WO2015099134A1 - 再構成されたｔ細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞由来のｔ前駆細胞を用いる免疫細胞療法 - Google Patents

再構成されたｔ細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞由来のｔ前駆細胞を用いる免疫細胞療法 Download PDF

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Definitions

  • This application relates to immune cell therapy. Specifically, the present invention relates to immune cell therapy using pluripotent stem cell-derived T precursor cells having a reconstituted T cell receptor gene. The present application also relates to a method of inducing T progenitor cells from pluripotent stem cells for use in immune cell therapy.
  • T-iPS cells cancer antigen-specific cytotoxic T cells
  • T-iPS cells cancer antigen-specific cytotoxic T cells
  • the advantages of this method are: i) All T cells made from T-iPS cells are specific for the original antigen. ii) T cells made from T-iPS cells are young and active. iii) By amplifying at the stage of iPS cells, it is possible to produce infinite desired T cells.
  • T-iPS cells inherit the gene structure of the original cancer antigen-specific cytotoxic T cell in which the T cell receptor (hereinafter abbreviated as “TCR”) gene is reconstituted, and are derived from such T-iPS cells.
  • TCR T cell receptor
  • the specificity for this cancer antigen is inherited by T cells.
  • T cells to be transferred have already been passaged for several generations, and the activity of killing cancer cells is reduced.
  • the method using T-iPS cells makes it possible to provide a large amount of young and active regenerative T cells.
  • T cells derived from the above-described T-iPS cells still has room for improvement. This is the following point. i) When T cells are induced from T-iPS cells, there is a possibility that TCR ⁇ -chain gene secondary reconstitution occurs in the induction process, resulting in T cells with specificity different from the original antigen specificity. is there. Such T cells may contain dangerous self-reactive T cells. ii) It is not known whether T cells regenerated in vitro are as functionally sound as naive T cells that are normally produced (in the thymus). iii) The cost is high because it takes time and effort to generate a large amount of T cells necessary for treatment of a single patient.
  • iv) i an unexpected TCR chain change described that self-reactive T cells can be formed, but the original TCR can still be dangerously reactive.
  • the original T cells of T-iPS cells were cells that were present without negative selection of the thymus and peripheral tolerance in the periphery, and thus were self-reactive among those who had the original T cells. It can be inferred that there is no. However, it may be a cell that survived accidentally despite being self-reactive.
  • the possibility of having reactivity to attack normal tissues is further increased.
  • T progenitor cells capable of differentiating into T cells
  • Differentiation into T cells in the thymus of patients undergoing cell therapy eliminates regenerative T cells if they are reactive to components of the patient's body, ensuring safety Is done.
  • the regenerated T cells have high quality, and a large amount of good quality T cells are produced from a small amount of progenitor cells, so that the cost can be suppressed.
  • T progenitor cells for immune cell therapy, characterized in that T progenitor cells are obtained by in vitro induction of pluripotent stem cells having a reconstituted T cell receptor gene.
  • T precursor cells are CD34 + CD5 + CD4-CD8- cells, CD34 + CD38-CD45RA-CD10- cells, CD45RA + CD10 + CD7-CD5- cells, CD45RA + CD10 + CD7 + CD5- cells, CD45RA + CD10
  • the method according to [1] which is selected from the group consisting of + CD7 + CD5 + cells, CD3-CD4 + CD8- cells and CD4 + CD8 + cells.
  • the pluripotent stem cell having a reconstituted T cell receptor gene is an iPS cell derived from a human cytotoxic T cell.
  • the human cytotoxic T cell is a cytotoxic T cell induced by stimulating human peripheral blood mononuclear cells with an antigen.
  • the antigen is a cancer antigen and immune cell therapy is performed to treat a cancer patient.
  • Immune cell therapy comprising obtaining T progenitor cells from pluripotent stem cells having a reconstituted T cell receptor gene and administering the T progenitor cells to a subject in need of treatment.
