CN115029314B

CN115029314B - Cd34+细胞分化培养基、方法及应用

Info

Publication number: CN115029314B
Application number: CN202210630366.1A
Authority: CN
Inventors: 杜如龙; 顾雨春; 武雪宁; 于蕾; 黄雯静; 吴理达
Original assignee: Allife Medical Science And Technology Co ltd
Current assignee: Allife Medical Science And Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN115029314A

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的培养基组合、试剂盒、方法及其应用。此外本发明还提供了一种CD34⁺细胞群体及衍生物以及药物组合物。本发明仅通过CHIR99021激活WNT信号通路即可实现中胚层的高效诱导，而无须添加BMP4、VEGF；在造血中胚层阶段协同使用VEGF和bFGF，大大提高分化效率。本发明的培养基组合、试剂盒成分简单、成本低、易操作、诱导时间短，有利于规模化和产业化。

Description

CD34+细胞分化培养基、方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及CD34⁺细胞分化培养基、方法及应用。

背景技术

CD34是一类跨膜磷酸糖蛋白，特异性地表达于造血前体细胞、血管内皮细胞、生血内皮细胞和各种间质前体细胞；且是造血干/祖细胞的主要标志物。由于CD34⁺细胞广泛存在于多种组织，且部分CD34⁺细胞具有分化的潜能；因此，CD34⁺细胞或由其分化获得的细胞可以应用于药物筛选、再生医学的研究或通过细胞移植来治疗相关的疾病。多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSC)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESC)、诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)及扩展多能干细胞(Extended Pluripotent Stem Cells，EPSC)和全能干细胞(Totipotent Stem Cells，TPSC)等；其可以诱导分化为CD34⁺细胞。但目前的分化方法存在很多的不足，主要包括诱导效率低下、分化周期长、分化流程复杂及分化培养基中含有动物源成分等，这些不足严重地限制了CD34⁺细胞的临床研究和应用。

目前有较多的文献报道CD34⁺细胞分化方法，但这些方法存在很多的不足，主要包括诱导效率低下、分化周期长、分化流程复杂及分化培养基中含有动物源成分等，这些不足严重地限制了CD34⁺细胞的临床研究和应用。

有研究公开了一种多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法，该发明通过适当使用一种用新型的嘧啶吲哚化合物配合三种特定成分和浓度的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率，但是该发明中每个阶段使用的培养基成分都较复杂，还需引入新型化合物，操作复杂，成本较高。

还有研究公开了一种用于诱导造血细胞分化的方法和组合物，使用到了BMP途径激活剂、bFGF、WNT途径激活剂、ROCK抑制剂，但是其使用的基础培养基种类较多，各个阶段添加的成分都比较复杂，诱导时间较长，不易操作，不利于规模化和产业化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的培养基组合、试剂盒、方法及应用。本发明的分化体系的培养基成分简单，不用形成拟胚体，无须引入新型化合物，操作简单，成本低、时间短，有利于规模化和产业化。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了培养基组合，特别是诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的培养基组合，所述培养基组合包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；

所述第一培养基包括第一基础培养基和ROCK抑制剂；优选地，所述ROCK抑制剂为Y-27632；更优选地，所述Y-27632的浓度为10μM；

需要说明的是，所述ROCK抑制剂还可以是Thiazovivin、Fasudil(HA-1077,AT-877)、GSK429286A、RKI-1447、H-1152dihydrochloride、Emetine hydrochloride、GSK269962A、Netarsudil、Azaindole 1、Y-39983、ZINC00881524、Belumosudil、Ripasudil、Hydroxyfasudil和/或AT13148；

所述第二培养基包括第二基础培养基和WNT通路激动剂；优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂；更优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述WNT通路激动剂包括GSK-3抑制剂；更优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR99021；更优选地，所述CHIR99021的浓度为6～12μM；最优选地，所述CHIR99021的浓度为9μM；

本申请发明人通过实验证实，在上述第二培养基中添加VEGF或bFGF并不能促进CD34⁺细胞的生成，添加BMP4反而会抑制CD34⁺细胞的生成，仅通过CHIR激活WNT信号即可实现CD34⁺和CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞高效诱导分化；

所述第三培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，更优选地，所述VEGF的浓度为10～80ng/mL，所述bFGF的浓度为10～80ng/mL；

本申请发明人通过实验证实，在所述第二基础培养基的基础上同时添加BMP4、VEGF会抑制KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化潜能，加入bFGF后会逆转BMP4的抑制作用；而同时添加VEGF、bFGF则会显著提高KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化潜能。可见，VEGF和bFGF可以协同促进中胚层细胞向KDR⁺PDGFRα^-造血中胚层的分化以及造血中胚层向KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的转换；

