TWI785273B - 一種用於促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的組合物及其培養體系 - Google Patents

一種用於促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的組合物及其培養體系 Download PDF

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Abstract

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種組合物及其用途。研究表明，MS275能夠促使人造血祖細胞向人造血幹細胞轉變。而在臍帶血造血幹細胞擴增培養過程中，加入細胞因子的同時加入MS275，達到了既增加造血幹細胞數量同時又提高造血幹細胞CFU集落形成能力的效果，使得造血幹細胞能夠處於增殖不分化的狀態，進而達到臨床移植需求。

Description

一種用於促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的組合物及其培養體系
本發明涉及造血乾祖細胞技術領域，特別涉及一種組合物及其用途。
本發明要求於2018年09月17日提交中國專利局、申請號為201811084022.5、發明名稱為“一種將人造血祖細胞轉變為造血幹細胞的方法”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本發明中，並且要求於2018年12月28日提交中國專利局、申請號為201811625923.0、發明名稱為“擴增造血幹細胞的培養體系、方法及其用途”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本發明中。
造血幹細胞是成體內極其重要的一類幹細胞，儘管其僅占人體血細胞比例不到萬分之一，但具備極強的自我更新能力和分化能力，能長期重建機體整個血液系統和免疫系統，具備各世系血細胞和免疫細胞的分化潛能。因此，造血幹細胞被廣泛應用於白血病、淋巴瘤等惡性血液疾病的臨床治療。不僅如此，造血幹細胞移植還能幫助治療代謝性疾病、先天性免疫缺陷、糖尿病等病症。據統計，每年全世界有超過40,000例造血幹細胞移植手術。目前，造血幹細胞的供體主要來源於患者自體或者與患者HLA(人類白血球抗原，human leukocyte antigen)匹配的捐獻者的骨髓和動員的外周血造血幹細胞。儘管該移植技術療效很好，但由於其存在HLA配型的嚴格配對要求，仍有大約70%的患者不能獲得合適的供體而無法接受治療；即使接受了治療，多數患者也會經受程度各異的移植物抗宿主病(GVHD，Graft-versus-host disease)的折磨。臍帶血造血幹細胞對於HLA配型的要求相對較低，且免疫原性低，再加上其獲取方便、來源豐富，逐漸成為造血幹細胞移植供體的一大來源。然而由於單份臍帶血所含造血幹細胞數量少，不 足以短時間內重建成人患者的免疫系統，從而增高機會性感染致死率，急需一種增加臍帶血造血幹細胞數量的方法。
細胞重程式設計是指分化的體細胞在特定的條件下去分化逆轉命運回到全能性或多能性狀態，或者將一種類型的分化細胞轉分化變成另外一種細胞類型的過程。從造血祖細胞到造血幹細胞的轉變，是一種細胞重程式設計。造血祖細胞是一類自我更新能力和分化潛能低於造血幹細胞的細胞類型，雖然表達CD34表面抗原，但不表達造血幹細胞特異的CD90表面分子，而為CD45RA陽性。因此，可以利用CD90和CD45RA區分造血幹細胞和造血祖細胞。造血祖細胞具備短期(不到一個月)的體內移植能力，能分化為紅細胞、淋巴細胞、髓系細胞等多種血液細胞。由於其不具備長期移植重建受體血液系統的能力，常常被排除在血液細胞移植治療惡性血液病的手術之外。但造血祖細胞體內含量遠遠高於造血幹細胞(0.03% vs 0.0001%)，若能夠將造血祖細胞重程式設計為造血幹細胞，則將大大拓寬造血幹細胞的供體來源。
近年來，人們對於臍帶血造血幹細胞的體外擴增進行了大量嘗試，但都沒有取得理想效果。早期人們利用血液中的細胞因子來培養造血幹細胞，結果導致細胞分化，而移植功能減弱。後來，人們發現骨髓造血幹細胞微環境中的Wnt信號分子、Notch配體、視黃酸拮抗因子等能夠有效擴增CD34+造血幹/祖細胞。利用CHIR99021或者BIO啟動Wnt信號通路維持體外培養的造血幹細胞的移植能力；而在造血幹細胞的培養體系中添加DLL1，DSL1等，能夠通過啟動Notch信號而適度擴增造血幹細胞。另有研究發現，骨髓內皮基質細胞分泌的PTN也能夠輕微擴增造血幹細胞。生理狀態下造血幹細胞處在低氧條件下，而體外培養產生的氧脅迫會通過增高ROS水準損害造血幹細胞的自我更新和移植功能；人們發現，抗氧化劑的添加以及mTOR的抑制能夠抵消這些損害。然而，上述技術並沒能夠顯著擴增臍帶血造血幹細胞。偶然的發現，銅離子螯合劑TEPA，SIRT抑制劑Nicotinamide能夠顯著提高造血幹細胞移植水準，且在臨床實驗中顯示初步療效，但擴增後的細胞體內存活時間不夠長，且分化譜系不夠完整。近幾年的高通量篩選化學小分子發現一類氮雜環化合物SR1和吲哚類似物UM171 能夠更有效的擴增具備長期移植能力的造血幹細胞。臨床實驗表明，SR1擴增的造血幹細胞具備重建患者免疫系統的能力，但其依然沒有擺脫對雙份臍帶血移植的依賴。總的來說，HSC最佳的體外擴增條件至今尚沒有明確的共識。
