ＢＤカタログ番号５６０３８０）を加えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓｔｅｍｆｌｏｗ抗体キット（カタログ番号５６０４７７）を用いて、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などの多能性幹細胞マーカーに対するフローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーサンプルをＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターにおいて分析した。

結果
その結果を図８に示す。
パネルＡは、リプログラミング因子によるトランスフェクションの２４日後のリプログラミングされたＳＴＲ０Ｃ０５細胞のコロニーを示し、
パネルＢは、リプログラミングの初期の段階のアルカリホスファターゼ（赤）染色ＳＴＲ０Ｃ０５細胞を示し、いくつかが多能性マーカーアルカリホスファターゼを発現することを示し、
パネルＣは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株を示し、
パネルＤは、ＡＰ陽性コロニーがさまざまなトランスフェクション条件に供されたウェルでさまざまな頻度で出現していることを示し、コロニーのないウェル１は、対照としてＧＦＰ非リプログラミングプラスミドでトランスフェクションし、リプログラミングされた細胞がなく、ウェル４および６は、生存細胞がほとんどなく、
パネルＥは、確立されたＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣ株がアルカリホスファターゼ陽性であることを示し、
パネルＦは、それが、多能性マーカーＳＳＥＡ４も陽性であるが、初期分化マーカーＳＳＥＡ１に関しては陰性であることを示す。

ＳＴＲ０Ｃ０５－ｉＰＳＣの多能性も上の実施例２に記載されている生殖系列分化方法を使用して確認し、その結果を図９に示す。ＣＴＸに関する図７のとおり、３つの一次胚葉を特定するタンパク質マーカー（一般に、転写因子）の同時発現によって示される内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化が示されている。

[実施例４]
リプログラミングされたｉＰＳＣ由来の成体幹細胞は多能性である
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の成体幹細胞の多能性を確認した。予め本発明者らは、候補ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ（間葉系幹細胞）に関する適したマーカー発現およびプラスチックに付着する能力を示す例のフローサイトメトリープロフィールを示した。この実験は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣがいくつかの異なる細胞タイプに分化する能力を確認する。

方法－多能性を確認するためのＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣの分化
１．脂肪および骨細胞形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、６ウェル組織培養処理プレートに播き、脂肪生成および骨形成を促進する市販の培地（脂肪生成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４１２、骨形成：ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４６５またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＣＣＭＮ００７およびＣＣＭ００８）とともに最大２８日間インキュベーションした後、固定および染色を行った。軟骨形成の評価のために、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣを、１５ｍｌチューブの底にある集塊としてペレット状にし、軟骨形成培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０５４５５）とともに培養し、続いて標準的な方法を使用してホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋および切片作製を行った。
２．アルシアンブルー染色（軟骨形成）：スライド上の切片に蒸留水で水分を与え、３％酢酸で３分間処理した後、３％酢酸中の１％アルシアンブルー、ｐＨ２．５で３０分間染色した。そのスライドを、その後、流水中で５分間洗浄し、蒸留水中ですすぎ、５％硫酸アルミニウム溶液中の０．１％ヌクレアファストレッドで５分間対比染色した後、画像化した。
３．オイルレッドＯ染色（脂肪生成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、６０％イソプロパノール／４０％水中の０．３％オイルレッドＯで１５分間染色し、再蒸留水で洗浄した後、画像化した。
４．アリザリンレッドＳ染色（骨形成）：６ウェルプレート中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。それらを、室温において２％アリザリンレッドＳ溶液、ｐＨ４．２で１５分間染色し、水で洗浄し、画像化した。

結果
図１０は、ｉＰＳＣ由来のＭＳＣが、軟骨（シアログリカンのアルシアンブルー染色によって示される）、脂肪（オイルレッドＯによる細胞内脂質滴の染色によって示される）および骨（沈着したカルシウムのアリザリンレッド染色によって示される）へ分化する能力を示す。

その後、４－ＯＨＴの存在下または非存在下において高継代（２０継代）まで培養したＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣに関するフローサイトメトリープロフィールを得た。その結果を図１１に示す。この試験株は、先に作成したバイサルファイトデータが脱メチル化Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭプロモーターを有したことを示した株であり、その結果、プロモーターがこれらの細胞において依然として活性であるはずであることを示唆するものである。興味深いことに、この株は、４－ＯＨＴが細胞周期を誘導しているとき、そのマーカープロフィールをよりよく維持するようであり、ＣＤ９０およびＣＤ１０５発現はより一定でより高く、陰性マーカーＣＤ１４、２０、３４および４５は、より厳重に「オフ」である（この株は、常により低いＣＤ７３発現を示す、場合によって、抗体のアーティファクト）。第２のパネルにおいて、４－ＯＨＴ処理細胞は、分化時に骨を形成するのにより有効であるようであり、４－ＯＨＴが関係する細胞周期の強制が周期からの逸脱および能力の喪失を改善することを示唆する。

