CN115433715A

CN115433715A - 一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用

Info

Publication number: CN115433715A
Application number: CN202210974483.XA
Authority: CN
Inventors: 龚士欣; 顾雨春; 李楠; 蒋明月; 曹文华; 彭钦清; 吴理达
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-08-15
Filing date: 2022-08-15
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2042-08-15
Also published as: WO2024037011A1; CN115433715B

Abstract

本发明涉及一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用，涉及生物医药技术领域，包括第一阶段培养基至第六阶段培养基；所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培养基，所述第二阶段培养基为含有GSK‑3β抑制剂的E8完全培养基，第三阶段培养基包括M1培养基和M2培养基，所述第四阶段培养基为M3培养基，所述第五阶段培养基为M4培养基，所述第六阶段为M5培养基。通过优化培养方式和培养条件，提高巨噬细胞产量，并且降低培养成本，1个iPSC约可获得18.8万个巨噬细胞，且获得的巨噬细胞具有良好的吞噬功能。

Description

一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用。

背景技术

巨噬细胞(Macrophages)是先天免疫系统的关键组成部分，分布在多种组织和器官中。巨噬细胞参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)，巨噬细胞在非特异性免疫中发挥清除细菌、病毒、真菌病原体的作用，在特异性免疫应答中起抗原提呈和产生相应细胞因子的作用。巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下,表现出明显的功能差异。目前根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞，和M2型即替代性活化的巨噬细胞。此外，巨噬细胞是一种多分化来源的细胞，单核细胞、CD34+造血干细胞、早期的T淋巴细胞等在一定条件下都可以分化为巨噬细胞。

目前，体外实验所用人类巨噬细胞主要有两种来源，一种是肿瘤衍生细胞系，如U937和THP-1等细胞系；另一种是原代细胞如外周血单核细胞来源的巨噬细胞。前者来源的巨噬细胞具有无限增殖的潜能，在巨噬细胞相关生物学研究中发挥了重要的作用，但同原代巨噬细胞相比，这些永生化的细胞系容易发生非正常的遗传结构改变，导致功能的缺失，严重限制了其在相关研究中的应用。而来源于外周血的巨噬细胞虽然相对交易获得，但是其不能自我更新，缺乏增殖能力，且较难对其进行基因编辑，导致试验结果不具代表性。

诱导性多能干细胞(iPSC)在体外能够诱导分化为巨噬细胞。利用iPSC诱导产生的巨噬细胞，由于来源丰富、获取相对容易、能获得个体特异性的iPSC等优点，受到广泛的关注。但iPSC向巨噬细胞分化的机制尚不明确，且诱导的效率较低。目前诱导巨噬细胞分化主要有单层贴壁诱导和形成拟胚体(embryoid body，EB)两种方式。Cao et al(Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages fromhiPSCs with Peripheral Blood Derivatives)通过单层贴壁诱导获得悬浮的造血干细胞，随后继续诱导获得单核细胞，再进一步诱导巨噬细胞分化；该方案的产率为1个iPSC获得约36.83±10.40个单核细胞，获得单核细胞周期为15天，继续分化7天可以获得巨噬细胞，但是该方案使用的细胞因子复杂，诱导产率低，不利于用于大规模的诱导策略。Zhanget al.(Pluripotent stem cell-derived CAR-macrophage cells with antigen-dependent anti-cancer cell functions)采用形成EB的方式制备巨噬细胞，iPSC诱导10天后将EB贴壁到有matrigel包被的培养板中，继续培养到27天获得巨噬细胞，该方案1个iPSC约获得大约50个巨噬细胞，但是该方案培养基配方复杂，产量低，1个iPSC只能获得约50个巨噬细胞。专利CN109082411B公开了一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法，培养基配方复杂，成本高，诱导iPSC逐步形成拟胚体、中胚层细胞、造血细胞、髓系细胞、巨噬细胞、成熟巨噬细胞，整个过程历时29天，但是该方案最后一种培养基中使用了胎牛血清，引入外源性物质。

因此，开发出一种高效、稳定、成本低的iPSC分化获得巨噬细胞的诱导用培养基及方法具有重要意义。另外，本申请人已经申请了专利申请号为CN202210677254.1，专利名称为一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用的专利。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、方法及其应用。目的是通过优化培养方式和培养条件，提高巨噬细胞产量，并且降低培养成本，1个iPSC约可获得18.8万个巨噬细胞，且获得的巨噬细胞具有良好的吞噬功能。