表觀修飾在調控細胞命運方面具有重要作用。基因座的甲基化、乙醯化，組蛋白的各類基團修飾直接影響鄰近區域基因的開放程度和轉錄因子結合難度，進而調控基因的表達，完成對細胞狀態及命運的調節。因此，表觀修飾在更高的層面上影響細胞功能。人們研發了許多表觀修飾物來改變細胞命運。近年研究發現表觀修飾物對人造血幹細胞的體外擴增也有明顯促進作用。小分子化合物MS275在細胞重程式設計領域也引起高度重視，因其能夠促進細胞命運改變，被用作IPS製備的催化劑。
小分子化合物MS275，又名SNDX-275或Entinostat，分子式為C21H20N4O3，CAS號為209783-80-2，是I型組蛋白去乙醯化酶HDAC1和HDAC3的特異抑制劑。醫療領域多用Entinostat來指稱MS275，該藥物在白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤已經進入I期和II期臨床試驗。據報導，MS275能促進人誘導型多潛能幹細胞(Ipsc，Induced pluripotent stem cell)的產生，而MS275對造血幹細胞的維持和擴增作用，以及對造血祖細胞向造血幹細胞重程式設計的作用尚無報導。
針對相關技術中的上述技術問題，本發明提供了一種組合物及其在造血乾祖細胞中的用途。本發明研究表明，小分子化合物MS275能夠促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變，並且能夠顯著提高造血幹細胞體外擴增所得的細胞總量。
本發明提供了MS275在促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變中的應用。
本發明提供了，MS275在製備造血幹細胞中的應用。
本發明提供了，MS275和造血祖細胞在製備造血幹細胞中 的應用
本發明還提供了一種組合物，其由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成。
一種促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的組合物，其由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成。
一種促進造血幹細胞體外擴增的組合物，其由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成。
本發明實施例中，本發明提供的組合物作為培養基的添加劑，用於促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變和促進造血幹細胞擴增。其中，MS275的溶液以DMSO配置，母液濃度為100mmol/L。
本發明提供的組合物中，所述MS275、TPO、SCF和FLT3L的品質比為(38~3800)：(30~70)：(80~120)：(90~110)。
一些實施例中，所述組合物中MS275、TPO、SCF和FLT3L的品質比為380：30：80：90。
一些實施例中，所述組合物中MS275、TPO、SCF和FLT3L的品質比為380：50：100：100。
一些實施例中，所述組合物中MS275、TPO、SCF和FLT3L的品質比為380：70：120：110。
本發明所述的組合物在促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變中的應用。
本發明所述的組合物在製備造血幹細胞中的應用。
本發明所述的組合物和造血祖細胞在製備造血幹細胞中的應用。
本發明所述的組合物在促進造血幹細胞擴增中的應用。
本發明提供了一種培養體系，其包括基礎培養基和本發明所述的組合物。
本發明還提供了一種促進造血幹細胞擴增的培養體系，其包括基礎培養基和本發明所述的組合物。
本發明還提供了一種促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的 培養體系，其包括基礎培養基和本發明所述的組合物。
本發明提供的培養體系中，所述MS275的濃度為0.1μmol/L~10μmol/L。一些實施例中，所述MS275的濃度為1μmol/L。
本發明所述的培養體系中：所述TPO的濃度為30ng/mL~70ng/mL；所述SCF的濃度為80ng/mL~120ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL~110ng/mL。
