WO2022169300A1 - 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법 - Google Patents

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법 Download PDF

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    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • It relates to a method for producing a gene-edited cell using pluripotent stem cell-derived hematopoietic endothelial cells.
  • hemangioblasts Although there is a high level of recognition for the stable differentiation technology of hemangioblasts, there are no reports on the differentiation of hemangioblasts and their use as base cells for loading genetically modified products.
  • gene editing is used as a method to mount the killing ability of natural killer cells, but the transfection efficiency of primary PB-derived natural killer cells or NK92mi cell lines is very low, so there is a problem that the gene cannot be inserted efficiently.
  • hemangioblasts are able to adhere to a culture dish, and thus have high transfection efficiency in the cells, and have the advantage of dividing with information about gene editing during cell division.
  • hemangioblasts possess the characteristics of progenitor cells, they can be differentiated into lymphoid cells or natural killer cells, and genetic modification can be attempted with high efficiency. Therefore, there is a need to develop hemangioblasts that enable the generation of blood cells such as lymphocytes or natural killer cells as base cells for gene editing.
  • One aspect is to prepare a hematopoietic endothelial cell (Hemogenic endothelial cell, HEC); injecting a carrier for gene editing into the hematopoietic endothelial cells; And to provide a method for producing a gene-edited hematopoietic endothelial cell comprising the step of obtaining a gene-edited hematopoietic endothelial cell.
  • HEC hematopoietic endothelial cell
  • One aspect is to prepare a hematopoietic endothelial cell (Hemogenic endothelial cell, HEC); injecting a carrier for gene editing into the hematopoietic endothelial cells; and obtaining a gene-edited hematopoietic endothelial cell.
  • HEC hematopoietic endothelial cell
  • hemogenic endothelial cell refers to a rare differentiated vascular endothelial cell, which can be differentiated into a hematopoietic cell (hematoblast) during embryogenesis.
  • hematopoietic cells hematopoietic cells
  • the development of hematopoietic cells in the embryo sequentially proceeds from the mesoderm to the vascular endothelium and hematopoietic precursor cells through hemangioblasts.
  • the “angioblast, or vasoformative cell” is a type of endothelial precursor cell derived from bone marrow, and is one of the mesenchymal cells that can develop into the endothelium of blood vessels.
  • the hematopoietic endothelial cells are mesodermal cells by culturing pluripotent stem cells in a first medium containing a first medium composition comprising bFGF, VEGF and SCF. differentiating; culturing the mesoderm cells in a second medium containing a second medium composition comprising TPO, EPO and IGF-1 to differentiate them into early hemogenic endothelial cells (EHE); and culturing the EHE in a third medium containing a third medium composition comprising IL-5, IL-7 and DLL to differentiate into late hemogenic endothelial cells (LHE).
  • the medium composition may be included in a conventional cell culture medium.
  • the cell culture medium is, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA), MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA), RPMI 1640 (GIBCO, USA).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle, GIBCO, USA
  • RPMI 1640 GIBCO, USA.
  • DMEM/F10 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA
  • DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO, USA
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal essential
  • G-MEM Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA
  • IMDM Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA
  • Apel II STEMdiff APEL 2 Medium
  • EGM-2 EGM-2(EGM Endothelial Cell Growth) Medium
  • the step of differentiating into mesodermal cells may be performed for 1 to 3 days.
  • the step may be performed for 1 to 3 days, 1 to 2 days, or 2 to 3 days.
  • the culture period is less than the above range, there is a problem that the pluripotent stem cells are not sufficiently differentiated into mesoderm cells.
  • the step of differentiating the initial hematopoietic endothelial cells may be performed for 6 to 8 days. At this time, when the culture period is less than the above range, there is a problem that the growth and expansion of hematopoietic endothelial cells may be atrophied. There is a reduction problem.
  • the step of differentiating into late hematopoietic endothelial cells may be performed for 12 to 13 days. At this time, when the differentiation period is less than the above range, there is a problem that the primary hematopoiesis process does not sufficiently occur, which affects the cell generation and frequency of the definitive hematopoiesis process.
  • pluripotent stem cell is pluripotent (pluripotent) or totipotent (totipotent) capable of differentiating into cells of all tissues of an individual having self-renewal capacity (self-renewal) means stem cells.
  • the pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs), and somatic cell nuclear transfer derived stem cells by somatic cell nuclear transfer.
  • lymphoid lineage blood cell is a lineage cell differentiated from hematopoietic stem cells, mainly involved in adaptive immunity and innate immunity. Lymphocyte lineage cells include, for example, natural killer cells (NK cells), T lymphocytes, and B lymphocytes. Therefore, the method according to one aspect stably stabilizes gene-edited cells in all lineages by using hematopoietic endothelial cells that can efficiently differentiate into lymphoid lineage cells such as NK cells, T lymphocytes or B lymphocytes of pluripotent stem cells in vitro. can be obtained with hematopoietic endothelial cells that can efficiently differentiate into lymphoid lineage cells such as NK cells, T lymphocytes or B lymphocytes of pluripotent stem cells in vitro. can be obtained with hematopoietic endothelial cells that can efficiently differentiate into lymphoid lineage cells such as NK cells, T lymphocytes or B lymphocytes of pluripotent stem cells in vitro. can
  • the term "gene editing” refers to a nucleic acid molecule (one or more, for example, 1 to 100,000 bp, 1 to 10,000 bp, 1 to 1,000 bp, 1 to 100 bp, 1 to 70 bp, 1 to 50 bp, 1 to 30 bp, 1 to 20 bp or 1 to 10 bp) can be used to alter, and/or restore (correct) gene function by deletion, insertion, substitution, etc. .
  • the gene editing may be to transfer a gene using a viral gene delivery system or a non-viral delivery agent.
  • the viral gene delivery system is a DNA virus such as adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, etc. or retino virus, lenti virus. It may be an RNA virus such as
  • the non-viral carrier may be, for example, direct gene injection, electroporation, gene gun, lipid-gene conjugate, polymer-gene conjugate, and the like.
  • Gene-edited hematopoietic endothelial cells may include cells that have been gene-edited by targeting one or more genes of interest (GOIs).
  • the gene of interest is, for example, B2M-/-, CIITA-/-, HLA-E+, HLA-G+, Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody, CD3z, 4.1.BB, It may be a cancer stem cell marker, CD44, FLT4, or the like.
  • the gene of interest may be operably linked to a reporter gene.
  • the "operably linked (operably linked)" means that a nucleic acid encoding a nucleic acid expression control sequence and a target protein are functionally linked to perform a general function.
  • the reporter gene is, for example, a fluorescent protein, beta-galactosidase, beta-lactamase, TEV-protease, dihydrofolate reductase), luciferase, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, selection marker, surface marker gene, antibiotic resistance protein, etc.
  • a fluorescent protein beta-galactosidase, beta-lactamase, TEV-protease, dihydrofolate reductase
  • luciferase Renilla luciferase
  • Gaussia luciferase selection marker
  • surface marker gene antibiotic resistance protein, etc.
  • obtaining the gene-edited hematopoietic endothelial cells may include selectively killing cells whose expression of a gene of interest is not increased or suppressed by gene editing.
  • the selectively killing the cells may be performed by treating a cell sample containing the gene-edited hematopoietic endothelial cells with an antibiotic or the like.
  • the gene-edited hematopoietic endothelial cells may be cells in which cell division is in progress or in which progress has been completed, and the cells may be cultured for 2 to 10 passages.
  • the cell death may refer to apoptosis, unless otherwise stated.
  • Another aspect provides a hematopoietic endothelial cell produced by the method.
  • the transfection efficiency of the hematopoietic endothelial cells was similar to or increased as compared to the embryonic stem cells (CHA562), HDF cells, and NK92mi cells as the cell division progressed. Therefore, hematopoietic endothelial cells according to an aspect can replace existing cells with low gene editing efficiency as cell division proceeds while maintaining information on gene editing.
  • the hematopoietic endothelial cells can be differentiated into lymphoid cells, various genetic modifications such as vascular cells and lymphatic cells can be attempted using the cells.
  • the method according to one aspect can stably and efficiently obtain gene-edited cells by using hematopoietic endothelial cells inducible into lymphoid cells.
  • 1 is a photograph showing the characteristics of early and late hematopoietic endothelial cells.
  • Figure 2a is a photograph showing the cell morphology according to the culture time of the late hematopoietic endothelial cells and a graph showing the proliferation of single cells.
  • 2b is a photograph confirming the expression of marker protein in late hematopoietic endothelial cells.
  • Figure 3a is a photograph showing the cell shape after culturing HE in Apel II basal medium on day 1, day 3, day 7, and thereafter.
  • Figure 3b is a photograph showing the cell shape of days 1 and 3 of culturing HE in EGM-2 basal medium.
