KR20230042492A - 조혈 세포를 분화시키기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

조혈 세포를 분화시키기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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누신 타바타베이-자바레
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스템셀 테크놀러지스 캐나다 인크.
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Abstract

외인성으로 첨가된 특정 성장 인자 신호전달의 작동제의 임의의 조합을 배제하는 조건 하에서 초기 중배엽 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지, 방법, 시스템 및 키트가 개시된다. 초기 중배엽 세포의 집단은 다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있고, 개시된 조건 하에서 분화된 조혈 전구 세포는 다분화능이다. 본 명세서의 배양 조건 개시내용은 무혈청 작업흐름 및/또는 간질 및/또는 배양보조 세포가 없는 작업흐름을 형성할 수 있다.

Description

조혈 세포를 분화시키기 위한 시스템 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 7월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/057,037호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 전체가 참조에 의해 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 세포 배양 응용예, 보다 특히 조혈 세포를 사용한 세포 배양 응용예에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 조혈 세포를 분화시키기 위한 세포 배양 응용예에 관한 것이다.
NK 세포, B 세포 및 T 세포는 병원체 및 종양에 대한 방어를 제공하는 림프구이다. NK 세포는 전염증성 사이토카인을 분비할 수 있을 뿐만 아니라 암세포 또는 바이러스-감염 세포를 살해할 수 있는 선천 면역에 중요한 역할을 한다. T 세포는 적응 면역계의 세포이다. 이들은 이들의 항원 특이적 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)를 통해 광범위한 표적을 인식하고 사이토카인 분비 및 세포독성 세포 살해를 비롯한 이펙터 기능을 발휘한다. B 세포는 적응 면역계의 세포이다. 다양한 기능 중에서 특정 B 세포는 항체를 생산하거나 생산하도록 자극될 수 있다.
인간 NK, B 및 T 세포는 제대혈(cord blood: CB), 골수(bone marrow: BM) 또는 말초혈액(peripheral blood: PB)으로부터 정제된 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 간질 세포 및 사이토카인과 함께 배양함으로써 생성될 수 있다. 그러나, CB, BM 및 PB에서 유래되는 세포는 종종 불균질성이며, 공여자마다 품질이 다를 수 있다. 또한, CB, BM 및 PB에서 유래된 세포의 수는 제한적이다.
다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell: PSC)는 임상 응용예에 적절한 균질하고 맞춤가능한 대규모 집단을 생성할 수 있는 기회를 제공한다. PSC의 사용은 또한 질병 모델링 또는 세포 요법 응용예를 용이하게 하는 유전자 공학 방법을 가능하게 한다.
PSC를 NK, B 및 T 세포로 분화시키는 것은, 예를 들어, 암 환자에서 입양 면역요법, 뿐만 아니라 이들 세포의 기본 생물학에 대한 연구를 개발하는 데 유용한 도구를 제공할 것이다. 따라서, PSC로부터 시작하는 효율적인 NK 세포, B 세포 및 T 세포 분화 프로토콜이 필요하다.
본 개시내용은 조혈 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 일 양상에서, 제1 배지에서 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cell)를 분화시키는 방법이 제공되되, 여기서 제1 배지는 하나 이상의 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L)가 보충되고, BMP 신호전달의 작동제(agonist), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합은 배제되는, 기본 배지를 포함한다.
일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 골형성 단백질이다. 일 실시형태에서, 골형성 단백질은 BMP4이다.
일 실시형태에서, FGF 신호전달의 작동제는 섬유아세포 성장 인자이다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF2이다.
일 실시형태에서, VEGF 신호전달의 작동제는 혈관 내피 성장 인자이다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 무혈청이다.
일 실시형태에서, 방법은 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조(feeder) 세포의 부재 하에 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 배지에서 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 것은 3 내지 15일 동안이다.
일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 CD34+이다. 일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 골수계, 적혈구계 및 림프계 잠재력(potential)을 갖는다.
일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단은 다능성 줄기 세포(PSC)로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 방법은 유도 배지에서 PSC를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 유도 배지는 PSC-유래 초기 중배엽 세포의 분화된 집단을 수득하기 위해 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 VEGF 신호전달의 작동제 중 하나 이상이 보충된 제2 기본 배지를 포함한다.
일 실시형태에서, 유도 배지에서 BMP 신호전달의 작동제는 골형성 단백질이다. 일 실시형태에서, 골형성 단백질은 BMP4이다.
일 실시형태에서, 유도 배지에서 FGF 신호전달의 작동제는 섬유아세포 성장 인자이다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF2이다.
일 실시형태에서, 유도 배지에서 VEGF 신호전달의 작동제는 혈관 내피 성장 인자이다.
일 실시형태에서, 유도 배지는 무혈청이다.
일 실시형태에서, 방법은 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조 세포의 부재 하에 PSC를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 유도 배지에서 PSC를 배양하는 것은 1일 내지 7일 동안이다.
일 실시형태에서, 방법은 유도 배지에서 PSC를 배양하기 전에 PSC를 응집체로 형성시키는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 유도 배지에서 PSC를 응집체로 형성시키는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 응집체는 마이크로웰 장치에서 형성된다.
일 실시형태에서, 방법은 분화된 조혈 전구 세포를 무혈청 조건 하에 및/또는 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조 세포의 부재 하에 림프계 분화 배지에서 배양한 후 림프계 전구 세포를 수득하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 림프계 전구 세포는 다계통 잠재력을 갖는다.
일 실시형태에서, 림프계 전구 세포는 T 세포 및 NK 세포 잠재력을 갖는다.
일 실시형태에서, T 세포 및 NK 세포는 기능적이다.
본 개시내용의 또 다른 양상에서, 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지가 제공되며, 이 배지는 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 중 하나 이상이 보충되고, BMP 신호전달의 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합은 배제되는, 기본 배지를 포함한다.
일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단은 다능성 줄기 세포에서 유래된다. 일 실시형태에서, 다능성 줄기 세포는 포유동물이다.
일 실시형태에서, 배지는 무혈청이다. 일 실시형태에서, 배지는 간질- 및/또는 배양보조 세포-무함유 작업흐름(workflow)에서 효과적이다.
일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제는 섬유아세포 성장 인자이다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF2이다.
일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 골형성 단백질이다. 일 실시형태에서, 골형성 단백질은 BMP4이다.
일 실시형태에서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제는 VEGF이다.
일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 림프계, 골수계 및 적혈구계 효능을 갖는다. 일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 CD34+이다.
본 개시내용의 또 다른 양상에서, 다능성 줄기 세포로부터 초기 중배엽 세포의 집단을 통해 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 성분(본 명세서에 기재된 바와 같음)을 포함하는 시스템 및/또는 키트가 제공된다. 시스템 및/또는 키트는 또한 단계별 방식(본 명세서에 개시된 배지 및 기타 배양 코팅 또는 배양 용기를 사용하여)으로 분화된 임의의 세포 집단을 농축시키기 위한 성분을 포함할 수 있다. 시스템 및/또는 키트는 조혈 전구세포를 다분화능(multipotent) 림프계 전구세포의 집단으로 분화시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
현재 개시된 주제의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 개시된 주제의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이므로, 단지 예시로서 주어진다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 기술된 다양한 실시형태를 더 잘 이해하고 이러한 다양한 실시형태가 어떻게 실행될 수 있는지를 보다 명확하게 보여주기 위해, 적어도 하나의 실시형태의 예를 보여주는 첨부 도면을 예로서 참조할 것이며, 이제 설명된다. 도면은 본 명세서에 기술된 교시의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다.
도 1은 다양한 성장 인자 조합의 존재 또는 부재 하에 분화된 산출 조혈 전구 세포의 막대 그래프를 보여준다. 6-웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 CD34+ 조혈 전구 세포의 빈도(도 1a) 및 수율(도 1b)은 본 개시내용의 방법에 따라 분화된(BMP4, FGF, 및 VEGF 작동작용의 여러 조합으로) WLS-1C, STiPS-M001, H1 및 H9 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다. 도 1c는 본 개시내용의 방법에 따라 분화된 WLS-1C, STiPS-M001, H1 및 H9 PSC 세포주에 걸쳐 VEGF만의 부재 하에 결정된 6웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 CD34+ 조혈 전구 세포의 빈도 및 수율을 보여준다. 도 1d는 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 빈도 및 수율을 쿼리할 때 CD34+ 세포 분화(VEGF의 부재 하에 분화될 때)의 증가가 달성됨을 보여준다. 데이터는 PSC 세포주에 따라 2 내지 5회 실험의 평균을 나타낸다.
도 2는 다양한 응집체 해리 시약을 사용하여 수득한 조혈 전구세포의 수(a) 및 생존 조혈 전구세포의 퍼센트(b)에 대한 막대 그래프를 보여준다. Aggrewell™ 400의 각 웰에서 1,000개 PSC의 응집체가 형성되었고 총 응집체를 모은 다음, 6개의 동일한 분획으로 나누고, 여기서 이들을 1-Accutase™, 2-TrypLE™ Express, 3-Collagenase II & TrypLE™ Express, 4-Collagenase IV & TrypLE™ Express, 5-Gentle Cell Dissociation Reagent(GCDR) 또는 6-트립신을 사용하여 해리시켰다. 데이터는 개별 점으로 보여준 2-3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 3은 다양한 PSC 세포주로부터 분화된 산출 조혈 전구 세포의 막대 그래프를 보여준다. 6-웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 CD34+ 조혈 전구 세포의 빈도 및 수율은 본 개시내용의 방법에 따라 분화된 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(a). 데이터는 PSC 세포주에 따라 7-22회 실험의 평균±SEM을 나타낸다. 농축 전(b) 및 농축 후(c) 분화된 CD34+ 조혈 전구 세포에 대한 대표적인 유세포 분석 플롯이 도시된다.
도 4는 CD34+ 조혈 전구 세포의 다분화능에 대한 막대 그래프를 보여준다. VEGF 없이 분화된 CD34+ 전구 세포는 MethoCult™에서 배양하여 골수 및 적혈구 계통으로 분화하는 능력을 평가했다(a). 또한, 본 개시내용의 CD34+ 세포는 StemSpan™ 림프계 확장(Lymphoid Expansion) 시스템에서 다양한 세포 수로 추가 배양하여 전구 세포 빈도를 한계 희석으로 평가했다. 각 세포 수는 12개의 복제 웰에 플레이팅했고, 각 세포 수에 대해 양성 웰(림프계 전구 세포를 함유하는 웰)의 수를 사용하여 빈도를 결정했다. 각 조건에 대한 데이터는 표에 요약되어 있다(b).
도 5는 조혈 전구 세포로부터 분화된 산출 림프계 전구 세포의 막대 그래프를 보여준다. 본 개시내용의 방법에 따라 PSC-유래 조혈 전구세포로부터 분화된 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 투입 CD34+ 세포당 CD5+CD7+ 림프계 전구세포의 빈도 및 수율을 결정했다(a). 데이터는 PSC 세포주에 따라 5-20회 실험의 평균±SEM을 나타낸다. PSC-유래 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 대표적인 유세포분석 플롯(b).
도 6은 분화 프로토콜의 초기 단계의 기간을 변화시킬 때 산출 조혈 전구 세포 및 림프계 전구 세포에 대한 막대 그래프를 보여준다. CD34+ 조혈 전구 세포의 6-웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 빈도 및 수율은 본 개시내용의 방법에 따라 10일 또는 12일 동안 분화된 1C, H1 및 H9 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(a). 투입 CD34+ 세포당 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 빈도 및 수율은 본 개시내용의 방법에 따라 10일 또는 12일 동안 분화된 1C, H1 및 H9 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(b). (a) 및 (b)의 데이터는 세포주에 따라 3 내지 7회 실험의 평균을 나타낸다.