實施例中，本發明所述的培養體系中：所述MS275的濃度為0.1μmol/L~10μmol/L；所述TPO的濃度為30ng/mL~70ng/mL；所述SCF的濃度為80ng/mL~120ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL~110ng/mL。
本發明所述的培養體系其製備方法為，在StemSpan SFEM II培養基中，加入本發明提供的組合物直至各組分的濃度為本發明所述的濃度。本發明所述組合物可為乾粉，其可為各組分的混合物或各組分分別單獨存在。所述組合物亦可為溶液，或稱為母液。所述母液中包括組合物的全部或部分組分。MS275母液的溶劑為DMSO，TPO、SCF和FTL3L母液的溶劑為0.1%BSA。
一些實施例中，所述TPO的濃度為30ng/mL；所述SCF的濃度為80ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL。
一些實施例中，所述TPO的濃度為50ng/mL；所述SCF的濃度為100ng/mL；所述FLT3L的濃度為100ng/mL。
一些實施例中，所述TPO的濃度為70ng/mL；所述SCF的濃度為120ng/mL；所述FLT3L的濃度為110ng/mL。
本發明中，所述基礎培養基為StemPro、RPMI1640、IMDM、α-MEM或StemSpan SFEM II。一些實施例中，所述基礎培養基為StemSpan SFEM II。
一些具體實施例中，本發明提供的培養體系包括StemSpan SFEM II培養基、1μmol/L MS275、50ng/mL TPO、100ng/mL SCF和100ng/mL FLT3L。
一些具體實施例中，本發明提供的培養體系包括StemSpan SFEM II培養基、1μmol/L MS275、30ng/mL TPO、80ng/mL SCF和90ng/mL FLT3L。
一些具體實施例中，本發明提供的培養體系包括StemSpan SFEM II培養基、1μmol/L MS275、70ng/mL TPO、120ng/mL SCF和110ng/mL FLT3L。
本發明所述的培養體系在促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變中的應用。
本發明所述的培養體系在製備造血幹細胞中的應用。
本發明所述的培養體系和造血祖細胞在製備造血幹細胞中的應用。
本發明所述的培養體系在促進造血幹細胞擴增中的應用。
本發明還提供了一種促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的方法，其以本發明所述的培養體系對造血祖細胞進行培養。
本發明提供的方法中，所述造血祖細胞為CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞。
本發明提供的方法中，所述培養接種的CD34+CD90-細胞密度為0.1~10×104cells/mL，CD34+CD45RA+細胞密度為0.1~10×104cells/mL。
一些具體實施例中，所述培養接種的CD34+CD90-細胞密度為0.55×104cells/mL，CD34+CD45RA+細胞密度為0.13×104cells/mL。
所述培養的條件為37℃,5%CO2，培養時長為5~10天。
本發明還提供了一種擴增造血幹細胞的方法，其以本發明所述的培養體系對造血幹細胞進行培養。
本發明所述的方法中，所述造血幹細胞為臍帶血造血幹細胞；接種的密度為0.1~10×104cells/mL。
所述培養的條件為37℃,5%CO2。每隔2天補加新鮮的本發明提供的培養基及組合物。培養5~10天擴增倍數為4~20倍。
本發明提供了MS275在促進造血幹細胞擴增中的應用。研究表明，在臍帶血造血幹細胞擴增培養過程中，加入細胞因子的同時加入MS275，達到了既增加造血幹細胞數量同時又提高造血幹細胞CFU集落形成能力的效果，使得造血幹細胞能夠處於增殖不分化的狀態，進而達到臨床移植需求。本發明的操作簡便，成本低廉，得到的造血幹細胞數量更多，解決了現有技術中造血幹細胞擴增率低、易分化等缺陷。
MS275通過表觀修飾的調節有望將造血祖細胞誘導為造血幹細胞，並且能實現體外擴增造血幹細胞，可應用於臍帶血、胎盤血、外周血、骨髓來源的造血幹細胞；利用MS275和人造血祖細胞製備的造血幹細胞數量多，且具備各譜系分化潛能，能夠為臨床應用提供造血幹細胞供體。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的圖式作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的圖式僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些圖式獲得其他的圖式。
