CN117050943B - 一种制备巨噬细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备巨噬细胞的方法，所述方法包括（a）在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导iPSC分化成EB，和（c）将形成的HSPC与巨噬细胞集落刺激因子（M‑CSF）接触。本发明的方法能够分步体外培养iPSC，实现了向HSPC的高效分化，分化时间更短、效率更高；通过本发明的方法制备的iMAC不含生物异源成分且符合GMP标准，具有高纯度和高吞噬活性以及良好的体内持久性。

Description

一种制备巨噬细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种制备巨噬细胞的方法，特别是涉及一种从多能干细胞诱导分化巨噬细胞的方法。更具体地，本发明涉及通过分阶段在不同的特定分化因子存在下体外培养，从胚胎干细胞或者诱导的多能干细胞生产诱导巨噬细胞的方法，以及由此产生的iMAC群体及其用途。
背景技术
巨噬细胞是先天免疫反应的关键介质。巨噬细胞具有吞噬、细胞毒性、促炎因子分泌和T 细胞抗原呈递功能（参考文献Franken, L., Schiwon, M. & Kurts, C.Macrophages: sentinels and regulators of the immune system. Cell. Microbiol.18, 475–487 (2016)）。巨噬细胞可以通过多种清道夫受体、模式识别受体和吞噬受体，感知并响应感染性微生物对组织的侵袭和组织损伤。巨噬细胞还具有稳态功能，例如可以清除脂蛋白、细胞碎片和死细胞（参考文献Lavin, Y., Mortha, A., Rahman, A. & Merad,M. Regulation of macrophage development and function in peripheral tissues.Nat. Rev. Immunol. 15, 731–744 (2015)）。
人类外周血单个核细胞（PBMC）通常用于分离产生巨噬细胞。然而，尽管该分离过程相对简单，但很难从不同的供体定期获得大量高质量的细胞。因此，人类胚胎干细胞（hESC）和诱导的多能干细胞（iPSC）被提出作为起始细胞，用于开发包括诱导的巨噬细胞（iMacrophage，简称“iMAC”）内的多种细胞谱系。Ackermann, M等人的研究表明，hESC-/iPSC 来源的巨噬细胞可预防急性呼吸道铜绿假单胞菌感染发生，并且可以挽救已建立了肺部感染和严重呼吸功能不全的小鼠（参考文献Ackermann, M. et al. Bioreactor-based mass production of human iPSC-derived macrophages enablesimmunotherapies against bacterial airway infections. Nat. Commun. 9, 5088(2018)）。此外，已有报道表明，表达CAR的诱导巨噬细胞具有增强的肿瘤细胞吞噬作用和体内抗癌细胞活性（参考文献Zhang, L. et al. Pluripotent stem cell-derived CAR-macrophage cells with antigen-dependent anti-cancer cell functions. J.Hematol. Oncol. 13, 153 (2020)）。Klichinsky, M等人的研究也表明，在两种实体瘤异种移植小鼠模型中，载有抗 HER2 CAR的巨噬细胞可降低肿瘤负荷并延长总生存期；并且在人源化小鼠模型中，CAR-巨噬细胞能够诱导促炎性肿瘤微环境并增强抗肿瘤T细胞活性（参考文献Klichinsky, M. et al. Human chimeric antigen receptor macrophages forcancer immunotherapy. Nat. Biotechnol. 38, 947–953 (2020)）。与天然巨噬细胞相同，iMAC也可以极化为促炎M1型或抗炎M2型。已有报道显示，M2型iMAC在肝纤维化小鼠模型中可以减少纤维化基因和疾病相关标志物的表达（参考文献Pouyanfard, S. et al.Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liverfibrosis. Stem Cells 39, 1701–1717 (2021)）。
因此，iMAC是一种有前景的可用于多种疾病的通用型细胞治疗手段。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种制备巨噬细胞的方法，使制备得到的巨噬细胞能够极化为促炎性M1表型或抗炎性M2表型，同时具有高纯度、高吞噬活性和良好的体内持久性。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种制备巨噬细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为巨噬细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
优选地，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
优选地，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
优选地，所述HSPC具有CD34+表型。
优选地，步骤c中所述诱导是将步骤b中形成的HSPC与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）接触。
优选地，所述步骤c包括：
（c1）将步骤b中形成的HSPC加入第一培养基中进行细胞培养；
（c2）将步骤（c1）培养得到的细胞加入第二培养基中进行细胞培养，得到巨噬细胞。
优选地，所述第一培养基是X-VIVO15培养基，补充有GlutaMAX、P/S、β-巯基乙醇、M-CSF和IL-3中的一种或多种；
优选地，所述第二培养基是X-VIVO15培养基，补充有GlutaMAX、P/S、β-巯基乙醇和M-CSF中的一种或多种。
优选地，所述第一培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 β-巯基乙醇、200 ng/ml M-CSF和50 ng/ml IL-3；
优选地，所述第二培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 uM β-巯基乙醇和100ng/ml M-CSF。
优选地，步骤（c1）中所述细胞培养是培养6-8天；