도 7은 조혈 전구 세포로부터 분화된 산출 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포의 막대 그래프를 보여준다. 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포의 빈도 및 수율은 본 개시내용의 방법에 따라 PSC-유래 림프계 전구 세포로부터 분화된 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(a). CD3+TCRαβ+ 세포(CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포에 대해 게이팅됨)의 빈도는 본 개시내용의 방법에 따라 PSC-유래 림프계 전구 세포로부터 분화된 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(b). 산출 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포의 대표적인 유세포분석 플롯(c). CD4+CD8+ 세포에 대해 게이팅된 CD3+TCRαβ+ 세포 산출의 대표적인 유세포 분석 플롯(d). (a) 및 (b)의 데이터는 PSC 세포주에 따라 3-13회 실험의 평균±SEM을 나타낸다.
도 8은 림프계 전구세포로부터 분화된 산출 CD4+CD8+ 이중-양성 T 세포의 막대 그래프를 보여준다. 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포의 빈도 및 수율에 대한 분화된 림프계 전구세포 중 분류된 생존 세포 또는 CD7+ 세포의 파종 효과는 H1, WLS-1C 및 H9 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(a). 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포의 빈도 및 수율에 대해 파종된 림프계 전구세포의 수를 변화시키는 효과는 H1(점 기호) 및 WLS-1C(사각형 기호) PSC 세포주에서 결정되었다(b). (a) 및 (b)의 데이터는 PSC 세포주에 따라 1 내지 4회 실험의 평균을 나타낸다.
도 9는 PSC-유래 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포로부터 분화된 산출 CD8+ 단일 양성(SP) T 세포(CD3+TCRαβ+CD4-CD8+)의 막대 그래프를 보여준다. H1, H9 및 WLS-1C PSC 세포주로부터 본 개시내용의 방법에 따라 분화된 CD8+ 단일 양성 T 세포의 빈도가 도시된다(a). 데이터는 PSC 세포주에 따라 3 내지 4회 실험의 평균±SEM으로 표시된다. 산출 CD8+ 단일 양성 T 세포에 의한 상이한 T 세포 마커의 발현의 대표적인 유세포분석 플롯(b) 내지 (e).
도 10은 림프계 전구세포로부터 분화된 산출 CD56+ NK 세포의 막대 그래프를 보여준다. 투입 CD34+ 세포당 CD56+ NK 세포의 빈도 및 수율은 본 개시내용의 방법에 따라 림프계 전구 세포로 분화된 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001, 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다(a). 데이터는 PSC 세포주에 따라 4-13회 실험의 평균±SEM으로 나타낸다. STiPS-M001 PSC에서 유래된 산출 CD56+ NK 세포에 대한 NK 세포 마커 공동발현의 대표적인 유세포 분석 플롯(b) 내지 (h).
도 11은 PSC-유래 NK 세포가 기능적임을 입증하는 막대 그래프 및 유세포 분석 플롯을 보여준다. 분화된 CD56+ NK 세포는 2.5:1 이펙터(NK 세포) 대 표적(K562 세포) 비율에서 말초 혈액(PB) NK 세포로서 다중 PSC 세포주에 걸쳐 비슷한 살해 능력을 나타낸다(a). 데이터는 PSC 세포주에 따라 3-7회 실험의 평균±SEM으로 나타낸다. K562 세포와 공동배양에 의해 활성화된 말초 혈액 NK 세포(d)와 비교되는, 1:1 NK 세포:K562 세포 비율로 K562 세포와 공동 배양 시 활성화되지 않았거나(b) 또는 활성화된(c) H1-유래 NK 세포에 의한 CD107a 및 IFN-γ 발현의 대표적인 유세포 분석 플롯. K562 세포와 공동배양에 의해 활성화된 PB CD56+ NK 세포와 비교되는, 다양한 PSC 세포주로부터 분화된 CD56+ NK 세포에 의한 IFN-γ(e) 및 CD107a(f)의 발현. 데이터는 PSC 세포주에 따라 2 내지 4회 실험의 평균±SEM으로 나타낸다.
도 12는 출발 PSC가 상이한 배지 제형에서 유지되었을 때 산출 조혈 전구 세포 및 림프계 전구 세포에 대한 막대 그래프를 보여준다. 6웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 CD34+ 조혈 전구 세포 수율은 mTeSR1 또는 TeSR-E8(a), 또는 mTeSR1 또는 mTeSR Plus(c)에서 유지된 H1, H9, STiPS-F016 및 WLS-1C PSC 세포주에 걸쳐 결정되었다. (a)와 (c)의 데이터는 mTeSR1을 사용한 4회 실험과 TeSR-E8을 사용한 2회 실험의 평균을 나타낸다. CD5+CD7+ 림프계 전구세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율은 mTeSR1 또는 TeSR-E8(b)에서, 또는 mTeSR1 또는 mTeSR Plus(d)에서 유지된 H1, H9, STiPS-F016 및 WLS-1C PSC 세포주에서 결정되었다. (b)와 (d)의 데이터는 mTeSR1을 사용한 7회 실험과 mTeSR Plus를 사용한 2회 실험의 평균을 나타낸다.
하기 설명은 다능성 줄기 세포(PSC) 또는 초기 중배엽 세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화시키기 위한 배지, 방법 및 시스템(키트)에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "다능성 줄기 세포" 또는 "PSC"는 임의의/모든 3가지 배아 생식 층의 임의의 세포 유형으로 자가 재생 및/또는 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포와 같은 PSC는 배반포에서 단리될 수 있고 유지 또는 분화 세포 배양 조건으로 처리될 수 있다. 유도 다능성 줄기 세포와 같은 PSC는 Oct4, Nanog, Sox2, Klf4 등과 같은 특정 만능 유전자(pluripotency gene)의 강제 발현에 의해 임의의 세포 유형으로부터 유도될 수 있다. 만능 유전자의 강제 발현은 그들의 암호 영역을 안정하게 또는 일시적으로 숙주 세포 내로 도입시키거나 또는 숙주 세포에서 이들 유전자의 내인성 카피의 발현을 활성화시키는 인자를 도입시킴으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초기 중배엽 세포" 또는 "중배엽 전구체 세포"는 조혈 줄기 및 전구 세포의 전구체이다. 이들은 배아(예를 들어, 대동맥-생식선-중신)와 같은 적절한 조직에서 단리될 수 있거나 PSC로부터 분화된다. 또한, 초기 중배엽 세포는 혈액생성 내피로 알려진 혈관 내피의 특화된 하위세트에 상응할 수 있다. 초기 중배엽 세포의 집단이 PSC-유래이든지 또는 초기 단계 배아에서 단리된 것인지 여부에 관계없이, 이들은 KDR, CD56(NCAM) 또는 Brachyury 중 하나 이상을 발현할 수 있지만, CD326(EpCAM)과 같은 마커의 발현이 결여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 및 전구 세포" 또는 "HSPC"는 자가 재생할 수 있고 및/또는 조혈 계통의 보다 특화된 세포로 분화할 수 있는 조혈 계통의 세포를 지칭한다. HSPC는 골수(BM), 제대혈(CB), 배아에서 성인 말초 혈액(PB)까지, 흉선, 말초 림프절, 위장관, 편도선, 임신자궁, 간, 비장 또는 HSPC의 국재화된 집단을 갖는 임의의 다른 조직으로부터 수득될 수 있다. HSPC는 또한 유도 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 미경험 줄기 세포, 확장 줄기 세포 등과 같은 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수도 있다. HSPC의 특징은 막관통 포스포당단백질 CD34의 발현이며, 이에 따라 HSPC는 CD34+ 세포로서 지칭될 수 있다. 인간 HSPC는 CD45 및 CD34의 발현에 의해 추가로 정의될 수 있으며, HSPC 하위세트를 구별하는 데 사용될 수 있는 CD38, CD43, CD45RO, CD45RA, CD10, CD49f, CD59, CD90, CD109, CD117, CD133, CD166, HLA-DR, CD201, 및 인테그린-알파3과 같은 마커의 조합에 의해 더욱 추가로 정의될 수 있다. HSPC는 글리코포린 A, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20 및 CD56과 같은 마커의 발현이 결여되거나 발현이 단지 낮을 수 있으며; 이러한 마커는 더욱 성숙한 혈액 세포의 특징일 수 있다. 용어 "조혈 전구 세포"는 "조혈 줄기 및 전구 세포" 또는 "HSPC"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "림프계 전구세포"는 HSPC보다 더욱 특화되지만 B 세포, T 세포 또는 NK 세포와 같은 하나 이상의 림프계 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있는 세포 유형을 지칭한다. 림프계 전구 세포는 HSPC의 직계 후손이거나 HSPC로부터 추가로 제거될 수 있다. 또한, 림프계 전구 세포는 하류 림프계 세포 유형으로 직접 분화할 수 있거나, 또는 림프계 세포 유형이 되기 전에 하나 이상의 추가 분화 단계를 거칠 수 있다. 림프계 전구 세포의 한 예는 표현형 마커 CD7 및 CD5에 대해 양성인 세포이다. 또 다른 예에서, 림프계 전구 세포는 CD7에 대해 양성이지만 CD5에 대해 음성이거나, 그 반대일 수 있다. 또 다른 예에서, 림프계 전구 세포는 CD7 및 CD5 둘 다에 대해 음성일 수 있다. 림프계 전구 세포에 의해 발현될 수 있는 다른 표현형 마커로는 CD10, CD45RA, CD34, CD38, CD161, CD122, CD117, CD127, CD1a 및/또는 인테그린β7을 포함한다. 여기서, 명시적으로 언급되지 않는 한, 림프계 전구 세포의 집단은 하나 이상의 림프계 세포 유형으로 분화할 수 있는 균질한 세포 집단 또는 불균질한 세포 집단을 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 림프계 전구세포는 임의의 유형의 림프계 세포로 분화할 수 있다. 일 실시형태에서, 림프계 전구세포는 이의 분화 능력이 더 제한적일 수 있고, 림프계 세포의 모든 유형은 아니지만, 하나 이상의 유형으로만 분화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 킬러 세포" 또는 "NK 세포"는 HSPC로부터 유래될 수 있는 조혈 계통의 림프구 유형을 지칭한다. 보다 구체적으로, NK 세포는 다중림프계 전구세포(MLP) 또는 공통 림프계 전구세포(CLP)로부터 유래할 수 있다. NK 세포는 전형적으로 다음과 같은 특징이 있다: T 및 B 세포 특이적 마커의 부재; CD16(NK 세포의 하위세트에서 발현되는 낮은 친화도 Fc 감마 수용체 3A)의 유무 하에 CD56의 발현; 및 이들의 이펙터 기능. 보다 구체적으로, NK 세포의 이펙터 기능은 세포독성 및/또는 IFNγ 및/또는 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 생산을 포함할 수 있다. NK 세포는 추가로 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로 지칭되는 활성화 및 저해 수용체의 발현을 특징으로 할 수 있다. NK 세포가 발현할 수 있는 다른 활성화 수용체로는 NKG2D, NKG2CNKG2E 및 NKG2F를 포함하는 CD94/NKG2 수용체 및 NKp30, NKp44 및 NKp46을 포함하는 천연 세포독성 수용체(NCR)를 포함한다. 다른 저해 수용체로는 NKG2A 및 NKG2B를 포함하는 CD94/NKG2 수용체를 포함한다. PSC 또는 HSPC(예를 들어, PSC-유래 HSPC)로부터 NK 세포의 분화는 일반적으로 PSC-유래 중배엽 전구체 및/또는 림프계 전구 세포(예를 들어, PSC-유래 림프계 전구세포)와 같은 하나 이상의 전구세포 집단에 의해 중개된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "T 세포"는 HSPC로부터 유래할 수 있는 조혈 계통의 림프구 유형을 지칭한다. 보다 구체적으로, T 세포는 다중림프계 전구세포(MLP) 또는 공통 림프계 전구세포(CLP)로부터 유래할 수 있다. T 세포는 전형적으로 NK-, B- 및 적혈골수계-특이적 마커의 부재; CD3 및 TCRαβ(또는 TCRγδ) 및 CD4 또는 CD8의 발현; 및 이들의 이펙터 기능을 특징으로 한다. T 세포의 일부 하위세트는 T 및 NK 세포 둘 다의 특성을 발현할 수 있고, TCRαβ 또는 TCRγδ를 발현하거나 발현하지 않을 수 있으며, CD4, CD8, CD56, CD16 및 NK1.1을 발현하거나 발현하지 않을 수도 있다. 보다 구체적으로, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인 생산, 감염된 세포 또는 종양 표적 세포의 살해 또는 다른 조혈 세포 유형의 자극을 포함할 수 있다. T 세포는 CD8α, CD8β, CD45RA 및 CD27의 발현을 추가로 특징으로 할 수 있다. PSC 또는 HSPC(예를 들어, PSC-유래 HSPC)로부터 T 세포의 분화는 일반적으로 PSC-유래 중배엽 전구체 및/또는 림프계 전구 세포(예를 들어, PSC-유래 림프계 전구 세포)와 같은 하나 이상의 전구세포 집단에 의해 중개된다.
