CN116445408B

CN116445408B - LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用

Info

Publication number: CN116445408B
Application number: CN202310574435.6A
Authority: CN
Inventors: 张博洋; 杜如龙; 武雪宁; 张成志; 于蕾; 黄雯静; 顾雨春; 吴理达
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2023-05-22
Filing date: 2023-05-22
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-05-22
Also published as: CN116445408A

Abstract

本发明公开了LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用，本发明首次发现LSD1抑制剂能够促进iPSC向HSC分化和HSC的干性维持，不仅能够提升关键蛋白EPCR的表达，而且能够促进CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期再生造血干细胞的获得，能够实现多种来源HSC的干性维持，为实现HSC的功能延续及更好的移植效果奠定了基础。

Description

LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用。

背景技术

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）是一类具有自我更新和多潜能分化能力的成体干细胞，能够通过细胞分裂产生子代造血干细胞，同时也能分化为所有功能性成熟血细胞。因此，HSC在体内维持着正常的造血过程，同时也在许多造血系统相关疾病的治疗中发挥着重要的作用。造血干细胞移植及基于造血干细胞基因编辑的基因治疗已经成为目前治疗白血病、淋巴瘤等相关血液疾病最为有效的临床治疗方案。通过造血干细胞移植重建整个造血系统，并长期维持造血能力，为造血干细胞移植重建患者提供了新的生机和希望。目前，在体外扩增HSC是一项重要的研究领域，因为其可以为造血干细胞移植提供更多的来源，并有望用于治疗多种血液疾病。

然而，造血干细胞在成人骨髓中的含量仅约为0.01%，细胞移植所用的造血干细胞主要从机体中分离获取，但由于其含量极少，且体外无法长期扩增培养等缺点，严重制约了造血干细胞的临床研究和应用。因此，开发新的方法以获得足够数量和纯度的HSC已经成为当前研究的热点和挑战。此外，造血干细胞在体外扩增时难以维持其干性，即它们倾向于失去其自我更新和分化能力，导致扩增后的细胞无法有效地进行移植和治疗。这可能是因为在体外培养中缺乏正确的信号和细胞间相互作用，或者由于HSC的表观遗传学状态的改变，导致它们的基因表达模式发生变化。最典型的标志是CD34、CD90、EPCR和ITGA3等干性标志物表达的降低。

近年来，由诱导性多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）分化为HSC成为了一种新的来源。通过iPSC分化获得大量的HSC，可以有效地解决上述瓶颈，为造血干细胞移植重建提供了新的途径。然而，与机体来源的HSC相比，iPSC分化得到的HSC存在着异质性较强等缺点。特别是，长期造血干细胞（LT-HSC）比例较低是目前急待优化和解决的难点之一。因此，需要进一步优化iPSC分化为HSC的过程和条件，以提高iPSC分化得到的HSC的质量和数量，获得干性和功能性更强的HSC，为临床应用打下更坚实的基础。此外，如何维持HSCs的干性仍需进一步的研究，以为将来的临床应用提供可靠的来源。目前，尚未见将LSD1抑制剂应用于促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持的相关研究或报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的是提供LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化中的应用。

进一步，所述LSD1抑制剂包括：OG-L002、SP2509、GSK-LSD1 2HCl、Pulrodemstat(CC-90011) besylate、Iadademstat (ORY-1001) 2HCl、Seclidemstat (SP-2577)、GSK2879552 2HCl、T-3775440 HCl、降低LSD1表达的shRNA和/或降低LSD1表达的siRNA。

进一步，所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509。

进一步，所述OG-L002的使用浓度为0.1-20 μM，所述SP2509的使用浓度为0.1-5 μM。

进一步，所述HSC为长期造血干细胞，所述长期造血干细胞为CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期造血干细胞。

在一些实施方案中，本发明通过在iPSC向HSC分化过程的Day6或Day9分别添加LSD1抑制剂，提高了关键蛋白EPCR的表达，并且促进了CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期再生造血干细胞的获得。

在一些实施方案中，所述LSD1是指组蛋白去甲基化酶1，是首个被发现的组蛋白特异性去甲基化酶。LSD1催化黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），属于单胺氧化酶家族。从结构来看，LSD1包括N端的SWIRM结构域，C端的AOL（胺基氧化酶）结构域和中心定位的Tower结构域。现有的研究证实，LSD1与肿瘤的发生和发展密切相关。

在一些实施方案中，所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509，所述OG-L002、SP2509均购自于Selleck，其货号分别为：S7237、S7680。所述OG-L002的使用浓度为0.1-20μM时、所述SP2509的使用浓度为0.1-5 μM时，均能够显著促进iPSC向HSC分化，不仅提高了EPCR的表达，而且促进了CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期再生造血干细胞的获得。

在一些实施方案中，所述LSD1抑制剂并不局限于本发明所列举的具体试剂，任何可抑制LSD1的试剂、任何可通过基因编辑技术实现LSD1的敲低和表达干预的试剂均在本发明的保护范围内。

