CN116622634A - Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜能中的应用 - Google Patents

Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜能中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜能中的应用，本发明首次发现Garcinone D能够有效维持造血干细胞干性并提高其多谱系分化潜能，解决了现有技术中存在的无法在体外长期扩增培养过程中维持造血干细胞干性的这一技术问题，为造血干细胞移植技术奠定了基础，可广泛应用于治疗一系列的血液系统疾病，临床应用前景广阔。

Description

Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜 能中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜能中的应用。
背景技术
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）是一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，其可以分化为所有类型的血细胞和血小板，是维持机体内血液稳态的重要组成部分。造血干细胞不仅能分化为各种血液细胞，同时具有自我更新能力，因此，造血干细胞移植是临床治疗恶性血液系统疾病的重要方案。造血干细胞的来源主要有骨髓、脐带血和外周血，但由于其含量少，来源不稳定，个体间质量差异大，且体外无法长期培养等缺点严重制约了造血干细胞的临床研究和应用。因此，如何在获得造血干细胞后，实现体外长期培养、扩增并维持其干性成为本领域亟需解决的问题。
以往造血干细胞的扩增主要依赖于细胞因子，但是往往会引起造血干细胞的干性发生快速的丢失。近年来，由于小分子化合物的化学合成技术的提高，相关小分子化合物的研发成为体外扩增造血干细胞的研究重点，目前，UM171和SR1这两个小分子化合物被认为是较为成熟稳定的造血干细胞体外扩增剂，然而大部分的实验方案只能在短期内维持人源的造血干细胞的干性，随着培养时间的延长，经UM171和SR1处理的造血干细胞的干性同样会发生快速的衰减，得到的细胞质量满足不了临床移植的需求。因此，本领域亟需一种能够在培养时间较长的条件下仍然能够保证造血干细胞的干性的新型体外扩增剂。
Garcinone D（GD）是一种来自山竹的天然呫吨酮（xanthone），有研究表明其可促进神经干细胞的增殖，涉及的信号通路包括STAT3/Cyclin D1和Nrf2/HO-1，但是未见其与造血干细胞相关的报道，也未见其能够作为造血干细胞体外扩增剂的相关报道，更未见其在维持造血干细胞干性及提高造血干细胞多谱系分化潜能中的应用的相关报道。本发明首次发现Garcinone D能够有效维持造血干细胞干性并提高其多谱系分化潜能。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供Garcinone D在维持造血干细胞干性及提高其多谱系分化潜能中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了Garcinone D在维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能中的应用。
进一步，所述Garcinone D的浓度为(1-30) μM。
进一步，所述Garcinone D的浓度为15 μM。
在本发明中，所述Garcinone D是一种来自山竹的天然呫吨酮，结构式如式(Ⅰ)所示，名称：1,3,6-trihydroxy-8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-7-methoxy-2-(3-methylbut-2-enyl)xanthen-9-one，CAS编号：107390-08-9，分子式：C24H28O7，分子量：428.47。Garcinone D能够促进C17.2神经干细胞的增殖，Garcinone D对CEM-SS细胞系显示出显著的细胞毒性，IC50值为3.2 μg/mL。Garcinone D以浓度和时间依赖的方式增加磷酸化信号转导子和转录激活因子3（p-STAT3）、Cyclin D1和核因子红细胞2相关因子（Nrf2）、以及血红素加氧酶-1（HO-1）的蛋白水平。在本发明中，所述GD同Garcinone D。
式(Ⅰ)。
在一些实施方案中，本发明通过实验验证首次发现在体外扩增造血干细胞的培养基中添加Garcinone D能够有效维持造血干细胞干性并提高其多谱系分化潜能。目前现有技术中报道的技术方案在对造血干细胞进行扩增培养时，CD34+的表达衰减速度较快，而在培养过程中引入本发明所述的Garcinone D后能够显著降低CD34+的表达衰减速度。在具体实施方案中，本发明所述的Garcinone D的使用浓度并无特别限制，只要能够产生有效维持造血干细胞干性并提高其多谱系分化潜能这一效果的Garcinone D的使用浓度均在本发明的保护范围内，所述Garcinone D的浓度优选为1-30 μM，更优选为5-20 μM，最优选为15 μM。
本发明的第二方面提供了一种用于维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的组合物。
进一步，所述组合物包含本发明第一方面中所述的Garcinone D。
在一些实施方案中，所述组合物还可包含其它能够用于维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的试剂、其它能够增强Garcinone D维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的效果的试剂、造血干细胞培养基、和/或生长因子。
在一些实施方案中，所述其它能够用于维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的试剂包括但不限于：以Src为靶点的小分子抑制剂、以HDAC为靶点的小分子抑制剂、以PKC为靶点的小分子抑制剂、以JNK为靶点的小分子抑制剂、以PDGFR为靶点的小分子抑制剂。