所述第四培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂、FGF通路激动剂、SCF/c-kit通路激动剂、白细胞介素、TPO通路激动剂、Flt-3L和/或BMP通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，所述SCF/c-kit通路激动剂为SCF，所述白细胞介素为IL-3，所述TPO通路激动剂为TPO，所述BMP通路激动剂为BMP4；更优选地，所述VEGF、所述bFGF和所述SCF的浓度分别为10～80ng/mL，所述IL-3的浓度为5～40ng/mL，所述TPO的浓度为10～60ng/mL，所述Flt-3L的浓度为5～40ng/mL，所述BMP4的浓度为10～60ng/mL；最优选地，所述VEGF的浓度为20ng/mL，所述bFGF的浓度为20ng/mL，所述SCF的浓度为50ng/mL，所述IL-3的浓度为10ng/mL，所述TPO的浓度为30ng/mL，所述Flt-3L的浓度为10ng/mL，所述BMP4的浓度为10ng/mL；

优选地，所述第一培养基中的所述第一基础培养基包括E8培养基；更优选地，所述第一培养基中的所述第一基础培养基为E8培养基；

优选地，所述第二培养基、第三培养基和第四培养基中的所述第二基础培养基包括APEL培养基；更优选地，所述第二培养基、第三培养基和第四培养基中的所述第二基础培养基为APEL培养基；所述第一基础培养基和所述第二基础培养基还可以分别是BSS、MEM、DMEM、1640、F-12培养基；

本申请发明人通过实验证实，在分化第3天开始，在所述第二基础培养基的基础上添加造血混合物(VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4)，可以明显促进CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成，大大提高分化效率。

需要说明的是，所述VEGF通路激动剂也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述FGF通路激动剂也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述SCF/c-kit通路激动剂也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述白细胞介素也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述TPO通路激动剂也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述Flt-3L也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；所述BMP通路激动剂也可以是类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质。

本发明的第二方面提供了试剂盒，所述试剂盒中包含配制所述培养基组合所需要的试剂。

本发明的第三方面提供了诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)：提供诱导多能干细胞并在所述的培养基组合中的第一培养基中进行单层分化培养，获得单层细胞；

步骤(2)：将步骤(1)中所述单层细胞接种于所述的培养基组合中的第二培养基，培养，获得中胚层细胞；

步骤(3)：将步骤(2)中所述中胚层细胞接种于所述的培养基组合中的第三培养基，培养，获得造血中胚层细胞；

优选地，所述造血中胚层细胞为KDR⁺PDGFRα^-造血中胚层细胞；

优选地，所述造血中胚层细胞经过造血-内皮转换生成KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞；

步骤(4)：将步骤(3)中所述造血中胚层细胞接种于所述的第四培养基，培养，获得CD34⁺细胞；

优选地，所述CD34⁺细胞为CD34⁺KDR⁺CD144⁺细胞；

进一步，所述诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的方法，还可以包括：步骤(5)：将步骤(4)中所述CD34+细胞接种于所述的第四培养基，继续培养，获得长期再生造血干细胞；优选地，所述长期再生造血干细胞为CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞；

进一步，所述步骤(1)中所述单层分化培养的时间为1天，所述步骤(2)中所述培养的时间为1天，所述步骤(3)中所述培养的时间为3天，所述步骤(4)中所述培养的时间为6天，所述步骤(5)中所述培养的时间为3天；

进一步，所述步骤(1)中所述单层分化培养的方法包括以单层贴壁细胞的方式培养；

进一步，所述步骤(1)中所述培养所用的细胞消化液或细胞解离液包括蛋白类、多肽类或非蛋白类细胞消化液或细胞解离液；优选地，所述细胞消化液或细胞解离液包括TrypLE、EDTA、胶原酶；

进一步，所述步骤(1)中所述培养所用的包被基质包括蛋白类、多肽类物质；优选地，所述包被基质包括lamnin、fibronectin、vitronectin、geletin

进一步，所述步骤(4)中所述培养的细胞培养密度为0.5～8×10⁴个/cm²；优选地，所述细胞培养密度为1～4×10⁴个/cm²；更优选地，所述细胞培养密度为2×10⁴个/cm²。

本发明的第四方面提供了CD34⁺细胞群体或其衍生物。

进一步，所述CD34⁺细胞群体为采用本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的；

优选地，所述CD34⁺细胞群体同时表达CD45；

优选地，所述CD34⁺细胞群体衍生物为CD34⁺细胞群体诱导分化得到的长期再生造血干细胞群体；

更优选地，所述长期再生造血干细胞群体同时高表达CD34、CD90、EPCR和ITGA3。

本发明的第五方面提供了用于治疗和/或预防血液系统疾病的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的CD34⁺细胞群体或其衍生物；

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；

优选地，所述血液系统疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症。

进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。

进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。

进一步，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。

进一步，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。

进一步，所述药物组合物中的活性成分(本发明第四方面所述的CD34⁺细胞群体或其衍生物)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。

本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的培养基组合、本发明第二方面所述的试剂盒在诱导iPSC分化制备获得CD34⁺细胞和/或长期再生造血干细胞中的应用；