第1a圖是CD34+CD90-造血祖細胞培養5天後的造血幹細胞流式檢測圖(DMSO為對照組)；第1b圖是CD34+CD45RA+造血祖細胞培養5天後的造血幹細胞流式檢測圖(DMSO為對照組)；第2a圖是CD34+CD90-造血祖細胞培養5天後的造血幹細胞比例和數目統計圖(DMSO為對照組)；第2b圖是CD34+CD45RA+造血祖細胞培養5天後的造血幹細胞比例和數目統計圖(DMSO為對照組)；第3圖示組1和組4的造血幹細胞在第5天的表面抗原表達情況分析圖；其中，第3a圖示SSC、CD34的表達情況，第3b圖示CD34、CD45RA的表達情況，第3c圖示CD34、CD90的表達情況；第4圖示倒置顯微鏡下各譜系集落形成代表圖，其中(a)示CFU-E，(b)示BFU-E，(c)示CFU-G，(d)示CFU-M，(e)示CFU-GM，(f)示 CFU-GEMM。
本發明公開了一種組合物及其用於造血幹細胞的製備方法、製劑，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
一種利用人造血祖細胞製備人造血幹細胞的方法，包括以下步驟：S1從人臍帶血獲取CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞；S2將所述CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞懸浮接種於臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基中培養，所述臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基採用StemSpan SFEM II無血清培養基，添加100ng/ml SCF，100ng/ml FLT3，50ng/ml TPO；初始細胞接種密度為：CD34+CD90-細胞為0.1~10×104/ml，CD34+CD45RA+細胞為0.1~10×104/mL；添加MS275濃度為1μM；置於37℃,5%CO2培養箱培養。
本發明所述的利用人造血祖細胞製備人造血幹細胞的方法，還進一步包括：S3根據細胞培養狀態，每隔2天補加所述臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基500μl，5~10天獲得數量較多的細胞，擴增倍數為4~20倍。
本發明所述方法中，步驟S1所述的從人臍帶血獲取CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞進一步包括以下步驟：S11獲取外周血單個核細胞PBMC(peripheral blood mononuclear cell)；S12利用磁珠分選MACS(Magnetic-activated cell sorting)從 上述PBMC中獲得CD34+臍帶血造血幹、祖細胞；和S13將CD34+細胞利用流式抗體CD34、CD90、CD45RA染色半小時，通過流式分選儀分選得到CD34+CD90-和CD34+CD45RA+造血祖細胞。
本發明所述方法中，步驟S11所述的獲取外周血單個核細胞PBMC進一步包括以下步驟：S111用含肝素鈉等抗凝劑的一次性血袋採集臍帶血80~120ml，將臍帶血由血袋轉移至500ml培養瓶中，加生理鹽水稀釋2~3倍，混勻後逐滴加入到0.4倍體積淋巴細胞分離液中；S112置於離心管中以1500~2000rpm/分鐘離心20分鐘，因密度不同離心管中由上到下分為四層：第一層為血漿層，第二層為環狀乳白色單個核細胞層PBMC，第三層為透明分離液層，第四層為紅細胞層；S113用吸管吸取第二層環狀乳白色單個核細胞層PBMC到另一50ml離心管中，補加生理鹽水，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘；和S114棄上清，加生理鹽水重懸，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘，棄上清，得到PBMC細胞團塊。
本發明所述方法中，所述的步驟S12進一步包括：S121每份臍帶血PBMC採用50ul人CD34+磁珠和50ul FcR阻滯劑及150ul 0.5%BSA的混合液重懸，4℃孵育30分鐘；S122同時將磁鐵和磁力架至於超淨台中紫外線照射30分鐘；S123加入10ml無菌PBS，混勻後，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘，棄上清；S124將MACS專用吸附柱放進磁鐵中，加入500ul 0.5%BSA潤洗，流出的液體用15ml管接住；S125用500ul 0.5% BSA重懸步驟S123中PBMC團塊，混勻，轉移到MACS專用吸附柱中，待液體完全流出；S126用500ul 0.5% BSA洗滌3次，取下吸附柱，置於15ml 管中；和S127加入1ml 0.5% BSA，用活塞把液體推入15ml管中，所得液體即含CD34+臍帶血造血幹、祖細胞；和S128稀釋，計數。