방법
본 개시내용의 방법은 PSC 또는 초기 중배엽 세포로부터 조혈 전구세포 및 기타 하류 조혈 세포 유형을 분화시키기 위한 단계를 포괄한다. 본 개시내용의 방법은 또한 하나 이상의 전구체 세포 집단을 통해 PSC를 T 세포, NK 세포 및 B 세포로 분화시키는 단계를 포괄할 수 있다. 조혈 전구세포 및 기타 하류 조혈 세포 유형을 분화시키기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 바람직하게는 시험관내 및/또는 생체외 방법이다.
조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 하나 이상의 사이토카인(들) 또는 성장 인자(들)로 보충된 제1 기본 배지를 포함하는 제1 배지에서 초기 중배엽 세포(예를 들어, 조혈 전구세포의 전구체의 세포) 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 사이토카인(들) 또는 성장 인자(들)는 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L)이다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 BMP 신호전달의 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합을 배제한다. 다른 실시형태에서, 제1 배지는 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 중 하나 이상이 보충된 기본 배지로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단은 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 전구체이고, 이들은 배아(예를 들어, 대동맥-생식선-중신)와 같은 적절한 조직으로부터 단리된다. 일 실시형태에서, 중배엽 전구체 세포는 혈액생성 내피로 알려진 혈관 내피의 특화된 하위세트에 상응한다. 일부 실시형태에서, 초기 중배엽 세포(예를 들어, 중배엽 전구체 세포)의 집단은 PSC로부터 분화된다. 초기 중배엽 세포의 집단이 PSC-유래이든지 또는 초기 단계 배아에서 단리된 것인지 여부에 관계없이, 이들은 KDR, CD56(NCAM) 또는 Brachyury 중 하나 이상을 발현할 수 있지만, CD326(EpCAM)과 같은 마커의 발현은 결여될 수 있다.
본 개시내용의 제1 배지는 중배엽 세포로부터 조혈 전구 세포(또는 조혈 내피(hemogenic endothelium), HE)를 분화시키는 데 사용될 수 있는 임의의 배지를 포함한다. HE 세포는 배아의 대동맥-생식선-중신(AGM) 영역에 위치한 내피 세포이고, 내피에서 조혈(endothelial-to-hematopoietic: EHT) 전이라는 과정을 통해 조혈 전구세포로 분화할 수 있다. 초기 중배엽 세포 집단을 제1 배지에서 조혈 전구 세포로 분화시키는 것은 하나 이상의 중간체 집단(예를 들어, 조혈 내피)을 거칠 수 있다. 또는, 이러한 제1 배지는 초기 중배엽 세포 집단을 조혈 전구 세포로 직간접적으로 분화시킬 수 있다.
본 개시내용의 제1 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 무혈청일 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 제1 배지는 무혈청이다. 배지가 무혈청인 경우, 이러한 배지에 BIT 9500 Serum Substitute(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09500) 또는 기타 상업적으로 이용가능한 혈청 대체 용액과 같은 혈청 대체 보충제를 포함하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 임의의 세포를 배양하거나 분화시키는 데 필요한 혈청에 일상적으로 존재하는 성분은 배지에 허용가능한 농도로 개별적으로 첨가될 수 있고, 예컨대, 알부민(재조합체이든 아니든)이다.
본 개시내용의 제1 배지는 본 개시내용의 세포(예를 들어, 조혈 전구 세포, 또는 HSPC, 및 잠재적인 하류 림프계 전구세포, NK 세포, T 세포, B 세포)를 배양/분화하는 데 적절한 것으로서 제형화되는 제1 기본 배지를 포함할 것이다. 따라서, 제1 기본 배지는 조혈 계통의 세포 배양/분화를 지원하는 임의의 기본 배지일 수 있다. 비제한적 예로서, 제1 기본 배지는 STEMdiff Hematopoietic - EB Basal Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #100-171), STEMdiff Hematopoietic Basal Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #05311), STEMdiff™ APEL™2 Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #05270), 또는 목적에 맞는 임의의 다른 상업적으로 이용가능한 기본 배지일 수 있다. 이러한 제1 기본 배지를 제형화하는 데 사용되는 공통 성분은 염, 완충액, 지질, 아미노산, 미량 원소, 특정 단백질 등을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 기본 배지는 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포(또는 조혈 내피 세포, HE)의 분화를 최적으로 지원하도록 제형화된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 제1 배지는 조혈 분화의 초기 단계에 영향을 미치는 것으로 알려진 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함할 수 있다. 제1 기본 배지에 첨가되는 보충제(들)는 배양할 세포의 특정 유형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 잠재적인 보충제의 철저하지 않은 목록으로는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 하나 이상의 사이토카인; 하나 이상의 성장 인자; 또는 다른 단백질.
일 실시형태에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO, 및 IGF-1 또는 IGF-2일 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 각각의 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2로 보충된다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나 이상으로 보충된다. IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나 이상을 포함하는 제1 배지의 실시형태에서, 이러한 사이토카인은 각각 약 1 내지 1000 ng/㎖, 또는 약 1 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖의 농도로 존재할 수 있다. 전술한 사이토카인 중 하나 이상의 소분자 유사체가 제1 배지에 포함되는 실시형태에서, 이들은 전형적으로 더 낮은 농도로 사용될 것이다.
일부 실시형태에서, L-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 어느 하나 이상은 포함되지 않을 수 있지만, 배지의 효율은 손상될 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 배지에 IL-15를 포함시키는 것은 불필요하다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 SCF, FLT3L 및 TPO 중 하나 이상을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 또한 조혈 전구 세포를 포함하는 조혈 세포의 배양 또는 분화에 일반적으로 사용되는 하나 이상의 다른 성장 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 배지는 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 VEGF 신호전달의 작동제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 VEGF 신호전달의 작동제 중 하나, 일부 또는 전부를 포함하지 않는다. 다르게 말하면, 제1 배지는 BMP 신호전달의 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 목록에서 선택되는 외인성으로 첨가되는 작동제의 임의의 조합을 배제할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 외인성으로 첨가된 BMP 신호전달의 작동제를 포함하거나 포함하지 않는다. 포함하는 경우, BMP 신호전달의 작동제는 임의의 알려진 BMP 신호전달의 작동제일 수 있다. BMP 신호전달의 작동제는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, BMP 신호전달의 작동제는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되어 단리될 수 있다. 또는, BMP 신호전달의 작동제는 소분자일 수 있다. 일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 마우스 또는 인간 BMP4와 같은 임의의 종의 골형성 단백질이다.
제1 배지에서 BMP 신호전달의 작동제의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖ 사이의 범위일 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 외인성으로 첨가된 FGF 신호전달의 작동제를 포함하거나 포함하지 않는다. 포함하는 경우, FGF 신호전달의 작동제는 임의의 알려진 섬유아세포 성장 인자일 수 있다. 섬유아세포 성장 인자는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, 섬유아세포 성장 인자는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되고 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 인간 또는 마우스 FGF2(염기성 FGF, bFGF로도 알려짐)이다.
제1 배지에서 섬유아세포 성장 인자의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖ 사이일 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 외인성으로 첨가된 VEGF 신호전달의 작동제를 포함하거나 포함하지 않는다. 포함하는 경우, VEGF 신호전달의 작동제는 임의의 공지된 혈관 내피 성장 인자일 수 있다. 혈관 내피 성장 인자는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, 섬유아세포 성장 인자는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되어 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 혈관 내피 성장 인자는 인간 또는 마우스 VEGF이다.
제1 배지 중 혈관 내피 성장 인자의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖ 사이일 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 배지는 하나 이상의 외인성으로 첨가된 BMP4, FGF2 및 VEGF를 배제한다.
일부 실시형태에서, 제1 배지는 액티빈(예를 들어, 액티빈 A), CHIR99021과 같은 Wnt 신호전달 작동제, 및/또는 SB431542와 같은 액티빈 수용체-유사 키나제의 저해제를 포함하지 않는다.
또한, 본 개시내용의 제1 배지는 세포 배양을 지원하기 위한 추가 보충제와 상승작용할 수 있다. 예를 들어, 한편으로는 간질 또는 배양보조 세포가 본 개시내용의 세포 배양 배지와 함께 사용될 수 있다. 이러한 세포의 철저하지 않은 예로는 배아 간 세포주 EL08.1D2, AFT024 세포, OP9 세포, MS-5 또는 M2-10B4 세포, 마우스 배아 섬유아세포 또는 배아 대동맥-생식선 중신(AGM)으로부터의 간질 세포를 포함한다. 다른 한편으로, 간질- 및/또는 배양보조-무함유 배양 접근법은 본 개시내용의 세포 배양 배지와 함께 사용될 수 있다. 이러한 접근법의 일부 실시형태에서, 간질/배양보조 세포의 배양에 의해 조정된 배지가 사용될 수 있거나, 이러한 시스템은 간질/배양보조 세포 대체제를 활용할 수 있다. 간질/배양보조 세포 대체제는 배양 중인 세포에 적절한 신호 또는 부착 부위를 제공하는 하나 이상의 한정된 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 제1 배지에, 또는 배양 용기의 내부 배양 표면에 적용된 코팅에, 또는 입자, 비드, 미세담체 등과 같은 세포 배양 배지에 현탁된 고체 표면에 포함될 수 있다. 이러한 성분의 철저하지 않은 예로는 피브로넥틴 코팅, 젤라틴 코팅, 콜라겐 코팅 또는 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Supplement(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09925) 또는 Matrigel(Corning)과 같은 코팅을 포함할 수 있다. 또는 간질/배양보조 세포 대체제는 이러한 성분을 세포 배양 배지 내에 가용성 형태로, 예컨대 보충에 의해 또는 간질/배양보조 세포에 의해 이전에 조정된 배지로서 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 간질-무함유 조건 및/또는 배양보조-무함유 조건 하에 초기 중배엽 세포(예를 들어, 중배엽 전구체 세포)를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조 세포가 없는 조건 하에서 중배엽 전구체 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
PSC-유래 중배엽 전구체 세포와 같은 초기 중배엽 세포 집단의 배양(전술한 바와 같은 제1 배지와 같은 적절한 배지에서)은 이들의 생존력 또는 하류 계통으로 분화하는 능력에 영향을 미치지 않는 임의의 시간 기간 동안일 수 있다. 일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 제1 배지에서 세포를 약 2일 내지 21일, 또는 약 4일 내지 14일 동안 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 제1 배지에서 세포를 약 6일 내지 10일 동안 배양하는 것을 추가로 포함한다.