(2)本发明第四方面所述的CD34⁺细胞群体或其衍生物在制备治疗和/或预防血液系统疾病的药物中的应用；

(3)本发明第五方面所述的药物组合物在治疗和/或预防血液系统疾病疾病中的应用。

本发明的培养基组合、试剂盒或方法，有如下有益效果：

1、第一阶段采用形成单层贴壁细胞的方法对多能干细胞进行培养，不用形成拟胚体，用时短、工作量小，利于规模化的生产和应用；

2、第二阶段即中胚层诱导阶段，仅需要通过CHIR99021激活WNT信号通路即可实现中胚层的高效诱导，无需添加BMP4、VEGF，成分简单；

3、第三阶段，即造血中胚层阶段，添加VEGF促进KDR⁺PDGFRα-造血中胚层细胞的生成，bFGF进一步促进生血内皮细胞的生成，VEGF和bFGF的协同大大提高分化效率。

我们发现，在该阶段，生血内皮特化及内皮-造血转换具有细胞密度依赖性，较高的细胞密度抑制该过程的发生；1～4×10⁴个/cm²的细胞密度更有利于CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成，而较高的细胞密度(8×10⁴个/cm²)明显抑制CD34⁺CD45⁺造血干/祖细胞的生成。

4、在分化的第3天开始，在所述第二基础培养基的基础上将造血混合物(VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4)能进一步提高CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成。

5、本发明的诱导分化体系可以获得CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺的LT-HSCs，说明本发明诱导的CD34⁺细胞可成功地进一步分化为长期再生造血干细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示人多能干细胞传代前细胞形态图；其中，左图为4倍目镜下的细胞形态；右图为20倍目镜的细胞形态；

图2示悬滴法形成不同大小的拟胚体；其中，从上到下第一行至第五行依次为由2000cells、4000cells、8000cells、16000cells和32000cells形成的拟胚体形态；

图3示第1、3、6、9天拟胚体形态变化及贴壁生长的细胞形态；从上到下第一行至第五行依次为由2000cells、4000cells、8000cells、16000cells和32000cells形成的拟胚体形态；

图4A示造血细胞分化流程图；其中包括中胚层诱导、造血中胚层特化、生血内皮特化及生血内皮-造血转换；

图4B示在分化第9天利用流式分析第0～1天处理9μM CHIR或协同10ng/mL BMP4、20ng/mL bFGF或20ng/mL VEGF对CD34⁺和CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞诱导的影响；

图4C示在分化第9天利用流式分析中内胚层诱导阶段培养条件对CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞诱导的影响的统计图；

图4D示在分化第9天利用流式分析中内胚层诱导阶段培养条件对CD34⁺生血内皮细胞诱导的影响的统计图；

图4E示在分化第1天利用流式分析第0～1天处理3～15μM CHIR对T⁺中胚层诱导的影响；

图4F示在分化第6天利用流式分析第0～1天处理3～15μM CHIR对CD34⁺生血内皮细胞诱导的影响；

图5A示VEGF信号诱导KDR⁺PDGFRα^-造血中胚层细胞的流式分析图；

图5B示造血中胚层特化阶段流程图；

图5C示造血中胚层细胞经过造血-内皮转换生成KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的流式分析图；

图5D示造血中胚层特化培养基成分对KDR⁺CD34⁺细胞的影响统计图；

图5E示造血中胚层特化培养基成分对KDR⁺CD34⁺CD144⁺细胞的影响统计图；

图5F示造血中胚层特化培养基bFGF浓度优化，在分化第9天利用流式分析第1～3天处理20ng/mL VEGF或协同不同剂量bFGF(10～80ng/mL)对CD34⁺或CD34⁺CD45⁺造血细胞诱导的影响；Control代表处理20ng/mL VEGF；10～80ng/mL依次代表20ng/mL VEGF+10～80ng/mL bFGF；

图5G示在分化第12天利用流式分析第1～3天处理20ng/mL VEGF或协同不同剂量bFGF(10～80ng/mL)对CD34⁺或CD34⁺CD45⁺造血细胞诱导的影响；Control代表处理20ng/mLVEGF；10～80ng/mL依次代表20ng/mL VEGF+10～80ng/mL bFGF；

图6A示造血细胞分化流程，在分化的第3～6天处理TPO、Flt-3L对生血内皮细胞生成的影响；

图6B示生血内皮细胞的明场图片；其中，从上至下依次为第4天、第5天、第6天的细胞，细胞由间质样的造血中胚层细胞逐渐变成长梭形、扁平的生血内皮细胞；

图6C示在分化的第6天，流式分析造血混合物诱导CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化效率；其中T+F+B代表第3～6天额外添加30ng/mL TPO、10ng/mL Flt-3L和10ng/mLBMP4；

图7A示造血细胞分化流程，在分化的第3天进行细胞传代，并探究细胞密度对生血内皮细胞和造血细胞生成的影响；

图7B示不同细胞密度传代后生成悬浮细胞的明场图片；其中上图代表高密度实验组；下图代表低密度实验组；

图7C示在分化的第12天，流式分析不同细胞密度的造血中胚层细胞生成CD34⁺或CD45⁺悬浮细胞的效率；

图7D示在分化的第9天，流式分析不同细胞密度的造血中胚层细胞生成CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的效率；