本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基、第五阶段培养基和第六阶段培养基；其中iPSC分化随着时间依次进行第一阶段至第六阶段的培养，依次采用第一阶段培养基至第六阶段培养基的培养基；

所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培养基，所述第二阶段培养基为含有GSK-3β抑制剂的E8完全培养基，第三阶段培养基包括M1培养基和M2培养基，所述第四阶段培养基为M3培养基，所述第五阶段培养基为M4培养基，所述第六阶段为M5培养基；

所述M1培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、BMP4、VEGF和bFGF，所述M2培养基包括M1培养基和TGF-βI型受体ALK5、ALK4和ALK7的抑制剂；

所述M3培养基包括X-VIVOTM 15、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、NEAA、β-巯基乙醇、BMP4、VEGF、bFGF、SCF、IL-3和M-CSF；

所述M4培养基包括X-VIVOTM 15、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、NEAA、β-巯基乙醇、IL-3和M-CSF；

所述M5培养基包括X-VIVOTM 15、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、NEAA、β-巯基乙醇和M-CSF。

本发明的有益效果是：通过采用优化的培养基，提高巨噬细胞产量，并且降低培养成本，1个iPSC约可获得18.8万个巨噬细胞，且获得的巨噬细胞具有良好的吞噬功能。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述第一阶段培养基中的ROCK通路抑制剂选自Y-27632、Thiazovivin、Fasudil(HA-1077)HCl、GSK429286A、RKI-1447和Azaindole 1中的任意一种；优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632；

所述第二阶段培养基中的GSK-3β抑制剂选自CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib和SB415286中的任意一种；优选地，所述GSK-3β抑制剂为CHIR-99021；

所述M2培养基中的TGF-βI型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂选自SB431542、Galunisertib(LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124和GW788388中的任意一种。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过采用优选的ROCK通路抑制剂、GSK-3β抑制剂及TGF-βI型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂，能够最优化的提高巨噬细胞产量，并且降低培养成本。

进一步，所述Y-27632的浓度为0.5-20uM，优选地，所述Y-27632的浓度为10uM，所述聚乙烯醇浓度为4mg/mL；

所述CHIR-99021的浓度为1-10μM，优选地，所述CHIR-99021的浓度为10μM；

所述第三阶段培养基中，所述M1培养基包括50wt％stempro-34完全培养、50wt％DMEM/F12、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、50μg/mL BMP4、50μg/mL VEGF和50μg/mL bFGF，所述M2培养基包括M1培养基和1-9μMSB431542；优选地，所述SB431542的浓度为6μM；

所述第四阶段培养基中，所述M3培养基包括X-VIVOTM 15、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、50μg/mL BMP4、50μg/mL VEGF、50μg/mL bFGF、50μg/mL SCF、25μg/mL IL-3和100μg/mL M-CSF；

所述第五阶段培养基中，所述M4培养基包括X-VIVOTM 15、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、25μg/mL IL-3和100μg/mL M-CSF；

所述第六阶段培养基中，所述M5培养基包括X-VIVOTM 15、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇和100μg/mL M-CSF。

采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述第一阶段培养基至第六阶段的培养基能够能够最佳化的提高巨噬细胞产量，并且最大化的降低培养成本。

进一步，还包括第七阶段培养基，所述第七阶段培养基包括M6培养基或M7培养基；

所述M6培养基包括X-VIVOTM 15、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、20μg/mL IFN-γ和50μg/mL LPS；

所述M7培养基包括X-VIVOTM 15、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、20μg/mL IL-4和20μg/mL IL-13。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过采用第七阶段培养基可以使M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化。

第二个目的是提供一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的试剂盒，包括上述所述的第一阶段培养基至第六阶段培养基，或包括上述所述的第一阶段培养基至第七阶段培养基。