优选地，步骤（c2）中所述细胞培养是培养7-9天。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的巨噬细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述巨噬细胞和药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种所述巨噬细胞或所述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤选自维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中的一种或多种。
发明的效果
本发明经过研究提供了一种用于从诱导的多能干细胞（iPSC）分化产生诱导的巨噬细胞（iMAC）的方法，该方法不含生物异源成分（xeno-free）且符合 GMP 标准，并易于实现工艺放大，由本发明方法制备的iMAC具有高纯度和高吞噬活性以及良好的体内持久性。
本发明的方法还能够在合适的条件下进行分步体外培养iPSC，成功地实现了向HSPC的高效分化，具有分化时间更短、效率更高的优势。
附图说明
图1为iMAC的分化流程图，包括从人iPSC生成3维（3D）iPSC球体，然后引导其分化为中胚层拟胚体（EB）、造血拟胚体、HSPC细胞，以及随后分化为iMAC。
图2显示了iPSC向HSPC分化过程中的细胞形态变化，比例尺=200µm，放大图像中的比例尺=100µm。其中，“D-1”指贴壁培养的iPSC, 此时细胞在iPSC培养基（E8）中；“D1”指HSPC分化的第一天，此时加入了CHIR；“D7”是收集HSPC的前一天，此时HSPC已经释放到培养基中。
图3为iPSC向HSPC分化过程中的细胞形态变化。显示了造血干细胞和祖细胞（HSPC）通过胚胎体从诱导型多能干细胞（iPSC）分化的时间线，箭头表示悬浮液中CD34+造血干细胞的出现。
图4为HSPC标志物的流式细胞术分析。A为用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表。HSPC细胞在条件6的第8天被鉴定为（CD235a-CD14-CD43+CD34+）。B为用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表；HSPC细胞在条件#6的第10天被鉴定为（CD235a-CD14-CD43+CD34+）。
图5显示了iPSC培养阶段代表性明场图像。
图6为CHIR99021的添加时间1天vs 2天的比较结果。
图7显示了细胞稳定性实验结果。
图8显示了通过本发明的方法，由iPSC衍生的HSPC的表面标志物鉴定。A和B为流式细胞术分析造血祖细胞标志物CD34和CD43表达；C为流式细胞术分析造血谱系标志物CD45和CD235a、巨噬细胞/单核细胞标志物CD14、间充质干细胞标志物CD73、和内胚层标志物CD184的表达。
图9显示了在iMAC分化的第9天和第16天，从细胞系1和细胞系2产生的分化细胞的细胞形态的代表性图像，比例尺=200µm，放大图中比例尺=100µm。
图10显示了qPCR分析结果，巨噬细胞标志物CD11b、CD14、CD16、CD163和CD68在iMAC中具有高的mRNA表达水平，作为对照的iPSC不表达这些巨噬细胞标志物。
图11显示了iMAC可以极化为促炎性M1表型或抗炎性M2表型。A为流式细胞术分析M1和M2表型，M0、M1、M2分别表示来自两个细胞系的未极化、M1型和M2型iMAC。其中，*表示p<0.05; **表示p<0.01; ***表示p<0.001; ****表示 p<0.0001。B为qPCR分析M1极化的iMAC细胞在用LPS和IFNγ刺激后的促炎细胞因子TNF、IL-1β和IL-6表达，其中以iPSC和未极化的iMAC细胞作为对照。
图12显示了使用pHrodo™ Red E. coli BioParticles™偶联物检测iMAC细胞的吞噬活性。 A为iMAC细胞的pHrodo吞噬活性测定的代表性图像；B为pHrodo阳性区域的百分比。
图13显示了对iMAC分化的表征。A为iPSC向iMAC分化过程中的细胞形态变化；B为通过流式细胞术比较iMAC（i-M0）和单核细胞来源巨噬细胞（m-M0）上巨噬细胞相关标志物（CD68, CD86, CD80）的表达，上图显示标志物阳性细胞的百分比，下图显示相应标志物的中位荧光强度（MFI）。
图14显示了iMAC的M1极化能力。A为单核细胞来源巨噬细胞和iPSC来源巨噬细胞的M1极化示意流程；B为通过流式细胞术检测在M1极化之前和之后的巨噬细胞相关标志物表达。
图15显示了iMAC对SKOV3卵巢癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用。A和B为iMAC与SKOV3细胞以多种E:T比（效靶比），在100nM抗体赫赛汀存在下，共培养2小时；流式细胞术分析以确定A吞噬百分比，和B吞噬强度。C和D为使用1:2的给定E:T比值，在不同赫赛汀浓度下，将iMAC与SKOV3细胞共培养，流式细胞术分析以确定C吞噬百分比；和D吞噬强度。
图16显示了iMAC对Raji癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用。A和B为在不同浓度的抗体Rituximab和/或 α-CD47存在下，将iMAC与Raji癌细胞共培养2小时。进行流式细胞术分析，以确定吞噬百分比A；和吞噬强度B。C为在100 nM Rituximab和/或100 nM α-CD47抗体存在下, 检查两种抗体在iMAC的Raji细胞吞噬强度上的组合效应，** p<0.005，*** p<0.001。
图17显示了CAR-iMAC表现出对SKOV3卵巢癌细胞增加的吞噬作用。A为靶向HER2的CAR结构。B为示意性显示iMAC转导和功能检测流程。C为腺病毒转导后两天，CAR在iMAC上的表达。D为腺病毒转导后两天，iMAC上CD14, CD80和 CD86的表达。E和F为吞噬性iMAC或CAR-iMAC在α-CD47抗体存在或不存在下对SKOV3细胞的吞噬百分比E和吞噬强度F。吞噬强度表示为iMAC中吞噬的肿瘤细胞的平均数；UTD：未转导的对照；空载体：使用不含CAR的Ad5F35转导的巨噬细胞；CAR-M：用含CAR的Ad5F35转导的巨噬细胞。
图18显示了iMAC在NOG-EXL小鼠中的体内持久性。A为荧光染料染色的iMAC细胞通过i.p.或i.v.施用至未荷瘤NOG-EXL小鼠中后，荧光信号随时间的变化；B为i.p.或i.v.施用后iMAC的体内分布。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
如本文中所用，术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及分化培养基包含分化因子、补充剂和基础培养基时，也意在涵盖所述的分化培养基由补充了所述分化因子和补充剂的基础培养基组成。