图7E示在分化的第12天，流式分析不同细胞密度的造血中胚层细胞生成CD34⁺CD45⁺造血细胞的效率；

图7F示在分化第12天流式分析悬浮细胞中CD34⁺CD45⁺造血细胞的比例；

图8A示长期再生造血干细胞的分化流程；

图8B示生血内皮细胞转化为造血干细胞(EHT)阶段第8天、第10天、第12天细胞变化的明场图；贴壁的生血内皮细胞经过EHT产生非贴壁的悬浮细胞；

图8C示在分化的第12天流式分析CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的生成情况。

具体实施方式

本发明公开了CD34+细胞分化培养基组合、方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的培养基组合、试剂盒、方法、CD34⁺细胞群体及衍生物、药物组合物及其应用，分化流程主要包括单层细胞形成、中胚层诱导、造血中胚层特化、生血内皮特化及生血内皮-造血转换。

Day(-1)～0单细胞形成使用TeSR-E8培养基，细胞密度为8000个/cm²，添加10μMY-27632；

Day 0～1中胚层诱导培养基：APEL基础培养基+CHIR99021；

Day 1～3造血中胚层特化培养基：APEL基础培养基、VEGF+bFGF；

Day 3～12生血内皮特化及生血内皮-造血转换培养基(CD34⁺细胞培养基)，APEL基础培养基、VEGF+bFGF+SCF+IL-3+TPO+Flt-3L+BMP4。

其中在Day 3进行细胞传代，细胞接种密度为2×10⁴个/cm²，额外添加10μM Y-27632，24小时后更换培养基，去除Y-27632。此后，每两天更换一次新鲜生血内皮特化及生血内皮-造血转换培养基，直至Day 12。

本发明中一些通用检测方法：

一、流式细胞技术(FACS)检测细胞表面标志物

1、FACS检测所需试剂和抗体

(1)清洗试剂：Buffer A(PBS+4％FBS)

(2)直标一抗：FITC anti-human CD34 Antibody，APC anti-human CD309Antibody，APC anti-human CD31 Antibody，APC anti-human CD235a Antibody，PE anti-human CD140a Antibody，PE anti-human CD144 Antibody

2、待测样品的准备

(1)确定待测细胞，吸出旧培养基，用PBS清洗一次，加预热的TrypLE消化液，37℃消化3分钟，用移液枪将细胞吹散后，转移至含有10％FBS的分化培养基的15mL离心管中，终止TrypLE的消化，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(2)用Buffer A清洗细胞2次，每次3mL Buffer A，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(3)孵育直标一抗：用Buffer A稀释抗体后每管加入100μL，重悬细胞，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合；

(4)用Buffer A清洗细胞3次，每次3mL Buffer A，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(5)每管加入200μL DPB重悬细胞，并经70μm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至流式管中，置于4℃避光保存，等待上机检测。

3、流式上机检测

(1)开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑；

(2)设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数；

(3)待机器变为Ready状态后，清洗机器；

(4)首先通过同型对照样品，设置FSC和SSC的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置Gate，进入下一步分析；

(5)根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品；

(6)检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。

二、流式细胞技术(FACS)检测细胞核内标志物

1、FACS检测所需试剂和抗体

(1)清洗试剂：Buffer A(PBS+4％FBS)

(2)打孔试剂：Buffer B(PBS+4％FBS+0.4％Triton X-100)

(3)直标一抗：Human/Mouse Brachyury Alexa 488-conjugated Antibody等

(4)固定试剂：PBS+4％多聚甲醛

2、待测样品的准备

(3)每管加0.5mL PBS+4％多聚甲醛，轻弹离心管，使细胞悬浮在多聚甲醛溶液中，对细胞进行固定，4℃固定15分钟；

(4)用Buffer B清洗细胞3次，每次3mL Buffer B，1000rpm离心5分钟，弃上清。Buffer B中含有0.4％Triton X-100，可对细胞膜进行打孔；

(5)孵育直标一抗：用Buffer B稀释抗体后每管加入100μL，重悬细胞，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合；

(6)用Buffer A清洗细胞3次，每次3mL Buffer A，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(7)每管加入200μL DPB重悬细胞，并经70μm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至流式管中，置于4℃避光保存，等待上机检测。

3、流式上机检测

(1)开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑；

(2)设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数；

(3)待机器变为Ready状态后，清洗机器；

(6)检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。

本发明中上述直标一抗也可以是偶联其他荧光素的相似抗体，或通过其他方式偶联或结合荧光素的抗体或抗体复合物。

表1示本发明具体实施方案中所用试剂的信息：

表1

如无特殊说明，本发明所用原料、试剂、耗材以及采用的仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

特别说明：

第一阶段(单层贴壁细胞)中：

TrypLE工作液也可以是其他蛋白类、多肽类或非蛋白类细胞消化或解离液；

E8完全培养基也可以是其他支持多能干细胞生长和干性维持的培养基。

包被基质也可以是其他蛋白类、多肽类物质，如lamnin、fibronectin、vitronectin、geletin等；

Y-27632的使用浓度范围是0.1～100μM；

Y-27632也可以是其他ROCK通路抑制剂或类似的小分子化合物。

第二阶段(中内胚层诱导)：

STEMdiff^TM APEL^TM2 Medium也可以是其他支持细胞生长和利于细胞诱导分化的其他培养基；

CHIR99021也可以是其他Wnt通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

第三阶段(造血中胚层特化)中：

VEGF也可以是其他VEGF通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

bFGF也可以是其他FGF通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质。

生血内皮特化阶段中：

VEGF的使用浓度范围是10～80ng/mL(优选20ng/mL)，VEGF也可以是其他VEGF通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

bFGF的使用浓度范围是10～80ng/mL(优选20ng/mL)，bFGF也可以是其他FGF通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