  • Figure 3c is a photograph showing the cell shape after culturing HE in DMEM/F12 basal medium on day 1, day 3, day 7, and thereafter.
  • Figure 4a is the result of confirming the marker protein in the late hematopoietic endothelial cells.
  • Figure 4b is a photograph confirming the Tie-2 enrichment of CD31 cells.
  • Figure 5a is the result of confirming the lymphocyte cell generation in hematopoietic endothelial cells in the liver of mice.
  • Figure 5b is a result confirming the lymphocyte cell generation in hematopoietic endothelial cells in the mouse AGM.
  • Figure 5c is a chart showing the appearance and colony formation of hematopoietic endothelial cells cultured in each basal medium, and the generation of lymphocytes and myeloid cells, and confirming the shape of hematopoietic endothelial cells.
  • Figure 5d is a graph showing the results of analyzing the expression levels of CD45, CD4, CD8, NK1.1 using the differentiated cells in AGM.
  • 6A is a result showing the characteristics and expression markers of cells at each stage of generation of lymphocytes from hematopoietic endothelial cells derived from human pluripotent stem cells.
  • FIG. 6b is a graph confirming whether differentiation into lymphocyte-based cells occurs in a spot treated with IL-5 and DDL1 by expression of a lymphoblastic transcription factor.
  • HE 7a is a microscopic image of the bright field and GFP-expressing hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells on the 6th and 9th days in situ.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • CHF embryonic stem cells
  • NK92mi NK92mi cells
  • 7B is a graph qualitatively analyzed by FACS analysis of the fluorescence levels of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • CHF embryonic stem cells
  • NK92mi cells NK92mi cells
  • Figure 7c is a graph quantifying the degree of fluorescence of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells.
  • Figure 8a induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells at an MOI of 10 until day 9, and whether GFP-transfected cells and CFSE were co-expressed at the cell level. This is the result confirmed in Red boxes indicate coexpression.
  • Figure 8b induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells at an MOI of 50 until day 9, and whether GFP-transfected cells and CFSE were co-expressed at the cell level. This is the result confirmed in
  • 8c shows the results of inducing division of hematopoietic endothelial cells (HE) and HDF cells up to day 9 at MOI 10 and MOI 50, and quantifying the expression of GFP and PE-congugated CFSE on days 6 and 9.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • Figure 8 induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), and HDF cells by day 9 at MOI 10 and MOI 50, and quantification of CFSE and dividing cells in each cell expressing GFP on days 6 and 9. It is one graph.
  • stem cells into hematopoietic endothelial cells were confirmed. Specifically, 2.0 x 10 5 stem cells (hereinafter, 'CHA52' cells) obtained from CHA Biotech Co., Ltd. were dispensed into 1 well coated with Matrigel in a 6 well culture dish and cultured for two days. Thereafter, the cells were basal medium (Stemline II medium) with bFGF 7 ng/ml, CHIR 1 nM, ascorbic acid 60 ng/ml, VEGFA 15 ng/ml, SCF 35 ng/ml and mesoderm containing 18 ng/ml BMP4. It was cultured for 3 days in a specific conditioned medium (hereinafter, 'Step I').
  • the cells were incubated in a basal medium (Apel II medium) with bFGF 7 ng/ml, VEGFA 15 ng/ml, SCF 180 ng/ml, FLT3L 150 ng/ml, GCSF 18 ng/ml, TPO 80 ng/ml, EPO It was further cultured for 6 days in an optimized medium containing 17 ng/ml, 25 ng/ml of IL-6 and 30 ng/ml of IGF-1 (hereinafter, 'Step II').
  • a basal medium Apel II medium
  • pro hemogenic endothelial cells pro hemogenic endothelial cells
  • hematopoietic endothelial cells were subcultured and isolated with high purity.
  • non-hematopoietic endothelial cells distributed as a single layer fell first by treatment with 0.25% Trypsin/EDTA in an incubator for 3 minutes. After washing the medium with DPBS, 0.25% Trypsin/EDTA was further treated to separate hematopoietic endothelial cell clusters into single cells.
  • composition Preparation 2 Preparation 3
  • Preparation 4 Preparation 5 Phase I bFGF 15 ng/ml 9 ng/ml 12 ng/ml 17 ng/ml CHIR 5 nM 2 nM 4 nM 7 nM ascorbic acid 70 ng/ml 80 ng/ml 120 ng/ml 150 ng/ml VEGFA 18 ng/ml 22 ng/ml 25 ng/ml 30 ng/ml SCF 55 ng/ml 45 ng/ml 58 ng/ml 65 ng/ml BMP4 20 ng/ml 22 ng/ml 30 ng/ml 35 ng/ml
  • composition Preparation 2 Preparation 3
  • Preparation 4 Preparation 5 Phase II bFGF 15 ng/ml 9 ng/ml 12 ng/ml 17 ng/ml VEGFA 18 ng/ml 22 ng/ml 25 ng/ml 30 ng/ml SCF 225 ng/ml 195 ng/ml 210 ng/ml 270 ng/ml FLT3L 170 ng/ml 190 ng/ml 210 ng/ml 230 ng/ml GCSF 25 ng/ml 23 ng/ml 27 ng/ml 30 ng/ml TPO 150 ng/ml 120 ng/ml 130 ng/ml 180 ng/ml EPO 23 ng/ml 21 ng/ml 25 ng/ml 27 ng/ml IL-6 35 ng/ml 45 ng/ml 55 ng/ml 65 ng/ml IGF-1 40 ng/ml 35
  • composition Preparation 2 Preparation 3
  • Preparation 4 Preparation 5 Phase III bFGF 13 ng/ml 15 ng/ml 20 ng/ml 23 ng/ml VEGFA 30 ng/ml 70 ng/ml 90 ng/ml 110 ng/ml SCF 230 ng/ml 200 ng/ml 300 ng/ml 330 ng/ml FLT3L 180 ng/ml 210 ng/ml 240 ng/ml 270 ng/ml GCSF 25 ng/ml 22 ng/ml 28 ng/ml 32 ng/ml IL-6 45 ng/ml 40 ng/ml 55 ng/ml 65 ng/ml IGF-1 40 ng/ml 30 ng/ml 50 ng/ml 55 ng/ml IL-7 25 ng/ml 18 ng/ml 28 ng/ml 35 ng/ml IL-15 23 ng/ml 17
  • Example 1 Confirmation of differentiation of stem cells into hematopoietic endothelial cells
  • 1 is a photograph showing the characteristics of early and late hematopoietic endothelial cells.
  • the hematopoietic endothelial cells mainly show rod-like cells, which are typical of cobblestone-shaped endothelial cells. -like cells) or mesenchymal stem cells (mesenchymal stromal cells) were found to be different in shape.
  • the blood cells formed by the late hematopoietic endothelial cells are mainly primitive blood cells (mainly myeloid) in the early stage, and definitive blood cells (including both myeloid and lymphocytes) in the late hematopoietic endothelial cell-derived cells. It was confirmed that tube formation was formed in the generated vascular endothelial cells. Judging from the above results, it is considered that hematopoietic endothelial cells possess both the characteristics of vascular endothelial cells and those of blood cells.
  • Figure 2a is a photograph showing the cell morphology according to the culture time of the late hematopoietic endothelial cells and a graph showing the proliferation of single cells.
  • the porphyrin precursor As a result, as shown in FIG. 2A , on the first day of culture of late hematopoietic endothelial cells, the porphyrin precursor, 5-aminolevulinate synthase, was exposed to bright light presumed to be caused by the enzyme. (indicated by a white arrow) was confirmed to show bright yellow light under the microscope. However, it was confirmed that the bright light disappears from the hematopoietic endothelial cells after the generation of erythroblasts (D9, after the 10th day).
  • the shape of budding erythroblasts could be confirmed, and it was confirmed that the erythroblasts were formed after the 7th day. It was confirmed that the doubling day of the hematopoietic endothelial cells was about 1.2 days, and the average doubling time was about 29.5 hours.
  • 2b is a photograph confirming the expression of marker protein in late hematopoietic endothelial cells.
  • the late hematopoietic endothelial cells cultured in Example 1-1 were stored frozen for 1 month, and then thawed in a water bath at 37°C. Thereafter, three basic media (Apel II, EGM-2, and DMEM/F12 media) were used to identify media suitable for proliferation and differentiation of late hematopoietic endothelial cells, and in the case of Apel II and DMEM/F12 media, 7 ng of bFGF /ml, VEGFA 15ng/ml, SCF 180ng/ml, FLT3L 150ng/ml, GCSF 18ng/ml, TPO 80ng/ml, EPO 17ng/ml, IL-6 25ng/ml, IGF-1 30 ng/ml, IL-3 45 ng/ml and CHIR 1 nM were added.