采用上述方案的有益效果是：通过将第一阶段培养基至第六阶段培养基或第一阶段培养基至第七阶段培养基制成试剂盒，便于将iPSC便捷的培养成巨噬细胞。

第三个目的是提供一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

S1：第一阶段，拟胚体的形成：在常氧条件下，采用如权利要求1-3中任一项所述的第一阶段培养基对iPSC进行悬浮培养1天，形成拟胚体；

S2：第二阶段，拟胚体向中胚层分化：在缺氧条件下，采用权利要求1-3中任一项所述的第二阶段培养基对所述拟胚体进行诱导分化培养1天，形成中胚层细胞；

S3：第三阶段，中胚层细胞向生血内皮细胞分化：在缺氧条件下，采用如权利要求1-3中任一项所述的第三阶段培养基对所述中胚层细胞进行诱导培养3天，形成生血内皮细胞；

第三阶段的前1天采用如权利要求1-3中任一项的所述M1培养基对所述中胚层细胞进行诱导培养，第三阶段的后两天采用如权利要求1-3中任一项所述的M2培养基替换M1培养基继续诱导培养；

S4：第四阶段，生血内皮细胞向髓系祖细胞分化：在常氧条件下，采用如权利要求1-3中任一项所述的第四阶段培养基，在有基质胶包被的细胞培养皿中对所述生血内皮细胞进行诱导培养8天，形成髓系祖细胞；

S5：第五阶段，髓系祖细胞向单核细胞分化：在常氧条件下，采用如权利要求1-3中任一项所述的第五阶段培养基对所述髓系祖细胞进行诱导培养14天，形成单核细胞；

第五阶段的前7天在有基质胶包被的细胞培养皿中对所述髓系祖细胞进行诱导培养，第五阶段的后7天在没有基质胶包被的细胞培养皿继续进行诱导培养；

S6：第六阶段，单核细胞向M0型巨噬细胞分化：在常氧条件下，采用如权利要求1-3中任一项所述的第六阶段培养基对单核细胞进行诱导培养7天，得到M0型巨噬细胞。

其中，所述有基质胶包括但不仅限于Mtrigel、Geltin(明胶，CAS No.:9000-70-8)、Lamin521或者Fibronection。

采用上述方案的有益效果是：通过采用优化培养方式和培养条件，提高巨噬细胞产量，并且降低培养成本，1个iPSC约可获得18.8万个巨噬细胞，且获得的巨噬细胞具有良好的吞噬功能。

进一步，还包括S7：第七阶段，M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞分化

(1)若需极化获得M1型巨噬细胞，Day34-Day35，在常氧条件下，采用上述所述的M6培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养，得到M1型巨噬细胞；或者，在常氧条件下，采用如权利要求4中所述的M7培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养，得到M2型巨噬细胞，在常氧条件下，再采用如权利要求4中所述的M7培养基对M2型巨噬细胞进行诱导培养2天，得到M1型巨噬细胞；

(2)若需极化获得M2型巨噬细胞，Day34-Day35，在常氧条件下，采用上述所述的M7培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养，得到M2型巨噬细胞。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述优化培养方式和培养条件，可以使M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化，且使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。

进一步，步骤S1，S4-S7中所述在常氧条件下为5％CO₂，37℃，步骤S2-S3中所述在缺氧条件下为5％CO₂，90％N₂，37℃；

步骤S3中，第3天进行半换液1次，步骤S4至S6中，每3天半换液1次。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述最优化培养方式和培养条件，能够使iPSC最优化的转化为巨噬细胞。

第四个目的是提供一种药物组合物，包括上述制备得到的M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞中的一种或二种以上。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。

优选地，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。

优选地，所述药物组合物中的活性成分(本发明的M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞中的一种或二种以上)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。

优选地，所述药物组合物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。

第五个目的是提供一种药物组合物的应用，所述药物组合物在制备治疗和/或预防血液系统疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物中的应用。

优选地，所述血液系统疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症；

优选地，所述自身免疫性疾病包括难治性类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、幼年特发性关节炎、系统性硬化症、韦格纳肉芽肿、抗磷脂抗体综合症、严重性重症肌无力、克罗恩病、Ⅰ型糖尿病、重症联合免疫缺陷症；

优选地，所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、鼻咽癌、腹膜后卵黄囊瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、肾母细胞瘤、肝癌、恶性神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。为了进一步解释本发明，对本发明中涉及到的部分专业术语进行如下解释：