[実施例５]
リプログラミングされたＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣのさらなる特徴づけ
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ株を、４－ＯＨＴの非存在下または存在下で培養した。図１２および１３の２つの異なるＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＭＳＣ細胞培養を用いた実験の結果は、４－ＯＨＴ／Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ^ＴＡＭの存在および活性により向上したより一貫した長期にわたる増殖を示す。

この実施例は、条件付きで不死化されたｉＰＳＣ－ＡＳＣが、より確実により長く増殖させることができることを示す。

[実施例６]
同種異系免疫療法のスケーラブルな生成のために条件付きで不死化可能なｈｉＰＳＣから誘導される造血系
方法および裏付けデータ
この実施例は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣが中胚葉細胞、ＨＳＣおよび高分化造血細胞（例えば、キラーＴ細胞）を形成することができることを示す。本発明者らは、専用の培地などの市販のシステムおよび文献において公開されているプロトコルの両方を含む、さまざまな方法を使用した。どちらの場合も、確立されたシステムは、別のドナー細胞タイプ、例えば、ｈＰＳＣではなく骨髄または臍帯血由来のＨＳＣを念頭において一般に設計されているため、本発明者らは、必要な場合、確立された技術に独自の改変を行った。

中胚葉。図１４は、インビトロでのｈＰＳＣからの造血系細胞の生成における最初の必須のステップを示し、それによって、アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＢＭＰ４を加えた市販の培地は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣ分化を中胚葉に誘導する（Jung M et al. [2018] Blood Advances 2 3553）。

造血幹細胞。ＨＳＣを、図１５Ａに示されるとおりＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来の中胚葉細胞（図１４Ｂ）から形成した。ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－中胚葉細胞を、ＦＬＴ３、ＳＣＦ、ＢＭＰ－４、ならびにインターロイキン３および６の存在下において１４日間培養した。本発明者らは、この時点で最大およそ６０％のＣＤ３４が陽性の細胞を観察している。これらの細胞の大きな割合が（図１５Ｂ）ＣＤ４３も陽性であった。これは、ＣＤ４３＋ ＨＳＣが、ＣＤ３４単独陽性の細胞よりも広い能力を有するようであり、赤血球系細胞（Kessel et al., 2017, Transfus Med Haemother 44 143-50）および骨髄系細胞ならびにリンパ系細胞も形成することができるようであるため注目すべきである。白血球マーカーＣＤ４５は、この段階では細胞の未成熟さと一致して非常に低いレベルで発現し（図１５Ｂ）、したがって成熟マーカーの発現が低いが、本発明者らは、この分化段階からの細胞においてＮＫマーカーＣＤ５６を発現する細胞を確認した。これは、ＣＴＸ－ＨＳＣもナチュラルキラー細胞を生成する潜在性があることを示唆する。

リンパ球。ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＨＳＣを、共培養方法（Montel-Hagen et al., 2019 Cell Stem Cell 24 1-14）、および臍帯血ＨＳＣを、結合したＶＣＡＭおよびＤＬＬ４タンパク質の単層上で培養した（Shukla et al., 2017 Nature Methods 14 531-538）方法の適合の両方を使用してＴリンパ球細胞運命に分化させた（図１６）。どちらの場合も、ＨＳＣにおけるＮＯＴＣＨシグナル伝達を活性化し、Ｔリンパ球運命への分化を誘導するために、関連タンパク質ＤＬＬ－１またはＤＬＬ－４の一方を供給した。

図１７Ａは、ＣＴＸ－ＨＳＣを、ＨＳＣにＶＣＡＭおよびＤＬＬ４を提示する結合したキメラタンパク質の層上で１４日の期間培養することによってＣＴＸ－ＨＳＣから前駆Ｔ細胞を形成する方法を示す。１４日の期間の終わりに、付着および懸濁細胞の不均質な集団が得られた。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって（図１７Ｂ）、前駆リンパ球集団を含むより小さな懸濁細胞（「単一細胞２」集団、図１７）と区別することができた。この細胞集団は、ＣＤ３（Ｔ細胞レセプター関連タンパク質）、ＣＤ４３（白血球マーカー）、ＣＤ５（リンパ球、主に初期Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ７（未成熟Ｔ細胞マーカーおよびＮＫ細胞マーカー）およびＣＤ２５（インターロイキン２レセプター）を発現した。しかしながら、成熟Ｔ細胞の表現型よりもむしろそのＴ前駆細胞の表現型の解釈と一致して、ＣＤ５およびＣＤ７の発現に加えて、それらはＴ細胞レセプター自体も関連分子ＣＤ４もしくはＣＤ８も発現しなかった。これは、前駆細胞表現型を維持しながら細胞集団を増殖させるサイクルを誘導するために条件付き不死化システムを使用して、初期のリンパ系またはリンパ球（例えば、具体的にはＴ前駆細胞および／またはＢ前駆細胞）を単離する興味深い可能性を示唆する。