如本文中所用，提及添加到培养基中的因子（包括各种分化因子、生长因子和补充剂等）的浓度时，是指基于培养基的总体积计的浓度。
如本文中所用，术语“多能干细胞”是指，具有分化产生三个胚层（内胚层，外胚层，中胚层）的细胞类型的潜能的干细胞。在本发明中，多能干细胞包括例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞等。
胚胎干细胞是原始来源于胚胎的未分化的多能细胞，其可以是例如已建立的胚胎干细胞系（例如，人胚胎干细胞系MA09细胞），利用未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离或者获取的胚胎干细胞，或者是通过人工方式例如核转移从成体细胞产生的具有分化成任何细胞类型的潜能的胚胎干细胞。但需要特别指出的是，胚胎干细胞并非是指、并且不应该是指通过破坏体内发育的人胚胎而生成的细胞，也不应该是指自受精大于14天的人胚胎分离的细胞。可以使用的ES细胞包括但不限于，例如MA01、MA09、ACT-4、MA142、MA143、MA144、MA145、MA146、MA126（NED1）、MA127（NED2）、MA128（NED3）、MA129（NED4）、NED7、No. 3、H1、H7、H9、H14和ACT30 ES细胞。还可以参照NIH人类胚胎干细胞登记，获得可用的ES细胞。
诱导的多能干细胞（iPSC）是通过表达或诱导表达细胞因子而从体细胞生成的、具有分化成各种胚层的潜能的细胞。本领域已知的多种重编程方法，可以用于将体细胞重编程为诱导的多能干细胞。参见例如公开的美国专利申请号20090246875，公开的美国专利申请号2010/0210014；公布的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利8,129,187；美国专利号8,268,620；PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利8,268,620，其通过引用并入本文。通常，将体细胞重编程为去分化或多能状态，涉及重编程因子（包括转录因子）的表达。相关的转录因子可以包含以下一种或多种，或由以下一种或多种因子组成或基本上由其组成：OCT4、SOX2、KLF4和MYC（OSKM）；SOX2、KLF4和OCT4（SKO）；OCT4、SOX2、KLF4和 GLIS1（OSKG）；OCT4、SOX2、NANOG和LIN28（OSNL）；或OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28（OKSMNL）。用于将重编程因子或编码这些重编程因子的核酸引入体细胞的方法是本领域已知的，参见例如美国专利号8,268,620、8,691,574、8,741,648、8,546,140，以及美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369。也可以使用体细胞核移植技术（SCNT）生成iPSC。
在某些实施方式中，用于本发明的iPSC 可以从市售的细胞系获得，或者也可以是从以下细胞制备：骨髓细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血单核细胞、造血细胞、角质形成细胞、肝细胞、肠细胞、间充质细胞、骨髓前体细胞、脾细胞以及采集自胎盘血的CD34阳性细胞。在一些实施方案中，用于本发明方法的多能干细胞包括胚胎干细胞（ESC）或诱导的多能干细胞（iPSC），并且可以是任何合适哺乳动物来源，包括人，以及小鼠、猪、非人灵长类等，尤其是人来源的ESC或iPSC。在一些实施方案中，用于本发明的多能干细胞可以在根据本发明方法诱导分化之前或之后经遗传修饰或未经遗传修饰，以表达免疫效应分子，例如，嵌合抗原受体（CAR）或重组T细胞受体（TCR）。
如本文中所用，术语“诱导巨噬细胞”是指由多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞，诱导形成的巨噬细胞，在本文中也缩写为iMAC。
如本文中所用，术语“HSPC”或“HSC/HPC”是指造血干/祖细胞。HSPC具有自我更新能力，并且能够在诱导下产生造血谱系的其他细胞类型。通过细胞表面标记CD34和CD43的表达水平可以鉴定造血干/祖细胞。
如本文中所用，术语“HE”或“造血内皮细胞”是指，具有产生血液细胞潜能的内皮细胞。
如本文中所用，术语“拟胚体”或“EB”是指，由多能干细胞形成的具有分化潜能的多细胞三维聚集体。例如，可以在低粘附条件下在利于iPSC团聚的条件下悬浮培养iPSC，以产生3维iPSC球体，这样的球体是具有分化形成三个胚层（包括内胚胎、中胚层和外胚层）以及分化产生各种成年特化细胞群潜能的拟胚体。在无外源因子加入的情况下，该三维球体中的细胞能够自发产生分化所需的因子和信号，由此自分化以例如产生中胚层细胞等；但在本发明中，优选加入特定分化因子控制拟胚体的分化轨迹，以促进拟胚体中细胞的定向分化和/或特化。
如本文中所用，术语“中胚层拟胚体”或“中胚层EB”是指，在由多能干细胞形成拟胚体的过程中，多能干细胞被诱导向中胚层细胞定向分化而形成的拟胚体。在本发明的一些实施方案中，优选地，在含有GSK-3抑制剂（或wnt激动剂）的培养基中，由悬浮培养的多能干细胞形成中胚层EB。
如本文中所用，术语“造血拟胚体”（Hemogenic EB）是指，由中胚层拟胚体形成的、包含特化的造血内皮细胞的拟胚体。在本发明的一些实施方案中，在此造血内皮细胞的特化过程中，有利地，拟胚体依序与第一分化因子组合和第二分化因子组合接触，其中，第一分化因子组合促进拟胚体中的中胚层细胞向具有造血内皮（HE）潜能的中胚层细胞过渡，而第二分化因子组合有利于造血内皮潜能中胚层细胞特化形成造血内皮（HE）细胞。在本发明的一些实施方案中，第一和第二分化因子组合互不相同，且第一分化因子组合包含BMP4，第二分化因子组合包含BMP4、SCF2和TFGβ抑制剂，更优选地，第一和第二分化因子组合还包含生长因子，尤其是FGF2和VEGF。
如本文中所用，术语“表达标志物”或“标志物”可用于确定细胞类型的身份。细胞特异性基因的某些有信息的DNA序列可以被转录成mRNA，并且通常随后被翻译成在细胞中发挥特定功能的蛋白质（其基因产物）。标志物的表达可以通过本领域已知的方法在RNA水平或蛋白质水平上检测和定量。iPSC细胞标志物是本领域已知的，并且包括但不限于TRA-1-60、TRA-1-81、Ecat1、Nanog、Oct4 / POU5F1、Sox2、Rex1 / Zfp-42和UTF1、或其任何组合。巨噬细胞细胞标志物也是本领域已知的，并且包括但不限于，CD11b、CD45和CD68。