本发明的第二方面提供了LSD1抑制剂在HSC干性维持中的应用。

进一步，所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509。

进一步，所述OG-L002的使用浓度为2-10 μM，所述SP2509的使用浓度为0.5-5 μM。

进一步，所述HSC包括iPSC来源HSC或脐血来源HSC。

进一步，所述LSD1抑制剂能够维持HSC干性相关基因CD34、CD90、EPCR、ITGA3的表达，提高EPCR的表达水平。

在一些实施方案中，本发明通过在iPSC来源和脐血来源的HSC的体外干性维持和扩增培养基中添加LSD1，实现了iPSC来源和脐血来源的HSC的干性维持，保持其干性至一周以上（干性相关基因CD34、CD90、EPCR、ITGA3的表达可达一周以上），并提高了EPCR等关键基因的表达水平，为最终实现造血干细胞的功能延续及更好的移植效果奠定了基础。

在一些实施方案中，所述HSC并不局限于iPSC来源的HSC或脐血来源的HSC，任何来源的HSC均在本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，所述干性维持主要体现在高增殖、低分化、自我更新、具备迁移能力及干性相关基因（例如CD34、CD90、EPCR和ITGA3）的表达，其中，最典型的标志主要体现在干性相关基因（例如CD34、CD90、EPCR和ITGA3）的表达。

本发明的第三方面提供了一种促进iPSC向HSC分化的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1) Day-1，iPSC单层贴壁细胞形成；

(2) Day0，中内胚层诱导，采用中胚层诱导培养基培养步骤(1)得到的iPSC；

(3) Day1-2，造血中胚层特化，采用造血中胚层特化培养基培养步骤(2)得到的细胞；

(4) Day3-Day12，生血内皮特化及内皮-造血细胞转化，采用生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基培养步骤(3)得到的细胞，加入LSD1抑制剂，Day12，收集HSC细胞。

进一步，步骤(2)中所述中胚层诱导培养基包含：STEMdiff™ APEL™2 Medium、Penicillin-Streptomycin、CHIR99021。

进一步，所述中胚层诱导培养基中各组分的含量为：1% Penicillin-Streptomycin、9 μM CHIR99021。

进一步，步骤(3)中所述造血中胚层特化培养基包含：STEMdiff™ APEL™2Medium、Penicillin-Streptomycin、VEGF、bFGF。

进一步，所述造血中胚层特化培养基中各组分的含量为：1% Penicillin-Streptomycin、20 ng/mL VEGF、20 ng/mL bFGF。

进一步，步骤(4)中所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基包含：STEMdiff™ APEL™2 Medium、Penicillin-Streptomycin、VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L、BMP4。

进一步，所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基中各组分的含量为：1%Penicillin-Streptomycin、20 ng/mL VEGF、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt-3L、10 ng/mL BMP4。

进一步，所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基还含有Y-27632。

进一步，所述Y-27632的浓度为10 μM。

进一步，步骤(4)中所述LSD1抑制剂的加入时间为Day6或Day9。

进一步，步骤(4)中所述LSD1抑制剂从Day6开始每天添加至Day12或从Day9开始每天添加至Day12。

进一步，步骤(4)中所述LSD1抑制剂包括：OG-L002、SP2509、GSK-LSD1 2HCl、Pulrodemstat (CC-90011) besylate、Iadademstat (ORY-1001) 2HCl、Seclidemstat(SP-2577)、GSK2879552 2HCl、T-3775440 HCl、降低LSD1表达的shRNA和/或降低LSD1表达的siRNA。

进一步，所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509。

本发明的第四方面提供了一种HSC干性维持的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：在HSC干性维持与扩增培养基中培养HSC，并加入LSD1抑制剂。

进一步，所述HSC干性维持与扩增培养基包含：StemSpan™ SFEM Medium、Flt3L、SCF、TPO、IL-3、UM171、VPA、LAA、Trolox、NAC、SR1、PVA、ITS-X。

进一步，所述HSC干性维持与扩增培养基中各组分的含量为：50 ng/mL Flt3L、50ng/ mL SCF、50 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、35 nM UM171、1 μM VPA、50 μg/mL LAA、50 μMTrolox、50 μM NAC、0.5 μM SR1、1% PVA、1% ITS-X。

进一步，所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509。

进一步，所述HSC包括iPSC来源HSC或脐血来源HSC。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了促进对本发明的理解，此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释：

在本文中使用，术语“或”，是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。

在本文中使用，术语“和/或”，是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。

在本文中使用，术语“造血干细胞（HSC）”，是指具有自我更新和分化成含有不同谱系细胞的成熟血细胞的能力的未成熟的血细胞，所述谱系细胞包括但不限于粒细胞（例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）、红细胞（例如，网织红细胞、红细胞）、凝血细胞（例如，原巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板）、单核细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞）、树突状细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞（例如，NK细胞、B细胞和T细胞）。另外，HSC还指长期再生造血干细胞（LT-HSC）和短期再生造血干细胞HSC（ST-HSC）。基于功能潜力和细胞表面标志物表达，LT-HSC和ST-HSC是分化的，LT-HSC具有更强大的自我更新潜力（即，它们在整个成年期存活，并且可以通过连续接受者连续移植），而ST-HSC具有有限的自我更新能力（即，它们仅在有限的时间段内存活，并且不具备连续移植潜力）。在本发明关于“LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化中的应用”的具体实施方案中，所述HSC优选为LT-HSC。