在一些实施方案中，所述以Src为靶点的小分子抑制剂包括但不限于：Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391、KX1-004；所述以HDAC为靶点的小分子抑制剂包括但不限于：VPA、SAHA、AR-42、ACY-241、TSA、LBH589、CXD101；所述以PKC为靶点的小分子抑制剂包括但不限于：Enzastaurin、Midostaurin、GSK690693、Chelerythrine Chloride、Staurosporine；所述以JNK为靶点的小分子抑制剂包括但不限于：JNK-IN-8、JNK-IN-7、Tanzisertib、SP600125、Doramapimod、Berberine chloride；所述以PDGFR为靶点的小分子抑制剂包括但不限于：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil、Erdafitinib。
在一些实施方案中，所述造血干细胞培养基包括但不限于：StemSpan SFEMMedium、Iscove's Modified Dulbecco's Medium、Dulbecco's modified Eagle'smedium、Minimum Essential Medium、Roswell Park Memorial Institute，在本发明的具体实施方案中，所述造血干细胞培养基为StemSpan SFEM Medium。
在一些实施方案中，所述生长因子包括但不限于：Flt-3L、SCF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、IL-6、IL-3、IL-12，在本发明的具体实施方案中，所述生长因子为：Flt-3L、SCF、TPO、IL-3。
本发明的第三方面提供了一种用于扩增造血干细胞并维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的培养基。
进一步，所述培养基包含本发明第一方面中所述的Garcinone D。
进一步，所述培养基中还包含造血干细胞培养基、Flt-3L、SCF、TPO、IL-3、UM171、VPA、LAA、Trolox、NAC、SR1、PVA、ITS-X。
进一步，所述培养基中各组分的含量分别为：(1-30) μM Garcinone D、(5-15)ng/mL Flt-3L、(25-100) ng/mL SCF、(10-50) ng/mL TPO、(5-15) ng/mL IL-3、(10-50)nM UM171、(0.1-5) μM VPA、(10-100) µg/mL LAA、(10-100) µM Trolox、(10-100) µMNAC、(0.01-1) µM SR1、(0.1-5) % PVA、(0.1-5)× ITS-X。
进一步，所述培养基中各组分的含量分别为：15 μM Garcinone D、10 ng/mL Flt-3L、50 ng/mL SCF、30 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、35 nM UM171、1 μM VPA、50 µg/mL LAA、50 µM Trolox、50 µM NAC、0.5 µM SR1、1% PVA、1× ITS-X。
在一些实施方案中，本发明所列举的数值范围或具体数值（例如，培养基中各组分的含量范围或具体含量）仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能这一效果，这样经调整或修改后的数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。
本发明的第四方面提供了一种扩增造血干细胞并维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第三方面所述的培养基对造血干细胞进行培养。
进一步，所述方法还包括如下步骤：每隔2天进行补液，每隔3天进行换液，直至分化进行至Day9。
在本发明的具体实施方案中，所述扩增造血干细胞并维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的方法具体包括如下步骤：
(1) Day0，用适当的本发明第三方面所述的培养基重悬造血干细胞，按照一定的细胞密度将细胞进行接种；
(2) Day2，补液，补加新鲜配置的本发明第三方面所述的培养基；
(3) Day3，换液，弃去原培养液，加入新鲜配置的本发明第三方面所述的培养基；
(4) 后续重复步骤(2)和步骤(3)，每隔2天进行补液，每隔3天进行换液，直至分化进行至Day9。
进一步，步骤(1)中所述的细胞密度为(1-20)万/mL，优选为10万/mL。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面中所述的Garcinone D、本发明第二方面所述的组合物和/或本发明第三方面所述的培养基在扩增造血干细胞中的应用。
此外，本发明还提供了基于本发明第一方面中所述的Garcinone D、本发明第二方面所述的组合物、本发明第三方面所述的培养基和/或本发明第四方面所述的方法制备得到的造血干细胞在治疗血液系统疾病中的应用。
在一些实施方案中，所述血液系统疾病包括各种原因（如感染、化学性、物理性、变态反应性、肿瘤、代谢性、失血性、遗传性，以及原因不明的）导致某一种血细胞的过多或过少，而出现的相应的各种类型的疾病，包括：红细胞疾病、粒细胞与单核细胞疾病、淋巴细胞（包括浆细胞）疾病、血小板减少与出血性疾病、髓性白血病与骨髓纤维化等。
在一些实施方案中，所述血液系统疾病包括但不限于：急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、再生障碍性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、急性失血性贫血、骨髓增生异常综合症、血小板减少症、骨骼纤维化、血友病、地中海贫血、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性血小板减少性紫癜、过敏性紫癜、弥漫性血管内凝血、急性放射病。
为了促进对本发明的理解，此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释：