如本文中所用，术语“分化”是指将较低分化程度的细胞转化为较高分化程度的细胞，特别是有丝分裂后组织特异性细胞类型，的一个或多个步骤，例如将iPSC分化为iMAC。可以例如通过向细胞培养基中加入分化因子，诱导iPSC向iMAC分化。
如本文中所用，术语“合适的分化培养基”与“分化培养基”可互换使用，是指用于将iPSC分化成iMAC的任何培养基。如本文所述的分化培养基含有至少一种“分化因子”。分化因子包括但不限于导致细胞分化的生物活性多肽或小分子化合物。
如本文中所用，术语“生长因子”是指，可以引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物。
如本文中所用，HSPC分化相关的“D0天”是指，将具有三胚层分化潜能的多能干细胞（例如，ES或iPSC），置于分化条件下的当天。
本发明中涉及的因子具有本领域中的常规含义。例如，其中一些因子解释如下：
Y-27632结构如下所示，
，是一种选择性的Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。Y-27632可以与ATP竞争结合此类激酶的催化位点，从而发挥其抑制作用。
CHIR 99021结构如下所示，
，是一种有效且高度选择性的糖原合酶激酶3（GSK-3）抑制剂，可作为Wnt信号通路激活剂。
ITS-G（胰岛素-转铁蛋白-硒）是一种基础培养基补充剂。胰岛素可促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪生成、细胞内转运以及蛋白质和核酸合成。转铁蛋白是一种铁载体，也有助于降低氧自由基和过氧化物的毒性水平。硒（以亚硒酸钠的形式提供）是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅助因子，在培养基中用作抗氧化剂。
SB431542结构如下所示，
，是一种有效的转化生长因子(TGF)-β信号传导的小分子抑制剂。
如本文中所用，术语“BMP4”（骨形态发生蛋白4）是骨形态发生蛋白家族的成员。BMP4的一个例子是Uniprot登录号P12644下的人来源BMP4蛋白。
如本文中所用，术语“FGF2”（成纤维细胞生长因子2），也称为bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）和FGF-β，是由FGF2基因编码的生长因子和信号蛋白。它通过特定的成纤维细胞生长因子受体（FGFR）蛋白结合并发挥作用。FGF2的一个例子是Uniprot登录号P09038下的人来源FGF2蛋白。
如本文中所用，术语“VEGF”（血管内皮生长因子）是参与血管生成和血管生成的重要信号蛋白。VEGF的一个例子是Uniprot登录号P15692下的人来源VEGF蛋白。
如本文中所用，术语“SCF”（干细胞因子）是一种与c-KIT受体（CD117）结合的细胞因子。该细胞因子在造血、精子发生和黑色素生成中起重要作用。SCF的一个例子是Uniprot登录号P21583下的人来源SCF蛋白。
如本文中所用，术语“IL-3”（白细胞介素3）是一种具有广泛生物活性的造血生长因子。所述生物活性包括刺激未成熟多能造血干细胞和各种谱系定向祖细胞的增殖和分化，导致大多数主要血细胞类型的产生。IL-3的一个例子是Uniprot登录号P08700下的人来源IL-3蛋白。
如本文中所用，术语“M-CSF”（巨噬细胞集落刺激因子）是一种在造血前体细胞（尤其是单个核巨噬细胞）的存活、增殖和分化调节中起作用的细胞因子。M-CSF的一个例子是Uniprot登录号P09603下的人来源M-CSF蛋白。
如本文中所用，术语“GM-CSF”（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）是一种刺激造血前体细胞生长和分化的细胞因子。GM-CSF的一个例子是Uniprot登录号P04141下的人来源GM-CSF蛋白。
如本文中所用，术语“G-CSF”（粒细胞集落刺激因子）是一种在造血过程中起作用的细胞因子，控制粒细胞和单核细胞-巨噬细胞的产生、分化和功能。G-CSF的一个例子是Uniprot登录号P09919下的人来源G-CSF蛋白。
如本文中所用，术语“FLT3L”（FMS样酪氨酸激酶3配体）是一种内源性小分子，可作为细胞因子和生长因子通过激活造血祖细胞来增加免疫细胞的数量。它通过结合并激活FLT3（CD135）发挥作用。FLT3L的一个例子是Uniprot登录号P49771下的人来源FLT3L蛋白。
如本文中所用，术语“IL-6”（白细胞介素6）是一种多功能细胞因子，可调节免疫反应、造血、急性期反应和炎症反应。IL-6的一个例子是Uniprot登录号P05231下的人来源IL-6蛋白。
非另有说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另有说明，本发明所述的室温为20℃～30℃。除非另有说明，本发明所使用的各种材料和试剂，可以使用本领域常规的方法获得，也可以通过商业渠道获得，具体如下所示：
StemScale PSC悬浮培养基：ThermoFisher，#A4965001
Y27632：Tocris，#1254/#TB1254-GMP
Stemline II造血干细胞扩增培养基：Sigma，# S0192
青霉素-链霉素（P/S）：ThermoFisher，#15140122
GlutaMAX补充剂：ThermoFisher，#35050061
L-抗坏血酸：Sigma-Aldrich，#A4544
ITS-G：ThermoFisher，#41400045
BMP4：Miltenyi Biotec，#130-111-167
FGF2：Miltenyi Biotec，#130-111-167
VEGF：Miltenyi Biotec，#130-109-396
SB431542：Tocris，#1614/TB1614-GMP
SCF：Miltenyi Biotec，#130-096-695
β-巯基乙醇：ThermoFisher，#21985023
IL-3：Miltenyi Biotec，#130-095-070
M-CSF：Miltenyi Biotec，#130-096-492
Therapeak XVIVO15：Lonza，#BEBP02-061Q
DPBS：ThermoFisher，#14190-144
LPS：Sigma，#L2630
IFN- γ：Miltenyi Biotec，#130-096-484
IL-4：Miltenyi Biotec，#130-093-921
pHrodoTM Deep Red E. coli BioParticlesTM 偶联物：Invitrogen，#P35360
活/死细胞染料：Invitrogen，#L10119
PercP抗hCD3：Biolegend，#317338
BV421抗hCD19：Biolegend，#302234
PercP-Cy5.5抗hCD45：BD，#564105