SCF的使用浓度范围是10～80ng/mL(优选50ng/mL)，SCF也可以是其他SCF/c-kit通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

IL3的使用浓度范围是5～40ng/mL(优选10ng/mL)，IL3也可以是其他类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

TPO的使用浓度范围是10～60ng/mL(优选30ng/mL)，TPO也可以是其他TPO通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

Flt-3L的使用浓度范围是5～40ng/mL(优选10ng/mL)，Flt-3L也可以是其他类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质；

BMP4的使用浓度范围是10～60ng/mL(优选10ng/mL)，BMP4也可以是其他BMP通路激动剂或类似的小分子化合物或蛋白类、多肽类物质。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：CD34⁺细胞诱导分化流程和操作方法

第一阶段：形成单层贴壁细胞(Day(-1)～0)

本阶段的培养基：E8完全培养基+ROCK抑制剂

1、配制TrypLE工作液：吸取适量DPBS至新的15mL离心管中，按照1:1的比例加入TrypLE原液，混匀后即为TrypLE工作液；

2、根据传代所需的培养基量，配制含10μM Y-27632(ROCKi)的E8完全培养基，每毫升培养基加1μL Y-27632(10mM)储存液；

3、从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1min(洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30～45秒再行吸出)；

4、加TrypLE工作液后(六孔板加约1mL TrypLE工作液，T25瓶加约2mL TrypLE工作液)，置于培养箱孵育2～5min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可；

5、轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入DMEM/F12终止消化。吸取适量的细胞悬液计数；

6、配平后离心，200×g，5min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，按照不同的细胞密度(2000cells/20μL，4000cells/20μL，8000cells/20μL，16000cells/20μL，32000cells/20μL)，加入含10μM Y-27632的E8完全培养基重悬。细胞充分混匀后，将细胞悬液滴至Matrigel基质包被的培养板孔中，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养；

7、培养24h后，普通光学显微镜下观察细胞形态；使用DPBS清洗两次后进行后续的诱导分化。

细胞形态如图1所示，Day(-1)天时，普通光学显微镜观察，人多能干细胞传代前，细胞汇合度约70％～80％；细胞克隆边缘光滑，未见明显分化的细胞，细胞排列紧密、立体感较好。

第二阶段：中内胚层诱导(Mesoderm Induction)(Day 0～1)

1、配制适量的中胚层诱导培养基(最优选培养基成分和浓度)：STEMdiff^TMAPEL^TM2 Medium+1％Penicillin-Streptomycin+9μM CHIR99021，37℃水浴锅预热；

2、单层贴壁细胞形成24h后，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞；

3、添加中胚层诱导培养基然后置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养24h；

4、流式细胞检测仪检测。

第三阶段：造血中胚层特化(Hematopoietic Mesoderm Specification)(Day 1～3)

1、配制适量的造血中胚层特化培养基(最优选择)：STEMdiff^TM APEL^TM2 Medium+1％Penicillin-Streptomycin+20ng/mL VEGF+20ng/mL bFGF，37℃水浴锅预热；

2、中内胚层诱导24小时后，从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞；

3、添加造血中胚层特化培养基(STEMdiff^TM APEL^TM2 Medium+1％Penicillin-Streptomycin+20ng/mL VEGF)，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养48h。

第四阶段：生血内皮特化(Hematopoietic&Endothelial Specification)(Day 3～12)

1、配制适量的生血内皮特化培养基：(STEMdiff^TM APEL^TM2 Medium+1％Penicillin-Streptomycin+20ng/mL VEGF+20ng/mL bFGF+50ng/mL SCF+10ng/mL IL-3+30ng/mL TPO+10ng/mL Flt-3L+10ng/mL BMP4)，37℃水浴锅预热；

2、造血中胚层特化48h后，吸弃原培养液；加入适量的DPBS清洗细胞；

3、添加生血内皮特化培养基，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养；

4、细胞培养24h后，更换一次新鲜的生血内皮特化培养基；

5、此后，每2天更换一次新鲜的生血内皮特化培养基，直至诱导分化的第12天。

对比例1：第一阶段中采用离心法形成拟胚体(Embryoid Body，EB)

形成拟胚体的培养基：E8完全培养基+PVA+Y-2763

1、配制TrypLE工作液：吸取5mL DPBS至新的15mL离心管中，再加入5mL TrypLE原液，混匀后即为TrypLE工作液；

2、根据传代所需的培养基量，配制含1％PS、10μM Y-27632(ROCKi)和4mg/mL PVA的E8完全培养基，每毫升培养基加1μL Y-27632(10mM)储存液；

3、从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1min(洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30～45sec再行吸出)；