“干细胞”指未分化或未充分分化的细胞，其一方面能够自我复制(self-renewing)，即产生更多的与其自身相同的细胞，另一方面是能够分化为两种或更多种成熟细胞类型。根据干细胞的来源，可以将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞可来自早期动物胚胎，例如胚泡(即早期胚胎)的内细胞团，具有分化为身体每种细胞类型的能力(全能性)。成体干细胞存在于成体的各种器官和组织中，具有分化并替换其所在组织的细胞的能力(多能性)。造血干细胞(HSC)就属于成体干细胞，存在于骨髓中，具有分化为各种血液细胞的能力。造血干细胞(HSC)能够产生髓系和淋巴系祖细胞二者，进而产生髓系细胞(如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、红细胞、血小板等)和淋巴系细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞等)。干细胞的自我复制和分化为多种或特定细胞类型的能力使得其成为细胞替代疗法的核心。

“诱导多能干细胞(iPSC)”指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞(如成纤维细胞)获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4；Sox基因家族的某些成员(例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。目前已经可以从市场上购得用于制备iPSC的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的iPSC。hiPSC指从人体细胞诱导获得的iPSC。一个具体实例中，所用的hiPSC是按照中国专利公开CN113462638A中描述的方法(例如采用重编程因子组合OCT4、SOX2、E6和E7)制备，在此通过引用将该专利文献全文并入本文。

iPSC细胞可以来自任何物种。已经成功利用小鼠和人类细胞产生了iPSC细胞。此外，已经使用胚胎、胎儿、新生儿和成体组织成功产生了iPSC细胞。因此，人们可以很容易地应用任何物种的供体细胞产生iPSC细胞。因此，人们可以从任何物种产生iPSC细胞，包括但不限于人类、非人类的灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛，羊等)、狗(家养的和野生的狗)、猫科动物(家养的和野生的猫科动物，如狮、虎、猎豹)、兔子、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)等。

“拟胚体(EB)”，是指胚状体或聚集体，是指包含分化细胞，部分分化细胞和/或悬浮培养的多能干细胞的均质或异质细胞簇。为了概括体内分化固有的一些线索，本发明使用三维拟胚体作为中间步骤。在细胞聚集开始时，可以启动分化并且细胞可以在有限程度上开始以重现胚胎发育。虽然它们不能形成滋养外胚层组织，但是生物体中存在的几乎所有其他类型的细胞都可以发育。本发明可以进一步促进拟胚体形成后的造血祖细胞分化。

“中胚层细胞”指在三胚层动物的胚胎发育过程中，在原肠胚末期处在外胚层和内胚层之间的细胞层。中胚层细胞可发育为躯体的真皮、肌肉、骨骼及其他结缔组织和循环系统，包括心脏、血管、骨髓、淋巴结、淋巴管等；体腔末、内脏的浆膜和系膜，以及内脏中结缔组织、血管和平滑肌等；肾脏、输尿道、生殖腺(不包括生殖细胞)、生殖管、肾上腺的皮质部等。在本文中，中胚层细胞指诱导多能干细胞(iPSC)在中胚层诱导培养基中培养后所产生的具有中胚层细胞标志物(如Braychury)的细胞。相应地，将iPSC诱导培养成中胚层细胞的过程称为“中胚层诱导(mesoderm induction)”。本领域已知从诱导多能干细胞(iPSC)产生中胚层细胞的方法，例如已经有商业化的中胚层诱导培养基，例如STEMdiff^TM中胚层诱导培养基；另外，中国专利公开CN 111321110 A描述了从iPSC诱导产生中胚层细胞的方法，中国专利公开CN106867961A描述了用于从iPSC诱导产生中胚层细胞的培养基和方法，在此通过引用将这些专利文献引入本文。

“生血内皮细胞”是指能分化产生造血细胞或内皮细胞类型的细胞，其可表达PECAM-1、VE-钙粘蛋白和/或Endoglin(例如，PECAM1+VE-Cad+Endoglin+造血性PVE-HE)，并可选地来源于多能干细胞。可以基于许多结构和功能特性来描述这些细胞，包括但不限于表达(RNA或蛋白质)或缺乏表达(RNA或蛋白质)一种或多种标记。生血内皮细胞的特征是标记CD34的表达和CD235a的不表达。例如，至少大约50％、至少大约60％，或至少约70％。