Pacific blue抗hCD11b：Biolegend，#301315
APC抗hCD68：Biolegend，#333810v
FcR阻断剂：Miltenyi，#130-059-901
PE-标记的人Her2蛋白：Acro，#HE2-HP2E3
APC抗人CD14：Biolegend，#367118
PE抗人CD86：Biolegend，#374206
BV510抗人CD80：Biolegend，#305234
Adeno-X™ Rapid Titer试剂盒：Clontech，#632250
CellTrace结晶紫：Invitrogen，#C34557
XenoLight DiR：Perkin Elmer，#125964。
本发明提供了一种制备巨噬细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为巨噬细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
在某些实施方式中，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
在某些实施方式中，所述方法在制备的过程中无需滋养层。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基选自StemScale PSC、Essential 8、KSR/FGF2、mTeSR、AKIT或B8中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基为StemScale PSC。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.1-100µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.2-50µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.5-25µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为1-20µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为约约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13 μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸和ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2、1-100 ng/mL VEGF和1-20 μM SB431542。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SB431542的浓度为约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
在某些实施方式中，所述HSPC具有CD34+表型。
在某些实施方式中，步骤c中所述诱导是将步骤b中形成的HSPC与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）接触。
在某些实施方式中，所述步骤c包括：
（c1）将步骤b中形成的HSPC加入第一培养基中进行细胞培养；
（c2）将步骤（c1）培养得到的细胞加入第二培养基中进行细胞培养，得到巨噬细胞。
在某些实施方式中，所述第一培养基是X-VIVO15培养基，补充有GlutaMAX、P/S、β-巯基乙醇、M-CSF和IL-3中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述第二培养基是X-VIVO15培养基，补充有GlutaMAX、P/S、β-巯基乙醇和M-CSF中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述第一培养基中M-CSF的浓度为约20-300ng/ml。
在某些实施方式中，所述第一培养基中M-CSF的浓度为约20 ng/ml、约50 ng/ml、约70 ng/ml、约100 ng/ml、约150 ng/ml、约200 ng/ml、约250ng/ml或约300 ng/ml。
在某些实施方式中，所述第一培养基中IL-3的浓度为约10-100 ng/ml。
在某些实施方式中，所述第一培养基中IL-3的浓度为约10ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml或约100ng/ml。
在某些实施方式中，所述第二培养基中M-CSF的浓度为约100-300ng/ml。
在某些实施方式中，所述第二培养基中M-CSF的浓度为约150ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml。
在某些实施方式中，所述第一培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 β-巯基乙醇、200 ng/ml M-CSF和50 ng/ml IL-3。
在某些实施方式中，所述第二培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 uM β-巯基乙醇和100 ng/ml M-CSF。
在某些实施方式中，步骤（c1）中所述细胞培养是培养6-8天。
在某些实施方式中，步骤（c1）中所述细胞培养是培养约6天、约7天或约8天。
在某些实施方式中，步骤（c2）中所述细胞培养是培养7-9天。
在某些实施方式中，步骤（c1）中所述细胞培养是培养约7天、约8天或约9天。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的巨噬细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述巨噬细胞和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含额外的治疗剂。
本发明还提供了一种所述巨噬细胞或所述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤选自维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中的一种或多种。
实施例1：HSPC的制备（条件#8）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mM GlutaMaX、50ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。结果可以看出，本发明的方法中所生成的HSPC能够表达造血干细胞和祖细胞的细胞标志CD34和CD43，且主要细胞类型为CD34+/CD43+型，可见，该方法获得了造血谱系的HPC。