  • Apel II and DMEM/F12 media 7 ng of bFGF /ml, VEGFA 15ng/ml, SCF 180ng
  • EGM-2 medium only the cytokine Lonza (cat no CC-3202) was additionally added. Thereafter, the frozen and thawed late hematopoietic endothelial cells were cultured in each of the three media, and all media maintained a half change of the media once every 3 to 4 days. In the case of late hematopoietic endothelial cells, since they are vascular endothelial cells thawed after freezing, it was expected that they would attach to the culture dish and proliferate.
  • Figure 3a is a photograph showing the cell shape after cultured hematopoietic endothelial cells in Apel II basal medium 1, 3, 7, and thereafter.
  • Figure 3b is a photograph showing the cell shape on day 1 and day 3 of culturing hematopoietic endothelial cells in EGM-2 basal medium.
  • hematopoietic endothelial cells cultured in EGM-2 basal medium proliferated stably after attachment to the culture dish, and their proliferation rate was also faster and more stable than other basal media.
  • hematopoietic endothelial cells proliferated for more than 7 days it was confirmed that they were divided into a typical cobblestone-shaped endothelial progenitor cell and an atypical vascular endothelial cell-shaped cell group.
  • the EGM-2 basal medium is positive for proliferation and engraftment of hematopoietic endothelial cells, and can affect the production of blood cells by stably attaching and proliferating hematopoietic endothelial cells in a culture dish.
  • Figure 3c is a photograph showing the cell shape on day 1, day 3, day 7 and thereafter after culturing hematopoietic endothelial cells in DMEM/F12 basal medium.
  • FIG. 3C it was confirmed that hematopoietic endothelial cells cultured in DMEM/F12 basal medium adhered to the culture dish and proliferated. Compared with hematopoietic endothelial cells cultured in EGM-2 basal medium, the proliferation rate was delayed by 4 to 5 days, but many colonies of hematopoietic endothelial cells were formed, and it was confirmed that a large amount of blood cells were stably generated after 8 days. .
  • marker proteins expressed in hematopoietic endothelial cells according to the basal medium of Example 1-2 was compared. As a result, the expression of marker proteins according to the basal medium was not significantly different, and it was confirmed that typical marker proteins were expressed in hematopoietic endothelial cells.
  • Figure 4a is the result of confirming the marker protein in hematopoietic endothelial cells cultured in EGM-2 basal medium for 3 days.
  • Figure 4b is a photograph confirming the Tie-2 enrichment of hematopoietic endothelial cells cultured for 14 days in EGM-2 basal medium.
  • Example 1-2 culture conditions for hematopoietic endothelial cells for inducing lymphocyte production were additionally confirmed.
  • AGM Arota gonad mesonephros
  • liver tissue were isolated from rat fetus at 10.5 to 11.5 days of age. Thereafter, the tissue minced behind the lid of the sterilized 1.5 ml eppendorf tube was washed with DPBS, and then cultured in the same three mediums as in Example 1-3 until the 20th day, the birth date of mice. Hematoxylin & Eosin staining was performed to confirm the shape of hematopoietic endothelial cells cultured in each medium.
  • Figure 5a is the result of confirming the generation of lymphocytes in hematopoietic endothelial cells in the liver of a mouse
  • Figure 5b is the result of confirming the generation of lymphocytes in the hematopoietic endothelial cells in the mouse AGM
  • Figure 5c is a chart showing the appearance and colony formation of hematopoietic endothelial cells cultured in each basal medium, and the production degree of lymphoid cells and myeloid cells, and confirming the shape of hematopoietic endothelial cells.
  • hematopoietic endothelial cells were hardly obtained from liver tissue-derived blood cells, it was confirmed that blood cells made from hematopoietic endothelial cells showed different trends according to each of the three mediums in the process of infiltration into the liver and maturation. Specifically, as shown in FIG. 5a , in the case of EGM-2 basal medium, it was confirmed that all hematopoietic endothelial cells were killed. On the other hand, in the case of Apel II basal medium, cells were rapidly induced from megakaryocytes-red blood cells and pronormoblasts to orthochromic normoblasts within 3 days, and it was confirmed that the cells disappeared within 6 days.
  • FIG. 5b in the case of hematopoietic endothelial cells present in AGM, it was confirmed that the culture level was different up to the 9th day depending on the medium. Specifically, in the case of the EGM-2 basal medium, it was confirmed that the annihilation of blood cells increased remarkably. That is, it can be seen that, unlike human pluripotency-derived hematopoietic endothelial cells, mouse hematopoietic endothelial cells do not survive for a long period of time. However, in the case of Apel II basal medium, it was confirmed that the enrichment of the red blood cells was made rapidly and the proliferation of the white blood cells was significantly increased.
  • liver and AGM-derived cells exhibited active adhesion and cell proliferation in DMEM/F12 and Apel II basal media compared to EGM-2 basal media, enabling long-term differentiation into hematopoietic endothelial cells and hematopoietic cells.
  • Figure 5d is a graph showing the results of analyzing the expression levels of CD45, CD4, CD8, NK1.1 using the differentiated cells in AGM.
  • Human pluripotent stem cells were differentiated into hematopoietic endothelial cells and blood cells in the medium of Example 1-2 based on the confirmation that the hematopoietic endothelial cells derived from the mouse fetus were differentiated into blood cells in Example 1-4. It was checked whether or not Specifically, hematopoietic endothelial cells cultured for 21 days according to steps I to III in Preparation Example 1 were further cultured until the 34th day. At this time, after 28 days of culture, the functional window of hematopoietic endothelial cells was set as 21 to 28 days because the hematopoietic endothelial cells were eliminated or the frequency of cell death increased.
  • 6A is a result showing the characteristics and expression markers of cells at each stage of generation of lymphocytes from hematopoietic endothelial cells derived from human pluripotent stem cells.
  • FIG. 6b is a graph confirming whether differentiation into lymphocyte-based cells occurs in a spot treated with IL-5 and DDL1 by expression of a lymphoblastic transcription factor.
  • the medium according to one aspect is capable of long-term culture of human pluripotent stem cells, so that differentiation into hematopoietic endothelial cells and vascular cells (lymphocytes) is possible.
  • fibroblasts such as 293T cells or HDF cells are used for transfection.
  • immortalized cell line cells such as 293T cells
  • cell division occurs to the end, so it is widely used for transfection.
  • CAR-NK hematopoietic endothelial cells
  • hematopoietic endothelial cells have strong progenitor cell properties, so they can have the strength of gene editing and maintain high efficiency, so they can be used as CAR-NK and Universal NK.
  • Example 1 the possibility of using the hematopoietic endothelial cells for which the culture conditions were established in Example 1 as a base cell for gene editing was confirmed.
  • the GFP-expressing construct was inserted into the hematopoietic endothelial cells of Example 1 using a lentivirus, the cells were cultured. The frequency of GFP-bearing cells was investigated on days 3, 6 and 9 after culture.
  • 5 ⁇ g pRSV-Rev plasmid, 5 ⁇ g pCMV-VSV-G plasmid, 5 ⁇ g pCgpV plasmid and 15 ⁇ g pSIH1-H1-siLUC-copGFP plasmid were added to 6 mil HEK-293T cells with lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat no TFS). -11668019) was introduced and cultured for 72 hours to produce GFP-attached lentivirus. Thereafter, the lentivirus was filtered through a 0.45 ⁇ m filter and concentrated at 4° C. for 24 hours using Retro-Concentin Retroviral Concentration Reagent (System Biosciences, cat no RV100A-1).
  • the titer of the lentivirus was measured using the QuickTiter Lentivirus Titer Kit (Cellbiolabs, cat no VPK-107), and the measured lentivirus was applied to the hematopoietic endothelial cells of Example 1 at an MOI (multiplicity of infection) 10 or 50. Thereafter, the cells were left for 3 days without changing the medium, and then divided into a FACS analysis group and a continuous culture group on the third day. After culturing the FACS analysis group and the continuous culture group, respectively, the degree of decrease in GFP was measured on the 6th and 9th days. Embryonic stem cells (CHA562), HDF cells, and NK92mi cells were used as controls, and the same method as above was used.
  • HE 7a is a microscopic image of the bright field and GFP-expressing hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells on the 6th and 9th days in situ.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • CHF embryonic stem cells
  • NK92mi NK92mi cells
  • 7B is a graph qualitatively analyzed by FACS analysis of the fluorescence levels of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • CHF embryonic stem cells
  • NK92mi cells NK92mi cells
  • Figure 7c is a graph quantifying the degree of fluorescence of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells.
  • the initial (3rd day) transfection efficiency of embryonic stem cells was the lowest regardless of the MOI.
  • the transfection efficiency was about 10% at MOI 50 (day 3), but it was confirmed that the frequency of GFP-expressing cells decreased significantly over time.
  • HDF cells increased until the 6th day regardless of the MOI, and in the case of the MOI50, the transfection efficiency was about 20% on the 6th day, but it was confirmed that it decreased significantly after the 6th day.