“单核细胞”是指由骨髓中的造血干细胞分化而来，并在骨髓中发育的细胞。可进一步分化为成熟的巨噬细胞和树突状细胞的。单核细胞具有明显的变形运动的特点，具有吞噬和清除受伤、衰老的细胞及其碎片的能力。此外，单核细胞还参与免疫反应，将吞噬抗原后所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，继而诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。本申请中，单核细胞是由诱导多能干细胞经特定条件分化而来，其功能不受影响。

“巨噬细胞(Macrophage)”通常是指一种由单核细胞(Monocyte)穿出血管后发育而来的髓样免疫细胞，广泛分布于机体组织的各个脏器中。其在正常组织中的主要生理作用是：通过加工和呈递抗原的方式介导特异性免疫反应；以固定细胞或游离细胞的形式吞噬并降解坏死细胞、碎片和异物，继而参与机体内非特异性反应；通过分泌炎症因子激活淋巴球或其他免疫细胞，进而协调炎症过程。

“LNCaP细胞”是指最初从人前列腺腺癌的转移病灶分离的人前列腺癌细胞系(PC3细胞)。与PC3细胞不同，LNCaP细胞的生长是雄激素依赖性的。

“治疗和/或预防”，是指预防、逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进展，治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，例如，本文中所使用“治疗和/或预防血液系统疾病”包括以下一种或多种：(1)预防血液系统疾病的发生；(2)抑制血液系统疾病的发展；(3)治愈血液系统疾病；(4)缓解血液系统疾病患者的相关症状；(5)减轻血液系统疾病的严重程度；(6)防止血液系统疾病的复发。

附图说明

图1为本发明的iPS细胞在4倍光学显微镜下细胞形态图；

图2为本发明的分化进程中Day 0、Day 4、Day 12、Day19、Day 26、Day 33细胞在4倍光学显微镜下细胞形态图；

图3为本发明M1和M2细胞形态图；

图4为本发明分化第4天CD34和CD235a表达情况检测图；

图5为本发明分化第12天CD45、CD14和CD11b表达情况检测图，其中，A图：CD45、CD11b，B图：CD45、CD14；

图6为本发明分化第19天CD45、CD14和CD11b表达情况检测图，其中，A图：CD45、CD11b，B图：CD45、CD14；

图7为本发明分化第26天CD45、CD14和CD11b表达情况检测图，其中，A图：CD45、CD11b，B图：CD45、CD14；

图8为本发明分化第26天吉姆萨染色图；

图9为本发明分化第33天CD45、CD14和CD11b表达情况检测图，其中，A图：CD45、CD11b，B图：CD45、CD14；

图10为本发明极化M1和M2的CD206和CD80表达情况检测图，其中，A图：M1的CD206，B图：M1的CD80，C图：M2的CD206，D图：M2的CD80；

图11为本发明M2向M1转化细胞形态观察图；

图12为本发明M2向M1转化流式检测CD80和CD206表达情况图，A图：M2的CD206，B图：M2的CD80，C图：M2转化为M1的CD206，D图：M2转化为M1的CD80；

图13为本发明极化获得的M2吞噬实验验证图；

图14为本发明细胞产量图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明使用的实验材料：本发明实施例中涉及到的实验材料见表1。

表1实验材料

实施例1：诱导iPSC分化获得巨噬细胞

1、诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法

本实施例涉及的诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

1)拟胚体(Embryoid bodies，EB)的形成

(1)iPSC由北京呈诺医学科技有限公司自行制备，采用专利申请CN202110733296.8中所述方法制备而得，也可采用专利申请CN201910110768.7中的制备方法制备而得，还可以由本领域公知方法或商品化试剂盒制备而得。iPSC生长汇合度达到70％后(细胞形态图详见图1)，吸去上清，加入提前预热的DPBS(杜氏磷酸缓冲液)清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple(重组酶tryple，Tryple Express)消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，加入含有10μM Y-27632的E8和4mg/mL聚乙烯醇(PVA)的完全培养基重悬细胞，进行细胞计数。

(2)调整细胞密度为1.0×10⁴-2×10⁴/mL，接种细胞到低吸附六孔板中，每孔3mL培养基，即10-50万细胞每孔(优选30万细胞每孔)，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时，记为Day-1，得到EB；