实施例2：HSPC的制备（条件#4）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021（2X）。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mM GlutaMaX、50ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。
实施例3：HSPC的制备（条件#6）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24-48小时后（第2-3天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mMGlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第4-5天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-48小时后（第6-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。
实施例4-8：HSPC的制备（条件#1-3、5、7）
实施例4-8（条件#1-3、5、7）的培养方式与实施例1基本相同，具体条件参见图2。
实施例9：HSPC稳定性试验
从形态学角度观察了在iPSC培养阶段（即图2的第0天）添加CHIR（条件6），结果如图5，可以看到，CHIR的添加使得在iPSC培养阶段及形成了iPSC球体再开始进行分化, 从而达到数量更多及均一性更好的球体进行下游的分化。
进一步尝试在iPSC诱导形成中胚层的阶段（即条件6的第1-3天），将CHIR99021的诱导时间延长为2d，结果如图6，可以看到CHIR99021只添加1天会相比于添加2天更助于从HE EB上释放出HPC细胞，对于细胞整体活性/成长也更有利。
针对条件6进行了4批次的稳定性实验，结果如图7所示，造血EB里的CD34细胞多为更早期的前体细胞(CD43-),而已经从EB球释放出来的悬浮细胞可达到>50% CD34阳性，>90% CD43阳性，说明从EB球释放的悬浮细胞多为造血谱系祖细胞。
实施例10：巨噬细胞分化
在HSPC分化第9天，收获所有培养物，此时计作巨噬细胞分化第0天。将培养物重悬在巨噬细胞分化培养基1中，所述巨噬细胞分化培养基1为补充如下成分的X-VIVO15 培养基：2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 β-巯基乙醇、200 ng/ml M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）和50 ng/ml IL-3。细胞在37°C、5% CO2孵育。
在巨噬细胞分化第4天，用巨噬细胞分化培养基1进行全培养基更换。
在巨噬细胞分化第8天，收获全部培养物，并重悬在巨噬细胞分化培养2中，所述巨噬细胞分化培养基2为补充如下成分的X-VIVO15 培养基：2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 uMβ-巯基乙醇和100 ng/ml M-CSF。
巨噬细胞分化第15-17天，收获巨噬细胞，并重接种在24孔板中用于M1/M2诱导和吞噬活性测定。
实施例11：细胞形态和巨噬细胞标记物表达
使用Leica DMi1倒置显微镜，获取相位对比图像（phase contrast images），以记录细胞系1和2在实施例1所述分化方法中于分化第9天（D9）和第16天（D16）的细胞形态。
此外，通过流式细胞术和qPCR，检测由细胞系1和细胞系2获得的iMAC（分化第22-24天收获）的巨噬细胞标志物表达。在BD Fortessa（BD Biosciences）上获取流式细胞数据，并应用FlowJo分析。在QuantStudio 7 Pro（ThermoFisher）上获取qPCR数据，并计算为相对于管家基因GAPDH的表达倍数。
流式细胞术分析结果和qPCR分析结果表明，巨噬细胞标志物CD11b、CD14、CD16、CD163和CD68在iMAC中高表达；而作为对照的iPSC不表达巨噬细胞标志物。
实施例12：iMAC极化性质
基本按照Genin 2015 BMC cancer. M1 and M2 macrophages derived fromTHP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide中描述的方法，用10 ng/ml LPS（脂多糖）和50 ng/ml IFN-γ，将诱导巨噬细胞（iMAC）极化为M1型巨噬细胞；用20 ng/ml IL-4将诱导巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。
在极化处理之后，流式细胞术分析M1极化细胞和M2极化细胞相比未极化的细胞在巨噬细胞标志物、M1和M2标志物表达水平上的改变。在BD Fortessa（BD Biosciences）上获取流式细胞数据，并应用FlowJo分析。
流式分析结果表明，由细胞系1和2诱导分化形成的iMAC能够成功极化为促炎性M1表型或抗炎性M2表型。图11中A显示，M0、M1、M2分别表示来自两个细胞系的未极化、M1型和M2型iMAC，其均表现出巨噬细胞共同标志物CD11b的高表达。相比于M2型iMAC，M1型iMAC展示出了显著上调的M1型标志物CD16表达。而相比于M1型iMAC，M2型iMAC显示出主要M2标志物CD163和CD206的表达上调。
进一步，检测M1极化的诱导巨噬细胞的功能性。用LPS和IFNγ刺激将诱导巨噬细胞极化为M1后，通过qPCR分析细胞中促炎细胞因子TNF、IL-1β和IL-6的转录水平。在QuantStudio 7 Pro（ThermoFisher）上获取qPCR数据，并计算为相对于管家基因GAPDH的表达倍数。结果显示在图11中B。结果表明，相对于iPSC和未刺激的巨噬细胞，以LPS和IFNγ刺激后的iMAC表达显著水平的促炎细胞因子，说明由本发明方法诱导分化产生的iMAC具有良好的免疫功能。
实施例13：吞噬活性测定
吞噬活性是巨噬细胞功能性的一个典型指标。在本实施例中，使用pHrodo™ RedE. coli BioParticles™偶联物检测iMAC细胞的吞噬活性。在偶联物与细胞孵育期间，保留在溶液中或与细胞非特异性结合的pHrodo™染料标记的微生物颗粒，由于细胞外环境的中性pH，将不发荧光。而通过巨噬细胞的吞噬作用摄入的颗粒将包被在细胞囊泡中，并随着囊泡中pH降低，pHrodo™标记的颗粒将发出明亮的荧光。基于此荧光，可以检测细胞的吞噬活性。