  • hematopoietic endothelial cells the transfection efficiency was the highest on day 6 regardless of the MOI and showed a decreasing trend thereafter, but showed the highest efficiency compared to embryonic stem cells, HDF cells and NK92mi cells (day 9). ). That is, hematopoietic endothelial cells according to one aspect can be utilized as base cells for transfection by stably delivering information about gene editing to passaged cells despite the progress of cell division.
  • Example 2 To confirm the transfection stability of hematopoietic endothelial cells into which the GFP construct was inserted in Example 2, GFP expressed in hematopoietic endothelial cells co-expressed with CFSE (proliferation marker) was quantified. Specifically, 1.0 x 10 6 hematopoietic endothelial cells of Example 2 were placed in a beaker containing 1 ml of DPBS, and 1 ⁇ l of PE-conjugated CFSE (Carboxylfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) (Invitrogen, Cat No C34573) stock was added thereto. Exposure at room temperature for 20 minutes.
  • PE-conjugated CFSE Carboxylfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester
  • the culture solution was filled so that the total volume of the beaker was 5 ml, washed and further cultured to investigate the frequency of GFP-bearing cells on days 3, 6, and 9, and cells undergoing cell division were subjected to FACS. It was analyzed and quantified. Embryonic stem cells (CHA562), HDF cells, and NK92mi cells were used as controls, and the same method as above was used.
  • Figure 8a induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells at an MOI of 10 until day 9, and whether GFP-transfected cells and CFSE were co-expressed at the cell level. This is the result confirmed in Red boxes indicate coexpression.
  • Figure 8b induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), embryonic stem cells (CHA562), HDF cells and NK92mi cells at an MOI of 50 until day 9, and whether GFP-transfected cells and CFSE were co-expressed at the cell level. This is the result confirmed in
  • the MOI 50 also exhibited a similar aspect to the MOI 10 (see FIG. 8a ).
  • the intensity of GFP fluorescence is stronger in HDF cells and hematopoietic endothelial cells, confirming that the frequency of transfected cells is higher.
  • 8c shows the results of inducing division of hematopoietic endothelial cells (HE) and HDF cells up to day 9 at MOI 10 and MOI 50, and quantifying the expression of GFP and PE-congugated CFSE on days 6 and 9.
  • HE hematopoietic endothelial cells
  • Figure 8 induced cell division of hematopoietic endothelial cells (HE), and HDF cells by day 9 at MOI 10 and MOI 50, and quantification of CFSE and dividing cells in each cell expressing GFP on days 6 and 9. It is one graph.

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Abstract

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 림프구계 세포로 유도 가능한 조혈 내피세포를 이용함으로써 유전자 편집 세포를 안정되고, 고효율로 수득할 수 있다.

Description

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법
본 출원은 2021년 2월 5일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2021-0016846호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법에 관한 것이다.
혈관모세포의 안정된 분화기술법에 대하여 높은 인지도가 있음에도 불구하고 실제로 혈관모세포 분화와 이를 활용하여 유전자 변형물 탑재를 위한 기반세포로의 활용에 대한 보고가 없는 실정이다. 현재 자연살해세포의 살상능을 장착하기 위한 방법으로 유전자 편집이 사용되고 있으나 primary PB 유래 자연살해세포 또는 NK92mi 세포주 등의 형질주입(transfection) 효율이 매우 낮아 유전자를 효율적으로 삽입할 수 없다는 문제점이 있다. 한편, 혈관모세포는 배양접시에 부착가능하여 상기 세포에서의 형질주입 효율이 높을 뿐만 아니라, 세포분열시 유전자 편집에 관한 정보를 가지고 분열한다는 장점이 있다. 또한, 혈관모세포는 전구세포로의 성상을 보유하고 있기 때문에 림프구계 세포 또는 자연살해세포로의 분화가 가능하며 고효율로 유전자 변형을 시도할 수 있다. 따라서, 림프구계 세포 또는 자연살해세포 등과 같은 혈액세포의 생성을 가능하게 하는 혈관모세포를 유전자 편집을 위한 기반세포로서 개발할 필요가 있다.
일 양상은 조혈 내피세포(Hemogenic endothelial cell, HEC)를 준비하는 단계; 상기 조혈 내피세포에 유전자 편집을 위한 전달체를 투입하는 단계; 및 유전자 편집된 조혈 내피세포를 수득하는 단계를 포함하는 유전자 편집된 조혈 내피세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 조혈 내피세포(Hemogenic endothelial cell, HEC)를 준비하는 단계; 상기 조혈 내피세포에 유전자 편집을 위한 전달체를 투입하는 단계; 및 유전자 편집된 조혈 내피세포를 수득하는 단계를 포함하는 유전자 편집된 조혈 내피세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "조혈 내피세포(hemogenic endothelial cell)"는 분화된 희귀 혈관 내피세포로서, 배 발생 동안에 조혈 세포(hematoblast)로 분화될 수 있다. 배아에서 조혈 세포의 발달은 중배엽에서 혈관 모세포를 통해 혈관 내피 및 조혈세포의 전구체(hemopoietic precursor cell)로 순차적으로 진행된다. 상기 "혈관모세포(angioblast, 또는 vasoformative cell)"는 골수에서 파생된 일종의 내피 전구체 세포로, 혈관의 내피로 발달할 수 있는 중간엽 세포 중 하나이다.
일 구체예에 있어서, 상기 조혈 내피세포는 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하는 제1 배지 조성물을 함유하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계; 상기 중배엽성 세포를 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 제2 배지 조성물을 함유하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계; 및 상기 EHE를 IL-5, IL-7및 DLL을 포함하는 제3 배지 조성물을 함유하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 통하여 제조된 것일 수 있다. 상기 배지 조성물은 통상의 세포 배양용 배지 중에 포함되는 것일 수 있다. 상기 세포 배양용 배지는 예를 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA), MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA), RPMI 1640 (GIBCO, USA), DMEM/F10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA), DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO, USA), α-MEM(α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA), Apel Ⅱ(STEMdiff APEL 2 Medium), EGM-2(EGM　Endothelial Cell Growth Medium) 등일 수 있다. 상기 중배엽성 세포로 분화시키는 단계는 1 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계는 1 내지 3일, 1 내지 2일 또는 2 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 다능성 줄기세포가 중배엽성 세포로 충분히 분화되지 못하는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 다능성 줄기세포가 중배엽에서 조혈 내피세포로 분화되지 못하고 다른 계통의 세포로 분화되는 문제점이 있다. 또한, 상기 초기 조혈 내피세포로 분화시키는 단계는 6 내지 8일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 조혈 내피세포의 성장과 팽창이 위축될 수 있다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 중배엽에서 조혈 내피세포의 분화가 충분히 일어나지 않아 조혈 내피세포의 빈도가 줄어드는 문제점이 있다. 또한, 상기 후기 조혈 내피세포로 분화시키는 단계는 12 내지 13일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 분화 기간이 상기 범위 미만인 경우, 초기 조혈(primary hematopoiesis) 과정이 충분히 일어나지 않아 확정적 조혈(definitive hematopoeisi) 과정의 세포 생성과 빈도가 줄어드는데 영향을 준다는 문제점이 있다.
본 명세서에서, 용어 "다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 상기 다능성 줄기세포는 예를 들어, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 체세포 핵치환술에 의한 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer derived stem cell) 등이 있다.
본 명세서에서, 용어 "림프구 계통세포(lymphoid lineage blood cell)"는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로부터 분화된 계통 세포로서 주로 적응 면역계(adaptive immunity)와 선천 면역계(innate immunity)에 관여한다. 림프구 계통세포는 예를 들어, 자연살해세포(natural killer cell, NK cell), T 림프구, B 림프구가 있다. 따라서, 일 양상에 따른 방법은 체외에서 다능성 줄기세포의 NK 세포, T 림프구 또는 B 림프구와 같은 림프구 계통 세포로 효율적으로 분화 가능한 조혈 내피세포를 이용함으로써 모든 계통(lineage)에서 유전자 편집 세포를 안정적으로 확보할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "유전자 편집"은 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 핵산 분자(하나 이상, 예를 들어, 1 내지 100,000 bp, 1 내지 10,000 bp, 1 내지 1,000 bp, 1 내지 100 bp, 1 내지 70 bp, 1 내지 50 bp, 1 내지 30 bp, 1 내지 20 bp 또는 1 내지 10 bp)의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 변경, 및/또는 회복(수정)시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 유전자 편집은 바이러스(virus)성 유전자 전달체 또는 비-바이러스(non-viral)성 전달체를 이용하여 유전자를 전달하는 것일 수 있다. 상기 바이러스성 유전자 전달체는 아데노바이러스(adeno virus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 등과 같은 DNA 바이러스 또는 레티노 바이러스(retino virus), 렌티 바이러스(lenti virus) 등과 같은 RNA 바이러스인 것일 수 있다. 또한, 상기 비바이러스성 전달체는 예를 들어, 유전자의 직접 주사, 전기천공법, 유전자 총, 지질-유전자 결합체, 폴리머-유전자 결합체 등인 것일 수 있다.