本發明所述方法中，所述的步驟S127中，用凍存保護劑二甲亞碸DMSO將所得的液體凍存於液氮中。
本發明提供了MS275在促進造血幹細胞擴增中的應用。
本發明還提供了一種促進造血幹細胞擴增的組合物，其由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成。
本發明所述組合物中，所述MS275、TPO、SCF和FLT3L的品質比為(38~3800)：(30~70)：(80~120)：(90~110)。
本發明還提供了擴增造血幹細胞培養體系，其包括基礎培養基和MS275。
本發明所述培養體系中，所述MS275的濃度為0.1μmol/L~10μmol/L。
本發明所述培養體系中還包括TPO、SCF和FLT3L。
本發明所述培養體系中，所述TPO的濃度為30ng/mL~70ng/mL；所述SCF的濃度為80ng/mL~120ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL~110ng/mL。
本發明所述培養體系中，所述基礎培養基為StemPro、RPMI1640、IMDM、α-MEM或StemSpan SFEM II。
本發明還提供了一種擴增造血幹細胞的方法，其以本發明所述的培養體系對造血幹細胞進行培養。
本發明實施例中，所述造血幹細胞為臍帶血造血幹細胞；初始接種密度為2×104cells/mL。
MS275通過表觀修飾的調節有望將造血祖細胞誘導為造血幹細胞，進而實現體外擴增造血幹細胞，可應用於臍帶血、胎盤血、外周血、骨髓來源的造血幹細胞；利用人造血祖細胞製備的造血幹細胞數量高，且具備各譜系分化潛能，能夠為臨床應用提供造血幹細胞供體。
本發明中，所述造血幹細胞是一類具有自我更新能力和分化能力，能向各類血細胞分化，在體內能長期重建受體整個血液系統和免疫系統的細胞，其表達CD34和CD90表面抗原，不表達CD45RA，即為CD34+CD90+CD45RA-，本發明中CD34+CD90+和CD34+CD45RA-均代表造血幹細胞。
本發明中，所述造血祖細胞是一類自我更新能力和分化能力低於造血幹細胞的細胞類型，能向多種血細胞分化，但在體內不能長期重建受體整個血液系統和免疫系統，雖然表達CD34表面抗原，但不表達造血幹細胞特異的CD90表面分子，而CD45RA陽性，即為CD34+CD90-CD45RA+，本發明中CD34+CD90-和CD34+CD45RA+均代表造血祖細胞。
本發明中，所述轉變，亦可稱為轉化，即造血祖細胞向造血幹細胞轉化；也可以稱為是重程式設計，即造血祖細胞重程式設計為造血幹細胞。所述重程式設計是指使造血祖細胞逆轉恢復到造血幹細胞的狀態。
本發明中，所述擴增是指將造血幹細胞進行培養，使其數量得到增加的過程。本發明中，經過本發明提供的培養體系對造血幹細胞進行擴增培養後，細胞數量可以得到17倍以上的擴增。本發明中，所述組合物是指小分子化合物MS275，以及生長因子TPO、SCF和FLT3L的組合。本發明所述組合物中的各組分可以各自獨立存在，也可相互混合，本發明對此不做限定。各組分可以為溶液也可為粉末。在本發明中，各組分以溶液形式存在，各組分相互獨立。
本發明中，所述培養體系是指體外條件下培養細胞的營養物質，亦可稱為培養基。本發明所述的培養體系可於使用前現配現用，也可製成成品長期儲存。
本發明中，所述基礎培養基是指能夠實現造血幹細胞擴增或生長的所需基本營養物質的培養基。本發明所述的基礎培養基可為粉末狀也可為培養液。
本發明採用的試材、試劑或實驗器材皆為普通市售品，皆可於市場購得。具體地，關於下面實施例中涉及的原料生產廠家如下表(表1)：表1 原料資訊
Figure 108132969-A0305-02-0014-1
StemSpanSFEM II是無血清培養基，生產廠商為StemCell Technologies，貨號為09655；重組人幹細胞因子rhSCF(recombined human stem cell factor)，生產廠商為Stemimmune LLC，貨號為HHM-SF-1000；重組人血小板生成素rhTPO(recombined human thrombopoietin)，生產廠商為Stemimmune LLC，貨號為HHM-TP-0100；重組人FMS樣酪氨酸激酶3配體rhFLT3L(recombined human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)，簡稱FLT3或FLT3L，生產廠商為Stemimmune LLC，貨號為HHM-FT-1000；外周血單個核細胞PBMC(peripheral blood mononuclear cell)MACS：磁珠分選；DMSO：二甲亞碸；PBS：磷酸鹽緩衝液；MethoCultTM GF