其中，ROCK通路抑制剂还可以为Thiazovivin、Fasudil(HA-1077)HCl、GSK429286A、RKI-1447或Azaindole 1。

2)诱导启动拟胚体向中胚层分化

将EB转移到离心管中，20g离心2min后去除上清，加入含有10μMGSK-3β抑制剂CHIR-99021的E8完全培养基，启动中胚层分化，记为Day0，开始置于5％CO₂，90％N₂，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时，得到中胚层细胞(细胞形态图详见图2中Day 0图)；

其中，GSK-3β抑制剂还可以为SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib或SB415286。分化诱导基础培养基还可以为E8完全培养基(TeSR^TM-E8^TM，购于北京诺为生物)、StemPro-34(

-34SFM，购于普飞生物)、

II(购于北京诺为生物)或STEMdiff^TMAPEL^TM2Medium(购于北京诺为生物)。

3)诱导中胚层细胞向生血内皮细胞分化

(1)Day 1更换为M1培养基，M1培养基由50％stempro-34完全培养、50％DMEM/F12(购于尚恩生物)、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITSE，购于研卉)、50μg/mL BMP4(蛋白编号：P12644(S293-R408))、50μg/mLVEGF(血管内皮生长因子)、50μg/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，将上述Day 0得到的EB重悬于M1培养基中，放于5％CO₂，90％N₂，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时；

(2)Day2更换为M2培养基，M2培养基在M1基础上加入6μMSB431542抑制剂(TGF-βI型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂)，每孔加入3mL，将上述Day1的EB重悬于M2培养基中，放于5％CO₂，90％N₂，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时；

(3)Day 3半换液，将培养板静置1min，去除1.5mL的上清，加入新的1.5mL的M2培养基，得到生血内皮细胞。

其中，TGF-βI型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂还可以为1-12μM Galunisertib(LY2157299)、1-12μM LY2109761、1-10μM SB525334、1-10μM SB505124或1-10μMGW788388。

4)诱导生血内皮向髓系祖细胞(Myeloid progenitor)分化

分化第4天，将EB转移到有基质胶Matrigel前包被的细胞培养皿中，同时更换M3培养基，M3培养基包括X-VIVOTM 15、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、50μg/mL BMP4、50μg/mLVEGF、50μg/mL bFGF、50μg/mL SCF、25μg/mL IL-3、100μg/mL M-CSF，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞至Day 12，期间每3天半换液1次，获得髓系祖细胞。分化进程中Day 4、Day 12细胞在4倍光学显微镜下细胞形态图见图2。Day4收取悬浮细胞进行流式检测，检测CD34和CD235a表达情况(详见图4)。Day 12收取悬浮细胞进行流式检测，检测CD45、CD14和CD11b表达情况(详见图5)。

其中，培养皿包被基质还可以为Mtrigel、Geltin(明胶，CAS No.:9000-70-8)、Lamin521或者Fibronection。

5)诱导髓系细胞向单核细胞分化

(1)分化第13天，更换M4培养基，M4培养基包括X-VIVOTM 15、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、25μg/mL IL-3、100μg/mL M-CSF，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞至Day 19，期间每3天半换液1次；

Day 19收取悬浮细胞进行流式检测(详见图6)，流式检测CD45、CD14和CD11b表达情况。

(2)分化第20天将悬浮细胞转移到不进行包被的培养皿中，调整细胞密度为1.0×10⁵/cm²，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞至Day 26，期间每3天半换液1次，得到单核细胞。分化进程中Day19、Day26细胞在4倍光学显微镜下细胞形态图见图2。Day 26收取悬浮细胞进行流式检测，流式检测CD45、CD14和CD11b表达情况(详见图7)。检测分化第26天吉姆萨染色，详见图8。

6)诱导巨噬细胞M0分化

分化第27天，调整细胞密度为3.0×10⁴/cm²，更换M5培养基，M5培养基包括X-VIVOTM 15、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、100μg/mL M-CSF，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞至Day 33，期间每3天半换液1次，得到M0型巨噬细胞。分化进程中Day33细胞在4倍光学显微镜下细胞形态图见图2。Day 33收取悬浮细胞进行流式检测，流式检测CD45、CD14和CD11b表达情况(详见图9)。