유전자 편집된 조혈 내피세포는 1종 이상의 관심 유전자(gene of interest, GOI)를 표적화하여 유전자 편집된 세포를 포함할 수 있다. 상기 관심 유전자는 예를 들어, B2M-/-, CⅡTA-/-, HLA-E+, HLA-G+, 키메릭항원수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)-specific 모노클로날 항체, CD3z, 4.1.BB, 암 줄기세포 마커, CD44, FLT4 등인 것일 수 있다. 또한, 상기 관심 유전자는 리포터 유전자와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적 단백질을 코딩하는 핵산이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 리포터 유전자는 예를 들어, 형광 단백질, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레 닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene), 항생제 저항성 단백질 등인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전자 편집된 조혈 내피세포를 수득하는 단계는 유전자 편집에 의하여 관심 유전자의 발현이 증가하거나 억제되지 않은 세포를 선택적으로 사멸시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포를 선택적으로 사멸시키는 단계는 유전자 편집된 조혈 내피세포를 포함하는 세포 시료에 항생제 등을 처리하여 수행될 수 있다. 상기 유전자 편집된 조혈 내피세포는 세포 분열이 진행 중이거나 진행이 완료된 세포일 수 있으며, 상기 세포를 2 내지 10 계대 동안 배양한 것일 수 있다. 상기 세포 사멸은 다르게 언급되지 않는 한, 아폽토시스(apoptosis)를 의미할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 조혈 내피세포를 제공한다. 일 실시예에서는 상기 조혈 내피세포가 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포와 비교하여 세포 분열이 진행됨에 따른 형질주입 효율이 초기 세포와 유사하거나 상승하는 것을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 조혈 내피세포는 유전자 편집에 관한 정보를 유지하면서 세포 분열이 진행되는 바 유전자 편집 효율이 낮은 기존 세포를 대체할 수 있다. 또한, 상기 조혈 내피세포는 림프구 계통 세포로 분화할 수 있으므로 상기 세포를 이용하여 혈관세포, 림프관 세포 등의 다양한 유전자 변형을 시도할 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 림프구계 세포로 유도 가능한 조혈 내피세포를 이용함으로써 유전자 편집 세포를 안정되고, 고효율로 수득할 수 있다.
도 1은 초기 및 후기 조혈내피세포의 성상을 나타낸 사진이다.
도 2a는 후기 조혈내피세포의 배양 시간에 따른 세포 형태를 나타낸 사진 및 단일 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 후기 조혈내피세포의 마커 단백질 발현을 확인한 사진이다.
도 3a는 Apel Ⅱ 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 3b는 EGM-2 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째 및 3일째의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 3c는 DMEM/F12 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 4a는 후기 조혈 내피세포에서의 마커 단백질을 확인한 결과이다.
도 4b는 CD31세포의 Tie-2 enrichment를 확인한 사진이다.
도 5a는 생쥐의 간 내 조혈내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다.
도 5b는 생쥐 AGM 내 조혈내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다.
도 5c는 각 기본 배지에서 배양한 조혈내피세포의 성상과 콜로니 형성, 림프구계 세포 및 골수구계 세포의 생성 정도를 도표화하고, 조혈내피세포의 모양의 확인한 결과이다.
도 5d는 AGM 내 분화된 세포들을 이용하여 CD45, CD4, CD8, NK1.1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계 세포의 생성 단계별 세포의 성상 및 발현 마커를 나타낸 결과이다.
도 6b는 IL-5 및 DDL1을 처리한 스팟에서 림프구계 세포로의 분화가 이루어지는지 여부를 림프루계 전사인자의 발현으로 확인한 그래프이다.
도 7a는 Bright field와 GFP를 발현하는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 6일째 및 9일째 in situ 상태를 현미경으로 확인한 이미지 사진이다.
도 7b는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 형광의 정도를 FACS로 분석하여 정성화한 그래프이다.
도 7c는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 형광의 정도를 정량화한 그래프이다.
도 8a는 MOI 10의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 세포 분열을 유도하고 GFP 형질주입된 세포와 CFSE의 공발현 여부를 세포 수준에서 확인한 결과이다. 붉은색 상자는 공발현을 나타낸다.
도 8b는 MOI 50의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 세포 분열을 유도하고 GFP 형질주입된 세포와 CFSE의 공발현 여부를 세포 수준에서 확인한 결과이다.
도 8c는 MOI 10 및 MOI 50 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 및 HDF 세포의 분열을 유도하고 6일째 및 9일째에 GFP와 PE-congugated CFSE 발현 여부를 정성화한 결과이다.
도 8d는 MOI 10 및 MOI 50의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 및 HDF 세포의 세포 분열을 유도하고, 6일째 및 9일째에 GFP를 발현하는 각 세포에서 CFSE 및 분열 세포를 정량화한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 줄기세포의 조혈 내피세포로의 분화 및 유지를 위한 배양 조건 확립
줄기세포의 조혈내피세포로의 분화 및 배양 조건을 확인하였다. 구체적으로, ㈜차바이오텍으로부터 입수한 줄기세포(이하, 'CHA52' 세포) 2.0 x105 개를 6 well 배양 접시 중, 마트리겔이 코팅된 1 well에 분주하고 이틀 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포를 기본 배지(Stemline Ⅱ 배지)에 bFGF 7 ng/㎖, CHIR 1 nM, 아스코르브산 60 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 35 ng/㎖ 및 BMP4 18 ng/㎖를 포함한 중배엽 특이 조건배지에서 3일 동안 배양하였다(이하, '단계 Ⅰ'). 이후, 상기 세포를 기본 배지(Apel Ⅱ 배지)에 bFGF 7 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 180 ng/㎖, FLT3L 150 ng/㎖, GCSF 18 ng/ ㎖, TPO 80 ng/㎖, EPO 17 ng/㎖, IL-6 25 ng/㎖ 및 IGF-1 30 ng/㎖을 포함하는 최적화된 배지에서 6일동안 추가로 배양하였다(이하, '단계 Ⅱ'). 6일째까지의 기간을 전 조혈 내피세포(pro hemogenic endothelial cell, pro HE)라고 명명하고, 6일째 되는 날 조혈 내피세포를 계대배양 하여 고순도로 분리하였다. 이때, 0.25% Trypsin/EDTA를 배양기 안에서 3분 동안 처리하여 single layer로 분포된 비 조혈 내피세포들이 먼저 떨어지는 것을 확인하였다. 이후, DPBS로 배지를 세척한 후, 0.25% Trypsin/EDTA를 추가로 처리하여 조혈 내피세포 클러스터(cluster)를 단일 세포로 분리하였다. 분리된 단일 세포를 0.44 ㎛ 필터로 여과한 후, 1 well에서 나온 세포를 2 well에 나누어 기본 배지(Apel Ⅱ 배지)에 bFGF 11 ng/㎖, VEGFA 50 ng/㎖, SCF 170 ng/㎖, FLT3L 150 ng/ ㎖, GCSF 18 ng/㎖, IL-6 35 ng/㎖, IGF-1 25 ng/㎖, IL-7 15 ng/㎖, IL-15 10 ng/㎖, IL-5 25 ng/㎖ 및 DLL1 7 ng/㎖을 포함한 조건배지에서 21일 동안 계대배양 하였다(이하, '단계 Ⅲ'). 21일까지 3~4일에 한번씩 배지의 half change를 유지하였다.
제조예 2~4.