在本文中使用，术语“包括”或“包含”为开放式用语，故应解释成“包括但不限于”，即包括所陈述的元件或组成部分中的任意一种或多种，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在本文中使用，术语“造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）”或“HSC”，是指能够产生三种造血谱系（红系、淋巴系和髓系）的所有血细胞类型的干细胞，这些细胞类型包括髓系谱系（单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞）和淋巴系（T细胞、B细胞、NK细胞），造血干细胞是维持人类正常生命功能的重要成体干细胞之一，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。造血干细胞的干性标志物为CD34，随着骨髓移植技术的发展，造血干细胞已被广泛应用于临床治疗各种血液系统疾病，如白血病、淋巴瘤、贫血以及免疫性疾病等。在扩增培养得到的造血干细胞中，CD34+的比例越高，代表CD34+造血干细胞的数量越多，干性越强。
在一些实施方案中，所述“造血干细胞”可获自以下来源的任何一者或多者：胚胎组织、脐带血、骨髓、外周血、流通外周血、干细胞系，或者可体外获自其它细胞，比如胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPS细胞）或成体多能细胞。以上来源的细胞可在使用前采用本领域所属技术人员可接受的任何方法进行体外扩增。在一些情况下，造血干细胞可分离自任何上述来源（例如骨髓）或体外培养。如果使用的造血干细胞获自永生干细胞系，则可进一步有利于轻松获取和制备充分数量的造血干细胞。
在本文中使用，术语“CD34”，是指高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面，并随着细胞的成熟逐渐减弱至消失。已有越来越多的研究结果表明CD34分子在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用，可以参与造血干/祖细胞的运输、定植，参与炎症反应以及淋巴细胞的归巢，在造血干细胞移植治疗过程中，CD34分子作为筛选、计数造血干细胞的标志物已广泛应用于临床。在移植前外周血干细胞动员过程中，CD34分子起到维持骨髓干细胞池稳态的作用；在移植后造血干细胞植入过程中，CD34分子能够提高黏附作用过程中相关细胞因子的表达，增强CD34分子与骨髓基质细胞表面分子的聚集、结合，增强造血干细胞的定植，促进造血干细胞的植入、造血功能的恢复以及免疫功能的重建，在造血干细胞移植领域发挥着重要的作用。
在本文中使用，术语“干性”，是指干细胞维持未分化状态的一种能力。干细胞在不断的自我更新的同时，还保持了向一种或多种细胞分化的潜在能力，以及接受外加诱导进行分化的能力。干细胞的干性可以通过形态学观察，也可以通过检测细胞的干性基因（干性标志物）来检测。术语“干性基因”，又称“干性标志物”、“干性标记基因”或“干性相关基因”，是指与干细胞的状态有关的基因，这些基因的表达有利于干细胞的干性维持。在本发明的具体实施方案中，术语“干性”，是指造血干细胞维持未分化状态的一种能力，所述造血干细胞对应的“干性标记基因”为CD34，CD34的表达有利于造血干细胞的干性维持。
在本文中使用，术语“多谱系分化潜能”，是指干细胞分化为多种细胞谱系的细胞群的能力。在本发明的具体实施方案中，术语“多谱系分化潜能”，是指造血干细胞的多谱系分化潜能，即造血干细胞分化为多种细胞谱系的细胞群（包括但不限于：红细胞、白细胞、粒细胞、巨核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等几乎全谱系的血液细胞以及血小板）的能力。在本发明的具体实施方案中，通过集落形成单位实验（CFU，Colony-Forming Unit Assays）判定造血干细胞的分化潜能，正常功能的造血干细胞可以形成多种集落单位，其中包括红系集落形成单位（CFU/BFU-E）、多谱系细胞集落形成单位（CFU-GEMM）、粒细胞/巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、粒细胞集落形成单位（CFU-G）、巨噬细胞集落形成单位（CFU-M），形成的集落种类越丰富，数量越多，代表造血干细胞的多谱系分化能力越强。
在本文中使用，术语“多能干细胞”或“iPS细胞”，是指通过分化的体细胞的基因重编程获得并具有与胚胎干细胞部分相似的形态以及自我更新和多能性潜力的多能干细胞。这些细胞特别是对多能性标志物呈阳性，所述多能性标志物包括碱性磷酸酶染色和蛋白NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4的表达。获得诱导性多能干细胞的方法是本领域技术人员众所周知的，并且特别是在Yu等人（《科学》(Science),2007,318(5858):1917-1920），Takahashi等人（《细胞》(Cell),2007,131(5):861-872）和Nakagawa等人（《自然—生物技术》(NatBiotechnol),2008,26(1):101-106）的文章中有所描述。
在一些实施方案中，在制备所述“诱导多能干细胞”时，可以从市场上购得用于制备诱导多能干细胞的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至是商业化的诱导多能干细胞。人多能干细胞是指从人体细胞诱导获得的诱导多能干细胞。在本发明的具体实施方案中，实施例中所采用的人诱导多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）是按照本课题组在先申请的中国专利CN115247151A中公开描述的制备方法制备得到，在此通过引用将该专利文献全文并入本文。