7)诱导巨噬细胞分别向M1和M2极化

(1)分化第34天，对获得的M0巨噬细胞进行极化。如果要极化获得M1巨噬细胞，则需要更换M6培养基，M6培养基包括X-VIVOTM 15、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、20μg/mL IFN-γ和50μg/mL LPS(脂多糖，Sigma-Aldrich)，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞2天，得到M1型巨噬细胞，

(2)如果需要极化获得M2巨噬细胞，则需要更换M7培养基，M7培养基包括X-VIVOTM15、1％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、1×NEAA、55μMβ-巯基乙醇、20μg/mL IL-4(白细胞介素，购于赛业生物科技有限公司)和20μg/mL IL-13(重组人白介素13，购于艾美捷科技)，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞2天，得到M2型巨噬细胞。收取M1和M2的悬浮细胞进行流式检测，检测CD206、CD80表达情况(详见图10)。

(3)诱导M2向M1极化

将极化获得的M2转化成M1。吸引器吸去旧液，加入新的M7培养基，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞2天，得到M1型巨噬细胞。M2向M1转化细胞形态观察见图11。M2向M1转化流式检测，检测CD80和CD206表达情况(详见图12)。

2、悬浮细胞流式检测

悬浮细胞流式检测的具体实验步骤如下：

(1)将上清转移到15mL离心管中，250g离心5min，去除上清；

(2)加入1mL DPBS清洗细胞1次；

(3)用100μL含4％FBS的DPBS重悬细胞；

(4)加入相应的流式检测抗体，4℃孵育30min；

(5)250g离心去除上清，加入1mL DPBS清洗细胞3次；

(6)200μL DPBS重悬细胞后进行上机检测。

3、实验结果

本实施例iPSC细胞在4倍光学显微镜下细胞形态见图1，由图1可见iPSC汇合度达到70％-80％开始进入分化。

本实施例分化进程中Day 0、Day 4、Day 12、Day19、Day 26、Day 33细胞在4倍光学显微镜下细胞形态见图2；由图2可知，分化第0天形成比较均一的拟胚体，分化第4天拟胚体出现大小不一的腔体，分化第12天开始出现悬浮细胞，分化第19天悬浮细胞不断增加，形成细胞集落，分化第26天细胞呈现较大的泡沫化形态，分化第33天细胞多呈现贴壁短纤维状，另外一部分呈现圆形轻微贴壁状态。

本实施例M1和M2细胞形态见图3；由图3可知，M1呈现多边形的纤维状形态，并成集落生长；M2多为半贴壁的圆形形态，部分呈现短纤维状。本实施例分化第4天CD34和CD235a表达情况检测见图4，由图4可知，分化第4天流式检测CD235a不表达，约有69％的CD34+细胞，说明此时生血内皮细胞的比率接近70％。

本实施例分化第12天CD45、CD14和CD11b表达情况检测见图5，由图5A-5B可知，分化第12天流式检测悬浮细胞约有98％表达CD45，约有15％细胞表达CD11b，约有9％细胞表达CD14，表明分化第12天造血祖细胞率达到98％，且开始向单核细胞分化。

本实施例分化第19天CD45、CD14和CD11b表达情况检测见图6，由图6A-6B可知，分化第19天流式检测悬浮细胞约有94％表达CD45，约有87％细胞表达CD11b，约有73％细胞表达CD14，表明分化第19天单核细胞率可达到73％。

本实施例分化第26天CD45、CD14和CD11b表达情况检测见图7，由图7A-7B可知，分化第26天流式检测悬浮细胞约有99.96％表达CD45，约有92.5％细胞表达CD11b，约有98.3％细胞表达CD14。本实施例分化第26天吉姆萨染色见图8，由图8可知，分化第26天单核细胞吉姆萨染色观察细胞呈现单一细胞核形态。此时单核细胞比率接近100％。此时，每个IPSC可产生单核细胞数量约10万；

本实施例分化第33天CD45、CD14和CD11b表达情况检测见图9，由图9A-9B可知，分化第33天流式检测悬浮细胞约有98％表达CD45，约有100％细胞表达CD11b，约有97.6％细胞表达CD14。巨噬细胞率达到100％。每个IPSC可产生巨噬细胞数量约18,8万，见图14。