각 단계에서 하기 표 1~3의 구성 및 함량을 포함하였다는 점을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅰ bFGF 15 ng/㎖ 9 ng/㎖ 12 ng/㎖ 17 ng/㎖
CHIR 5 nM 2 nM 4 nM 7 nM
아스코르브산 70 ng/㎖ 80 ng/㎖ 120 ng/㎖ 150 ng/㎖
VEGFA 18 ng/㎖ 22 ng/㎖ 25 ng/㎖ 30 ng/㎖
SCF 55 ng/㎖ 45 ng/㎖ 58 ng/㎖ 65 ng/㎖
BMP4 20 ng/㎖ 22 ng/㎖ 30 ng/㎖ 35 ng/㎖
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅱ bFGF 15 ng/㎖ 9 ng/㎖ 12 ng/㎖ 17 ng/㎖
VEGFA 18 ng/㎖ 22 ng/㎖ 25 ng/㎖ 30 ng/㎖
SCF 225 ng/㎖ 195 ng/㎖ 210 ng/㎖ 270 ng/㎖
FLT3L 170 ng/㎖ 190 ng/㎖ 210 ng/㎖ 230 ng/㎖
GCSF 25 ng/㎖ 23 ng/㎖ 27 ng/㎖ 30 ng/㎖
TPO 150 ng/㎖ 120 ng/㎖ 130 ng/㎖ 180 ng/㎖
EPO 23 ng/㎖ 21 ng/㎖ 25 ng/㎖ 27 ng/㎖
IL-6 35 ng/㎖ 45 ng/㎖ 55 ng/㎖ 65 ng/㎖
IGF-1 40 ng/㎖ 35 ng/㎖ 45 ng/㎖ 55 ng/㎖
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅲ bFGF 13 ng/㎖ 15 ng/㎖ 20 ng/㎖ 23 ng/㎖
VEGFA 30 ng/㎖ 70 ng/㎖ 90 ng/㎖ 110 ng/㎖
SCF 230 ng/㎖ 200 ng/㎖ 300 ng/㎖ 330 ng/㎖
FLT3L 180 ng/㎖ 210 ng/㎖ 240 ng/㎖ 270 ng/㎖
GCSF 25 ng/㎖ 22 ng/㎖ 28 ng/㎖ 32 ng/㎖
IL-6 45 ng/㎖ 40 ng/㎖ 55 ng/㎖ 65 ng/㎖
IGF-1 40 ng/㎖ 30 ng/㎖ 50 ng/㎖ 55 ng/㎖
IL-7 25 ng/㎖ 18 ng/㎖ 28 ng/㎖ 35 ng/㎖
IL-15 23 ng/㎖ 17 ng/㎖ 30 ng/㎖ 37 ng/㎖
IL-5 40 ng/㎖ 30 ng/㎖ 50 ng/㎖ 65 ng/㎖
DDL1 35 ng/㎖ 15 ng/㎖ 28 ng/㎖ 30 ng/㎖
[실시예]
실시예 1. 줄기세포의 조혈 내피세포로의 분화 확인
1-1. 조혈 내피세포의 성상 확인
상기 제조예 1의 단계 Ⅲ에서 배양한 조혈 내피세포를 배양 13일차를 기준으로 하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)와 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 나눈 후, 각 세포의 성상을 현미경(x 100, x 200 및 x 400)을 이용하여 확인하였다.
도 1은 초기 및 후기 조혈 내피세포의 성상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 초기 조혈 내피세포의 경우, 넓지 않은 분포의 세포 덩어리를 이루며 클러스터를 형성하는 것을 확인할 수 있고, 초기 조혈 내피세포 외에 다른 세포들이 함께 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이때, CD31, VE-Cadherin과 같은 조혈 내피세포의 마커 단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 배양 13일차 이후의 후기 조혈 내피세포의 경우, 초기 조혈 내피세포에 비해 더 많은 세포가 응집된 것을 확인할 수 있었으며, 여기에서 떠오르는 혈액 세포의 경우 확정적 혈액(definitive blood)의 모양을 나타내었다. 이러한 후기 조혈 내피세포는 배양 후기로 갈수록 세포질이 얇아지고 가늘어지면서 수명을 다하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 후기 조혈내피세포로부터 FLK-1+의 거핵구-적혈구의 선조세포(Progenitors)가 나오는 것을 확인할 수 있었다. 이들 한 개의 후기 조혈 내피세포에서 여러 개의 거핵구-적혈구의 선조세포들을 생성하여 clonal expansion 한 결과, 조혈 내피세포는 주로 막대기 모양(rod like cells)을 나타내어, 전형적인 혈관내피세포의 모양인 조약돌 모양(cobblestone-like cells)이나 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells)의 모양과는 차별되는 것을 확인할 수 있었다. 후기 조혈 내피세포에 의해 형성된 혈액 세포는 초기단계의 주로 원시적 혈액 세포(primitive blood, 주로 골수구계)이며, 후기 조혈 내피세포 유래 세포에서는 확정적 혈액 세포(definitive blood, 골수구계와 림프구계 모두를 포함)를 가지고 있고, 생성된 혈관 내피세포에서의 튜브 형성(tube formation)이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로 미루어 보아 조혈 내피세포는 혈관내피세포의 특성과 혈액 세포의 특성을 모두 보유하고 있는 것으로 사료된다.
도 2a은 후기 조혈 내피세포의 배양 시간에 따른 세포 형태를 나타낸 사진 및 단일 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 후기 조혈 내피세포의 배양 1일 차에서는 포르피린(porpyrin)의 전구물질인 5-아미노레불린산 합성효소(5-aminolevulinate synthase)에 의한 것으로 추정되는 밝은 빛에 의해 (하얀색 화살표로 표시) 현미경상에서 밝은 노란색 빛을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 적아구(erythroblast)를 다 생성하고 난 다음의 조혈 내피세포에서는 밝은 빛이 사라지는 것을 확인할 수 있었다(D9, 10일째 이후). 또한, 5일 째 조혈 내피세포에서는 Budding되는 적아구(erythroblast)의 모양을 확인할 수 있으며, 7일 째 이후에 적아구가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 조혈 내피세포들의 Doubling day는 1.2일 정도이며, doubling time은 평균 29.5시간 정도인 것을 확인하였다.
도 2b는 후기 조혈내피세포의 마커 단백질 발현을 확인한 사진이다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 9일째 이후 클러스터를 이루는 조혈 내피세포에서 마커 단백질인 CD31, Tie-2, CD34, 등이 발현되는 것을 확인하였으며, 일부 세포에서는 RUNX1, brachuary와 같은 중배엽 마커가 핵 안에 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 조혈 내피세포에서 혈액 세포로 떠오를 때 혈액 세포에 FLK-1 단백질이 집중적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 배양 조건에 따른 후기 조혈 내피세포의 증식 및 분화
상기 실시예 1-1에서 배양한 후기 조혈 내피세포를 1개월 동안 냉동 보관한 후, 37℃ water bath에서 해동하였다. 이후, 후기 조혈 내피세포의 증식 및 분화에 적합한 배지를 확인하기 위하여 3가지 기본 배지(Apel Ⅱ, EGM-2 및 DMEM/F12 배지)를 사용하였고, ApelⅡ 및 DMEM/F12 배지의 경우, bFGF 7 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 180 ng/㎖, FLT3L 150 ng/㎖, GCSF 18 ng/㎖, TPO 80 ng/㎖, EPO 17 ng/㎖, IL-6 25 ng/㎖, IGF-1 30 ng/㎖, IL-3 45 ng/㎖ 및 CHIR 1 nM을 첨가하였다. EGM-2 배지의 경우, 사이토카인 Lonza (cat no CC-3202)만을 추가로 첨가하였다. 이후, 냉동 후 해동된 후기 조혈 내피세포를 상기 3개의 배지에 각각 배양하였고, 모든 배지는 3~4일에 한번씩 배지의 half change를 유지하였다. 후기 조혈 내피세포의 경우, 냉동 후 해동된 혈관내피세포이기 때문에 배양 접시에 부착하여 증식할 것으로 기대하였다.
도 3a는 Apel Ⅱ 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, Apel Ⅱ 기본 배지에서는 대부분의 조혈 내피세포가 배양 접시의 부착(attachment)에 실패하고 빠르게 죽는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 7일 이후까지 생존한 조혈 내피세포의 경우, 내피세포로서의 기능이 안정화되면 백혈구 유사 세포(WBC like cell)를 생성하거나 적아구 콜로니를 형성된 것을 확인할 수 있었다. 다만, EGM-2 및 DMEM/F12 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 혈액 세포 생산량에 비하여 현저히 낮았다.
도 3b는 EGM-2 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째 및 3일째의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도3b에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포는 배양 접시에 부착 후 안정적으로 증식하였으며, 증식 속도도 다른 기본 배지에 비해 빠르고 안정적이었다. 특히, 7일 이상 증식된 조혈 내피세포의 경우, 전형적인 조약돌모양의 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell)와 비정형적인 혈관 내피세포 모양의 세포군으로 나뉘어진 것을 확인할 수 있었다. 한편, ApelⅡ 기본 배지에서 배양한 세포 중, 세포 부착이 이루어지지 않은 세포를 EGM-2 배지에서 3일 동안 배양하여 부착 세포의 증식을 유도한 후, 다시 Apel Ⅱ 배지에서 배양한 결과, 조혈 내피세포가 정상적으로 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, EGM-2 기본 배지는 조혈 내피세포의 증식과 생착에 긍정적이며, 배양 접시 내에서 조혈 내피세포가 안정적인 부착과 증식을 함으로써 혈액 세포의 생산에 영향을 미칠 수 있다.