結合したＦｃ－ＤＬＬ４およびＦｃ－ＶＣＡＭタンパク質上におけるＴリンパ球前駆細胞のより長期間の培養（図１８Ａ、２５日、１４日とは対照的）は、いくぶんより均質になり（図１８Ｂ）、より成熟した表現型に達した（図１８Ｃ～Ｅ）細胞集団をもたらした。これらの細胞は、より均一（例えば、６０％を超える細胞が白血球マーカーＣＤ４３を発現した）であり、それらが、ＣＤ３に加えてＣＤ８も発現したが、ＣＤ５およびＣＤ７の発現は失われたより成熟したリンパ球集団を表すという解釈と一致する。したがって、このプロトコルは、例えば、現在のところＣＡＲ－Ｔ抗腫瘍治療薬の基礎を形成するなど、細胞傷害性Ｔ細胞と最も類似したリンパ球の集団を形成した。

条件付き不死化ｈｉＰＳＣ由来のＨＳＣからより成熟したリンパ球集団を作り出すために分化の代替的な方法も使用した。ヒトＮＯＴＣＨリガンドＤＬＬ１を発現するように操作されたマウスＭＳ５間質細胞とのＣＴＸ－ＨＳＣの共培養（図１９）またはＭＳ５－ＤＬＬ１細胞の単層上でのＣＴＸ－ＨＳＣの共培養は、小さな非付着性細胞集団の高い増殖を引き起こした（図２０Ｂ）。この集団は、分化の過程で成熟して、ＣＤ３４発現を失った（図２０Ｃ）が、初期マーカーＣＤ５およびＣＤ７発現レベルが低下したものの、ＣＤ８発現は観察されなかった（図２０Ｄ～Ｆ）。したがって、この方法によって生成されたＴ細胞前駆細胞は、おそらく上記の結合タンパク質アプローチによって生成されるものよりもＴ細胞の発生の早い段階を表す（図２１）。

図２２は、本発明のＨＳＣにおけるＣＤ５６の発現の増加を示し、したがって、ＮＫ細胞などの非抗原特異的なリンパ球を生成するための本発明のＨＳＣの潜在性を強調する。

条件付き不死化を使用した集団のスケーラブルな増殖に先立って分化経路が辿る段階を「細かく調整する」この能力は、患者に提供されるであろう細胞に対する絶妙な制御レベルを提供する非常に強力なシステムを示す。

結論
ＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＨＳＣおよびその分化誘導体は、場合によっては、非常に有用な臨床的リソースとなる。それらを、凍結保存用に条件付き不死化システムを使用して大規模な細胞バンクを形成するために増殖させてもよく、または治療用に純粋でＧＭＰ標準的な細胞の標的集団を形成するために、おそらく遺伝子改変を伴い、さらに分化させてもよい。これは、各患者に対して免疫適合ドナー（immunocompatible donor）の特定およびドナーからの原材料の細胞単離を必要とせずに、以前は実現不可能だった臨床的に関連した部分集団の定型化したスケーラブルな生産を可能にするであろう。さらに、これらのＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＨＳＣおよびその誘導体サブタイプは既に臨床安全性試験に合格した細胞株（ＣＴＸ）から誘導されるため、新しい適応症における効力に関する臨床試験への移行が加速される可能性がある。

[実施例７]
ＣＴＸ－ｉＰＳＣの造血分化は、ＨＳＣ、リンパ系前駆細胞およびエフェクターを生成する
多くのさらなる実験は、造血系のさまざまな細胞に分化するＣＴＸ－ｉＰＳＣ－ＨＳＣの能力を確認した。これらのさらなる実験の結果を図２５に示す。