조혈 전구 세포를 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 분화시키기 위해 제1 배지(본 명세서에 달리 기재된 바와 같음)에 외인성으로 첨가된 BMP 신호전달 작동제, FGF 신호전달 작동제 및 VEGF 신호전달 작동제 중 하나, 일부 또는 전부의 부재가 분화 효율을 현저하게 감소시키지 않았음은 본 발명자들에 의해 놀랍게도 밝혀졌다. 일부 경우에, 임의의 전술한 작동제(또는 임의의 조합)를 배제하는 것은 초기 중배엽 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 효율에 유익한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 외인성으로 첨가된 VEGF 신호전달 작동제의 부재는 외인성 VEGF 신호전달 작동제를 포함하는 제1 배지와 비교하여 분화된 조혈 전구 세포의 빈도 및/또는 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 외인성으로 첨가된 VEGF 신호전달 작동제를 포함하지 않는 제1 배지에서 분화된 조혈 전구 세포는 덜 부착성일 수 있고, 이에 따라 외인성으로 첨가된 VEGF 신호전달 작동제를 포함하는 제1 배지와 비교하여, 하류 림프계 전구 세포(및 추가로 발생하는 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포)의 빈도 및 수율 증가를 생산할 수 있다. 유사하게, 외인성으로 첨가된 FGF 또는 BMP 신호전달 작동제의 부재는 외인성으로 첨가된 FGF 또는 BMP 신호전달 작동제를 포함하는 제1 배지와 비교하여 분화된 조혈 전구 세포의 빈도 및/또는 수율을 증가시킬 수 있다. 반면, 제1 배지로부터 FGF 또는 BMP 신호전달 작동제를 배제하면, 조혈 전구 세포의 증가를 초래할 수 있지만, 이러한 세포는 하류 림프계 전구세포로 분화하는 능력이 손상된 것일 수 있다. 그러나 놀랍게도, VEGF 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 BMP 신호전달의 작동제 각각을 배제한 제1 배지에서 분화된 조혈 전구세포는 림프계 전구세포로 추가로 분화할 수 있는 증가된(또는 동등한) 능력을 가질 수 있다(3가지 각각을 포함한 조건과 비교 시). 조혈 전구 세포(및 하류 림프계 전구세포)를 분화시키기 위한 최소 배지 조건을 식별하는 다른 이점은 제조 비용이 크게 감소할 수 있고 복잡성이 감소하며, 감소된 복잡성이 더 적은 규제 방해를 제공할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 개시내용은 또한 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지를 포괄한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 PSC-유래 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지를 포괄한다. 일 실시형태에서, PSC는 포유동물이고, 일 실시형태에서 PSC는 인간이다. 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지는 제1 배지로 지칭될 수 있고, 이러한 제1 배지는 상기 기재된 임의의 제형 세부사항을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 무혈청이며 배양보조/간질-무함유 작업흐름에서 사용된다. 일 실시형태에서, 제1 배지는 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 중 하나 이상으로 보충된 기본 배지를 포함하고, BMP 신호전달 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달 작동제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합을 배제한다.
제1 배지로부터 BMP, FGF 및 VEGF 작동제 중 하나, 일부 또는 전부의 부재는 제1 배지에서 배양된(및 간질 세포 또는 간질-무함유 작업흐름에서 코팅 물질과 접촉함) 세포가 예를 들어, 간질 세포 또는 간질 대체제, 또는 세포 자체가 성장 인자를 도입시킨다면, 그럼에도 불구하고, 상기 작동제의 낮은 수준 또는 검출 미만의 수준에 노출된다는 것을 의미할 수 있다. 그러나, PSC 또는 간질 세포(존재하는 경우)가 이러한 작동제를 이소성으로 발현하거나 과발현하도록 조작되지는 않는다. 따라서, 본 발명자들이 아는 한, 이것은 BMP, FGF 및 VEGF 신호전달 작동제 중 하나, 일부 또는 전부의 부재 하에 혈청- 및 간질-무함유 조건 하에 PSC-유래 중배엽 전구체 세포로부터 조혈 전구 세포의 효율적인 분화를 보고하는 최초의 개시내용이다.
일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 PSC-유래 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 제2 기본 배지 및 하나 이상의 BMP 신호전달 작동제(전술한 것), FGF 신호전달의 작동제(전술한 것), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제를 포함하는 유도 배지에서 PSC를 배양하여 PSC-유래 초기 중배엽 세포의 분화된 집단을 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 유도 배지는 PSC로부터 초기 중배엽 세포의 집단을 분화시키는 데 사용될 수 있는 임의의 배지를 포함한다. 유도 배지에서 PSC로부터 초기 중배엽 세포의 집단을 유도하는 것은 하나 이상의 중간체 집단을 거칠 수 있다. 또는, 유도 배지는 PSC 집단을 초기 중배엽 세포 집단으로 직간접적으로 분화시킬 수 있다.
본 개시내용의 유도 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 무혈청일 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 유도 배지는 무혈청이다. 배지가 무혈청인 경우, BIT 9500 Serum Substitute(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09500) 또는 기타 상업적으로 이용가능한 혈청 대체 용액과 같은 혈청 대체 보충제를 상기 배지에 포함시키는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 임의의 세포를 배양하거나 분화시키는 데 필요한 혈청에 일상적으로 존재하는 성분은 알부민(재조합체이든 아니든 간에)과 같이, 허용 가능한 농도로 배지에 개별적으로 첨가될 수 있다.
본 개시내용의 유도 배지는 본 개시내용의 세포(예를 들어, PSC, 및 잠재적인 하류 조혈 전구 세포, 림프계 전구세포, NK 세포, T 세포, B 세포)를 분화시키기에 적절한 것으로서 제형화된 제2 기본 배지를 포함할 것이다. 제2 기본 배지는 PSC 및/또는 조혈 계통의 세포, 예컨대, 이의 전구세포(예를 들어, 초기 중배엽 세포)의 배양을 지원하는 임의의 기본 배지일 수 있다. 비제한적 예로서, 제2 기본 배지는 STEMdiff Hematopoietic - EB Basal Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #100-171), STEMdiff Hematopoietic Basal Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #05311), STEMdiff™ APEL™2 Medium(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #05270 또는 목적에 적합한 임의의 다른 상업적으로 이용가능한 기본 배지일 수 있다. 이러한 제1 기본 배지를 제형화하는 데 사용되는 공통 성분으로는 염, 완충액, 지질, 아미노산, 미량 원소, 특정 단백질 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 기본 배지는 제1 기본 배지와 동일하거나 본질적으로 동일하다. 일 실시형태에서, 제2 기본 배지는 제1 기본 배지와 상이하다.
일 실시형태에서, 유도 배지는 조혈 분화의 초기 단계에 영향을 미치는 것으로 알려진 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도 배지는 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 VEGF 신호전달의 작동제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
유도 배지의 일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 임의의 공지된 BMP 신호전달의 작동제일 수 있다. BMP 신호전달의 작동제는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, 또는 BMP 신호전달의 작동제는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되고 단리될 수 있다. 또는, BMP 신호전달의 작동제는 소분자일 수 있다. 일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 골형성 단백질이다. 일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 BMP4이다. 일 실시형태에서, BMP 신호전달의 작동제는 인간 또는 마우스 BMP4이다.
포함되는 경우, 유도 배지에서 BMP 신호전달의 작동제의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖의 범위일 수 있다.
유도 배지의 일 실시형태에서, FGF 신호전달의 작동제는 임의의 공지된 섬유아세포 성장 인자일 수 있다. 섬유아세포 성장 인자는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, 섬유아세포 성장 인자는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되고 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 인간 또는 마우스 FGF2(염기성 FGF, bFGF로도 알려짐)이다. 일부 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 단일 아이소형 변이체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 하나 초과의 아이소형 변이체를 포함한다.
포함되는 경우, 유도 배지 중 섬유아세포 성장 인자 작동제의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖ 범위일 수 있다.
유도 배지의 일 실시형태에서, VEGF 신호전달의 작동제는 임의의 공지된 혈관 내피 성장 인자 또는 이의 임의의 스플라이싱 아이소형일 수 있다. 혈관 내피 성장 인자 또는 스플라이스 변이체(들)는 생산 세포에서 내인성으로 발현되고 이로부터 단리될 수 있거나, 혈관 내피 성장 인자 또는 스플라이스 변이체(들)는 재조합체일 수 있고 생산 세포로부터 발현되고 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 혈관 내피 성장 인자의 단일 아이소형이 유도 배지에 포함된다. 일 실시형태에서, 혈관 내피 성장의 다중 아이소형이 유도 배지에 포함된다. 인간 혈관 내피 성장 인자는 여러 방식으로 스플라이싱되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 혈관 내피 성장 인자의 아이소형은 121, 145, 165, 183, 189 및 206개 아미노산 길이의 아이소형을 포함한다. 가장 강력하고 풍부한 아이소형은 121, 165 및 189개 아미노산 길이 변이체를 포함할 수 있다.
포함되는 경우, 유도 배지 중 혈관 내피 성장 인자 작동제의 농도는 약 0.05 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖, 약 0.5 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖의 범위일 수 있다.
유도 배지는 액티빈(예를 들어, 액티빈 A), Wnt 신호전달 작동제(예를 들어, CHIR99021) 및/또는 TGFβ 경로 저해제(예를 들어, SB431542), 및/또는 액티빈과 같은 조혈 분화의 초기 단계에 영향을 미치는 것으로 알려진 기타 사이토카인 또는 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 개시내용의 유도 배지는 세포 배양을 위한 추가 보충제와 상승작용할 수 있다. 예를 들어, 한편으로는 간질 세포 및/또는 배양보조 세포가 본 개시내용의 세포 배양 배지와 함께 사용될 수 있다. 이러한 세포의 철저하지 않은 예로는 배아 간 세포주 EL08.1D2, AFT024 세포, OP9 세포, MS-5 또는 M2-10B4 세포, 마우스 배아 섬유아세포 또는 배아 AGM의 간질 세포를 포함한다. 다른 한편으로, 간질- 및/또는 배양보조-무함유 배양 접근법은 본 개시내용의 세포 배양 배지와 함께 사용될 수 있다. 간질- 및/또는 배양보조-무함유 배양 시스템은 간질 세포에 의해 이전에 조정된 배지를 활용할 수 있거나, 이러한 시스템은 간질 세포 대체제를 활용할 수 있다. 이러한 시스템은 간질/배양보조 세포에 의해 이전에 조정된 배지를 활용할 수 있거나, 또는 이러한 시스템은 간질/배양보조 세포 대체제를 활용할 수 있다. 간질/배양보조 세포 대체제는 배양 중인 세포에 적절한 신호 또는 부착 부위를 제공하는 하나 이상의 정해진 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 유도 배지 또는 배양 용기의 내부 배양 표면에 적용된 코팅, 또는 입자, 비드, 미세담체 등과 같은 세포 배양 배지에 현탁된 고체 표면에 포함될 수 있다. 이러한 성분의 철저하지 않은 예로는 피브로넥틴 코팅, 젤라틴 코팅, 콜라겐 코팅, 고정된 Notch 리간드, 또는 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Supplement(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09925) 또는 Matrigel(Corning)과 같은 코팅을 포함할 수 있다. 또는, 간질/배양보조 세포 대체제는 이러한 성분을 세포 배양 배지 내에 가용성 형태로, 예컨대, 보충에 의해 또는 간질/배양보조 세포에 의해 이전에 조정된 배지로서 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포의 집단을 분화시키는 방법은 간질-무함유 조건 및/또는 배양보조-무함유 조건 하에서 PSC를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포 집단을 분화시키는 방법은 외인성으로 첨가된 간질- 및/또는 배양보조 세포가 없는 조건 하에서 PSC를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포 집단을 분화시키는 방법은 PSC를 덩어리 또는 단세포로 해리시키고, 이러한 세포를 유도 배지에서 플레이팅하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포 집단을 분화시키는 방법은 유도 배지에서 PSC를 배양하기 전에 PSC를 응집체로 형성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포 집단을 분화시키는 방법은 유도 배지에서 PSC를 응집체로 형성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
PSC는 임의의 공지된 접근법을 사용하여 응집체로 형성시킬 수 있다. 예를 들어, PSC의 응집체는 원하는 수의 PSC를 튜브 바닥 또는 세포 배양 플레이트의 웰에 침착시킴으로써 형성될 수 있다. 또는, 응집체는 원하는 수의 PSC를 Aggrewell™ 마이크로웰 장치의 웰에 침착시켜 형성시킴으로써 균일한 크기의 PSC 응집체의 효율적이고 재현가능한 형성을 도모할 수 있다.