도 3c는 DMEM/F12 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, DMEM/F12 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포는 배양 접시에 부착하여, 증식하는 것을 확인할 수 있었다. EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포와 비교하여 증식 속도가 4~5일 정도 늦었으나 조혈 내피세포의 콜로니가 다수 형성되어 8일 이후부터는 다량의 혈액세포를 안정적으로 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
1-3. 조혈 내피세포에서 발현하는 단백질 마커의 확인
상기 실시예 1-2의 기본 배지에 따라 조혈 내피세포에서 발현하는 마커 단백질의 발현을 비교하였다. 그 결과, 기본 배지에 따른 마커 단백질의 발현이 크게 다르지 않았으며, 조혈 내피세포에서 전형적인 마커 단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4a는 EGM-2 기본 배지에서 3일 동안 배양한 조혈 내피세포에서의 마커 단백질을 확인한 결과이다.
도 4b는 EGM-2 기본 배지에서 14일 동안 배양한 조혈 내피세포의 Tie-2 enrichment를 확인한 사진이다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포 그룹에서는 CD31 27.9%, CD34 8.2%, CD144 29.9%, Flk-1 4.5%의 단백질 마커가 발현되고, CD144+CD31+ 11.3%, CD144+CD34+ 8.5%, CD31+CD34+ 10.2%, Flk-1+CD34+ 4.9%의 단백질 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, CD31을 이용해 MACS sorting 한 그룹에서 Tie-2의 발현이 CD31+ 세포군에서 24.9% enrichment 되어 있음을 알 수 있었고, CD31- 세포군에서는 1.8% enrichment 되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, CD31+ 세포의 조혈 내피세포로의 commitment를 시사한다. 또한, Tie2 > CD144 > CD31 > CD34 > FLK1의 순서로 조혈 내피세포 마커가 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
1-4. 림프구계 세포의 생성 유도를 위한 조혈 내피세포의 배양 조건 확인
상기 실시예 1-2의 결과를 바탕으로 림프구계 생성을 유도하기 위한 조혈 내피세포의 배양 조건을 추가적으로 확인하였다. 먼저, 10.5~11.5 일의 생쥐 태아(rat fetus)에서 Arota gonad mesonephros (AGM)과 간조직을 분리하였다. 이후, 멸균된 1.5 ㎖ eppendorf tube 뚜껑 뒤로 mincing한 조직을 DPBS로 세척 후 상기 실시예 1-3과 동일한 3가지 배지에서 생쥐의 출생일인 20일째까지 배양하였다. 각 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 모양을 확인하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 수행하였다.
도 5a는 생쥐의 간 내 조혈 내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이고, 도 5b는 생쥐 AGM 내 조혈 내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다. 도 5c는 각 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 성상과 콜로니 형성, 림프구계 세포 및 골수구계 세포의 생성 정도를 도표화하고, 조혈 내피세포의 모양의 확인한 결과이다.
간 조직 유래 혈액세포에서는 조혈 내피세포의 획득이 거의 이뤄지지 않았으나, 조혈 내피세포에서 만들어진 혈액세포들이 간으로 침윤(infiltration) 하여 성숙하는 과정에서 각 3가지 배지에 따라 다른 경향을 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로, 도 5a에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지의 경우, 조혈 내피세포가 모두 죽는 것을 확인하였다. 반면, Apel Ⅱ 기본 배지 경우, 3일째 안에 거핵구-적혈구세포, 전적혈모구(Pronormoblast)에서 정염성적혈모구(orthochromic normoblast)까지 세포들이 빠르게 유도되어 6일 안에 세포들이 사라지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 적혈구계보다는 거핵구-적혈구세포유래 거핵모구, 거핵구 (MK-II)까지 분화가 왕성하고 전혈소판 돌기와 silia의 형성을 눈에 띄게 확인할 수 있었다. 특히, Heme 장착 적혈구 계열의 세포보다는 백혈구 계열 세포의 생성이 많은 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 5b에 나타낸 바와 같이, AGM에 존재하는 조혈 내피세포의 경우, 배지에 따라 최대 9일째까지의 배양 정도가 다른 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, EGM-2 기본 배지의 경우, 혈액 세포의 소멸이 눈에 띄게 상승한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 인간의 전분화능 유래 조혈 내피세포와는 다르게 생쥐의 조혈 내피세포는 장기간 생존하지는 않는 것을 알 수 있다. 그러나, Apel Ⅱ 기본 배지의 경우, 적혈구 계열 세포의 enrichment가 빠르게 이뤄지고 백혈구 계열 세포의 증식이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 적혈구계 세포의 분화보다 거핵구와 백혈구의 분화 정도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 간 및 AGM 유래 세포는 EGM-2 기본 배지에 비하여 DMEM/F12 및 Apel Ⅱ 기본 배지에서 부착 및 세포 증식이 활발히 이루어져 조혈 내피세포 및 혈구세포로 장기간 분화가 가능함을 알 수 있다.
도 5d는 AGM 내 분화된 세포들을 이용하여 CD45, CD4, CD8, NK1.1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, Apel Ⅱ 기본 배지의 경우 10일째에 부유세포 내 자연살해세포의 유도가 가장 높았고, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 6일째에 거핵구와 더불어 CD4, CD8 세포의 유도가 빠르게 상승하고 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 2개의 기본 배지 모두에서 AGM 유래 혈액 세포가 유지되는 것을 알 수 있다.
1-5. 인간 다능성 줄기세포의 조혈 내피세포 및 혈액세포로의 분화 확인
상기 실시예 1-4에서 생쥐 태아의 체내 유래 조혈내피세포가 혈액 세포로 분화하는 것을 확인한 것을 바탕으로, 상기 실시예 1-2의 배지에서 인간 다능성 줄기세포가 조혈 내피세포 및 혈액 세포로 분화되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 제조예 1에서 단계 Ⅰ 내지 Ⅲ에 따라 21일 동안 배양한 조혈 내피세포를 34일 째가 되는 날까지 추가로 배양하였다. 이때, 배양 28일 이후에는 조혈 내피세포의 탈락이 이루어지거나 세포 사멸의 빈도가 증가하기 때문에 조혈 내피세포의 기능적인 창(functional window)을 21~28일까지로 정하였다. 34일 째가 되는 날까지 배양한 조혈 내피세포에 한해 0.25% Trypsin/EDTA를 추가로 처리하여 세포 클러스터를 단일 세포로 분리하였다. 이후, CFU-assay를 수행하여 골수구계 세포의 콜로니 생성여부를 확인하였다.
도 6a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계 세포의 생성 단계별 세포의 성상 및 발현 마커를 나타낸 결과이다.
도 6b는 IL-5 및 DDL1을 처리한 스팟에서 림프구계 세포로의 분화가 이루어지는지 여부를 림프루계 전사인자의 발현으로 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 13일 이후 34일째까지 배양한 조혈 내피세포는 골수구계 세포의 콜로니가 생성되며 분화가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, IL-5 및 DLL1 등을 처리한 스팟(spot)에서 림프구계 전사인자(transcription factor)가 다수 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 배지는 인간 다능성 줄기세포의 장기 배양이 가능하여 조혈 내피세포 및 혈관 세포(림프구계 세포)로의 분화가 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 2. 조혈 내피세포의 형질주입(transfection) 효율성 확인
유도만능 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)를 활용하여 유전자 편집을 시도하고 있는 현재의 추세를 살펴보았을 때, 유전자 편집된 상태에서의 master cell banking 시도가 시작되고 있으며, 이는 세포치료제 시장에서의 중요성을 시사하고 있다. 그러나, 단일 복제 세포(single cloned cell)에서 세포 증식을 검증하는 과정과 한번에 한 개의 유전자의 편집 과정만 허용되기 때문에 기술적 한계가 있다. 반면, 유전자 편집된 NK 세포를 만들기 위한 다른 대안으로는 allogenic 상태의 NK 세포를 시작점으로 하여 primary PB NK 세포와 NK92mi 세포주를 활용하는 방법이 있다. 그러나, 이러한 세포들 역시 형질주입을 시도하고자 하는 바이러스 등에 내성이 있을 수 있다는 선천적 성상으로 인해 T 세포만큼 형질주입의 효율이 높지는 않다. 일반적으로 형질주입 시, 293T 세포나 HDF 세포와 같은 fibroblast를 이용한다. 특히 293T 세포와 같은 immortalized cell line 세포의 경우 세포분열이 끝까지 일어나는 성상을 가지고 있어 형질주입에 많이 사용되나 fibroblast 세포는 형질주입 후 세포의 운명(fate)이 혈액 계통 등으로 바꾸는 것이 불가능 하므로 유전자 편집된 CAR-NK 등으로 직접 분화한 후 사용해야하는 제한이 있다. 그러나 조혈 내피세포는 전구 세포의 성상이 강해 유전자 편집의 강점을 가질 수 있고 고효율을 유지할 수 있는바, CAR-NK, Universal NK로 활용할 수 있다.