  • T precursor cells are CD34 + CD5 + CD4-CD8- cells, CD34 + CD38-CD45RA-CD10- cells, CD45RA + CD10 + CD7-CD5- cells, CD45RA + CD10 + CD7 + CD5- cells, CD45RA + CD10
  • the immune cell therapy according to [6] which is selected from the group consisting of + CD7 + CD5 + cells, CD3-CD4 + CD8- cells and CD4 + CD8 + cells.
  • the immune cell therapy according to [6] or [7], wherein the pluripotent stem cell having a reconstituted T cell receptor gene is an iPS cell derived from a human cytotoxic T cell.
  • mode of this application is shown.
  • FIG. The figure which shows the antigen-specific killer activity of LMP2-specific CTL used for iPS cell induction
  • CD8 positive cells obtained by co-culturing T progenitor cells with LMP2 antigen-specific TCR with human HLA-A2402-expressing thymus tissue in Example C were obtained in the presence of antigen-presenting cells and LMP2 peptide.
  • FIG. 1 schematically illustrates an immune cell therapy, which is one embodiment of the present invention, in which T precursor cells specific for a cancer antigen are induced for cancer treatment and administered to a patient.
  • iPS cells are induced by a known method from cytotoxic T cells specific to cancer antigens (hereinafter sometimes abbreviated as “CTL”).
  • T precursor cells are induced in vitro from the obtained iPS cells (T-iPS cells).
  • This T precursor cell is administered to a cancer patient.
  • T progenitor cells administered to the patient migrate to the thymus, where they are induced into mature T cells (na ⁇ ve T cells).
  • the resulting mature T cells maintain a reconstituted T cell receptor gene.
  • Naive T cells become activated antigen-specific cytotoxic T cells by being stimulated with the cancer antigen used to induce cytotoxic T cells before inducing T-iPS cells. Attack specifically.
  • T progenitor cell includes from the stage corresponding to the hematopoietic stem cell, which is the most undifferentiated cell among the hematopoietic cells, to the stage corresponding to the cell immediately before receiving the positive selection / negative selection. . T precursor cells will be specifically described.
  • Hematopoietic stem cells in human bone marrow are generally identified as CD34 + CD38 ⁇ CD45RA ⁇ CD10 ⁇ cells (+ indicates that it is expressed on the cell surface, ⁇ indicates that it is not expressed).
  • Differentiation into T cells first becomes CD45RA + CD10 + cells with limited differentiation to the TB-myeloid system, and then CD7 and CD5 are expressed in turn.
  • progenitor cells are biased so that they can easily differentiate into T cells.
  • the most undifferentiated progenitor cells in the thymus are CD34 + CD5 + CD4 ⁇ CD8 ⁇ cells, which are differentiated in the thymus once through the CD3 ⁇ CD4 + CD8 ⁇ cell stage and then become CD4 + CD8 + cells.
  • T cell receptors are expressed, and after undergoing positive selection and negative selection, mature CD3 + CD4 + CD8 ⁇ cells or CD3 + CD4 ⁇ CD8 + cells. Therefore, the “T progenitor cells” defined in this application are from CD34 + CD38 ⁇ CD45RA ⁇ CD10 ⁇ cells to CD4 + CD8 + cells. T cell differentiation is described in Blood 111: 1318 (2008), Nature mm Immunology 11: 585 (2010) (these documents are incorporated herein by reference).
  • pluripotent stem cells having a reconstituted T cell receptor gene are used and induced to differentiate into T precursor cells.
  • inducing hematopoietic cells from pluripotent stem cells it does not necessarily accurately reproduce the differentiation process seen in normal bone marrow hematopoiesis. It is thought that there is. Therefore, even in the cells generated in the system for inducing differentiation from pluripotent stem cells, the cells corresponding to the respective differentiation stages from hematopoietic stem cells to CD4 + CD8 + cells are referred to as T precursor cells in the present specification and claims.
  • CD34 + CD5 + CD4 ⁇ CD8 ⁇ cells CD34 + CD38 ⁇ CD45RA ⁇ CD10 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 ⁇ CD5 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 + CD5 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 Examples include + CD5 + cells, CD3-CD4 + CD8- cells, and CD4 + CD8 + cells.