5、轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入DMEM/F12终止消化，吸取适量的细胞悬液计数；

6、配平后离心，200×g，5min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，按照2000cells/20μL，4000cells/20μL，8000cells/20μL，16000cells/20μL，32000cells/20μL细胞密度，加入5mL含10μM Y-27632和4mg/mL PVA的E8完全培养基重悬。细胞充分混匀后，20μL细胞悬液滴至培养皿盖内侧，培养皿中加入5mL DPBS，将盖子反转盖上之后，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养；

7、培养24h后，普通光学显微镜下观察细胞形态；将形成的EBs从培养皿盖上转移至离心管中，使用DPBS清洗两次，转移至低吸附的培养板中做后续的诱导分化；

细胞形态如图2、图3所示。图2为悬滴法分别由2000cells、4000cells、8000cells、16000cells、32000cells形成的拟胚体形态；图3为第1、3、6、9天拟胚体形态和贴壁生长的情况。

比较实施例1与对比例1，结果可知，第一阶段采用形成单层贴壁细胞的方法效果较好控制，形成的细胞层较均匀。而如果采用形成拟胚体的方法，形成的拟胚体需要在分化诱导培养系统中保持一定持续时间，通常为7至10天；且形成聚集体和拟胚体的成形需要较大的工作量，三维拟胚体聚集体中的细胞内容物不一致并且不均匀地暴露于培养基因子，这会导致在不同分化阶段形成异质细胞产品，并且不利于规模化的生产和应用。因此本发明在诱导的第一阶段优选采用形成单层贴壁细胞的方案。

实施例2：中内胚层诱导阶段培养条件探索

一、培养基成分探索：

在小鼠胚胎发育过程中，造血细胞起源于原条后部区域，该位置细胞表达中胚层的关键基因Brachury(T)和内皮细胞标志物基因VEGFR2(亦称作KDR或FLK1)。随后，细胞起始表达血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin(亦称作CD144或CDH5)和白细胞分化抗原CD34，并具有造血细胞谱系分化能力。在胚胎发育过程中，中胚层的生成和特化涉及诸多关键信号通路，包括WNT、BMP、FGF等信号通路。

为了探究中胚层诱导阶段BMP、FGF和VEGF信号是否协同WNT信号促进生血内皮细胞生成，在分化的第0～1天处理9μM CHIR的基础上，我们分别添加了10ng/mL BMP4、20ng/mL bFGF、20ng/mL VEGF、10ng/mL BMP4+20ng/mLbFGF以及10ng/mL BMP4+20ng/mL bFGF+20ng/mL VEGF(图4A)。

流式分析结果图4B、图4C、图4D表明：添加VEGF或bFGF并未显著地提高CD34⁺(60.1％VS.58.9％或60.7％)和CD34⁺CD144⁺(53.9％VS.52.5％或54.8％)生血内皮细胞的生成；而添加10ng/mL BMP4的实验组均显著地抑制CD34⁺和CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成。上述实验结果表明，在中胚层诱导阶段，仅通过CHIR激活WNT信号即可实现CD34⁺和CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞高效诱导分化。

二、培养基各成分浓度探索：

本发明进一步探究了CHIR剂量对T⁺中胚层及CD34⁺生血内皮细胞生成的影响。流式分析结果图4E、图4F表明，相对于对照组(DMSO)，第0～1天添加3～15μM CHIR均可高效地促进T⁺中胚层(＞80％)；6～12μM CHIR可以有效地促进CD34⁺生血内皮细胞生成，而低剂量组CHIR3(3μM CHIR)或高剂量组CHIR15(15μM CHIR)诱导CD34⁺生血内皮细胞生成的效率较低。上述实验结果表明，CHIR剂量依赖地促进CD34⁺生血内皮细胞生成。

在诱导分化的第0～1天，仅添加9μM CHIR即可高效地促进T⁺中胚层及CD34⁺生血内皮细胞的生成。

实施例3：造血中胚层特化阶段培养条件探索

KDR是血管内皮生长因子的特异性细胞表面受体。细胞谱系追踪实验表明，KDR⁺中胚层发育形成初级和次级血液细胞、内皮细胞、心肌细胞和肌细胞。在小鼠胚胎中，原条时期的侧板中胚层起始表达KDR，并可以根据血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)的表达分为两个亚群：KDR⁺PDGFRα^-和KDR⁺PDGFRα⁺细胞亚群(Kattman et al.,2011；Liu et al.,2012)。进一步的研究表明，KDR⁺PDGFRα⁺亚群为心肌中胚层，可以分化为平滑肌和心肌细胞；而KDR⁺PDGFRα^-亚群为造血中胚层，可以产生造血细胞和内皮细胞(Kattman et al.,2011；Liu et al.,2012)。

为了实现造血谱系的分化，我们检测了分化体系中KDR⁺中胚层的亚群表达情况。分化第3天的流式结果分析表明(图5A)，经过CHIR诱导中胚层后，VEGF信号可以高效地诱导KDR⁺PDGFRα^-(～72％)造血中胚层细胞；且该造血中胚层细胞经过造血-内皮转换生成KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞(图5C)。