在本文中使用，术语“诱导多能干细胞（iPSC）”，是指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4；Sox基因家族的某些成员（例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15）；Klf家族的某些成员（例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5）、Myc家族的某些成员（例如C-myc、L-myc和N-myc）、Nanog、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。目前已经可以从市场上购得用于制备iPSC的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的iPSC。hiPSC是指从人体细胞诱导获得的iPSC。在本发明的具体实施方案中，实施例中所采用的hiPSC是按照中国专利公开CN113462638A中描述的方法制备，在此通过引用将该专利文献全文并入本文。

在本文中使用，术语“中内胚层诱导（Mesoderm Induction）”，是指将iPSC在中胚层诱导培养基中培养产生具有中胚层细胞标志物的中胚层细胞的过程。本领域已知从iPSC产生中胚层细胞的方法，例如已经有商业化的中胚层诱导培养基，例如STEMdiff™中胚层诱导培养基；另外，中国专利公开CN111321110A描述了从iPSC诱导产生中胚层细胞的方法，中国专利公开CN106867961A描述了用于从iPSC诱导产生中胚层细胞的培养基和方法。

在本文中使用，术语“造血中胚层特化（Hematopoietic MesodermSpecification）”，是指将中胚层细胞诱导分化为“造血中胚层细胞”的过程。“造血中胚层细胞”可以认为是造血内皮细胞的前体细胞。

在本文中使用，术语“生血内皮特化（Hematopoietic&EndothelialSpecification）”是指将造血中胚层细胞诱导分化为“造血内皮细胞（hemogenicendothelium cell）”的过程。

在本文中使用，术语“内皮-造血细胞转化（Endothelial-to-HematopoieticTransition）”是指造血内皮细胞向造血干细胞或造血祖细胞转化的过程。该过程最终可产生具有治疗应用的造血干细胞，包括长期再生造血干细胞（LT-HSC）。可通过细胞标志物如CD34、CD45、CD90、CD45RA、EPCR或ITGA3等来分离或鉴定造血干细胞或造血祖细胞。在一些实施方案中，本发明通过标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3来鉴定长期再生造血干细胞，在具体的实施方案中，本发明通过CD34+EPCR+CD90+ITGA3+表征长期再生造血干细胞。其中，EPCR可通过蛋白酶活化受体(PAR)1信号通路等途径，参与HSC及其微环境的调节，介导HSC在骨髓中的保留和造血功能重建，其在HSC的功能实现过程中发挥了重要的作用，是一个极其关键的蛋白。如何在HSC体外扩增时维持和上调EPCR的表达，也具有重要的现实意义。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明首次创造性地发现在iPSC向HSC分化的过程中添加LSD1抑制剂不仅能够提升关键蛋白EPCR的表达，而且能够促进CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期再生造血干细胞的获得。此外，本发明首次发现LSD1抑制剂在iPSC来源和脐血来源的HSC的干性维持中起到了重要的调控作用，干性维持天数可达一周以上，提高了EPCR等相关干性标志物的表达，使HSC具有更好的功能性和移植潜力，为实现HSC的功能延续及更好的移植效果奠定了基础。

附图说明

图1为iPSC向HSC分化的实验流程图；

图2为iPSC向HSC分化Day3细胞形态图；

图3为iPSC向HSC分化Day6细胞形态图；

图4为iPSC向HSC分化Day12细胞形态图；

图5为iPSC向HSC分化Day3流式结果图；

图6为iPSC向HSC分化Day6流式结果图；

图7为四阳细胞圈门策略，首先根据CD34和EPCR的表达情况圈出CD34+/EPCR+双阳细胞，在双阳细胞中统计CD90和ITGA3的阳性比例，最终获得右上象限的四阳细胞比例；

图8为iPSC向HSC分化Day12流式结果图；

图9为HSC Day0干性标志物流式结果图；

图10为Day0时不同药物处理对HSC细胞形态（Day3）的影响结果图；

图11为Day3 HSC干性标志物（CD34/CD90）流式结果图；

图12为Day3 HSC干性标志物（CD34/EPCR/CD90/ITGA3）流式结果图；

图13为Day0不同药物处理对Day5 HSC细胞增殖及细胞形态的影响结果图；

图14为Day6 HSC干性标志物（CD34/CD90）流式结果图；

图15为Day6 HSC干性标志物（CD34/EPCR/CD90/ITGA3）流式结果图；

图16为Day0不同药物处理对Day9时细胞增殖及细胞形态的影响结果图；

图17为Day9 HSC干性标志物（CD34/CD90）流式结果图；

图18为Day9 HSC干性标志物（CD34/EPCR/CD90/ITGA3）流式结果图；

图19为HSC干性维持流式结果统计图；

图20为对照组HSC Day0到Day3干性标志物变化结果图；

图21为不同处理时间窗口对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day3检测）的影响结果图；

图22为不同浓度OG对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day3检测）的影响结果图；

图23为不同浓度SP对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day3检测）的影响结果图；

图24为OG不同处理时间窗口对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day6检测）的影响结果图；

图25为OG+SP联合处理不同处理时间窗口对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day6检测）的影响结果图；

图26为不同浓度OG对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day6检测）的影响结果图；

图27为不同浓度SP对HSC干性标志物（CD34/EPCR）表达（Day6检测）的影响结果图；

图28为流式检测脐血来源CD34+细胞中干性标志物表达水平结果图；

图29为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day3和Day4细胞形态图；

图30为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day3时的干性标志物（CD34/CD90）表达水平结果图；

图31为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day3时的干性标志物（CD34/EPCR）表达水平结果图；