在本文中使用，术语“干性维持培养基”，是指能够用于扩增干细胞并维持其干性的细胞培养基，在本发明的具体实施方案中，术语“干性维持培养基”，是指用于扩增造血干细胞并维持其干性和/或提高其多谱系分化潜能的细胞培养基，所述“干性维持培养基”中包含Garcinone D，还包含造血干细胞培养基（StemSpan SFEM Medium）、Flt-3L、SCF、TPO、IL-3、UM171、VPA、LAA、Trolox、NAC、SR1、PVA、ITS-X，上述各组分的含量分别为(1-30) μMGarcinone D、(5-15) ng/mL Flt-3L、(25-100) ng/mL SCF、(10-50) ng/mL TPO、(5-15)ng/mL IL-3、(10-50) nM UM171、(0.1-5) μM VPA、(10-100) µg/mL LAA、(10-100) µMTrolox、(10-100) µM NAC、(0.01-1) µM SR1、(0.1-5) % PVA、(0.1-5)× ITS-X，优选为：15 μM Garcinone D、10 ng/mL Flt-3L、50 ng/mL SCF、30 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、35nM UM171、1 μM VPA、50 µg/mL LAA、50 µM Trolox、50 µM NAC、0.5 µM SR1、1% PVA、1×ITS-X。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明首次发现Garcinone D能够有效维持造血干细胞干性并提高其多谱系分化潜能，解决了现有技术中存在的无法在体外长期扩增培养过程中维持造血干细胞干性的这一技术问题，申请人的这一研究成果可以实现造血干细胞的体外长期培养扩增、维持其干性并提高其多谱系分化潜能，为造血干细胞移植技术奠定了基础，可广泛应用于治疗一系列的血液系统疾病，临床应用前景广阔。
附图说明
图1为人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）向长期再生造血干细胞分化的流程图；
图2为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）传代前细胞形态图（Day-1），其中，A图：×40，B图：×100；
图3为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化前细胞形态图（Day0），其中，A图：×40，B图：×100；
图4为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化为中胚层细胞形态图（Day1），其中，A图：×40，B图：×100；
图5为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血中胚层细胞形态图（Day3），其中，A图：×40，B图：×100；
图6为人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血中胚层标志物流式检测结果图（Day3）；
图7为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血内皮细胞形态图（Day6），其中，A图：×40，B图：×100；
图8为人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血内皮细胞标志物流式检测结果图（Day6）；
图9为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血干祖细胞形态图（Day9），其中，A图：×40，B图：×100；
图10为不同放大倍数下人多能干细胞（hiPS-001-5-LHHRE）诱导分化造血干细胞形态图（Day12），其中，A图：×40，B图：×100；
图11为HSC干性维持流程及培养基配方示意图；
图12为低浓度梯度GD对HSC的干性维持流式检测结果图，其中，流式分别检测Day0、Day 6、Day 9各个实验组干性标志物CD34+的表达情况；
图13为高浓度梯度GD对HSC的干性维持流式检测结果图，其中，流式分别检测Day0、Day 4、Day 9各个实验组干性标志物CD34+的表达情况；
图14为集落形成单位实验（CFU，Colony-Forming Unit Assays）验证GD处理后的造血干细胞体外分化潜能的结果图，其中，A图：经过9天的干性维持培养后，分别对Control组和GD 15 μM处理组进行16天的集落形成实验所形成的各个谱系的集落形态图，包括CFU/BFU-E、CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-M、CFU-G，B图：Control组和GD 15 μM处理组在MethoCult®培养基中培养16天后形成不同类型集落单元的数量统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
本发明各实施例中所使用到的部分试剂信息见下表1。
表1 试剂信息
本发明实施例中所涉及到的流式细胞术（FACS）检测细胞表面标志物的表达情况、集落形成实验（Colony Forming Unit Assay，CFU）检测造血干细胞分化潜能的具体实验方法如下：
一、流式细胞术检测细胞表面标志物（以CD34为例）的表达情况
1、从培养箱中取出正在扩增的造血干细胞，计数，取目标量的细胞加入500 μL左右的DPBS进行清洗，共洗涤两次，每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30-45 s再行吸出）；
2、轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积DPBS终止消化，细胞计数后取5×104-1×106细胞；
3、配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量DPBS重悬，200 g离心5分钟，弃上清；
4、用DPBS清洗细胞2次，每次3 mL DPBS，200 g离心5分钟，弃上清；
5、孵育直标一抗：用100 µL DPBS重悬细胞后，每管加入1 test直标一抗，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合；
6、用DPBS清洗细胞3次，每次500 µL DPBS，200 g离心5分钟，弃上清；
7、每管加入200 µL DPBS重悬细胞，并经70 µm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至96孔培养板中，置于4℃避光保存，等待上机检测；
8、流式上机检测，包括如下步骤：
（1）开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑；
（2）打开流式软件，进行流式清洗工作，待机器变为Ready状态后，开始实验；