일 실시형태에서, 응집체를 형성하기 위해 사용되는 PSC의 수는 약 1 내지 100,000개 사이이다. 일 실시형태에서, 응집체를 형성하기 위해 사용되는 PSC의 수는 약 10 내지 10,000개 사이이다. 일 실시형태에서, 응집체를 형성하기 위해 사용되는 PSC의 수는 약 100 내지 1,000개 사이이다.
따라서, 일 실시형태에서, PSC의 응집체는 마이크로웰 장치에서 형성될 수 있다. 일 실시형태에서, PSC의 응집체는 약 1000개의 세포 또는 약 500개의 세포로부터 형성된다.
중배엽 전구체를 생성하기 위한 PSC의 배양(전술한 바와 같이, 유도 배지와 같은 적절한 배지에서)은 이들의 생존력 또는 하류 계통으로 분화하는 능력에 영향을 미치지 않는 임의의 시간 기간 동안일 수 있다. 일 실시형태에서, 초기 중배엽 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 약 1일 내지 7일 동안 유도 배지에서 PSC를 배양하여 PSC-유래 중배엽 세포의 분화된 집단을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, PSC로부터 초기 중배엽 세포 집단을 분화시키는 방법은 PSC를 유도 배지에서 약 2일 내지 5일 동안 배양하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, PSC는 제2 기본 배지, 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장인자(VEGF) 신호전달의 작동제를 포함하는 유도 배지에서 초기 중배엽 세포의 집단으로 분화되어, PSC-유래 중배엽 세포의 분화된 집단을 수득할 수 있다. 일 실시형태에서, 유도 배지는 각각 제2 기본 배지 및 BMP, FGF 및 VEGF 신호전달의 작동제를 포함한다.
따라서, 전술한 내용에 기초하여, 본 개시내용은 전술한 바와 같은 유도 배지를 포괄한다. 또한, 유도 배지 및 제1 배지는 PSC를 초기 중배엽 세포의 집단을 통해 조혈 전구세포로 분화시키기 위한 키트 또는 시스템에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, PSC-유래 중배엽 전구체로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법은 조혈 전구 세포를 해리시키고 해리된 조혈 전구 세포를 림프계 분화 배지에서 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에 배양한 후 림프계 전구 세포를 수득하는 것을 추가로 포함한다.
PSC의 응집체를 사용하여 초기 중배엽 전구체 집단을 분화시키고 이러한 PSC-유래 중배엽 전구체를 사용하여 조혈 전구 세포를 분화시키는 경우, 조혈 전구 세포는 임의의 공지된 또는 개발된 수단을 사용하여 해리시킬 수 있다. 다양한 해리 시약, 예컨대, Accutase™(STEMCELL Technologies), TrypLE™ Express(ThermoFisher Scientific), Gentle Cell Dissociation Reagent, GCDR(STEMCELL Technologies) 또는 트립신이 상업적으로 이용가능하다. 상이한 해리 시약을 조합하는 것도 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 나타낸 바와 같이, Collagenase II & TrypLE™ 또는 Collagenase IV & TrypLE™을 조합하여 조혈 전구 세포를 해리시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 조혈 전구 세포를 해리시킨 후, 샘플 내의 조혈 전구 세포를 농축하는 것이 바람직할 수 있다. EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II(STEMCELL Technologies)를 비롯한 다양한 상업적 시약이 알려져 있다. 또는, 조혈 전구세포(또는 조혈 내피 세포)는 FACS 분류에 의해 농축될 수 있다.
본 개시내용의 림프계 분화 배지는 조혈 전구 세포 또는 조혈 내피 세포를 림프계 전구 세포로 분화시키는 데 사용될 수 있는 임의의 배지를 포함한다. 이러한 림프계 분화 배지는 PSC-유래 조혈 전구세포에서 림프계 전구 세포로의 분화를 지칭할 수 있으며, 이는 이들 사이에 하나 이상의 중간체 집단의 유도를 포함할 수 있다. 또는, 이러한 림프계 분화 배지는 PSC-유래 조혈 전구 세포의 집단을 림프계 전구 세포의 하나 이상의 하위세트로 직간접적으로 분화시킬 수 있다.
본 개시내용의 림프계 분화 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 무혈청일 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 림프계 분화 배지는 무혈청이다. 배지가 무혈청인 경우, 이러한 배지에는 BIT 9500 Serum Substitute(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09500) 또는 기타 상업적으로 이용가능한 혈청 대체 용액과 같은 혈청 대체 보충제를 포함하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 임의의 세포를 배양하거나 분화시키는 데 필요한 혈청에 일상적으로 존재하는 성분은 허용가능한 농도로 배지에 개별적으로 첨가될 수 있다.
본 개시내용의 림프계 분화 배지는 본 개시내용의 세포를 분화(예를 들어, 조혈 전구세포에서 림프계 전구세포로)시키기에 적절한 것으로 제형화된 제3 기본 배지를 포함할 것이다. 제3 기본 배지는 조혈 계통의 세포 배양을 지원하는 임의의 기본 배지일 수 있다. 비제한적 예로서, 제3 기본 배지는 StemSpan™ SFEM(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09650), StemSpan™ SFEM II(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09655), StemSpan™-ACF(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09855), StemSpan™ H3000(STEMCELL Technologies, 카탈로그 #09850), 또는 목적에 맞는 다른 상업적으로 이용가능한 기본 배지일 수 있다. 이러한 제3 기본 배지를 제형화하는 데 사용되는 공통 성분으로는 염, 완충액, 지질, 아미노산, 미량 원소, 특정 단백질 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제3 기본 배지는 제2 기본 배지 또는 제1 기본 배지, 또는 둘 다와 동일하거나, 또는 제2 기본 배지 또는 제1 기본 배지, 또는 둘 다와 본질적으로 동일하다. 일 실시형태에서, 제3 기본 배지는 제2 기본 배지 또는 제1 기본 배지, 또는 둘 다와 상이하다.
일 실시형태에서, 림프계 분화 배지는 조혈 전구 세포의 분화를 지원하기 위해 추가로 보충될 필요가 있을 수 있다. 기본 배지에 첨가되는 보충제(들)는 배양할 세포의 특정 유형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 잠재적인 보충제의 철저하지 않은 목록으로는 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 단백질을 포함한다.
구체적으로, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2는 본 개시내용의 림프계 분화 배지에 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, 림프계 분화 배지는 각각의 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2로 보충된다. 일 실시형태에서, 림프계 분화 배지는 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나 이상으로 보충된다. IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나 이상을 포함하는 림프계 분화 배지의 실시형태에서, 이러한 사이토카인은 각각 약 1 내지 1000 ng/㎖, 또는 약 1 내지 100 ng/㎖, 또는 약 5 내지 50 ng/㎖ 사이의 농도로 존재할 수 있다. 소분자가 또한 포함된다면, 이는 전형적으로 낮은 농도로 사용된다. 예를 들어, Wnt 신호전달 작동제 CHIR99021 또는 TGFβ 경로 저해제 SB431542와 같은 소분자는 0.1nM-30uM 사이의 농도로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 어느 하나 이상은 림프계 분화 배지에 포함되지 않을 수 있지만, 림프계 분화 배지의 효율은 손상될 수 있다.
일 실시형태에서, 중배엽 세포로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법(후속적으로 조혈 전구 세포를 림프계 전구 세포로 분화함)은 T 세포 성숙 배지에서 림프계 전구 세포를 배양한 후 T 세포를 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, T 세포 성숙 배지는 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나, 일부 또는 전부는 T 세포 성숙 배지에 포함될 수 없다; 하지만, 이러한 배지의 효율은 손상될 수 있다. 예를 들어, IL-15는 이러한 배지의 효율에 유의미한 영향을 미침이 없이 T 세포 성숙 배지로부터 배제될 수 있다.
일 실시형태에서, T 세포는 CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포이고 CD3 및 TCRαβ를 발현할 수 있다. 일 실시형태에서, CD4+CD8+ 이중 양성 T 세포는 CD8+ 단일 양성 T 세포로 추가 성숙될 수 있다.
일 실시형태에서, 중배엽 세포로부터 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법(후속적으로 조혈 전구 세포를 림프계 전구 세포로 분화함)은 NK 세포 생성 배지에서 림프계 전구 세포를 배양한 후 NK 세포를 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, NK 세포 생성 배지는 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO, 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, SCF, FLT3L, TPO, EPO 및 IGF-1 또는 IGF-2 중 하나, 일부 또는 전부는 NK 세포 생성 배지에 포함되지 않을 수 있다; 하지만, 이러한 배지의 효율은 손상될 수 있다. 예를 들어, IL-15는 일부 실시형태에서 NK 세포 생성 배지의 중요한 성분이다.
일 실시형태에서, NK 세포는 CD56+ NK 세포이다. 일 실시형태에서, NK 세포는 기능적이다. 일 실시형태에서, NK 세포는 IFN-γ를 생산한다. 동일하거나 상이일 실시형태에서, NK 세포는 세포독성이다. 동일하거나 상이한 실시형태에서, NK 세포는 CD107, 보다 구체적으로 CD107a를 발현한다.
PSC를 초기 중배엽 세포(예를 들어, 전구체 세포) 집단으로, PSC-유래 중배엽 전구체를 조혈 전구 세포로, PSC-유래 조혈 전구세포를 림프계 전구세포로, 그리고 PSC-유래 림프계 전구세포를 다양한 림프 계통으로 분화시키는 방법을 개시하는 것 외에도, 본 명세서에 개시된 다양한 배지는 독립형 형식으로 포괄되거나, 또는 무혈청 조건 및/또는 간질 무함유 조건 하의 여부에 관계없이 PSC를 림프계 전구세포 및 그 이상으로 단계적으로 분화시키기 위한 시스템에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전체 시스템은 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 시스템의 특정 양상만이 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에서 수행된다. 예를 들어, 전술한 것의 일반성을 제한함이 없이, PSC를 초기 중배엽 세포 집단으로, PSC-유래 중배엽 전구체를 조혈 전구 세포로, 및 PSC-유래 조혈 전구세포를 림프계 전구세포로 분화시키는 것은 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에 수행되는 한편, 추가 하류 단계는 그렇거나 그렇지 않을 수 있다. 반대로, 시스템의 초기 단계는 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에서 수행되거나 수행되지 않을 수 있는 반면, 후속 단계는 무혈청 및/또는 간질 무함유 조건 하에 수행된다.