图32为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day3 CD34/EPCR双阳细胞中CD90和ITGA3的表达结果图；

图33为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day6和Day7细胞形态图；

图34为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day6时的干性标志物（CD34/CD90）表达水平结果图；

图35为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day6时的干性标志物（CD34/EPCR）表达水平结果图；

图36为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day8和Day9细胞形态图；

图37为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day9时的干性标志物（CD34/CD90）表达水平结果图；

图38为脐血来源HSC体外干性维持及扩增Day9时的干性标志物（CD34/EPCR）表达水平结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 iPSC向HSC分化流程

1、实验材料

实施例中所使用到的实验材料见下表1。

表1 实验材料

2、实验方法

iPSC向HSC分化的实验流程如图1所示，具体实验方法如下：

（1）单层贴壁细胞形成（Day-1）

① 配制TrypLE工作液：吸取5 mL DPBS至新的15 mL离心管中，再加入5 mLTrypLE原液，混匀后即为TrypLE工作液。

② 根据传代所需的培养基量，配制含1% PS（Penicillin-Streptomycin）、10 μMY-27632（ROCKi）的E8完全培养基，每毫升培养基加1 μL Y-27632（10 mM）储存液。

③ 从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶（含hiPSC，所述hiPSC为发明人制备的诱导多能干细胞hiPS-001-5，制备方法参见CN113462638A），吸弃上清，用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1 min（洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30-45 sec再行吸出）。

④ 加TrypLE工作液后（六孔板加约1 mL TrypLE工作液，T25瓶加约2 mL TrypLE工作液），置于培养箱孵育2-5 min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。

⑤ 轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入DMEM/F12终止消化。吸取适量的细胞悬液计数。

⑥ 配平后离心，200 g，5 min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，按照不同的细胞密度，加入含10 μM Y-27632的E8完全培养基重悬。细胞充分混匀后，将细胞悬液滴至培养板孔中，接种细胞密度为8000 cells/cm2，置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养。

⑦ 培养24 h后，使用DPBS清洗两次后进行后续的诱导分化。

（2）hiPSCs诱导HSC分化—中内胚层诱导（Mesoderm Induction）（Day0）

① 配置适量的中胚层诱导培养基：STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1%Penicillin-Streptomycin + 9 μM CHIR99021，37℃水浴锅预热。

② 吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞。

③ 添加中胚层诱导培养基（STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1% Penicillin-Streptomycin + 9 μM CHIR99021），然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养24 h。记为Day0。

（3）hiPSCs诱导HSC分化—造血中胚层特化（Hematopoietic MesodermSpecification）（Day1-2）

① 配置适量的造血中胚层特化培养基：STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1%Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20 ng/mL bFGF，37℃水浴锅预热。

② 吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞。

③ 添加造血中胚层特化培养基（STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1%Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20 ng/mL bFGF），然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养48 h。记为Day1。

（4）hiPSCs诱导HSC分化—生血内皮特化（Hematopoietic&EndothelialSpecification）及内皮-造血细胞转化（Endothelial-to-Hematopoietic Transition）（Day3-Day12）

① 配置适量的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基：STEMdiff™ APEL™2Medium + 1% Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20 ng/mL bFGF + 20 ng/mL SCF + 10 ng/mL IL-3 + 30 ng/mL TPO + 10 ng/mL Flt-3L + 10 ng/mL BMP4，37℃水浴锅预热。

② 造血中胚层特化48 h后，吸弃原培养液；加入适量的DPBS清洗细胞，TrypLE工作液消化细胞至单细胞，终止细胞消化，200 g，5 min离心后，用生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬细胞，并加入10 μM Y-27632，按照20000 cells/cm2接种细胞；然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养（低氧诱导处理组为5% CO2，5% O2培养箱）。记为Day3。

③ 此后，每2天更换一次新鲜的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基（STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1% Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20ng/mL bFGF + 20 ng/mL SCF + 10 ng/mL IL-3 + 30 ng/mL TPO + 10 ng/mL Flt-L +10 ng/mL BMP4）。

④ 在Day6或Day9加入LSD1的小分子抑制剂10 μM OG-L002（OG）或2 μM SP2509（SP）。

实验分组如下：对照组（不添加LSD1抑制剂）、OG D6-12组（从Day6开始每天添加OG-L002至Day12，持续添加7天）、SP D6-12组（从Day6开始每天添加SP2509至Day12，持续添加7天）、OG D9-12组（从Day9开始每天添加OG-L002至Day12，持续添加4天）、SP D9-12组（从Day9开始每天添加SP2509至Day12，持续添加4天）。

⑤ 一直到Day12，收集产生的悬浮HSC细胞。

3、实验结果

iPSC向HSC分化Day3细胞形态如图2所示，普通光学显微镜观察，人多能干细胞（hiPS-001-5）细胞诱导分化为造血中胚层细胞形态图，经过造血中胚层诱导后细胞快速增殖，细胞呈间质样细胞形态，细胞为多边形，排列相对疏松。

iPSC向HSC分化Day6细胞形态如图3所示，普通光学显微镜观察，人多能干细胞（hiPS-001-5）细胞诱导分化为造血内皮细胞形态图，细胞快速增殖，生成较多的造血内皮细胞，细胞排列紧密，呈短梭形，具有明显的核仁。

iPSC向HSC分化Day12细胞形态如图4所示，普通光学显微镜观察，人多能干细胞（hiPS-001-5）细胞诱导分化造血干细胞，形成大量非贴壁、圆形的造血干祖细胞。