（3）通过阴性对照，设置FSC和SSC的电压，使离散的细胞群主群明确且位于象限的合适位置，圈出目标细胞群；
（4）利用阴性对照和阳性对照画门，进入下一步分析；
（5）根据抗体偶联的荧光素，选择相应的检测通道进行样品分析；
（6）检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。
二、集落形成实验检测造血干细胞的分化潜能
1、将所需要的MethoCult®培养基在2-8℃过夜或室温融化；
2、用16号钝针头的注射器将培养基分装于流式管中（3.3 mL/管）；
3、准备2个35 mm的培养皿，把35 mm的带盖培养皿和一个盛有水的35 mm无盖培养皿一起放置到100 mm的培养皿中；
4、准备CD34+细胞，细胞计数仪计数后用0.3 mL IMDM 2% FBS稀释细胞至10倍的接种终浓度。推荐细胞数为每个3.5 cm培养皿500-2000个CD34+细胞。然后把稀释后的细胞悬液按照1：10的比例加到MethoCult®培养基中；
5、将细胞转移到装有MethoCult®培养基的流式管后立刻剧烈涡悬振荡。然后静置5 min，使气泡消散；
6、将无菌的16号钝端针头接到无菌的3 mL注射器上，用注射器吸取MethoCult®培养基和细胞的混合物，每个3.5 cm培养皿中加入1.1 mL，盖好盖子。每接种一支试管的混合物，用一套新的钝端针头和注射器；
7、重复5-6中操作，将细胞接种到另外一个35 mm培养皿中；
8、轻轻倾斜并旋转培养皿，使培养液在培养皿内铺满，并分布均匀；
9、将接种好细胞的35 mm培养皿置于10 cm培养皿中，并在不盖盖子的35 mm培养皿中加入3 mL无菌水，把10 cm培养皿的盖子盖好；
10、将培养皿置于CO2培养箱中，培养14-16天；
11、经过14-16天的培养后，进行克隆计数。
实施例1 人多能干细胞诱导造血干细胞的分化过程
本实施例所述人多能干细胞诱导造血干细胞的分化过程引用本课题组已公开的中国专利CN115247151A中的分化过程，具体分化流程如下：
1.1 单层贴壁细胞形成
实验操作：Day-1
（1）取适量的TrypLE工作液，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）根据传代所需的培养基量，配制含10 μM Y-27632的TeSR-E8培养基，每毫升TeSR-E8培养基加1 μL Y-27632（10 mM）储存液。37℃水浴锅预热10分钟；
（3）从培养箱取出待传代的hiPSC-001-5-LHHRE细胞（细胞汇合度70%-80%）（细胞形态见图2A和图2B），吸弃原培养基，并用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30-45秒再行吸出）；
（4）加TrypLE工作液后（六孔板加约1 mL TrypLE工作液，T25瓶加约2 mL TrypLE工作液），使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2-5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可；
（5）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积的消化终止液终止消化；
（6）配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量含10 μM Y-27632的TeSR-E8培养基重悬，细胞计数后，调整至合适的细胞密度；
（7）取出Matrigel包被好的培养板/瓶，去除剩余包被液，用DPBS清洗一次。将混合均匀的细胞悬液按照8000个/cm2的密度，接种于包被的培养板/瓶中，标记传代日期、细胞类型和细胞代数等信息。将培养板/瓶置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养。
注意：细胞接种密度控制在8000-10000个/cm2，接种后不要晃动培养板/瓶，防止细胞聚集在培养板/皿中央。
1.2 中胚层诱导（Mesoderm Induction）
实验操作：Day0
（1）取适量的中胚层诱导培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）单层贴壁细胞形成24小时后，从培养箱取出待分化的细胞（细胞形态见图3A和图3B），吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30-45秒再行吸出）；
（3）添加中胚层诱导培养基，然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养24小时（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）。
1.3 造血中胚层特化（Hematopoietic Mesoderm Specification）
实验操作：Day1
（1）取配制适量的造血中胚层特化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）中胚层诱导24小时后，从培养箱取分化的细胞（细胞形态见图4A和图4B），吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30-45秒再行吸出）；
（3）添加造血中胚层特化培养基，然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养48小时（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）。
1.4 造血内皮特化（Hematopoietic & Endothelial Specification）及内皮-造血转换（Endothelial-to-Hematopoietic Transition）
实验操作：Day3
（1）取配制适量的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）取适量的TrypLE工作液，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（3）造血中胚层特化48 h后，从培养箱取分化的细胞（细胞形态见图5A和图5B，中胚层标志物KDR流式检测结果见图6），吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30-45秒再行吸出）；