  • CD45RA + CD10 + CD7 + CD5 + cells and the like may be used as preferred T precursor cells.
  • a method for obtaining pluripotent stem cells having a reconstituted T cell receptor gene specific for a specific antigen for example, Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013 (this document is incorporated herein by reference) Incorporated) is exemplified. Specifically, a method of obtaining iPS cells by obtaining cytotoxic T cells specific for a specific antigen and introducing an initialization factor into the cytotoxic T cells can be used.
  • iPS cells Artificial pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • It is an artificial stem cell derived from a somatic cell having characteristics of, for example, pluripotency and proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol.
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, SV40 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as valproate (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg , Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)), MEK inhibitors (eg, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901) , Glycogenthsynthase kinase-3 inhibitors (for example, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (for example, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (for example, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2 , Nucleic acid
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, ⁇ 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosomes
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, polyadenylation site, etc. so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc. Can be included.
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be. (The literature listed in this paragraph is incorporated herein by reference)
  • RNA it may be introduced into somatic cells by, for example, lipofection or microinjection, and RNA that incorporates 5-methylcytidine and pseudoouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used to suppress degradation. (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630) (these documents are incorporated herein by reference).
  • a culture solution for iPS cell induction for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture solution containing 10 to 15% FBS (fetal bovine serum) (these culture solutions include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.) or a commercially available culture solution (for example, a culture solution for mouse ES cell culture (TX-WES culture solution, Thrombo X)) , Primate ES cell culture medium (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology).
  • FBS fetal bovine serum
  • the somatic cell and the reprogramming factor are contacted on DMEM or DMEM / F12 containing 10% FBS for about 4 to 7 days. Then, re-spread the cells on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and use bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS (including LIF, penicillin / streptomycin, etc.) on feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • ES-like colonies can be formed after about 25 to about 30 days or more.
  • somatic cells to be initialized themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845) (these documents are incorporated herein by reference).
  • hypoxic conditions oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less
  • Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845 these documents are incorporated herein by reference.
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but may be in the range of about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate. You can also
  • a known method may be used as a method of inducing cytotoxic T cells specific for a specific antigen.
  • a cytotoxic T cell specific for a cancer antigen can be obtained by stimulating lymphocytes obtained from a human by a conventional method with a cancer antigen specific for the cancer to be treated.
  • Cancer antigens have been identified for various cancers, and methods for inducing cytotoxic T cells using cancer antigens or epitope peptides thereof are well known.
  • lymphocytes may be stimulated using cancer cells to be treated.
  • a cytotoxic T cell specific for a cancer antigen specific for the cancer may be induced from a donor afflicted with the cancer to be treated.
  • Induction of reprogramming factor for example, Yamanaka factor, into induced cytotoxic T cells to induce iPS cells.
  • SV40 may be added in addition to the Yamanaka factor to increase the efficiency of initialization.
  • Induced iPS cells have a reconstituted T cell receptor gene derived from cancer antigen-specific cytotoxic T cells.
  • iPS cells having a reconstituted T cell receptor gene are referred to as T-iPS cells.
  • T cells regenerated from T-iPS cells can be used for other patients, not the original patient.
  • a cell bank of T-iPS cells obtained by inducing specific cancer antigen-specific cytotoxic T cells from lymphocytes collected in advance from a human having a specific HLA type and inducing iPS from such cells can be created.
  • the donor of lymphocytes may be a patient but may be a healthy person.
  • a project to construct a highly versatile iPS cell bank by using a human who has a homologous HLA haplotype as a donor CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139 (2012) (this document) Are incorporated herein by reference).
  • T-iPS cells are induced from such CTL cells to produce a T-iPS cell bank.
  • T-iPS cell bank is produced from lymphocyte cells collected from the same donor.
  • T-iPS cell bank donor HLA information and antigen information are registered for each cell line.
  • T-iPS cell bank select appropriate T-iPS cells based on the HLA type of the subject patient and the type of cancer affected. Selected T-iPS cells are induced to differentiate into T progenitor cells and administered to the patient. Furthermore, if cells differentiated into T progenitor cells instead of T-iPS cells are cryopreserved and banked, more rapid treatment can be provided to the patient.