实施例2 流式细胞术检测长期再生造血干细胞（LT-HSC）的marker基因（CD34、EPCR、CD90、ITGA3）表达

1、实验材料

实施例中所使用到的实验材料见下表2。

表2 实验材料

2、实验方法

流式细胞技术（FACS）检测细胞表面标志物，具体实验方法如下：

（1）FACS检测所需试剂和抗体

① 清洗试剂：Buffer A（PBS+4% FBS）

② 直标一抗：FITC anti-human CD34，PE anti-human EPCR，PerCP/Cyanine5.5anti-human CD90，APC anti-human ITGA3

（2）待测样品的准备

① 确定待测细胞，吸出旧培养基，用PBS清洗一次，加预热的TrypLE消化液，37℃消化3分钟，用移液枪将细胞吹散后，转移至含有10% FBS的分化培养基的15 mL离心管中，终止TrypLE的消化，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

② 用Buffer A清洗细胞2次，每次3 mL Buffer B，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

③ 孵育直标一抗：用Buffer A稀释抗体后每管加入100 µL，重悬细胞，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。

④ 用Buffer A清洗细胞3次，每次3 mL Buffer A，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

⑤ 每管加入200 µL DPB重悬细胞，并经70 µm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至流式管中，置于4℃避光保存，等待上机检测。

（3）流式上机检测

① 开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑。

② 设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。

③ 待机器变为Ready状态后，清洗机器。

④ 首先通过同型对照样品，设置FSC和SSC的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置Gate，进入下一步分析。

⑤ 根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。

检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。

3、实验结果

iPSC向HSC分化Day3的流式结果如图5所示，Day3的流式结果显示，KDR的阳性细胞比例达到98.41%，证实成功分化得到造血中胚层细胞。

iPSC向HSC分化Day6的流式结果如图6所示，Day6的流式结果显示，KDR和CD34双阳细胞的比例为63.14%，结合图3的细胞形态，证实成功分化得到造血内皮细胞。

四阳细胞圈门策略如图7所示，首先根据CD34和EPCR的表达情况圈出CD34+/EPCR+双阳细胞，在双阳细胞中统计CD90和ITGA3的阳性比例，最终获得右上象限的四阳细胞比例。

iPSC向HSC分化Day12的流式结果如图8所示，Day12的流式结果显示，对照组（与LSD1抑制剂组相比，不添加LSD1抑制剂）的EPCR阳性比例只有2.22%，CD34和EPCR的双阳比例只有2.04%。而在Day6和Day9添加LSD1的抑制剂可以大幅提升EPCR的表达，特别是OG。其中在Day6或Day9添加OG，EPCR的阳性比例提升至75%左右，CD34和EPCR的双阳比例提升至70%左右，是对照组的35倍。在Day6或Day9添加SP，也可以提升EPCR阳性比例2倍以上。

在四阳细胞（LT-HSC）的比例上，对照组仅有0.66%，而在Day6或Day9添加OG，四阳细胞（LT-HSC）的比例分别为33.4%和14.73%，分别是对照组的50倍和22倍。在Day6或Day9添加SP，四阳细胞（LT-HSC）的比例分别为4.43%和2.06%，分别是对照组的6.7倍和3.1倍。

四阳细胞比例及绝对细胞数统计结果见下表3，结果显示，相对于对照组，OG和SP的所有处理组都可以显著提高长期再生造血干细胞（LT-HSC）的数量，对照组产生的细胞数为4488个，在Day6或Day9添加OG，四阳细胞（LT-HSC）数分别为13360和66874，分别是对照组的3倍和15倍。在Day6或Day9添加SP，四阳细胞（LT-HSC）数分别为7442和10506，分别是对照组的1.65倍和2.34倍。综上可知，Day9引入OG的效果最佳。此外，本发明分别采用5 μM OG和1 μM SP进行了重复实验（除OG和SP的用量不同外，其他实验条件完全相同），所得实验结果类似。

以上实验结果表明，在iPSC向HSC分化过程的Day6或Day9分别添加LSD1的小分子抑制剂，在提升关键的蛋白EPCR表达的同时，显著促进了CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期再生造血干细胞的获得。

表3 四阳细胞比例及绝对细胞数统计结果

实施例3 iPSC来源的HSC的干性维持效果验证

1、实验材料

实施例中所使用到的实验材料见下表4。

表4 实验材料

2、细胞培养—HSC的体外扩增及LSD1抑制剂处理

iPSC来源的HSC（HSC采用发明人在先专利CN115247151B中的制备方法制备得到）以50W/孔的数量接种至6孔板中进行干性维持，培养基为“HSC干性维持与扩增培养基”，即StemSpan™ SFEM Medium + 50 ng/mL Flt3L+ 50 ng/ mL SCF+ 50 ng/mL TPO + 10 ng/mL IL-3 + 35 nM UM171 + 1 μM VPA + 50 μg/mL LAA + 50 μM Trolox + 50 μM NAC +0.5 μM SR1 + 1% PVA + 1% ITS-X。