H4435，是半固體培養基；CFU-E全稱Colony Forming Unit of Erythrocyte，中文名為紅細胞集落形成單位；BFU-E全稱Burst Forming Unit of Erythrocyte，中文名為爆發式紅細胞集落形成單位；CFU-G全稱Colony Forming Unit of Granulocyte，中文名為粒細胞集落形成單位；CFU-M全稱Colony Forming Unit of Macrophage，中文名為巨噬細胞集落形成單位； CFU-GM全稱Colony Forming Unit of Granulocyte-Macrophage，中文名為粒細胞-巨噬細胞集落形成單位；CFU-GEMM全稱Colony Forming Unit of granulocyte,erythrocyte,macrophage/monocyte,megakaryocyte，混合集落，其中文名為粒細胞，紅細胞，巨噬/單核細胞，巨核細胞集落形成單位；所述臍血造血幹細胞的製備包括：將臍帶血以生理鹽水稀釋2~3倍後加入淋巴細胞分離液，經1500~2000rpm/min離心20min取單個核細胞層(PBMC)，生理鹽水洗滌並重懸得到PBMC細胞團塊；然後以磁珠法分離CD34+細胞。
本發明提供的組合物或培養體系能夠適用於造血幹細胞的體外擴增，所述造血幹細胞可來源於實驗動物(例如小鼠等)或人類。人類造血幹細胞可來源於骨髓、外周血、臍帶血和胎盤血，在本發明實施例中，以臍帶血造血幹細胞為例，其中，臍帶血經檢測乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、愛滋病、巨細胞病毒、TORCH檢測、支原體、衣原體、G-6PD和地貧均為陰性，經檢測，分離的人臍帶血造血幹細胞表達如下幾種膜分子：白細胞分化抗原CD45、白細胞分化抗原CD34、白細胞分化抗原CD90、白細胞分化抗原CD49f。
下面結合圖式和具體實施方式進一步詳細說明本發明。
實施例1：
利用人臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基由造血祖細胞獲得大量的臍帶血造血幹細胞，包括如下步驟：
1.獲取外周血單個核細胞(PBMC)。
(1)用一次性血袋(含肝素鈉等抗凝劑)採集臍帶血80~120ml，將臍帶血由血袋轉移至500ml培養瓶中，加生理鹽水稀釋2~3倍，混勻後逐滴加入0.4倍體積淋巴細胞分離液中，注意不要破壞介面。
(2)1500~2000rpm/分鐘離心20分鐘，因密度不同離心管中由上到下分為四層：第一層為血漿層，第二層為環狀乳白色單個核細胞層(PBMC)，第三層為透明分離液層，第四層為紅細胞層。
(3)用吸管小心吸取第二層環狀乳白色單個核細胞層(PBMC) 到另一50ml離心管中，補加生理鹽水，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘。
(4)棄上清，加生理鹽水重懸，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘，棄上清，得到PBMC細胞團塊。
2．利用磁珠分選(MACS)從上述PBMC中獲得CD34+臍帶血造血幹、祖細胞。
(1)每份臍帶血PBMC採用50ul人CD34+磁珠和50ul FcR阻滯劑(blocker reagent)及150ul 0.5%BSA的混合液重懸，4℃孵育30分鐘。
(2)與此同時，將磁鐵和磁力架至於超淨台中紫外線照射30分鐘。
(3)加入10ml無菌PBS，混勻後，1500~2000rpm/分鐘離心5~10分鐘，棄上清。
(4)將MACS專用吸附柱放進磁鐵中，加入500ul 0.5%BSA潤洗，流出的液體用15ml管接住。
(5)500ul 0.5% BSA重懸步驟(3)中PBMC團塊，混勻，轉移到MACS專用吸附柱中，待液體完全流出。
(6)500ul 0.5% BSA洗滌3次，取下吸附柱，置於15ml管中。
(7)加入1ml 0.5% BSA，用活塞把液體推入15ml管中，所得液體即含CD34+臍帶血造血幹、祖細胞。
(8)稀釋，計數，如要必要，用凍存保護劑二甲亞碸(DMSO)將上述液體凍存於液氮中。
3.將CD34+細胞利用流式抗體CD34、CD90、CD45RA染色半小時，通過流式分選儀分選得到CD34+CD90-和CD34+CD45RA+造血祖細胞。
4.所述CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞懸浮接種於臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基中培養。採用StemSpan SFEM II無血清培養基，添加100ng/ml SCF，100ng/ml FLT3，50ng/ml TPO；24孔板中細胞接種密度為：CD34+CD90-細胞為0.55×104/孔，CD34+CD45RA+細胞為0.13×104/孔，體積均為0.5mL；化合物M(MS275)添加 至1μM，對照組添加DMSO(0.1%)；置於37℃,5%CO2培養箱培養。