일 실시형태에서, 이러한 시스템(들) 또는 키트(들)는 하기 성분 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함할 수 있다: PSC를 초기 중배엽 세포 집단으로 분화시키기 위한 제1 배양 시스템; PSC-유래 중배엽 세포를 조혈 전구 세포로 분화시키기 위한 제2 배양 시스템; PSC-유래 조혈 전구 세포를 림프계 전구 세포의 하나 이상의 하위세트로 분화시키기 위한 제3 배양 시스템; PSC-유래 림프계 전구세포를 B세포로 분화시키기 위한 제4 배양 시스템; PSC-유래 림프계 전구 세포를 T 세포로 분화시키기 위한 제5 배양 시스템; PSC-유래 림프계 전구세포를 NK 세포로 분화시키기 위한 제6 배양 시스템; 코팅 기재; 초기 중배엽 세포(예를 들어, 전구체 세포)의 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제1 키트; 조혈 전구 세포 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제2 키트; 림프계 전구 세포 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제3 키트; B 세포 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제4 키트; T 세포 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제5 키트; 및 NK 세포 집단을 양성 또는 음성으로 농축시키기 위한 제6 키트.
다음의 비제한적 실시예는 본 개시내용을 예시한다.
실시예
실시예 1: PSC의 유지
인간 PSC(hPSC)는 Matrigel™ 코팅된 플레이트에서 mTeSR™1(STEMCELL Technologies), TeSR™-E8(STEMCELL Technologies) 또는 mTeSR™ Plus(STEMCELL Technologies) 배지에 제조업체의 권장 사항에 따라 6 내지 8일 동안 유지시켰다. 완전배지 변경은 매일 수행했다. PSC 콜로니는 PSC 세포주의 유지 배양물에서 새로 코팅된 Matrigel™ 플레이트 상으로 덩어리 계대했다. PSC가 하류 분화 검정에 사용된 경우, 콜로니는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 ACCUTASE™(STEMCELL Technologies)를 사용하여 해리시켜 단세포 현탁액을 수득했다.
실시예 2: 응집체의 형성
실시예 1에 따라 단세포 현탁액을 수득하기 전에, 24-웰 또는 6-웰 Aggrewell™ 400 플레이트(STEMCELL Technologies)는 부착 방지 헹굼 용액(STEMCELL Technologies)으로 마이크로웰 장치를 코팅하여 마이크로웰 장치(STEMCELL Technologies)에 세포의 부착을 감소시키는 것을 포함한 제조업체의 권장 사항에 따라 준비했다. 권장 인큐베이션 후, 부착 방지 헹굼 용액은 버리고 각 웰은 15mM HEPES가 포함된 동일한 부피의 DMEM-F12로 1회 헹구었다.
마이크로웰 장치를 준비한 후, 실시예 1에 따라 해리된 hPSC를 마이크로웰 장치의 하나 이상의 웰 내로 유도 배지(예를 들어, EB 형성 배지)(STEMdiff™ Hematopoietic - EB 기본 배지, STEMdiff™ Hematopoietic - EB Supplement A, STEMCELL Technologies이 보충됨) 및 10μM Y-27632(STEMCELL Technologies)에서 파종했다. 마이크로웰 장치의 6-웰 형식이 사용되는 실시형태에서는 마이크로웰 장치의 웰에 2.5㎖의 EB 형성 배지가 첨가되었다. 다음으로, EB 형성 배지 중 추가 2.5㎖의 세포 현탁액(약 1.4×106개 세포/㎖)을 2.5㎖의 EB 형성 배지를 함유한 웰에 첨가했고 마이크로웰 장치를 잠시 원심분리하고 37℃에서 인큐베이션했다. 마이크로웰 장치의 24웰 형식이 사용되는 경우에는, 웰당 부피는 그에 따라 2㎖/웰로 축소되어야 한다. 마이크로웰 장치의 각 웰에서 최종 세포 농도는 약 3×105개 세포/㎖ 또는 6×105개 세포/24웰 플레이트의 웰 또는 7×105개 세포/㎖ 또는 6-웰 플레이트의 웰당 3.5×106개 세포여야 한다.
실시예 3: 유세포 분석 및 세포 카운트 및 수율의 결정
본 개시내용에 개략된 분화 프로토콜의 임의의 단계에서, 샘플을 수확할 수 있고 그의 표현형을 유세포 분석에 의해 평가할 수 있다. 다음 일반 프로토콜은 CD34, CD5, CD7, NK 계통 마커, 예컨대, CD56, NKp46, NKp44, NKp30, NKG2D, CD16 또는 KIR 및 T 계통 마커, 예컨대, CD4, CD8, TCRαβ 또는 CD3을 측정하는 데에도 동일하게 적용된다.
간략하게, 세포 샘플은 원심분리에 의해 수확하고 적절하게 세척했다. 그런 다음 세포 샘플을 선택한 항원에 대한 형광단-접합 항체로 염색했다. 준비된 세포 샘플을 CytoFLEX S™ 유세포 분석기(Beckman-Coulter)에서 분석했다. 광 산란 프로파일 및 DRAQ7 염색에 의해 죽은 세포를 배제시켰다.
제조업체의 권장 사항에 따라 NucleoCounter NC250(Chemometec)을 사용하여 총 생존 세포 카운트를 수득했다. 아크리딘 오렌지와 DAPI(AO/DAPI)의 혼합물로 염색하기 전에 필요에 따라 세포를 희석했다. 이 혼합물에서 AO는 세포막을 표지화하고, DAPI는 죽은/죽어가는 세포의 핵산을 표지화하여 - 함께 샘플 중 생존 세포 대 비생존 세포를 사진으로 구별할 수 있도록 한다. 그런 다음 NC250 소프트웨어는 결과 이미지를 분석하고 생존 세포 농도를 포함한 세포 카운트를 보고한다. 투입 세포당 특정 세포의 수율을 계산하기 위해 총 생존 카운트에 주어진 세포 유형의 빈도%를 곱했다. 예를 들어, 투입 CD34+ 세포당 NK 세포의 수율을 계산하기 위해, 생존 세포 카운트에 유세포 분석으로 수득한 CD56+%를 먼저 곱한다. 그런 다음 이 수를 투입 세포 수로 나누어(투입 CD34+ 세포의 경우) 최종 값을 수득한다. 투입 CD34+ 세포수는 하나의 웰에서 배양된 총 세포를 세포 분리 후 CD34+ 세포의 빈도를 곱하여 수득했다. Aggrewell™의 웰당 CD34+ 세포의 수율을 계산하기 위해, 투입 hPSC당 CD34+ 세포의 수율(세포 분리 전)을 Aggrewell™의 한 웰에 파종된 hPSC의 수(3.5×106/6wp Aggrewell™ 400의 웰)로 곱했다.
실시예 4: 응집체를 조혈 전구세포로 분화
실시예 2에 따라 응집체를 형성한 후 2일째에, 마이크로웰 장치의 각 웰에 있는 배지 2.5㎖를 응집체를 방해함이 없이 조심스럽게 제거하고 폐기했다. 2.5㎖ 부피의 새로운 유도 배지(예를 들어, EB Medium A)(STEMdiff™ Hematopoietic - EB Supplement A(STEMCELL Technologies)가 보충된 STEMdiff™ Hematopoietic - EB Basal Medium(STEMCELL Technologies))를 각 웰에 첨가하고 마이크로웰 장치를 원래 위치로 되돌려 37℃에서 인큐베이션했다.
중배엽 중간체(예를 들어, 초기 중배엽 세포 집단)가 형성되는 3일째에, 마이크로웰 장치의 각 웰 중 배지 2.5㎖를 응집체를 방해함이 없이 조심스럽게 제거하고 폐기했다. 2.5㎖ 부피의 새로운 제1 배지(예를 들어, EB Medium B)(STEMdiff™ Hematopoietic - EB Supplement B(STEMCELL Technologies)가 보충된 STEMdiff™ Hematopoietic - EB Basal Medium(STEMCELL Technologies))를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하여 중배엽 세포를 조혈 전구세포로 분화시켰다.
5일째 마이크로웰 장치의 각 웰에서 응집체를 수확하여 37㎛ 가역 필터(STEMCELL Technologies)를 통해 통과시켜 그 표면에 있는 응집체를 단리시켰다. 응집체의 여과액은 필터를 새로운 튜브 위에 뒤집고 메쉬에 대해 새로운 제1 배지(예를 들어, EB Medium B) 2.5 ㎖/웰(24-웰 형식의 마이크로웰 장치가 사용되었다면 1 ㎖/웰)을 유도하여 새로운 튜브 내에 침착시켰다. 이렇게 얻은 응집체는 부드럽게 재현탁시킨 후, 전체 부피를 비-조직 배양물-처리된 플레이트에 첨가한 뒤, 37℃에서 인큐베이션했다. 6-웰 플레이트의 각 웰은 7일째에 2.5㎖의 신선한 EB Medium B(또는 1㎖/24-웰 플레이트의 웰)로 채운 다음, 37℃에서 인큐베이션했다. 10일째에, 응집체를 방해하지 않도록 주의하면서 신선한 EB Medium B로 배지 절반을 교환한 다음, 추가 2일 동안 37℃에서 인큐베이션했다.
PSC를 초기 중배엽 중간체를 통해 조혈 전구세포로 분화할 때에는 하나 이상의 BMP, FGF 및 VEGF 신호전달의 작동제가 필요한 것으로 일반적으로 생각되며(Kennedy et al, 2012; Ng et al, 2016), 따라서 이러한 작용제를 단독으로 또는 조합으로 분화 프로토콜(예를 들어, 제1 배지)로부터 배제하는 것이 산출 조혈 전구세포에 부정적인 영향을 미치지 않았음은 놀라운 것이었다. 사실, 이 분화 단계에서 BMP, FGF 및/또는 VEGF를 생략하는 것은 산출 조혈 전구세포를 증가시킬 수 있는 한편(도 1a, 도 1b, 도 1c), 림프계 전구세포의 하류 분화에 도움을 주고(도 1d), 그 이후에 예컨대, 배양물 중 오염성 부착 세포의 수를 감소시켜 도움을 준다(데이터 미제시).
실시예 5: 조혈 전구세포 농축
실시예 4의 응집체를 각 웰로부터 수확하여 개별 15㎖ 튜브로 옮겼다. 튜브를 300g에서 5 내지 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 흡인하고 콜라게나아제 유형 II - 2500U/㎖(STEMCELL Technologies)(Cat#07418) 1㎖를 각 튜브에 첨가하고 37℃에서 20분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 TryPLE™ Express 3㎖를 첨가하고 각 튜브를 추가 20분 동안 인큐베이션했다. 이러한 해리 조건은 다른 기존 접근법과 비교하여 CD34+ 세포의 증가된 회수 및 생존 CD34+ 세포의 증가된 수율을 초래했다(도 2).
인큐베이션 후, 각 튜브에 6㎖의 DMEM/F12를 채우고 37㎛ 필터를 통해 여과했다. 용출액은 300g x에서 5 내지 10분 동안 원심분리하고 상청액은 버렸다. 펠릿화된 세포는 EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II(STEMCELL Technologies)를 사용하여 CD34+ 농축 프로토콜로 처리했다. CD34+ 농축에 대한 제조업체의 권장 사항을 따랐지만 자기 분리의 횟수는 4회에서 2회로 줄였다.
H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주는 CD34+ 조혈 전구 세포로 효율적으로 분화되었다. CD34+ 조혈 전구 세포의 평균 빈도는 모든 PSC 세포주에 걸쳐 실시예 3에 따라 계산 시, 31% 내지 42% 사이의 범위였다(도 3a). CD34+ 조혈 전구 세포의 6-웰 Aggrewell™ 플레이트의 웰당 평균 수율은 실시예 3에 따라 계산 시, 모든 PSC 세포주에 걸쳐 3.3×105 내지 7.4×105 세포 사이의 범위였다(도 3a). 이렇게 유도된 CD34+ 조혈 전구 세포의 대표적인 유세포 분석 플롯은 농축 전(도 3b) 및 농축 후(도 3c)에 도시했다.