简言之，根据厂商说明书进行检测。将7.5 × 104个iMAC与pHrodoTM Deep RedE. coli BioParticles®偶联物（100 μg/mL）在37 °C孵育1小时。在孵育期间，使用LeicaDMi8进行活细胞成像；并使用FIJI分析成像数据，对pHrodo阳性区域的百分比进行定量，以评估根据实施例1方法制备的iMAC的吞噬活性。
如图12中A的活细胞成像所示，M0、M1和M2型iMAC细胞都展示出了强的大肠杆菌生物颗粒摄取活性，说明来自细胞系1和2的iMACs在三种状况（即，未极化、M1和M2极化状态）下都具有高吞噬活性。
如图12中B的定量数据所示，M0和M2型iMAC显示出比M1型iMAC明显更高的吞噬活性。
实施例14：iMAC分化表征
使用Leica DMi1倒置显微镜，获取相位对比图像（phase contrast images），以记录在实施例1所述分化培养期间第0天、第1天、第3天、第10天、第12天、第18天、第19天和第24天的细胞形态变化。图13中A显示了代表性细胞图像。
在iMAC分化后（分化第24天），细胞被消化并收获用于纯度测试。简而言之，每管3x105 个iMAC细胞用人 FcR阻断剂封闭，然后在4℃用以下抗体组在暗中染色30分钟。（1）第一组：活/死细胞染料、PercP anti-hCD3、BV421 anti-hCD19和FITC anti-hCD14；或（2）第2 组：活/死细胞染料、PercP-Cy5.5 anti-hCD45、pacific blue anti-hCD11b、FITC anti-hCD14和 APC anti-hCD68。染色后，细胞用DPBS洗涤两次并通过BD CantoII流式细胞仪检测。
通过流式细胞术，比较未极化的iMAC（i-M0）和单核细胞来源巨噬细胞（m-M0）上巨噬细胞相关标志物（CD68、CD86、CD80）的表达。单核细胞来源巨噬细胞按图14中A所示方案产生。在检测的细胞群体中测定了标志物阳性细胞的百分比；以及相应标志物的中位荧光强度（MFI）。结果显示在图13中B，表明通过本发明方法分化产生的iMAC在主要标志物表达上与单细胞来源的巨噬细胞相似。
实施例15：表征iMAC的M1极化能力
为了确定iMAC向促炎M1表型（对抗肿瘤细胞的所需表型）极化的能力，按图14中A所示的巨噬细胞极化方案，极化iPSC来源的诱导巨噬细胞（iMAC）；并与M1极化的单核细胞来源巨噬细胞进行比较。
简言之，在50 ng/ml IFNγ和10 ng/ml LPS存在下培养根据实施例1产生的iMAC两天，以极化为M1巨噬细胞。同时，从PBMC中分离CD14+单核细胞，用50 ng/ml M-CSF诱导分化6天以获得巨噬细胞（M0），并在50 ng/ml IFNγ和10 ng/ml LPS存在下培养2天，以进一步极化为M1型。极化后，收获细胞并用流式细胞仪分析以确定CD68、CD86和M1相关标志物CD80的表达。
结果显示在图14中B。iPSC来源的巨噬细胞和单核细胞来源的巨噬细胞，在M1极化处理后，M1相关标志物CD80表达水平均显著增加，表明根据本发明方法产生的iMAC具有良好的M1极化能力。
实施例16：表征iMAC的抗体依赖性细胞吞噬作用
为了确定iMAC吞噬作用的适当效靶比（E:T），在存在或不存在100 nM赫赛汀（anti-Her2）或人IgG1（hIgG1）同种型对照抗体的情况下，将2 x 104个iMAC与不同数量的CFSE标记的 SKOV3卵巢癌细胞（5 x 103、1 x 104、2 x 104、4 x 104、8 x 104）共培养。这导致E:T比率分别为1:0.25、1:0.5、1:1、1:2和1:4。在37℃和5% CO2下共培养两小时后，用活/死细胞染料和抗hCD14对细胞进行染色。使用BD Canto II进行流式细胞术分析。由CD14+细胞中 CD14+ CFSE+细胞的百分比，确定吞噬百分比；并由CD14+ iMAC细胞中的CFSE中值荧光强度（MFI），确定吞噬作用强度。结果如图15中A和B所示，在较小的E:T比值下，吞噬百分比和吞噬强度随E:T比值的增加而增加；并自1:1的E:T值起，吞噬百分比和吞噬强度达到平台。由此，选择1:2的E:T比值，用于后续的iMAC抗体依赖性细胞吞噬活性检测。
为了确定iMAC对SKOV3卵巢癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用，在给定的1:2效靶比（E:T）下，在不同浓度的抗Her2抗体赫赛汀或同种型对照抗体hIgG1（100 nM、20 nM、4nM、 0.8nM、0.16 nM和0.032 nM）存在下，共培养iMAC与SKOV3癌细胞。在 37℃和5% CO2 下共培养两小时后，用活/死细胞染料和抗hCD14对细胞进行染色。由BD Canto II进行流式细胞术分析。吞噬百分比表示为CD14+细胞中CD14+ CFSE+细胞的百分比，而吞噬强度表示为CD14+ iMAC细胞中的CFSE中值荧光强度MFI。结果如图15中C和D所示，iMAC对SKOV3癌细胞展示出显著的抗体依赖性吞噬作用。相比于阴性对照和同种型对照抗体，吞噬百分比在甚至很低浓度的赫赛汀存在下已显著增加；而自0.8nM赫赛汀起，吞噬强度也急剧升高。
类似地，为了确定iMAC对Raji淋巴瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用，在不同浓度（100 nM、20 nM、4 nM、0.8 nM、0.16 nM和0.032 nM）的同种型对照抗体hIgG1、抗CD20抗体Rituximab和/或抗CD47抗体α-CD47存在下，以给定的1:2效靶比（E:T），在37℃和5% CO2 下共培养iMAC与Raji癌细胞两小时。α-CD47（抗CD47抗体Magrolimab，之前称作Hu5F9-G4）是临床试验中最前沿的抗人CD47单克隆抗体。在共培养之后，用活/死细胞染料和抗hCD14对细胞进行染色。使用BD Canto II进行流式细胞术分析。吞噬百分比表示为CD14+细胞中CD14+ CFSE+细胞的百分比；吞噬强度表示为CD14+ iMAC细胞中的CFSE中值荧光强度（MFI）。结果如图16中A-C所示，在不同浓度Rituximab存在下，iMAC展示出Rituximab依赖性的细胞吞噬作用；α-CD47单独也增强了iMAC的吞噬；而在Rituximab和α-CD47同时存在下，ADCP进一步增强，表明两种抗体具有组合效应。
实施例17：构建并表征CAR-iMAC
构建图17中A所示的靶向HER2的嵌合抗原受体（CAR）。将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 或EGFP加HER2靶向性嵌合抗原受体（CAR）的重组腺病毒Ad5F35包装后，用Adeno-X™ Rapid Titer Kit进行滴定。