轉變培養基：StemSpan SFEM II無血清培養基+100ng/ml SCF+100ng/ml FLT3+50ng/ml TPO+1μM MS275；對照組培養基：StemSpan SFEM II無血清培養基+100ng/ml SCF+100ng/ml FLT3+50ng/ml TPO+0.1% DMSO；
5.根據細胞培養狀態，每隔2天補加臍帶血造血幹細胞專用轉變培養基500μl，5~10天可獲得數量較多的細胞，擴增倍數約為4~20倍。
實施例2：
將上述分離的人胎盤血造血幹細胞進行表型鑒定、活率和純度檢測及功能鑒定，包括如下步驟：
1.細胞計數
分別對培養後的CD34+CD90+和CD34+CD45RA-造血幹細胞進行計數。
Figure 108132969-A0305-02-0017-2
Figure 108132969-A0305-02-0017-3
2.細胞流式分析
採用BD公司FACS Verse流式檢測儀，取細胞懸液20μl，加入溶解於0.5% BSA中的以下四種抗體各0.2μl：FITC標記的CD34，PE標記的CD38，APC-Cy7標記的CD45RA，APC標記的CD90。各管渦旋後室溫下避光孵育15分鐘，加入適量PBS，1600rpm室溫離心5分鐘， 棄上清液，加入PBS 200μl，然後上機分析。
3.集落形成單位分析
採用MethoCultTM GF H4534半固體培養基，在六孔板中加入培養基1ml/孔，CD34+細胞接種密度為1000細胞/孔，置於37℃ 5%CO2培養箱培養14天後，計算各譜系集落數目，並拍攝照片。
由第1a圖、第1b圖及第2a圖、第2b圖可以得知，含MS275的專用轉變培養基能誘導產生CD34+CD90+和CD34+CD45RA-表型的造血幹細胞，而普通培養基不能。
實施例3
1.獲取臍帶血單個核細胞；(1)將臍帶血加生理鹽水稀釋2~3倍，混勻後逐滴加入到0.4倍體積淋巴細胞分離液中，注意不要破壞介面；(2)使用1500~2000rpm/min離心20min，因密度不同離心管中由上到下分為四層：第一層為血漿層、第二層為環狀乳白色單個核細胞層(PBMC)、第三層為透明分離液層、第四層為紅細胞層；(3)用吸管小心吸取第二層環狀乳白色單個核細胞層(PBMC)到另一50ml離心管中，補加生理鹽水，再次使用1500~2000rpm/min離心5~10min；(4)棄上清加生理鹽水重懸，最後使用1500~2000rpm/min離心5~10min，再次棄上清，得到PBMC細胞團塊。
2、利用MACS從上述PBMC中獲得CD34+臍帶血造血幹細胞；(1)每份臍帶血PBMC採用50μL人CD34+磁珠和50μL FcR blocker reagent及150μL 0.5%BSA的混合液重懸，4℃孵育30min；(2)與此同時，將磁鐵和磁力架至於超淨台中紫外線照射30min；(3)加入10ml無菌PBS，混勻後，使用1500~2000rpm/min離心5~10min後棄上清；(4)將MACS專用吸附柱放進磁鐵中，加入500ul 0.5%BSA潤洗，流出的液體用15ml tube接住； (5)500μL 0.5% BSA重懸獲取臍帶血單個核細胞的步驟3)中PBMC團塊，混勻後轉移到MACS專用吸附柱中，待液體完全流出；(6)500μL 0.5% BSA洗滌3次，取下吸附柱，置於15ml tube中；(7)加入1ml 0.5% BSA，用活塞把液體推入15ml tube中，所得液體即含CD34+臍帶血造血幹細胞。
實施例4
各組培養基中因子的含量如表4：
Figure 108132969-A0305-02-0019-4
將各物質以表1濃度添加入StemSpan SFEM II無血清培養基。
將實施例1製得的CD34+臍帶血造血幹細胞懸浮接種於各組細胞培養基中進行培養。24孔板中細胞接種密度為1×104cells/孔，體積為0.5mL，置於37℃，5%CO2培養箱培養。根據細胞培養狀態，每隔2天補加各組新鮮的細胞培養基500μL，5~10天可獲得數量較多的造血幹細胞，擴增倍數約為4~20倍。
效果檢測
對實施例4各組培養的臍帶血造血幹細胞進行細胞計數、表型鑒定及集落形成單位分析。
1、細胞計數
分別對第5天的MS275或DMSO培養的細胞進行計數，並計算相比第0天的細胞數目擴增倍數。各組培養基培養結果如表5：表5：各組條件細胞數目擴增倍數統計表
Figure 108132969-A0305-02-0020-5
結果表明：添加MS275的組相對於組4，獲得的CD34+CD90+細胞數量更多，擴增倍數更大，經統計學分析，組1~3的擴增效果與組4存在顯著性差異，p<0.05。組1~3中，組2的擴增效果更佳。
2、細胞流式分析