干性维持组加入不同浓度的OG-L002和/或SP2509，处理9天，每2天更换一次培养基（对于悬浮培养的HSC细胞，用移液枪将细胞转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清，用3 mL HSC干性维持与扩增培养基重悬，转移至6孔板中培养）。与干性维持组相比，对照组（CK组）不添加OG-L002和/或SP2509。分别在Day0，Day3，Day6和Day9对四个干性标志物进行流式检测。

3、流式检测方法—检测CD34、CD90、EPCR和ITGA3四个干性标志物

（1）FACS检测所需试剂和抗体

① 清洗试剂：Buffer A（PBS+4% FBS）

（2）待测样品的准备

① 对于悬浮培养的HSC细胞，用移液枪将细胞转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

② 用Buffer A清洗细胞2次，每次3 mL，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

④ 用Buffer A清洗细胞3次，每次3 mL，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

（3）流式上机检测

① 开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑。

② 设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。

③ 待机器变为Ready状态后，清洗机器。

⑤ 根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。

4、实验结果

HSC的四个主要的干性标志物为CD34、CD90、EPCR和ITGA3，用CD34/CD90的双阳比例，CD34/EPCR的双阳比例，以及四阳细胞比例可以评价HSC的干性。对iPSC分化得到HSC的当天（记为Day0）对其干性标志物进行流式的检测，结果如图9所示，在Day0时，HSC中CD34的阳性比例为93.52%，CD90的阳性比例为97.57%，CD34和CD90双阳的比例达到了较高的91.51%；EPCR的阳性比例约为17%，CD34和EPCR双阳细胞比例为15.39%，在CD34和EPCR双阳细胞中，CD90和ITGA3的双阳比例为10.41%，因此CD34、CD90、EPCR和ITGA3四阳的比例约为1.5%。

在Day0时加入OG-L002（OG）和SP2509（SP）两种LSD1抑制剂，分别设置高低剂量和联合用药组，其中，OG对应的高剂量组和低剂量组分别为10 μM OG、5 μM OG；SP对应的高剂量组和低剂量组分别为2 μM SP、1 μM SP；联合用药组为5 μM OG + 1 μM SP。在Day3、Day6和Day9每隔3天进行流式检测，判断两种小分子的干性维持效果。

Day3时，各组间的HSC细胞形态和数量上没有显著的差异（见图10），说明LSD1抑制剂处理3天不影响细胞的增殖。

Day3时，CK组的双阳细胞由91.51%骤减至20.82%，干性丢失较为明显，CD34单阳约为65%；OG组双阳细胞能够维持在65%，剂量组间没有明显差异，CD34单阳能够维持在85%左右，高剂量组低于低剂量组；SP组双阳比例与CK组没有显著差异，高剂量组24.17%略高于对照；但SP组CD34的单阳比例分别为72.9%和74%，高于CK组；联合用药组效果最好，双阳细胞为68.2%，CD34单阳87%（见图11）。

Day3时，CK组的CD34/EPCR双阳细胞为14.88%，EPCR单阳为16.5%（Day0分别为15.39%和16%，基本没有变化）；OG处理将CD34/EPCR双阳细胞提高至75%，EPCR单阳提高至80%左右，OG有助于EPCR的表达；高剂量组EPCR略高于低剂量组，但CD34略低于低剂量组；SP组双阳比例分别为低剂量22.5%，高剂量25.5%，均高于对照组；联合用药组双阳细胞提高至80.95%；四阳细胞比例，CK组为9.88%，处理组均高于对照，其中OG高剂量组21.47%，SP低剂量组接近20%，其它组别上调幅度较小（见图12）；整体而言，图12的结果显示，OG对于EPCR和CD90都有明显的促进作用，联合用药组优于单一药物组。

Day5时，可以观察到OG处理能够显著促进HSC的增殖，而SP处理与对照组没有显著的差异（见图13）。

Day6时，CK组的双阳细胞为17.12%，CD34单阳约为47%，CD90单阳约为22.7%；OG组双阳细胞较Day3有骤减，5 μM组约28%，10 μM组约26%；CD34单阳比例约为42%和40%，低于CK；CD90单阳比例约为40%和35%，高于CK；SP组双阳比例较Day3略有升高，1 μM组约27.5%，2μM组约31%；CD34单阳比例均约为63%，高于CK；CD90单阳比例约为33%和39%，高于CK；联合用药组效果最好，双阳细胞为33.88%，CD34单阳55%，CD90单阳40.6%（见图14）。

Day6时，CK组的CD34/EPCR双阳细胞为21.54%；OG处理组双阳细胞大幅下降，较Day3天＞75%降至约34%；SP组较Day3 25%左右升至了40%左右；联合处理组双阳比例为49.52%；EPCR单阳方面，CK组约为30%，OG 5 μM组约47%，10 μM组约50.5%；SP 1 μM组约50%，2 μM组约54%；联合处理组为68%，呈现较好的促进EPCR表达的作用；四阳细胞比例，CK组为13.45%，与OG处理组没有太大的差异，SP组和联合用药组均高于对照，其中SP 1 μM组26.36%，2 μM组34.13%，联合用药组为23%（见图15）；整体而言，Day6时，SP组慢慢展现维持效果，OG的作用慢慢减退。

Day9时，OG处理9天时，能够显著促进HSC的增殖；此外，1 μM SP处理9天时也可以促进HSC的增殖，而2 μM SP处理9天与对照组没有显著的差异（见图16）。