簡単に言えば、これらの実験は、以下のことを示す：
－ ＣＤ３４＋細胞（血管内皮性（hemoendothelial）前駆細胞および幹細胞）へのＣＴＸ－ｉＰＳＣ分化の確認。
－ 一部のＣＤ３４＋細胞はＣＤ４９ＦおよびＣＤ９０も陽性で、マーカーＣＤ３８およびＣＤ４５ＲＡが陰性であることの確認。まとめると、これらの結果は、作り出された細胞が、免疫系全体を再構成することができる細胞およびこの系列のすべてのエフェクター細胞タイプの前駆細胞である、真の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）であることを強く示唆する。これは、重要な結果である。
－ ＣＴＸ－ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞（おそらく上記のＣＤ３４＋ＣＤ４９Ｆ＋Ｃ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ３８－ ＬＴ－ＨＳＣ）のさらなる分化によるリンパ系前駆細胞（ＬＰ）の生成。
－ 上記ＣＴＸ－ＬＰからのＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲ＋細胞傷害性Ｔ細胞の生成。
－ ＣＴＸ－ＬＰからのナチュラルキラー細胞の生成のさらなる証拠。

さらに具体的には、図２５は、ＣＴＸ－ｉＰＳＣの造血分化が、ＨＳＣ、リンパ系前駆細胞およびエフェクターを生成することを示す。

パネルＡは、胚様体が、単一細胞懸濁液を非付着性マイクロウェルプレートに播くことによってＣＴＸ－ｉＰＳＣから形成されたことを示す。

パネルＢでは、ＥＢを、中胚葉促進培地の存在下において（３日目まで）培養した後、造血系規定培地において（１０日目まで）培養して、（パネルＣ）ＣＤ３４＋細胞を形成し、そのおよそ５％がＣＤ３４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ ＬＴ－ＨＳＣであった。パネルＤは、このように誘導されたＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ３４磁気ビーズを用いて単離した後、さらに１４日間分化させて、（Ｅ）ＣＤ７＋リンパ球前駆細胞を形成し、これは、いくらか低下した多能性を保持し、その結果、それぞれ１４または２１日間分化させることができ、ナチュラルキラーまたはＣＤ４－ＣＤ８＋ＴＣＲαβ細胞傷害性Ｔ細胞を生成したことを示す。

選択参考文献

Claims (29)