一、培养基成分探索：

人多能干细胞体外分化内皮细胞的实验表明，Activin/Nodal/TGFβ、BMP、VEGF和FGF信号可以促进该分化过程(Ditadi and Sturgeon,2016；Kennedy et al.,2012；Niwaet al.,2011)。因此，我们探索了上述信号通路是否协同影响造血中胚层生成生血内皮细胞的潜能。在造血中胚层特化阶段(第1～3天)处理20ng/mL VEGF的基础上，分别添加20ng/mL bFGF或/和10ng/mL BMP4(图5B)。分化第9天的流式结果分析表明，相对于VEGF对照组，VEGF+bFGF实验组诱导产生的造血中胚层具有更高的KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化潜能；而VEGF+BMP4实验组诱导产生的造血中胚层生成KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的潜能降低。进一步的研究发现，bFGF可以改善BMP4导致的造血中胚层生成KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞潜能降低的影响(图5C、图5D、图5E)。

二、bFGF浓度探索：

我们对bFGF的使用剂量进行了探索。分化第9天的流式结果表明，相对于Control组，在分化的第1～3天添加10～80ng/mL bFGF明显提高CD34⁺生血内皮细胞的生成，并促进了CD34⁺CD45⁺造血细胞的产生(图5F)。分化第12天的流式结果表明，相对于Control组，在分化的第1～3天添加10～80ng/mL bFGF明显提高CD34⁺CD45⁺造血细胞的产生(图5G)

上述实验结果表明，在造血中胚层阶段FGF和VEGF信号协同诱导产生的造血中胚层具有更高的KDR⁺CD34⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化潜能。因此，我们在培养基成分中添加bFGF。

实施例4：生血内皮特化阶段(CD34⁺细胞)培养条件探索

进一步实现造血和内皮特化，我们在分化体系中添加VEGF、bFGF、SCF和IL-3诱导造血中胚层向生血内皮细胞的特化，在此过程中，间质样的造血中胚层细胞逐渐变为长梭形、扁平的生血内皮细胞(图6B)。流式结果分析显示，分化第6天的部分细胞表达生血内皮细胞的关键标志物CD34、KDR和CD144，而CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成率为～29.2％(31.82％×91.86％)(图6C)。为了进一步提高生血内皮细胞的生成效率，我们检测了TPO、Flt-3L和BMP4对造血和内皮特化的影响。在分化的第3～6天，我们额外添加30ng/mLTPO、10ng/mL Flt-3L和10ng/mL BMP4至分化体系中(图6A)，分化第6天流式分析结果表明，相对于对照组(Control组)，额外添加TPO、Flt-3L和BMP4(T+F+B组)促进了CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成(～48.34％，49.46％×97.74％)(图6C)。

根据上述的实验结果，我们将造血混合物(20ng/mL VEGF、20ng/mL bFGF、50ng/mLSCF、10ng/mL IL-3、30ng/mL TPO、10ng/mL Flt-3L和10ng/mL BMP4)的添加时间提前至分化的第3天，从而进一步提高CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成。

实施例5：细胞密度对造血中胚层细胞向生血内皮特化的影响

为了探究细胞密度对造血细胞分化的影响，在诱导分化的第3天通过细胞传代的方式降低细胞的密度。我们的实验结果显示，经过细胞传代后的低密度实验组出现大量圆形、非贴壁造血细胞，而未经细胞传代的高密度实验组则未产生悬浮细胞(图7B)。流式结果进一步表明，低密度实验组产生56.69％CD34⁺细胞和29.88％CD45⁺造血细胞；高密度实验组虽然可以产生22.35％CD34⁺细胞，但其诱导效率明显低于低密度实验组，且未能产生CD45⁺造血细胞(图7C)。上述实验结果表明，细胞密度影响造血中胚层向造血细胞的特化。

为了进一步确定分化过程中所需的最佳细胞密度，我们探究了不同细胞密度对生血内皮细胞及造血细胞产生的影响。在分化的第3天按照0.5～8×10⁴个/cm²的细胞密度进行接种，并在分化的第9天检测不同细胞密度实验组CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的分化效率。流式结果分析表明，1～4×10⁴个/cm²的细胞密度更有利于CD34⁺KDR⁺CD144⁺生血内皮细胞的生成(图7D)。此外，第12天的流式结果表明，1～4×10⁴个/cm²的细胞密度更有利于CD34⁺CD45⁺造血干/祖细胞的生成(图7E、图7F)，而较高的细胞密度(8×10⁴个/cm²)明显抑制CD34⁺CD45⁺造血干/祖细胞的生成。

根据上述的实验结果，分化至第9天，即可形成CD34⁺细胞；继续分化至12天，表明本发明诱导的CD34⁺细胞具有进一步向造血细胞分化的能力。同时，本发明将分化第3天的细胞接种密度确定为2×10⁴个/cm²，并应用于后续的研究(图7A)。

实施例6：生血内皮细胞转化为造血干细胞(CD34⁺细胞进一步分化为造血干细胞)