（4）加TrypLE工作液（6孔培养板板每孔加入1 mL TrypLE工作液），使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2-5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可；
（5）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积终止消化液终止消化；
（6）配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量含10 μM Y-27632的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬，细胞计数后，调整至合适的细胞密度；
（7）取出matrigel包被好的培养板/瓶，去除剩余包被液，用DPBS清洗一次。将混合均匀的细胞悬液接种于包被的培养板/瓶中，接种密度为2×104个/cm2，标记传代日期、细胞类型和细胞代数等信息，然后置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养（6孔培养板每孔加入2mL培养液）。
实验操作：Day4
（1）取配制适量的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，更换新鲜的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）。
实验操作：Day6
（1）取配制适量的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）从培养箱取分化的细胞（细胞形态见图7A和图7B，造血内皮细胞标志物CD34/KDR双阳流式检测结果见图8），吸弃原培养液，更换新鲜的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）。
实验操作：Day8
（1）取配制适量的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，更换新鲜的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）；
（3）在Day9观测细胞形态（见图9A和图9B），造血内皮细胞迁移形成造血中心。
实验操作：Day10
（1）取配制适量的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟；
（2）从培养箱取分化的细胞，收集原培养液至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量的含5 µg/mLDoxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬；
（3）将重悬后的细胞重新接种到培养板/瓶中，然后置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养（6孔培养板每孔加入2 mL培养液）。
实验操作：Day12
从培养箱取分化的细胞（细胞形态见图10A和图10B），收集原培养液至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，将获得的造血干细胞用于后续实验或冻存。
1.5 实验结果
本实施例所述的人多能干细胞向长期再生造血干细胞分化的实验流程图如图1所示。
Day-1，人多能干细胞传代前细胞形态如图2A和图2B所示，结果显示，细胞传代前细胞汇合度约为70%-80%；细胞克隆边缘光滑，大部分细胞排列紧密、干性较好。
Day0，人多能干细胞诱导分化前细胞形态如图3A和图3B所示，结果显示，诱导分化前细胞干性较好，克隆由5-15个细胞组成，克隆之前留有一定延展的空间。
Day1，人多能干细胞诱导分化为中胚层细胞形态如图4A和图4B所示，结果显示，人多能干细胞诱导分化为中胚层细胞，中胚层细胞发生明显的收缩及隆起，具有一定的立体感。
Day3，人多能干细胞诱导分化造血中胚层细胞形态如图5A和图5B所示，结果显示，人多能干细胞诱导分化为造血中胚层细胞，诱导后细胞快速增殖，48小时汇合度达到约100%，此时诱导效果最佳，细胞呈间质样细胞形态，细胞为多边形。
Day3，人多能干细胞诱导分化造血中胚层标志物流式检测结果图如图6所示，细胞流式检测造血中胚层细胞标志物KDR表达情况，结果显示，本实施例中KDR+的比例为99.22%，原则上KDR+细胞比例在70%以上为达标。
Day6，人多能干细胞诱导分化造血内皮细胞形态如图7A和图7B所示，结果显示，Day3传代后细胞快速增殖，Day 6细胞形态发生明显的改变，由原来的间质样形态变为蝌蚪样形态，尾部呈较长丝状，细胞排列紧密，具有明显的核仁。
Day6，人多能干细胞诱导分化造血内皮细胞标志物流式检测结果图如图8所示，流式检测造血内皮细胞标志物CD34和KDR的表达情况，结果显示，本实施例中CD34/KDR双阳的比例为80%，原则上30%以上为合格水平。
Day9，人多能干细胞诱导分化造血干祖细胞形态如图9A和9B所示，结果显示，造血内皮细胞增殖迁移形成造血中心，开始出现少量非贴壁、圆形的造血干细胞。
Day12，人多能干细胞诱导分化造血干细胞形态如图10A和10B所示，结果显示，人多能干细胞细胞诱导分化为造血干细胞，形成大量非贴壁、圆形的造血干祖细胞。
实施例2 Garcinone D对造血干细胞干性维持的影响研究
2.1 GD（Garcinone D）浓度的初步探索
2.1.1 实验方法
（1）取已经配制好的适量的干性维持培养基，置于37℃水浴锅中预热10分钟；
（2）收集已经分化好的造血干细胞（实施例1制备），配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散；
（3）D0：用适当的干性维持培养基重悬细胞（干性维持流程及培养基配方见图11），按照10万/mL的密度将细胞接种于6孔板中，每孔2 mL。同时用不同浓度的GD处理细胞，进行干性维持作用研究，GD的作用浓度分别为0(Control)、1、3、5、10 µM；
（4）D2：补液，从培养箱取出细胞，每孔补加1 mL新鲜的干性维持培养基及对应浓度的GD小分子；