실시예 6: PSC-유래 조혈 전구세포의 다분화능 결정
hPSC는 3 내지 12일 동안(전술한 바와 같음) VEGF를 포함하거나 포함함이 없이 STEMdiff™ Hematopoietic - EB 시약을 사용하여 12일 동안 분화시켰다. 산출 세포를 수확하고, 해리하고, CD34+ 세포에 대해 자기적으로 농축시켰다(전술한 바와 같음). 농축된 세포를 제조업체의 지침에 따라 웰당 1×104개 세포의 밀도로 피종하고 MethoCult™ SF H4636(STEMCELL Technologies)에서 배양시켰다. 12일 후, 이미지 및 카운트는 제조업체의 지침에 따라 STEM™vision 기기(STEMCELL Technologies)를 사용하여 수득했다. 도 4a는 플레이팅된 1x104 세포당 총 #CFU를 보여주며, 나열된 집단은 풀링된 CFU-GM, CFU-GEMM 및 BFU-E를 포함한다. H1 세포(ES) 및 WLS-1C(iPS)의 경우, VEGF 없이 유도된 CD34+ 조혈 전구 세포로부터 수득되는 CFU의 수는 VEGF를 함유한 것과 유사했다.
추가로, 조혈 전구 세포(상기 기술된 바와 같이 분화됨)의 림프계 잠재성은 한계 희석 검정으로 평가했다. 간략하게, FACS 분류된 CD34+ 세포(본 명세서에 기술된 바와 같이 분화되고 분류됨)를 StemSpan Lymphoid Expansioin Supplement 중 StemSpan Lymphoid Differentiation Coating Material(둘 다, STEMCELL Technologies)로 코팅된 플레이트 상에 증가하는 숫자: 웰당 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 및 5000개의 세포로 파종했다. 각 세포 수의 12개의 복제 웰을 설정하고, 200개 이상의 CD7+ 세포를 함유하는 웰을 양성으로 채점했다. 전구세포 빈도는 이러한 결과를 갖고 극한 한계 희석 검정(Extreme Limiting Dilution Assay) 도구를 사용하여 결정했다. VEGF 부재 하에 유도된(조혈 분화 단계 동안) 림프계 잠재력을 갖는 조혈 전구세포의 빈도는 VEGF를 포함하는 조건에 비해 더 높았다: H1(ES 세포)의 경우 2.07 대 0.4%, 및 1C(iPS 세포)의 경우 0.11 대 0.04%(도 4b).
따라서, VEGF의 제거는 다분화능 잠재력을 갖는 CD34+ 세포의 생성에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이지 않으며 사실상 림프계 잠재력을 증가시킬 수 있다.
실시예 7: 분화된 조혈 전구세포로부터 림프계 전구세포의 유도
농축된 CD34+ 세포(실시예 5에 따라 수득됨)를 사용하는 확장 실험에서 더 많은 수의 PSC 세포주에 걸쳐 분화된 것을 하류 분화 실험에서 테스트했다. 농축된 CD34+ 세포는 StemSpan™ Lymphoid Progenitor Expansion Medium(Lymphoid Progenitor Expansion Supplement가 보충된 StemSpan™ SFEM II(STEMCELL Technologies))를 사용하여 림프계 전구세포로 분화시켰다. 세포를 파종하기 2시간 전에 비-조직 배양물 처리된 배양 용기를 제조업체의 권장 사항에 따라 PBS에 1x 희석된 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Material(STEMCELL Technologies)로 코팅했다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후, 코팅 물질을 흡인하고 웰을 PBS로 헹구었다. 플레이트를 2 내지 8℃에서 밤새 인큐베이션하는 것도 가능하다.
세포 배양 플레이트 형식에 따라, 실시예 5의 농축된 CD34+ 세포의 적절한 수를 적절한 부피의 StemSpan™ 림프계 전구세포 확장 배지(STEMCELL Technologies)에서 각 웰에 파종했다(이하 표 참조).
Figure pct00001
배양 3 내지 4일 후, StemSpan™ 림프계 전구세포 확장 배지의 원래 부피와 동일한 추가 부피를 각 웰에 첨가했다. 다시 3 내지 4일의 배양 후(및 적절한 경우 후속 3 내지 4일 주기 동안), 세포를 파괴하지 않도록 주의하면서 StemSpan™ 림프계 전구세포 확장 배지의 절반 부피에 대한 배지 변경을 수행했다.
농축된 CD34+ 세포를 StemSpan™ 림프계 전구세포 확장 배지에 처음 파종한 후 대략 1주 후, 비-조직 배양물 처리된 배양용기를 상기 기재된 바와 같이 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Material로 코팅했다. 그런 다음 세포를 조심스럽게 재현탁하고 새로 코팅된 배양용기로 옮겼으며, 플레이트의 바닥을 긁거나 임의의 부착 세포를 제거하지 않도록 주의했다. 그런 다음 세포를 추가로 1주 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 절반 배지의 변경은 전술한 바와 같이 3-4일마다 수행했다.
H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주는 CD34+ 조혈 전구 세포 중간체를 통해 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포로 효율적으로 분화되었다. 실시예 3에 따라 계산 시, CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 평균 빈도는 모든 PSC 세포주에 걸쳐 37% 내지 57% 범위였다(도 5a). 실시예 3에 따라 계산 시, 투입 CD34+ 조혈 전구 세포당 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 평균 수율은 모든 PSC 세포주에 걸쳐 11 내지 22개 세포 범위였다(도 5a). 이와 같이 유도된 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 대표적인 유세포 분석 플롯은 도 5b에 도시된다.
실시예 8: 조혈 전구 세포 분화 및 하류 림프계 전구 세포에 대한 인큐베이션 기간의 변동 영향
실시예 4의 실험은 10일의 분화 기간을 사용하여 수행했다. 여기에는 초기 중배엽 세포 집단을 형성하기 위한 첫 3일 기간과 그 다음 조혈 전구 세포를 형성하기 위한 후속 7일 기간이 포함되었다. 전술한 10일 프로토콜을 후속 7일 기간이 9일로 연장된 더 긴 12일 프로토콜과 비교하는 일련의 실험이 수행되었다.
테스트된 3개의 PSC 세포주 중 2개(1C 및 H1)에서, 더 긴 기간은 CD34+ 조혈 전구 세포의 6-웰 Aggrewell™ 400 플레이트의 웰당 빈도 및 수율(도 6a)뿐만 아니라, 실시예 7에 따라 생성된 바와 같은 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 빈도 및 수율로 측정된 하류 림프계 잠재력(도 6b)을 개선시켰다.
실시예 9: 림프계 전구세포로부터 CD4 + CD8 + T 세포 유도
이 T 세포 분화 프로토콜을 시작하기 2시간 전에, 비-조직 배양물 처리된 배양용기를 실시예 7에 기재된 바와 같이 1x의 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Material로 코팅했다.
실시예 7의 CD5+CD7+ 림프계 전구세포를 StemSpan™ T Cell Progenitor Maturation Medium(StemSpan™ T Cell Progenitor Maturation Supplement가 보충된 StemSpan™ SFEM II(STEMCELL Technologies))에서 ㎖당 0.5 내지 1×106개 세포로 새로 코팅된 배양용기에 파종하고 37℃에서 2주 동안 배양했다. 처음 3 내지 4일 후, StemSpan™ T Cell Progenitor Maturation Medium의 원래 부피와 동일한 추가 부피를 각 웰에 첨가했다. 그 후 3 내지 4일마다 세포를 파괴하지 않도록 주의하면서 절반 부피의 배지 교환을 수행했다.
2주 인큐베이션 기간 후, CD4+CD8+ T 세포를 수확하고 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같은 유세포 분석으로 분석했다. 도 7a는 실시예 2 내지 5, 실시예 7 및 이 실시예 9에 따라 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주로부터 유도된 CD4+CD8+ T 세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율을 보여준다. 테스트된 모든 PSC 세포주에 걸쳐 CD4+CD8+ T 세포의 평균 빈도는 24% 내지 58% 범위였다. 테스트된 모든 PSC 세포주에 걸쳐 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ T 세포의 평균 수율은 7에서 120개 범위였다. 도 7b는 각 PSC 세포주로부터 유도된 CD4+CD8+ T 세포 중에서 CD3+TCRαβ+ 세포의 빈도를 보여준다. 모든 PSC 세포주에 걸쳐 CD4+CD8+ 세포 중에서 CD3+TCRαβ+ 세포의 평균 빈도는 9% 내지 38% 범위였다. CD4 및 CD8의 발현을 보여주는 대표적인 유세포분석 플롯은 H1-유래 CD4+CD8+ T 세포(도 7c) 및 CD4+CD8+ T 세포에 대해 게이팅된 H1-유래 CD3+TCRαβ+ 세포(도 7d)에 대해 도시된다.
FACS가 이용가능한 경우, CD5+CD7+ 림프계 전구세포를 파종하기 전에 DRAQ7 또는 7-AAD와 같은 생존 염료, 및 FSC 대 SSC의 조합을 사용한 생존 세포에 대한 분류는 CD4+CD8+ T 세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율을 개선시켰다. 도 8a는 실시예 2 내지 5, 실시예 7, 및 이 실시예 9에 따라 H1, WLS-1C 및 H9 PSC 세포주로부터 유래된 CD4+CD8+ T 세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율에 대한 분화 분류된 생존 세포 또는 CD7+ 세포의 효과를 보여준다. CD4+CD8+ T 세포의 투입 CD34+ 세포당 더 높은 빈도 및 수율은 실시예 7의 분류되지 않은 세포의 파종과 비교한 것으로서, 파종된 생존 세포 및 CD7+ 세포를 사용하여 H1 및 WLS-1C에서 관찰되었다.
새로 코팅된 배양 용기에 파종된 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포 수의 변동은 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ T 세포의 빈도 및 수율을 개선시켰다. 도 8b는 실시예 2 내지 5 및 실시예 7에 따라 H1, WLS-1C 및 H9 PSC 세포주로부터 유래된 CD4+CD8+ T 세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율에 대한 파종된 CD5+CD7+ 세포 수의 증가 효과를 보여준다. 투입 CD34+ 세포당 CD4+CD8+ T 세포의 더 높은 빈도 및 수율은 파종된 CD5+CD7+ 세포 수의 증가에 따라 H1 및 WLS-1C에서 관찰되었다.
실시예 10: 이중 양성 T 세포로부터 CD4 - CD8 + CD3 + TCRαβ + 단일 양성 T 세포 유도
이 T 세포 분화 프로토콜을 시작하기 2시간 전에, 비-조직 배양물 처리된 배양용기는 실시예 7에 기술된 바와 같이 1x의 StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Material로 코팅했다.
실시예 9의 CD4+CD8+ T 세포를 ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제(STEMCELL Technologies) 또는 ImmunoCult™ 인간 CD3/CD28 T 세포 활성화제(STEMCELL Technologies)를 권장 농도의 0.5배(즉, 12.5ug/㎖)로 포함하는, CD8 SP T 세포 성숙 배지(StemSpan™ T 세포 전구세포 성숙 보충제(STEMCELL Technologies) 및 대략 10 ng/㎖ 인간 재조합 IL-15(STEMCELL Technologies)가 보충된 StemSpan™ SFEM II)에서 1×106 세포/㎖로 새로 코팅된 배양용기에 파종했다. 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 3 내지 4일 동안 배양했다. 3 내지 4일 후, 웰은 ImmunoCult™ T 세포 활성화제를 포함하지 않는 새로운 CD8 SP T 세포 성숙 배지로 채우고 다시 37℃ 및 5% CO2에서 추가 3 내지 4일 동안 인큐베이션했다.