为进行病毒转导，将根据实施例1方法获得的诱导巨噬细胞（iMAC），在消化和重悬后，接种到24孔板中，每孔400 μL具有8 x 104个细胞。过夜培养后，腺病毒以不同的MOI（0、500、1000和1500）添加到每个孔中。轻轻摇动培养板并放回培养箱。2天后，消化转导的巨噬细胞用于标记表达分析和功能测定。
在转导后2天，通过流式细胞术，检查以不同MOI转导产生的CAR-iMAC细胞中CAR阳性细胞占比。结果如图17中C所示，在500-1500的MOI下均获得了高转导效率。
通过流式细胞术，分析转导的CAR-iMAC细胞上CD14、CD80和 CD86标志物的表达。为进行标志物表达分析，细胞用FcR阻断剂封闭，并与抗CD14、CD80、CD86抗体以及PE 标记的人HER2蛋白混合。在4°C暗处孵育30分钟后，用DPBS洗涤细胞两次并通过BD CantoII检测。结果如图17中D所示，与MOI=0的未转导细胞相比，转导的CAR-iMAC细胞具有更高的M1相关标志物CD80阳性表达率。
为了确定CAR 是否诱导iMAC的吞噬作用，在α-CD47（100 nM）存在或不存在下，将2x 104个未转导的iMAC（UTD）、空载体（无CAR）转导的iMAC、或CAR-iMAC（CAR-M）与4 x 104个CellTrace结晶紫标记的SKOV3细胞共培养。在37°C和5% CO2共培养两小时后，用活/死细胞染料和抗hCD14对细胞进行染色。使用BD Canto II进行流式细胞术分析。 吞噬百分比表示CD14+细胞中CD14+CellTrace Violet+细胞的百分比；吞噬强度表示为CD14+ iMAC中CellTrace Violet的中值荧光强度（MFI）。结果如图17中E和F所示，CAR显著地增强了iMAC的吞噬作用，尤其是在α-CD47抗体存在的情况下。
实施例18：iMAC的体内持久性
为了确定iMAC的体内持久性，通过将25 mg XenoLight DiR溶解在3 mL乙醇中，制备 XenoLight DiR染料原液。iMAC细胞在黑暗中用50 ug/mL该染料染色，并在37°C孵育30分钟。孵育后，将iMAC细胞在1000rpm和4°C下离心3分钟。弃去上清液，然后用1×PBS 洗涤iMAC两次，直至上清液澄清。将染色的iMAC细胞（5×106细胞）悬浮在200ul 1×PBS中，然后通过腹膜内（i.p.）或静脉内（i.v.）途径注射到NOG-EXL小鼠中。随着时间的推移，进行小鼠体内成像，并使用IVIS Lumina II分析。
如图18中A所示，使用Xenolight DIR荧光染料染色的iMAC细胞，通过i.p.或i.v.施用至未荷瘤NOG-EXL小鼠中后，荧光信号持续至少34天；并且信号在施用后的2小时（i.v.）或24小时（i.p.）达到最高，在24小时后缓慢降低。
如图18中B所示，i.v.施用iMAC后，其立即向肺部迁移（图18中B：10分钟、2小时和6小时），6小时后肝脏和腹股沟淋巴结中信号增加。之后，在肝脏、肺和腹股沟淋巴结中等同地检测到信号，24小时后肺中的信号缓慢减少，但持续到甚至21天后仍可检测。相反，i.p.注射iMAC细胞后，发现在整个观察期该细胞停留在腹腔中，信号持续34天。
这些数据表明，由本发明分化方案获得的iMAC具有良好的体内持久性。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (9)

1.一种制备巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为巨噬细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和ROCK抑制剂（Rki）Y27632的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导；
其中，所述CHIR 99021的浓度为1-20µM，所述Y27632的浓度为5-50 μm；
所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC；
所述BMP4、FGF2、VEGF、SCF的浓度为1-100 ng/ml，所述SB431542的浓度为1-20μm；
步骤c中所述诱导是将步骤b中形成的HSPC与巨噬细胞集落刺激因子接触；
所述步骤c包括：
（c1）将步骤b中形成的HSPC加入第一培养基中进行细胞培养；
（c2）将步骤（c1）培养得到的细胞加入第二培养基中进行细胞培养，得到巨噬细胞；
其中，所述第一培养基补充有150-250 ng/ml M-CSF和25-75 ng/ml IL-3；
所述第二培养基补充有100-150 ng/ml M-CSF；
所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行；
所述HSPC具有CD34+CD43+表型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b1）所述培养基中还补充有青霉素-链霉素（P/S）、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b2）所述培养基中还补充有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b3）所述培养基中还补充有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基中还补充有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 μm/ml抗坏血酸、1% ITS-G。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述第一培养基是X-VIVO15培养基，还补充有GlutaMAX、P/S和β-巯基乙醇；
所述第二培养基是X-VIVO15培养基，还补充有GlutaMAX、P/S和β-巯基乙醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述第一培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1 μm β-巯基乙醇、200 ng/ml M-CSF和50 ng/ml IL-3；
所述第二培养基补充有2mM GlutaMAX、1% P/S、0.1μm β-巯基乙醇和100 ng/ml M-CSF。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（c1）中所述细胞培养是培养6-8天；步骤（c2）中所述细胞培养是培养7-9天。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨噬细胞可以极化为促炎性M1表型或抗炎性M2表型。
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