（5）D3：换液，从培养箱取出细胞，然后用移液器轻轻吹打几次混匀，将各个组细胞分别收集至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入2 mL新鲜配置的干性维持养基重悬，接种于6孔板中；
（6）后续重复步骤（4）和（5），每隔两天进行补液，每隔三天进行换液，直至分化进行至Day9；
（7）在Day0、Day6和Day9分别从培养箱取出各个组别的细胞，用流式检测造血干细胞干性标志物CD34的表达水平。
2.1.2 实验结果
结果如图12所示，在Day0对分化获得的造血干细胞进行了干性标志物CD34的检测，阳性率为77.74%。后续实验分为5组，分别使用浓度为0(Control)、1、3、5、10 µM的GD处理6天，发现Control组发生了明显的衰减，CD34+的比例为47%。分别添加1、3、5、10 µM的GD后，各个组CD34+的比例衰减程度有所减缓，CD34+的比例分别为38.96%、37.76%、44.64%、60.82%。GD浓度大于3 µM时，CD34+的比例具有浓度依赖性，浓度越高，CD34+的比例越高，衰减程度越低。将Control组、GD 5 µM组、GD 10 µM组继续进行干性维持至Day9进行流式检测，各个组CD34+的比例分别为28.28%、43.94%、50.16%。结果依然显示10 µM GD具有更强的干性维持作用。
2.2 GD（Garcinone D）浓度的最优探索
2.2.1 实验方法
（1）取已经配制好的适量的干性维持培养基，置于37℃水浴锅中预热10分钟；
（2）收集已经分化好的造血干细胞，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散；
（3）D0：用适当的干性维持培养基重悬细胞，按照10万/mL的密度对细胞进行悬浮培养，同时用不同浓度的GD处理细胞，根据实验2.1的结果，发现在10 µM时GD具有较强的干性维持作用，故本实验继续增加GD的浓度进行造血干细胞干性维持作用的测试，作用浓度分别为0(Control)、5、10、15、20、30 µM；
（4）D2：补液，从培养箱取出细胞，每孔补加1 mL新鲜的干性维持培养基及对应浓度的GD小分子；
（5）D3：换液，从培养箱取出细胞，然后用移液器轻轻吹打几次混匀，将各个组细胞分别收集至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入2 mL新鲜配置的干性维持养基重悬，接种于6孔板中；
（6）后续重复步骤（4）和（5），每隔两天进行补液，每隔三天进行换液，直至分化进行至Day9；
（7）在Day0、Day4和Day9分别从培养箱取出各个组别的细胞，用流式检测造血干细胞干性标志物CD34的表达水平。
2.2.2 实验结果
结果如图13所示，分化获得的HSC在Day0进行CD34+的检测，比例为90.54%，分别添加浓度为0(Control)、5、10、15、20、30 µM的GD处理4天，CD34+的比例分别为71.44%、77.40%、71.48%、86.62%、73.71%、43.23%，可见GD浓度为15 µM时对造血干细胞干性维持的效果最佳。继续培养Control组及GD分别为5 µM组、10 µM组、15 µM组至Day9，流式结果显示Control组CD34+比例为19.80%，15 µM GD组比例为58.51%。此数据表明与现在普遍使用的扩增培养基相比，添加15 µM GD后具有显著的干性维持作用。
实施例3 Garcinone D对造血干细胞分化潜能的研究
3.1 GD（Garcinone D）处理后的造血干细胞的分化潜能检测（CFU实验）
（1）将所需要的MethoCult®培养基在2-8℃的条件下过夜或室温融化，注意不可反复冻融；
（2）用16号钝针头的注射器将培养基分装于流式管中（3 mL/管）；
（3）将实验2.2分化至Day 9的Control组细胞，计数仪计数后用0.3 mL IMDM + 2%FBS稀释细胞至30倍的接种终浓度。然后把稀释后的细胞悬液按照1：10的比例加到MethoCult®培养基中；
（4）将细胞转移到装有MethoCult®培养基的流式管后立刻剧烈涡悬振荡，然后静置5 min，使气泡消散；
（5）将无菌的16号钝端针头接到无菌的3 mL注射器上，用注射器吸取MethoCult®培养基和细胞的混合物，每个3.5 cm培养皿中加入1.1 mL，最终CD34+细胞接种数为每皿2000个。盖好盖子，每接种一支试管的混合物，用一套新的钝端针头和注射器；
（6）重复步骤（3）-（5）的操作，将GD处理浓度为15 µM的细胞接种到另外一个35 mm培养皿中；
（7）轻轻倾斜并旋转培养皿，使培养液在培养皿内铺满，并分布均匀；
（8）将接种好细胞的两个35 mm培养皿置于10 cm培养皿的中间位置，在周围放置一圈弃掉盖子的35 mm培养皿，每皿加入3 mL无菌水起到防止中间皿中半固体培养基挥发的目的，把10 cm培养皿的盖子盖好；
（9）将培养皿置于CO2培养箱中，培养16天；
（10）经过16天的培养后，进行集落形态观察及计数。
本实施例中所采用的CFU实验是一种判定HSC分化潜能的实验，正常功能的HSC可以形成多种集落单位，包括红系集落形成单位（CFU/BFU-E）、多谱系细胞集落形成单位（CFU-GEMM）、粒细胞/巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、粒细胞集落形成单位（CFU-G）、巨噬细胞集落形成单位（CFU-M）。HSC的干性越强，其多谱系分化能力越强，形成的集落种类越丰富，数量越多，因此本实施例开展了上述实验用来评价不同实验组的干性和分化潜能的差异。
3.2 实验结果
结果如图14A和14B所示，结果显示，在形成集落的种类及数量方面，GD 15 µM处理组明显高于Control组，Control组CFU-E\BFU-E、CFU-GEMM、CFU-G/M/GM集落的数量依次为0、15、3，与之对应的GD 15 µM处理组的集落数量依次为2、29、9。由此可以证明与普通干性维持培养基相比，额外的添加GD能够显著提高HSC的干性和分化潜能。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.Garcinone D在维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Garcinone D的浓度为(1-30) μM。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Garcinone D的浓度为15 μM。