通过阶段特异性调控与造血干细胞发育相关的关键信号通路，我们确定了人多能干细胞定向诱导造血干细胞的分化体系，包括中胚层诱导、造血中胚层特化和生血内皮特化及内皮-造血转换(培养条件同生血内皮特化阶段)(图8A)。我们的实验结果显示，在分化的第8天，扁平的、贴壁生长的生血内皮细胞经过内皮-造血转换过程生成圆形、非贴壁的造血细胞，并随着分化进程的推进，造血细胞的产生不断增加(图8B)。

造血干细胞根据其功能特征可以分为两种类型细胞：长期再生造血干细胞(LT-HSC，long-term repopulating HSC)，具有终生自我更新和多谱系分化潜能，维持终身造血功能；短期再生造血干细胞(ST-HSC，short-term repopulating HSC)，具有多谱系分化潜能，但其自我更新能力受限，仅能够提供早期和短暂的造血功能(Notta et al.,2011；Tomellini et al.,2019)。相关的研究表明，ITGA3(Integrin-α3)能够可靠地将EPCR⁺CD90⁺CD133⁺CD34⁺CD45RA^-造血干细胞群分为两种不同功能的细胞亚群：多数为短期再生造血潜能的ITGA3^-亚群和多数为长期再生造血潜能的ITGA3⁺亚群(Tomellini et al.,2019)。

为了探究我们的分化体系所获得的造血细胞是否含有LT-HSCs，我们检测了LT-HSCs标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3的表达情况。流式结果分析显示，CD34⁺CD90⁺细胞亚群中含有较高比例的EPCR⁺ITGA3⁺细胞(～9.39％)，而其他CD34/CD90细胞亚群则较少地表达EPCR/ITGA3(0％～2.46％)(图8C)。

上述实验结果表明，我们的诱导分化体系可以获得CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺的LT-HSCs，其分化效率为2.35％(25％×9.39％)(图8C)。说明本发明诱导的CD34⁺细胞可成功地进一步分化为长期再生造血干细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.试剂盒，其特征在于，包含培养基组合；

所述培养基组合包括：

第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；

所述第一培养基包括第一基础培养基和ROCK抑制剂；所述ROCK抑制剂为Y-27632；所述第一培养基中的所述第一基础培养基为E8培养基；

所述第二培养基包括第二基础培养基和WNT通路激动剂；所述第二培养基不包括BMP通路激动剂、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；所述WNT通路激动剂包括GSK-3抑制剂；所述GSK-3抑制剂为CHIR99021；所述CHIR99021的浓度为6~12 μM；

所述第三培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，所述VEGF的浓度为10~80 ng/mL，所述bFGF的浓度为10~80 ng/mL；

所述第四培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂、FGF通路激动剂、SCF/c-kit通路激动剂、白细胞介素、TPO通路激动剂、Flt-3L和/或BMP通路激动剂；所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，所述SCF/c-kit通路激动剂为SCF，所述白细胞介素为IL-3，所述TPO通路激动剂为TPO，所述BMP通路激动剂为BMP4；

所述第四培养基中，所述VEGF的浓度为20 ng/mL，所述bFGF的浓度为20 ng/mL，所述SCF的浓度为50 ng/mL，所述IL-3的浓度为10 ng/mL，所述TPO的浓度为30 ng/mL，所述Flt-3L的浓度为10 ng/mL，所述BMP4的浓度为10 ng/mL；

所述第二培养基、第三培养基和第四培养基中的所述第二基础培养基为APEL培养基。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二培养基中，所述CHIR99021的浓度为9 μM。

3.诱导多能干细胞分化为CD34⁺细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤（1）：提供诱导多能干细胞并在如权利要求1或2所述的试剂盒中的第一培养基中进行单层分化培养，获得单层细胞；

步骤（2）：将步骤（1）中所述单层细胞接种于如权利要求1或2所述的试剂盒中的第二培养基，培养，获得中胚层细胞；

步骤（3）：将步骤（2）中所述中胚层细胞接种于如权利要求1或2所述的试剂盒中的第三培养基，培养，获得造血中胚层细胞；

所述造血中胚层细胞为KDR⁺PDGFRα^-造血中胚层细胞；

步骤（4）：将步骤（3）中所述造血中胚层细胞接种于如权利要求1或2所述的试剂盒中的第四培养基，培养，获得CD34⁺细胞；

所述CD34⁺细胞为KDR⁺CD34⁺CD144⁺细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：步骤（5）、将步骤（4）中所述CD34⁺细胞接种于如权利要求1或2所述的试剂盒中的第四培养基，继续培养，获得长期再生造血干细胞；

所述长期再生造血干细胞为CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述单层分化培养的时间为1天，所述步骤（2）中所述培养的时间为1天，所述步骤（3）中所述培养的时间为3天，所述步骤（4）中所述培养的时间为6天，所述步骤（5）中所述培养的时间为3天。

6.如权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述单层分化培养的方法包括以单层贴壁细胞的方式培养。

7.如权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述培养的细胞培养密度为1~4 ×10⁴个/cm²。

8.如权利要求1或2所述的试剂盒在诱导iPSC分化制备获得CD34⁺细胞和/或长期再生造血干细胞中的应用。