따라서, 상기와 같은 배경을 바탕으로, 상기 실시예 1에서 배양 조건이 확립된 조혈 내피세포의 유전자 편집을 위한 기반 세포로서의 활용 가능성을 확인하였다. 상기 실시예 1의 조혈 내피세포에 렌티바이러스를 이용하여 GFP를 발현하는 construct를 삽입한 후, 상기 세포를 배양하였다. 배양 후 3일, 6일 및 9일째에 GFP를 보유한 세포의 빈도를 조사하였다. 구체적으로, 5 ㎍ pRSV-Rev plasmid, 5 ㎍ pCMV-VSV-G plasmid, 5 ㎍ pCgpV plasmid 및 15 ㎍ pSIH1-H1-siLUC-copGFP plasmid를 6 milion HEK-293T 세포에 lipofectamine 2000(Invitrogen, cat no TFS-11668019)을 이용하여 도입하고, 72시간 동안 배양하여 GFP가 부착된 렌티바이러스를 생산하였다. 이후, 상기 렌티바이러스를 0.45 ㎛ 필터로 여과한 후, Retro-Concentin Retroviral Concentration Reagent(System Biosciences, cat no RV100A-1)를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 농축하였다. 농축 후, QuickTiter Lentivirus Titer Kit (Cellbiolabs, cat no VPK-107)를 이용하여 렌티바이러스의 역가(titer)를 측정하고, 측정된 렌티바이러스를 실시예 1의 조혈 내피세포에 MOI(multiplicity of infection)10 또는 50으로 처리하였다. 이후, 상기 세포를 배지를 교체하지 않고 3일 동안 그대로 두었다가 3일 째에 FACS 분석군과 계속 배양군으로 나누었고, 계속 배양군은 새로운 배지로 이틀에 한번씩 교체하여 9일째까지 배양하였다. 상기 FACS 분석군과 계속 배양군을 각각 배양한 후 6일째 및 9일 째에 GFP의 감소 정도를 측정하였다. 대조군으로 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포를 사용하였고 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 7a는 Bright field와 GFP를 발현하는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 6일째 및 9일째 in situ 상태를 현미경으로 확인한 이미지 사진이다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포에서의 형질주입 효율은 MOI 10과 MOI 50에서 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, NK92mi 세포의 경우, MOI 50에서 GFP 발현 세포가 어느 정도 남아 있었으나, HDF 세포나 조혈 내피세포와 같은 정교한 형광을 보이지는 않았다.
도 7b는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 형광의 정도를 FACS로 분석하여 정성화한 그래프이다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 모든 세포는 MOI 10과 비교하여 MOI 50에서 형광의 정도가 더 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 한편, NK92mi 세포의 경우, 현미경에서 관찰되는 것과 달리(도 7a 참조) cell scattering에서 GFP 발현 세포가 풍부(enrich)하지 않은 것을 확인할 수 있었다.
도 7c는 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 형광의 정도를 정량화한 그래프이다.
그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포의 초기(3일째) 형질주입 효율은 MOI에 관계 없이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, NK92mi 세포의 경우, MOI 50에서 약 10%의 형질주입 효율을 보였으나(3일째), 시간이 지날수록 GFP 발현 세포의 빈도가 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, HDF 세포의 경우, MOI에 관계 없이 6일 째까지 증가하였으며 MOI50의 경우, 6일 째에 약 20%의 형질주입 효율을 보였으나, 6일 째 이후에 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 조혈 내피세포의 경우, MOI에 관계 없이 6일째 형질주입 효율이 가장 높았으며, 이후 감소하는 추세를 보이나, 배아줄기세포, HDF 세포 및 NK92mi 세포와 비교하여 가장 높은 효율을 나타내었다(9일째). 즉, 일 양상에 따른 조혈 내피세포는 세포 분열이 진행됨에도 불구하고 유전자 편집에 대한 정보를 안정하게 계대 세포에 전달함으로써 형질주입용 기반 세포로 활용할 수 있다.
실시예 3. 조혈 내피세포의 형질주입 안정성 확인
상기 실시예 2에서 GFP 컨스트럭트가 삽입된 조혈 내피세포의 형질주입 안정성을 확인하기 위하여, CFSE(proliferation marker)와 공발현(co-expression)하는 조혈 내피세포에서 발현하는 GFP를 정량화하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2의 조혈 내피세포 1.0 x 106개를 DPBS 1㎖를 포함한 비커에 넣고 PE-conjugated CFSE (Carboxylfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) (Invitrogen, Cat No C34573) stock 1㎕를 첨가한 후, 실온에서 20분 동안 노출하였다. 이후, 비커의 총 부피가 5㎖가 되도록 배양액을 채운 뒤, 세척하여 추가 배양하여 3일, 6일, 및 9일 째에 GFP를 보유한 세포의 빈도를 조사하고, 세포 분열이 이루어지는 세포를 FACS로 분석하여 정량화하였다. 대조군으로 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포를 사용하였고 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 8a는 MOI 10의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 세포 분열을 유도하고 GFP 형질주입된 세포와 CFSE의 공발현 여부를 세포 수준에서 확인한 결과이다. 붉은색 상자는 공발현을 나타낸다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포의 경우, 일부 세포에서 세포 분열에 성공하였고, NK92mi 세포의 경우, 다수의 세포가 분열하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 상기 세포들은 GFP 발현 세포가 관찰되지 않았는바 형질주입은 실패한 것을 확인할 수 있었다. 반면, HDF 세포 및 조혈 내피세포의 경우 일부 세포에서 세포 분열 및 형질 주입에 성공한 것을 확인할 수 있었다.
도 8b는 MOI 50의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 배아줄기세포(CHA562), HDF 세포 및 NK92mi 세포의 세포 분열을 유도하고 GFP 형질주입된 세포와 CFSE의 공발현 여부를 세포 수준에서 확인한 결과이다.
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, MOI 50에서도 MOI 10(도 8a 참조)과 유사한 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 다만, MOI 50에서는 HDF 세포 및 조혈 내피세포에서 GFP 형광의 세기가 더 강한 것으로 보아, 형질주입 세포의 빈도가 더 높은 것을 확인할 수 있다.
도 8c는 MOI 10 및 MOI 50 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 및 HDF 세포의 분열을 유도하고 6일째 및 9일째에 GFP와 PE-congugated CFSE 발현 여부를 정성화한 결과이다.
그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 조혈 내피세포 및 HDF 세포에서 double color의 존재가 확인되며, 상기 세포는 분열하면서 CFSE의 세기(intensity)가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
도 8d는 MOI 10 및 MOI 50의 상태에서 9일째까지 조혈 내피세포(HE), 및 HDF 세포의 세포 분열을 유도하고, 6일째 및 9일째에 GFP를 발현하는 각 세포에서 CFSE 및 분열 세포를 정량화한 그래프이다.
그 결과, 도 8d에 나타낸 바와 같이, HDF 세포의 경우 MOI에 관계 없이 세포 분열이 진행되는 세포 중에서 형질 주입에 성공한 세포가 약 12%의 빈도율을 나타내었으나(6일째), 9일재에 세포의 빈도가 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 조혈 내피세포의 경우, HDF 세포에 비해 형질 주입 및 세포 분열의 초기 효율은 낮았으나 9일째까지 그 효율이 유지되거나 약간 상승한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 조혈 내피세포는 세포 분열이 이루어지는 동안에도 유전자 편집 효율을 유지할 수 있어 형질 주입용 기반 세포로 활용할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 조혈 내피세포(Hemogenic endothelial cell, HEC)를 준비하는 단계;
    상기 조혈 내피세포에 유전자 편집을 위한 전달체를 투입하는 단계; 및
    유전자 편집된 조혈 내피세포를 수득하는 단계를 포함하는 유전자 편집된 조혈 내피세포를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집은 바이러스(virus)성 유전자 전달체 또는 비-바이러스(non-viral)성 전달체를 이용하여 유전자를 전달하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 바이러스성 유전자 전달체는 아데노바이러스(adeno virus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus), 레티노 바이러스(retino virus), 렌티 바이러스(lenti virus)로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 비바이러스성 전달체는 유전자의 직접 주사, 전기천공법, 유전자 총, 지질-유전자 결합체, 폴리머-유전자 결합체로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집된 조혈 내피세포는 1종 이상의 관심 유전자(gene of interest, GOI)를 표적화하여 유전자 편집된 세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 관심 유전자는 리포터 유전자와 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레 닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene) 및 항생제 저항성 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 편집된 조혈 내피세포를 수득하는 단계는 유전자 편집에 의하여 관심 유전자의 발현이 증가하거나 억제되지 않은 세포를 선택적으로 사멸시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 조혈 내피세포는 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 분화된 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 및 체세포 핵치환술에 의한 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer derived stem cell)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조혈 내피세포는
    다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하는 제1 배지 조성물을 함유하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계;
    상기 중배엽성 세포를 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 제2 배지 조성물을 함유하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계; 및
    상기 EHE를 IL-5, IL-7및 DLL을 포함하는 제3 배지 조성물을 함유하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 통하여 제조된 것이 방법.
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