4.一种用于维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-3中任一项所述的Garcinone D。
5.一种用于扩增造血干细胞并维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的培养基，其特征在于，所述培养基包含权利要求1-3中任一项所述的Garcinone D。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包含造血干细胞培养基、Flt-3L、SCF、TPO、IL-3、UM171、VPA、LAA、Trolox、NAC、SR1、PVA、ITS-X。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基中各组分的含量分别为：(1-30) μM Garcinone D、(5-15) ng/mL Flt-3L、(25-100) ng/mL SCF、(10-50) ng/mL TPO、(5-15) ng/mL IL-3、(10-50) nM UM171、(0.1-5) μM VPA、(10-100) µg/mL LAA、(10-100)µM Trolox、(10-100) µM NAC、(0.01-1) µM SR1、(0.1-5) % PVA、(0.1-5)× ITS-X。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述培养基中各组分的含量分别为：15μM Garcinone D、10 ng/mL Flt-3L、50 ng/mL SCF、30 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、35 nMUM171、1 μM VPA、50 µg/mL LAA、50 µM Trolox、50 µM NAC、0.5 µM SR1、1% PVA、1× ITS-X。
9.一种扩增造血干细胞并维持造血干细胞干性和/或提高造血干细胞多谱系分化潜能的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用权利要求5-8中任一项所述的培养基对造血干细胞进行培养。
10.权利要求1-3中任一项所述的Garcinone D、权利要求4所述的组合物和/或权利要求5-8中任一项所述的培养基在扩增造血干细胞中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444064A (zh) * 2021-06-09 2021-09-28 浙江工业大学 一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用
CN115044555A (zh) * 2022-06-10 2022-09-13 山西医科大学 一种人脐血造血干细胞体外扩增和维持干性用培养基
US20220362341A1 (en) * 2021-05-17 2022-11-17 Therapeutic Solutions International, Inc. Treatment of major depressive disorder by low dose interleukin-2
CN116426472A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用
CN116445408A (zh) * 2023-05-22 2023-07-18 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220362341A1 (en) * 2021-05-17 2022-11-17 Therapeutic Solutions International, Inc. Treatment of major depressive disorder by low dose interleukin-2
CN113444064A (zh) * 2021-06-09 2021-09-28 浙江工业大学 一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用
CN115044555A (zh) * 2022-06-10 2022-09-13 山西医科大学 一种人脐血造血干细胞体外扩增和维持干性用培养基
CN116445408A (zh) * 2023-05-22 2023-07-18 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用
CN116426472A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOZAKOWSKA, M 等: "Role of Heme Oxygenase-1 in Postnatal Differentiation of Stem Cells: A Possible Cross-Talk with MicroRNAs", ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING, vol. 20, no. 11, pages 2 - 4 *
XIAOHONG YANG等: "Garcinone D, a natural xanthone promotes C17.2 neural stem cell proliferation: Possible involvement of STAT3/Cyclin D1 pathway and Nrf2/HO-1 pathway", NEUROSCIENCE LETTERS, vol. 626, pages 2 - 3 *
李强等: "山竹主要化学成分及药理作用研究进展", 国际药学研究杂志, vol. 44, no. 08, pages 759 - 764 *
田丽娜: "基因转染饲养细胞对造血干/祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 2012, pages 2 *

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