分別對第0天、第5天的MS275或DMSO培養的CD34+細胞進行流式分析。採用BD公司FACS Verse流式檢測儀，取細胞懸液20μL，加入溶解於0.5% BSA中的FITC標記的CD34，PE標記的CD38，APC-Cy7標記的CD45RA，APC標記的CD90。各管渦旋後室溫下避光孵育15min，加入適量PBS，1600rpm室溫水準離心5min，棄上清液，加入PBS 200μL，然後上機分析。組2和組4的檢測結果如第3圖。結果表明，相對於未添加MS275的組4，組2擴增獲得的CD34+CD90+細胞比例更高，這說明表明組2擴增獲得的這些造血幹細胞更加原始，具有更強的重建血液系統的分化潛能，可以更有效地支援臨床治療需要。組1、3擴增獲得的細胞中，CD34+CD90+細胞比例與組2相似。
3、集落形成單位分析
分別對第0天、第5天的MS275或DMSO培養的CD34+細胞進行集落形成單位分析。採用MethoCultTM GF H4435半固體培養基，在六孔板中加入培養基1ml/孔，CD34+細胞接種密度為500細胞/孔，置於37℃ 5%CO2培養箱培養14天後，計算各譜系集落數目，並拍攝照片。倒置顯微鏡下各譜系集落形成代表圖如第4圖，集落形成數目統計如表6：表6 各組培養後集落形成數目
Figure 108132969-A0305-02-0021-6
如表6所示，添加MS275的組相對於組4，獲得的細胞集落數目更多，經統計學分析，組1~3的集落數目與組4存在顯著性差異，p<0.05。組1~3中，組2的群落數目最多。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。

Claims (10)

  1. 一種下述組合物在促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變中的應用，其中所述組合物由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成，並且所述MS275、TPO、SCF和FLT3L的質量比為(38~3800)：(30~70)：(80~120)：(90~110)。
  2. 一種促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變的方法，其特徵在於，以下述的培養體系對造血祖細胞進行培養，其中所述培養體系包含基礎培養基和組合物，所述組合物由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成，並且所述MS275、TPO、SCF和FLT3L的質量比為(38~3800)：(30~70)：(80~120)：(90~110)。
  3. 根據申請專利範圍第2項所述的方法，其中所述MS275濃度為0.1μmol/L~10μmol/L；所述TPO的濃度為30ng/mL~70ng/mL；所述SCF的濃度為80ng/mL~120ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL~110ng/mL。
  4. 根據申請專利範圍第2項所述的方法，其中所述基礎培養基為StemProTM、RPMI1640、IMDM、α-MEM或StemSpanTM SFEM II。
  5. 根據申請專利範圍第2-4中任一項所述的方法，其中，所述造血祖細胞為CD34+CD90-和CD34+CD45RA+臍帶血造血祖細胞。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述的方法，其中，所述培養接種的CD34+CD90-細胞密度為0.1~10×104cells/mL，CD34+CD45RA+細胞密度為0.1~10×104cells/mL。
  7. 一種通過促進造血祖細胞向造血幹細胞轉變而擴增造血幹細胞的方法，其特徵在於，以下述的培養體系對造血幹細胞進行培養，其中所述培養體系包含基礎培養基和組合物，所述組合物由MS275、TPO、SCF和FLT3L組成，並且所述MS275、TPO、SCF和FLT3L的質量比為(38~3800)：(30~70)：(80~120)：(90~110)。
  8. 根據申請專利範圍第7項所述的方法，其中所述MS275濃度為0.1μmol/L~10μmol/L；所述TPO的濃度為30ng/mL~70ng/mL； 所述SCF的濃度為80ng/mL~120ng/mL；所述FLT3L的濃度為90ng/mL~110ng/mL。
  9. 根據申請專利範圍第7項所述的方法，其中所述基礎培養基為StemProTM、RPMI1640、IMDM、α-MEM或StemSpanTM SFEM II。
  10. 根據申請專利範圍第7項所述的方法，其中，所述造血幹細胞為臍帶血造血幹細胞；初始細胞接種的密度為0.1~10×104cells/mL。
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