Day9时，CK组的双阳细胞下降至14.28%，CD34单阳仅剩34%，CD90单阳仅剩22.5%；OG组在Day9已经失去了维持干性的效果，双阳和CD34单阳比例均低于对照；SP组双阳比例为25-30%，高于对照组，相较于Day6略有下降；联合用药组效果介于OG组和SP组之间（见图17）。

Day9时，CD34/EPCR的趋势与CD34/CD90的趋势非常一致。由于SP处理9天会造成细胞凋亡，导致阳性信号的二象限漂移，双阳比例实际应低于检测值（见图18），综合来看Day0时用LSD1抑制剂处理HSC在Day9时很难再获得干性很高的HSC，因此，后续将干性维持实验设计为1周。

不同天数的流式检测统计结果如图19所示，整体而言，LSD1抑制剂OG和SP均可以实现HSC体外培养扩增过程中的干性维持，将HSC的主要干性标志物（CD34 CD90 EPCR和ITGA3）的较高表达维持至一周以上。在Day3时，5 μM和10 μM OG处理组的CD34/CD90双阳比例，CD34/EPCR双阳比例均远高于其他组别；在Day6时，OG处理组与SP处理组的CD34/CD90双阳比例，CD34/EPCR双阳比例均远高于对照组；在Day9时，SP处理组的CD34/CD90双阳比例，CD34/EPCR双阳比例要高于对照组，而OG处理组与对照组没有显著差异（见图19）。

实施例4 iPSC来源的HSC干性维持的时间窗口和处理浓度条件优化

1、细胞培养—HSC的体外扩增及LSD1抑制剂处理

除处理浓度和处理时间不同外，其他方法同实施例2中所述的实验方法。

处理浓度梯度：OG和SP的梯度均为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μM；

处理时间窗口（即添加LSD1抑制剂的时间）：Day0-1、Day0-2、Day0-3、Day0-4、Day0-5、Day0-6（Day0-6体现在浓度梯度的流式结果中，时间窗口的结果中展示Day0-1、Day0-2、Day0-3、Day0-4、Day0-5），其中，Day0-1是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加2天；Day0-2是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加3天；Day0-3是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加4天；Day0-4是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加5天；Day0-5是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加6天；Day0-6是指从第0天开始添加LSD1抑制剂，连续添加7天。

2、实验结果

基于前述研究结果，本实施例又对OG和SP的处理条件进行了更细化的研究，从处理浓度和处理时间窗口两个方向进行优化。如图20所示，Day3时CK组的CD34/CD90双阳比例由92.37%锐减至40.63%，EPCR/CD34双阳比例由53.95%下降至45.42%。根据Day3的流式结果（见图21）可知，添加OG或OG+SP处理能将EPCR/CD34的双阳比例维持在80%以上，从处理时间窗口来看，Day0-1、Day0-2、Day0-3添加OG或OG+SP的EPCR/CD34双阳比例依次升高，说明持续添加LSD1抑制剂（OG或OG+SP）效果更好。

如图22所示，OG在2-10 μM之间效果最好，可以将双阳比例维持在84%以上；如图23所示，SP在2 μM效果最好，可以维持在49.34%。当SP浓度高于5 μM时，会抑制细胞的增殖甚至造成细胞死亡。

如图24-25所示，从处理时间窗口来看，Day0-1、Day0-2、Day0-3、Day0-4、Day0-5、Day0-6添加OG或OG+SP的EPCR/CD34双阳比例依次升高，说明持续添加LSD1抑制剂（OG或OG+SP）效果更好。

如图26-27所示，OG的最佳浓度为10 μM，SP的最佳浓度为2 μM。高浓度的SP会引起细胞死亡。

综合Day3和Day6的流式结果，OG有效的浓度范围为2-10 μM，SP有效的浓度范围为0.5-5 μM。

实施例5 脐血来源的CD34+细胞分离及干性维持

1、实验材料

Buffer缓冲液：PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA的溶液。

2、样品准备

从脐血中分离MNC细胞（人脐带血单个核细胞）。

（1）将细胞通过30 μm细胞筛过滤，去除细胞团块。

（2）细胞计数，根据细胞数来确定使用的分选柱数量。

（3）将过滤后的细胞悬液300 g离心10分钟，弃上清液，将细胞重悬于300 μL缓冲液中。

（4）每108细胞加入100 μL FcR阻断试剂和100 μL CD34微珠，混合均匀，在冰箱(2-8°C)中孵育30分钟。

（5）每108细胞加入5-10 mL缓冲液清洗细胞，300 g离心10分钟。

（6）弃上清液，将108细胞重悬在500 μL缓冲液中。

3、细胞分选

根据CB-MNCs的细胞总数选择合适的柱子类型，本实验中选用LS分选柱。

（1）将LS分选柱放人MACs分离仪的磁场中。

（2）用3 mL缓冲液润洗分选柱。

（3）将细胞悬液加入到分选柱中。

（4）用适量缓冲液清洗分选柱，收集流过分选柱未被标记的细胞（LS: 3×3 mL）。

（5）从分选器上拆下分选柱，并将其放在合适的收集管中，向柱子中加入适量缓冲液（LS: 5 mL)，用柱子随带的内塞，加压将结合的细胞冲洗出来。

（6）根据实验需要使用流式细胞仪检测分选纯度并进行后续的细胞培养。

4、HSC干性维持培养

将分离得到的CD34+细胞以20W/孔的数量接种至12孔板中进行干性维持，培养基为“HSC干性维持与扩增培养基”，进行9天的干性维持实验，细胞培养及LSD1抑制剂处理同实施例3，其中OG处理浓度为10 μM，SP处理浓度为2 μM。