추가 3-4일 인큐베이션 후, 단일 양성 CD8+ T 세포를 수확하고 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석으로 분석했다. 도 9a는 CD3+TCRαβ+CD4-CD8+ 단일 양성 T 세포가 H1-, H9- 및 WLS-1C-유래 CD4+CD8+ T 세포(실시예 9에 따라 생성됨)로부터 생성될 수 있었음을 보여준다. 테스트된 모든 PSC 세포주에 걸쳐 CD3+TCRαβ+CD4-CD8+ 단일 양성 T 세포의 평균 빈도는 4% 내지 7% 범위였다. 도 9b-e는 CD3+TCRαβ+CD4-CD8+ 단일 양성 T 세포가 보다 미성숙한 세포를 나타내는 CD8αα 동종이량체보다는 CD8αβ 이종이량체, 및 성숙한 미경험 표현형을 나타낼 수 있는 CD45RA 및 CD27 마커를 발현함을 추가로 보여준다.
실시예 11: 림프계 전구세포로부터 NK 세포 유도
실시예 7의 CD5+CD7+ 림프계 전구세포를 StemSpan™ NK 세포 분화 배지(StemSpan™ NK 세포 분화 보충제가 보충된 StemSpan™ SFEM II(STEMCELL Technologies))에서 ㎖당 1×105개 세포로 미코팅 배양용기에 파종하고 37℃에서 2주 동안 배양했다. 처음 3-4일 후, StemSpan™ NK 세포 분화 배지의 원래 부피와 동일한 추가 부피를 각 웰에 첨가했다. 그 후 3-4일마다 세포를 파괴하지 않도록 주의하면서 절반 부피의 배지 교환을 수행했다.
2주 인큐베이션 기간 후, CD56+ NK 세포를 수확하고 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석으로 분석했다. 도 10a는 실시예 2 내지 5, 실시예 7 및 이 실시예 11에 따라 H1, H9, WLS-1C, STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에서 유래된 CD56+ NK 세포의 투입 CD34+ 세포당 빈도 및 수율을 보여준다. 테스트된 모든 PSC 세포주에 걸친 CD56+ NK 세포의 평균 빈도는 81% 내지 95% 범위였다. 테스트된 모든 PSC 세포주에 걸쳐 투입 CD34+ 세포당 CD56+ NK 세포의 평균 수율은 112 내지 332개 범위였다. 다양한 NK 세포 마커의 발현을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯은 STiPS-M001 PSC에서 보여진다(도 10b 내지 h).
PSC-유래 NK 세포가 기능적으로 활성인지를 결정하기 위해, 이들을 Calcein-AM(CAM) 표지된 K562 세포에 대한 세포독성 검정에서 테스트했다. EasySep™ 인간 NK 세포 단리 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 단리된 말초 혈액(PB) NK 세포, 및 EasySep™ 인간 단핵구 단리 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 단리된 단핵구를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용했다. 테스트 세포 및 대조군 세포를 Calcein AM(CAM)-표지된 K562 세포와 함께 2.5:1 이펙터(NK) 대 표적 세포(K562) 비율로 4시간 동안 공동배양했다. 공동배양 후, 상청액 샘플을 수득했고 용해된 세포로부터 방출된 형광을 Spectramax™ 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했다. 특이적 용해 %는 다음 식을 사용하여 계산했다: (테스트 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) * 100%. 도 11a는 실시예 2 내지 5, 실시예 7, 및 이 실시예 11에 기술된 바와 같은 다양한 PSC 세포주로부터 유래된 NK 세포가 PB NK 세포와 비슷한 K562 세포의 살해 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
도 11a에 도시된 Calcein-AM 세포독성 검정의 결과를 확인하기 위해, CD107a 탈과립 검정을 수행하여 비표지된 K562 표적 세포의 1:1 이펙터:표적 비율로 자극 시(상기 기재된 바와 같이) 탈과립화하는 NK 세포의 능력을 입증했다. CD107a는 NK 세포가 자극되고 탈과립하는 즉시 세포 표면에 노출되는 리소좀-연관 막 단백질이다. 음성 대조군으로서, 활성화되지 않은 H1-유래 NK 세포는 모넨신, 브레펠딘 A(BFA) 및 항-CD107a 형광 항체에 4시간 동안 노출시켰지만, K562 세포와 공동배양하지는 않았다(도 11b). H1 세포 및 PB NK 세포로부터 유래된 NK 세포는 각각 도 11c 및 11d와 같이 모넨신, 브레펠딘 A(BFA), 및 항-CD107a 형광 항체의 존재 하에 1:1 이펙터(NK 세포) 대 표적(K562) 세포의 비율로 K562 세포와 4시간 동안 공동배양에 의해 활성화되었다. 4시간 인큐베이션 후, 세포를 단리, 고정, 투과화하고, 생존력, CD56, CD107a 및 IFN-γ에 대해 염색했다. 이들 마커의 발현은 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석을 사용하여 평가했다. 비활성화된 H1-유래 CD56+ NK 세포와 대조적으로, 활성화된 H1-유래 CD56+ NK 세포는 활성화된 PB CD56+ NK 세포와 유사한 탈과립화 및 세포용해 활성을 가질 수 있다. 이러한 결과는 STiPS-M001 및 STiPS-F016 PSC 세포주에 걸쳐 확장되었다(도 11e 및 11f).
실시예 12: PSC는 하류 분화에 부정적인 영향을 미침이 없이 다양한 배양 배지에서 유지될 수 있다
실시예 1에 기술된 바와 같이 다양한 PSC 세포주를 다양한 PSC 유지 배지에서 유지시켰다. PSC를 분화시키고 실시예 2 내지 5 및 실시예 7에 요약한 바와 같이 분석했다. 도 12는 각각의 mTeSR™1, TeSR-E8 및 mTeSR Plus가 하류 분화에 화합성임을 보여준다.
도 12a는 유도 배지에 이어서 제1 배지에서 H1 및 STiPS-F016 PSC 세포주로부터 유래된 CD34+ 조혈 전구 세포의 6-웰 Aggrewell™ 마이크로웰 장치의 웰당 수율을 보여준다. H1- 및 STiPS-F016 유래 CD34+ 조혈 전구 세포의 평균 수율은 TeSR-E8 또는 mTeSR1에서 유지되는 PSC를 사용할 때 비슷했다. 도 12b는 H1 PSC 세포주로부터 유래된 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 투입 CD34+ 조혈 전구 세포당 빈도 및 수율을 보여준다. TeSR-E8- 및 mTeSR1-유지된 PSC는 둘 다가 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 비슷한 빈도 및 수율을 생성했다.
도 12c는 유도 배지에 이어서 제1 배지에서 WLS-1C 및 H9 PSC 세포주로부터 유래된 CD34+ 조혈 전구 세포의 6-웰 Aggrewell™ 마이크로웰 장치의 웰당 수율을 보여준다. WLS-1C- 및 H9-유래 CD34+ 조혈 전구 세포의 평균 수율은 mTeSR Plus 또는 mTeSR1에서 유지되는 PSC를 사용할 때 비슷했다. 도 12d는 WLS-1C 및 H9 PSC 세포주로부터 유래된 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 투입 CD34+ 조혈 전구 세포당 빈도 및 수율을 보여준다. mTeSR Plus- 및 mTeSR1-유지된 PSC는 둘 다가 CD5+CD7+ 림프계 전구 세포의 비슷한 빈도 및 수율을 생산했다.
본 개시내용은 현재 바람직한 예인 것으로 간주되는 것을 참조하여 설명되었지만, 본 개시내용은 개시된 예에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 반대로, 본 개시내용은 첨부된 청구범위의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 수정 및 등가 배열을 커버하도록 의도된다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이고 전체가 참조에 의해 원용되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

Claims (33)

  1. 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cell)를 분화시키는 방법으로서,
    제1 배지에서 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하되, 상기 제1 배지는 트롬보포에이틴(TPO), 줄기세포인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 중 하나 이상이 보충된 기본 배지를 포함하고, BMP 신호전달의 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합은 배제되는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 BMP 신호전달의 작동제가 골형성 단백질이고, 선택적으로 상기 골형성 단백질이 BMP4인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FGF 신호전달의 작동제가 섬유아세포 성장 인자이고, 선택적으로 상기 섬유아세포 성장 인자가 FGF2인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VEGF 신호전달의 작동제가 혈관 내피 성장 인자인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 배지는 무혈청인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조 세포의 부재하에 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 배지에서 초기 중배엽 세포의 집단을 배양하는 것이 3 내지 15일 동안인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 전구 세포가 CD34+인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 전구 세포는 골수계, 적혈구계 및 림프계 잠재력을 갖는 것인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell: PSC)의 집단으로부터 초기 중배엽 세포의 집단을 유도하는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 유도 배지에서 PSC 집단을 배양하는 단계를 더 포함하되, 상기 유도 배지는 PSC-유래 초기 중배엽 세포의 분화된 집단을 수득하기 위해 BMP 신호전달의 작동제, FGF 신호전달의 작동제, 및 VEGF 신호전달의 작동제 중 하나 이상이 보충된 제2 기본 배지를 포함하는 것인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 BMP 신호전달의 작동제는 골형성 단백질이고, 선택적으로 상기 골형성 단백질은 BMP4인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 FGF 신호전달의 작동제는 섬유아세포 성장 인자이고, 선택적으로 상기 섬유아세포 성장 인자는 FGF2인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 VEGF 신호전달의 작동제는 혈관 내피 성장 인자인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 배지는 무혈청인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성으로 첨가된 간질- 및/또는 배양보조 세포의 부재하에 상기 PSC를 배양하는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 배지에서 상기 PSC를 배양하는 것이 1일 내지 7일 동안인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 배지에서 상기 PSC를 배양하기 전에 상기 PSC를 응집체로 형성시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 배지에서 상기 PSC를 응집체로 형성시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 응집체가 마이크로웰 장치에서 형성되는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 조건 하에 및/또는 외인성으로 첨가된 간질 세포 및/또는 배양보조 세포의 부재 하에 림프계 분화 배지에서 상기 분화된 조혈 전구 세포를 배양한 후 림프계 전구 세포를 수득하는 단계를 더 포함하는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 림프계 전구 세포가 다계통 잠재력을 갖는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 림프계 전구 세포가 T 세포 및 NK 세포 잠재력을 갖는, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 T 세포 및 NK 세포가 기능적인, 조혈 전구 세포를 분화시키는 방법.
  25. 초기 중배엽 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포를 분화시키기 위한 배지로서,
    상기 배지가 트롬보포에이틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF) 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L) 중 하나 이상이 보충된 기본 배지를 포함하고 BMP 신호전달의 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제로 이루어진 목록에서 선택되는 외인성으로 첨가된 작동제의 임의의 조합은 배제되는, 배지.
  26. 제25항에 있어서, 상기 초기 중배엽 세포의 집단이 다능성 줄기 세포로부터 유래되는, 배지.
  27. 제26항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 포유동물인, 배지.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 무혈청인, 배지.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 간질- 및/또는 배양보조 세포-무함유 작업흐름에서 효과적인, 배지.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 작동제가 섬유아세포 성장 인자, 선택적으로 FGF2인, 배지.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 신호전달의 작동제가 골형성 단백질, 선택적으로 BMP4인, 배지.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 작동제가 VEGF인, 배지.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 전구 세포가 림프계, 골수계 및 적혈구계 효능을 갖는, 배지.
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