1. 条件付き不死化に関する制御可能な導入遺伝子を含む、人工多能性幹細胞から誘導される、造血系の細胞。
2. 前記細胞は、
   ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋造血幹細胞；
   ＣＤ４＋Ｔ細胞；
   ＣＤ８＋Ｔ細胞；
   制御性Ｔ細胞；
   ＣＤ５６^ｈｉｇｈＣＤ１６^±ナチュラルキラー細胞；
   ＣＤ５６^ｌｏｗＣＤ１６^ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞；
   ＣＤ１９＋Ｂ細胞；
   骨髄系樹状細胞；
   プラズマ細胞様樹状細胞；
   好中球；または
   ＣＤ３４＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－長期ＨＳＣ
   である、請求項１に記載の造血系の細胞。
3. 前記細胞は、骨髄芽球、リンパ芽球、巨核球、血小板、赤血球、マスト細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ＣＤ５６^ＤＩＭナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^{ＢＲＩＧＨＴ}ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｈｉｇｈＣＤ１６^±ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６^ｌｏｗＣＤ１６^ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ１６１を発現するＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリＴ細胞、Ｂ－２細胞、Ｂ－１細胞、メモリＢ細胞、プラズマＢ細胞、骨髄系樹状細胞、またはプラズマ細胞様ＤＣである、請求項１に記載の造血系の細胞。
4. 前記多能性幹細胞は、条件付き不死化細胞または条件付き不死化幹細胞から得ることができるか、または得られる、請求項１～３のいずれかに記載の造血系の細胞。
5. 前記多能性幹細胞は、１つ以上の転写因子により条件付き不死化幹細胞をリプログラミングすることによって得ることができるか、または得られる、請求項１～４のいずれかに記載の造血系の細胞。
6. 前記多能性幹細胞は、Ｃ－ＭＹＣ－ＥＲ融合タンパク質を含む、請求項１～５のいずれかに記載の造血系の細胞。
7. 前記多能性幹細胞は、任意にそのゲノム中に、ｃ－ｍｙｃＥＲ導入遺伝子を含む、請求項１～６のいずれかに記載の造血系の細胞。
8. 前記多能性幹細胞は、条件付き不死化神経幹細胞から得ることができるか、または得られる、請求項１～７のいずれかに記載の造血系の細胞。
9. 請求項１～８のいずれかに記載の前記多能性幹細胞は、条件付き不死化幹細胞株から得ることができるかまたは得られる、請求項１～８のいずれかに記載の造血系の細胞。
10. 前記幹細胞株は、ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１を有するＣＴＸ０Ｅ０３またはＥＣＡＣＣ受託番号０４１１０３０１を有するＳＴＲ０Ｃ０５である、請求項９に記載の造血系の細胞。
11. 前記細胞は、造血分化の１つ以上のマーカーを発現する造血幹細胞である、請求項１～１０のいずれかに記載の造血系の細胞。
12. 多能性幹細胞から造血系の細胞を生成する方法であって、（ｉ）条件付き不死化幹細胞をリプログラミングして、多能性細胞を形成するステップ；および（ｉｉ）前記多能性細胞を造血系の細胞に分化させるステップを含む、方法。
13. 前記リプログラミングするステップは、前記条件付き不死化幹細胞に、転写因子ＯＣＴ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のうちの１つ以上、および任意にＲＮＡ結合ＬＩＮ２８を導入することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４を含むか、もしくはそれからなる、
    前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含むか、もしくはそれらからなる、
    前記導入された転写因子は、ＯＣＴ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２を含むか、もしくはそれらからなる、
    前記導入された転写因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびＭＹＣを含むか、もしくはそれらからなる、または
    ＭＹＣ活性は、リプログラミングされる前記幹細胞においてｃ－ｍｙｃ－ＥＲ^ＴＡＭ導入遺伝子を活性化するために培地に４－ＯＨＴを供給することによってもたらされ、リプログラミングプロセスを促進する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記転写因子および任意のＬＩＮ２８は、前記条件付き不死化幹細胞中に、１つ以上のエピソームプラスミド、または１つ以上のウイルスベクター、任意にレンチウイルス、レトロウイルスもしくはセンダイウイルスから選択される１つ以上のウイルスベクターを使用して、またはｍＲＮＡトランスフェクションによって導入される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
16. 前記分化ステップは、前記多能性細胞をＨＳＣおよび任意にさらに後の系列に分化させるステップを含む、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記多能性細胞を、（ｉ）アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＢＭＰ４を含む培地において培養して、中胚葉細胞を形成した後、（ｉｉ）前記中胚葉細胞をＦＬＴ３、ＳＣＦ、ＢＭＰ－４、ならびにインターロイキン３および６の存在下において培養して、ＨＳＣを形成することによって、前記ＨＳＣに分化させる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＨＳＣを、（ｉ）培養物にＤＬＬ－１もしくはＤＬＬ－４タンパク質を供給して、前記ＨＳＣにおけるＮＯＴＣＨシグナル伝達を活性化すること、または（ｉｉ）任意にＮｏｔｃｈリガンドＤＬＬ１を発現するよう操作された、間質細胞と前記ＨＳＣを共培養すること、または（ｉｉｉ）結合したＶＣＡＭおよびＤＬＬ４タンパク質の単層上で前記ＨＳＣを培養することによって、Ｔリンパ球運命に分化させる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
19. 前記造血系は、リプログラミングされた前記条件付き不死化幹細胞の系列とは異なる、請求項１２から１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記造血系の細胞は、請求項２または請求項３のいずれかにおいて定義されるとおりである、請求項１２から１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記方法の結果もたらされる前記造血系の細胞の条件付きで不死化された表現型を再活性化するステップを含む、請求項１２から２０のいずれかに記載の方法。
22. リプログラミングされる前記条件付き不死化幹細胞は、請求項４から１０のいずれかにおいて定義されるとおりである、請求項１２から２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記方法によって得られる前記細胞を培養するステップ；
    前記方法によって得られる前記細胞を継代するステップ；
    前記方法によって得られる前記細胞を収集するステップもしくは回収するステップ；
    前記方法によって得られる前記細胞を１つ以上の容器に包装するステップ；および／または
    前記方法によって得られる前記細胞を１つ以上の賦形剤、安定剤もしくは保存料とともに製剤化するステップ
    から選択される１つ以上のステップを含む、請求項１２から２２のいずれかに記載の方法。
24. 請求項１２から２３に記載の方法によって得られるか、または得ることができる、造血系の細胞。
25. 請求項１から１１、または２４のいずれかに記載の細胞によって産生される、細胞外小胞。
26. エクソソームである、請求項２５に記載の細胞外小胞。
27. 請求項１から１１または２４のいずれかに記載の細胞あるいは請求項２５または請求項２６に記載の細胞外小胞、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
28. 凍結、凍結保存または凍結乾燥されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
29. 疾患または障害を、必要とする患者において処置する方法において使用するための、任意に前記疾患または障害はがん、自己免疫疾患または感染症であり、任意に前記感染症は、任意に前記ウイルスがコロナウイルスであるウイルス感染症または他のウイルス性気道感染症である、請求項２４に記載の細胞、請求項２５または２６に記載の細胞外小胞、あるいは請求項２７または請求項２８に記載の医薬組成物。

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