本实施例极化M1和M2的CD206和CD80表达情况检测见图10，由图10A-10D可知，极化后M1约有99.62％的CD80+细胞，说明M1极化率能达到99％以上。

极化后M2约有99.62％的CD206+细胞，且CD206的荧光强度较M1要强，说明M2极化率能达到99％以上。

本实施例M2向M1转化细胞形态观察见图11，由图11可知，M2极化前呈现半贴壁圆形或者贴壁的短梭形(左)，向M1转化后呈现多边纤维状或者长纤维状，且细胞呈现集落生长(右)。

本实施例M2向M1转化流式检测CD80和CD206表达情况见图12，由图12A-12D可知，M2向M1转化前约有99.62％的CD206+细胞和34.86％的CD80+细胞；M2向M1转化后约有99.12％的CD206+细胞但是CD206荧光强度较M2减弱，此时CD80+细胞比例达到99.83％，说明M2向M1转化率很高。

实施例2M2巨噬细胞吞噬能力验证

对实施例1中制备得到的M2巨噬细胞进行计数，按照4×10⁴/cm²提前12小时铺到12孔板中，12小时对带有GFP标记的LnCap细胞进行计数，取1/5的LnCap细胞与M2共同培养，放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养2小时。轻轻吹打去除LnCap细胞后，将巨噬细胞消化成单细胞。DPBS清洗细胞1次，加入200μL含4％血清的DPBS重悬细胞，加入5μLCD206-APC抗体(购自上海子起生物科技有限公司)，4℃孵育30min。

随后用DPBS清洗细胞3次，最后用200μLDPBS重悬细胞，然后进行流式检测，方法详见实施例1，结果详见图13。由图13可知，流式检测LnCap-GFP细胞不表达CD206(左)；M2和LnCap-GFP共孵育后出现CD206和GFP双阳性细胞(中)；进一步分析CD206+和CD206+/GFP+细胞比例，发现约有38.5％的巨噬细胞具有吞噬能力(右)。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基，其特征在于，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基、第五阶段培养基和第六阶段培养基；

2.根据权利要求1所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中的ROCK通路抑制剂选自Y-27632、Thiazovivin、Fasudil(HA-1077)HCl、GSK429286A、RKI-1447和Azaindole 1中的任意一种；优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y-27632；

3.根据权利要求2所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基，其特征在于，

所述Y-27632的浓度为0.5-20uM，优选地，所述Y-27632的浓度为10uM，所述聚乙烯醇浓度为4mg/mL；

所述第三阶段培养基中，所述M1培养基包括50wt％stempro-34完全培养、50wt％DMEM/F12、1wt％L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine、50μg/mL BMP4、50μg/mL VEGF和50μg/mL bFGF组成，所述M2培养基包括M1培养基和1-9μM SB431542；优选地，所述SB431542的浓度为6μM；

4.根据权利要求1所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基，其特征在于，还包括第七阶段培养基，所述第七阶段培养基包括M6培养基或M7培养基；

5.一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的第一阶段培养基至第六阶段培养基，或包括权利要求4所述的第一阶段培养基至第七阶段培养基。

6.一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法，其特征在于，还包括S7：第七阶段，M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞分化；

(1)若需极化获得M1型巨噬细胞，在常氧条件下，采用如权利要求4中所述的M6培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养2天，得到M1型巨噬细胞；或者，在常氧条件下，采用如权利要求4中所述的M7培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养，得到M2型巨噬细胞，在常氧条件下，再采用如权利要求4中所述的M7培养基对M2型巨噬细胞进行诱导培养2天，得到M1型巨噬细胞；

(2)若需极化获得M2型巨噬细胞，在常氧条件下，采用如权利要求4中所述的M7培养基对M0型巨噬细胞进行诱导培养2天，得到M2型巨噬细胞。

8.根据权利要求6或7所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤S1，S4-S7中所述在常氧条件下为5％CO₂，37℃，步骤S2-S3中所述在缺氧条件下为5％CO₂，90％N₂，37℃；

9.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求6-8任一项制备得到的M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞中的一种或二种以上。

10.基于权利要求9所述的一种药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备治疗和/或预防血液系统疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物中的应用。