5、实验结果

利用CD34+细胞分离试剂盒分离脐血中的CD34阳性细胞，并利用流式检测HSC干性相关的4个标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3，如图28所示，除了CD34之外，另外三个标志物基本不表达。以20W/孔的数量接种至12孔板中进行干性维持，添加10 μM OG或2 μM SP，每组2个平行，分别在Day3、Day6和Day9进行干性相关标志物的检测，评价抑制LSD1后，能否促进干性相关标志物的表达。

如图29所示，Day3和Day4时，细胞数量和细胞形态上，各组没有显著的差异。

Day3流式结果显示，OG可以显著提升脐血来源CD34阳性细胞中的CD90表达，CD34和CD90双阳细胞比例由对照的0.9%左右提升至14%左右，而SP也可以小幅提升双阳细胞的比例（见图30）。

Day3的CD34/EPCR流式结果显示，在体外干性维持和扩增培养基中培养3天，CK组的CD34和EPCR相较于Day0均有了一定的提高。更加重要的是，OG可以显著提升脐血来源CD34阳性细胞中的EPCR的表达，CD34和EPCR双阳细胞比例由对照的6.2%左右提升至59%左右，提升了将近10倍。而SP也可以小幅提升双阳细胞的比例（见图31）。

由图32看出，OG和SP可以提升CD34/EPCR双阳细胞中CD90和ITGA3的表达。其中对照CK组的LT-HSC 标志物 CD34、CD90、EPCR和 ITGA3四阳的比例为6% x 3%,约为0.18%，OG处理组的四阳比例为59% x 8% 约为4.72%，是对照的26倍；SP处理组的四阳比例为9% x10%，约为0.9%，为对照组的5倍。

如图33所示，Day6和Day7，细胞形态上各组没有显著的差异，细胞数量上SP组细胞略少于另外两组。

Day6的CD34/CD90流式结果显示，OG可以显著提升脐血来源CD34阳性细胞中的CD90表达，CD34和CD90双阳细胞比例由对照的2%左右提升至24%左右，而SP也可以小幅提升双阳细胞的比例（见图34）。

Day6的CD34/EPCR的流式结果显示，OG组的EPCR依然保持了较高的表达水平，CD34和EPCR双阳细胞比例由对照的5%左右提升至40%左右，提升了将近8倍。而SP也可以小幅提升双阳细胞的比例，约2倍（见图35）。

如图36所示，Day8和Day9时，细胞形态上各组没有显著的差异，细胞数量上SP组细胞略少于另外两组。

Day9的CD34/CD90流式结果显示，CK组的CD90基本不再表达，而CD34阳性率也只剩下20%左右，而OG可以显著提升脐血来源CD34阳性细胞中的CD90表达，CD34和CD90双阳细胞比例约为18%，CD34单阳细胞比例接近50%，远远优于对照。SP组双阳细胞比例约为1.5%，CD34单阳比例为30%左右，也要优于对照组（见图37）。图38的CD34/EPCR流式检测结果与CD34/CD90的流式检测结果一致。

综上，OG和SP依然可以实现脐血来源HSC的干性维持，尤其是OG对于EPCR表达的促进，Day6时EPCR/CD34双阳比例能够在40%左右，Day9双阳比例还可以维持在28%左右，对照组接近为0。由于EPCR对于HSC移植后具有重要的作用，因此通过抑制LSD1来提高脐血来源HSC的功能，具有重要的科学意义。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种促进iPSC向HSC分化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) Day-1，iPSC单层贴壁细胞形成；

(4) Day3-Day12，生血内皮特化及内皮-造血细胞转化，采用生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基培养步骤(3)得到的细胞，加入LSD1抑制剂，Day12，收集HSC细胞；

步骤(4)中所述LSD1抑制剂为OG-L002和/或SP2509；

步骤(2)中所述中胚层诱导培养基包含：STEMdiff™ APEL™2 Medium、Penicillin-Streptomycin和CHIR99021；

步骤(3)中所述造血中胚层特化培养基包含：STEMdiff™ APEL™2 Medium、Penicillin-Streptomycin、VEGF和bFGF；

步骤(4)中所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基包含：STEMdiff™ APEL™2Medium、Penicillin-Streptomycin、VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4；

所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基还含有Y-27632；

步骤(4)中所述LSD1抑制剂的加入时间为Day6或Day9。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述中胚层诱导培养基中各组分的用量为：1% Penicillin-Streptomycin和9 μM CHIR99021。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述造血中胚层特化培养基中各组分的用量为：1% Penicillin-Streptomycin、20 ng/mL VEGF和20 ng/mL bFGF。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基中各组分的用量为：1% Penicillin-Streptomycin、20 ng/mL VEGF、20ng/mL bFGF、20 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt-3L和10 ng/mLBMP4。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基中Y-27632的浓度为10 μM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述OG-L002的使用浓度为0.1-20 μM，所述SP2509的使用浓度为0.1-5 μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSC为长期造血干细胞，所述长期造血干细胞为CD34+EPCR+CD90+ITGA3+长期造血干细胞。