  • the induced T progenitor cells are suspended in an appropriate medium such as physiological saline or PBS and administered to a target patient whose HLA matches a certain level or more.
  • an appropriate medium such as physiological saline or PBS
  • HLA haplotype homo the case where one HLA haplotype corresponds is illustrated.
  • the “pluripotent stem cell having a reconstituted T cell receptor gene” is not limited to the iPS cell obtained by the above-described method, but has the ability to differentiate into a tissue or organ cell. Any pluripotent stem cell capable of proliferating indefinitely and having a reconstituted T cell receptor gene may be used.
  • cells obtained by introducing a reconstituted T cell receptor gene into ES cells or iPS cells are exemplified.
  • the introduction of the TCR gene into pluripotent stem cells may be performed by conventional methods, for example, according to the method described in Morgan RA et al, Science, 314: 126. 2006 (the text is incorporated herein by reference). Just do it.
  • TCR genes specific for various antigens are known.
  • EB virus-related antigen-specific TCR gene is disclosed in Jurgens et al, Journal of investigation, 26:22, 2006 (the text of which is incorporated herein by reference).
  • the WT1 antigen-specific TCR gene is disclosed, for example, in Anticancer Research 32 (12); 5201-5209, 2012 (incorporated herein by reference).
  • Pluripotent stem cells having a reconstituted T cell receptor gene are induced to differentiate into T progenitor cells.
  • Examples of the method for inducing differentiation into T progenitor cells include the method described in Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 (this document is incorporated herein by reference).
  • pluripotent stem cells are co-cultured with OP9 stromal cells, such as mouse OP9 stromal cell culture, to obtain blood cell progenitor cells, and the resulting blood cell progenitor cells are then co-cultured with OP9 stromal cells and DLL1 cells To do.
  • T progenitor cells can be selected by confirming cell surface markers by conventional methods.
  • T precursor cells CD34 + CD5 + CD4 ⁇ CD8 ⁇ cells, CD34 + CD38 ⁇ CD45RA ⁇ CD10 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 ⁇ CD5 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 + CD5 ⁇ cells, CD45RA + CD10 + CD7 + CD5 + cells, CD3 CD4 + CD8 ⁇ cells and CD4 + CD8 + cells.
  • T progenitor cells are administered to the patient.
  • T progenitor cells are administered to a target patient after suspending in an appropriate medium such as physiological saline or PBS.
  • an appropriate medium such as physiological saline or PBS.
  • routes of administration to the patient include intravenous injection and intrathymic injection.
  • the number of cells to be administered is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's age, sex, height, weight, target disease, symptoms, and the like. If an adult male weighing approximately 70 kg is a cancer patient, 10 6 to 10 8 cells are given by intravenous injection of T precursor cells, and 10 5 to 10 7 cells are given by intrathymic administration. Examples are administering cells. The optimal number of cells to be administered may be appropriately determined by clinical trials.
  • T progenitor cells administered to patients migrate to the thymus and are induced into mature T cells (na ⁇ ve T cells) in the thymus.
  • the resulting mature T cells maintain a reconstituted T cell receptor gene.
  • Naive T cells become activated antigen-specific cytotoxic T cells by stimulating with the cancer antigen used when inducing cytotoxic T cells prior to inducing T-iPS cells, resulting in cancer To attack specifically.
  • a cancer antigen peptide may be administered to a patient.
  • T precursor cells are administered to a patient
  • T cells are produced in the patient's thymus.
  • autoreactive T cells appear, they are eliminated by negative selection.
  • Improving the quality of regenerative T cells Naive T cells produced in the thymus can be expected to be healthy with normal functions.
  • Relatively few cells to be administered to patients It is known that one progenitor cell that migrates to the thymus can be expected to produce at least 10 6 immature T cells.
  • immature T cells undergo positive and negative selection by the thymus, so that at most 5% can migrate to the periphery as naive T cells. Moreover, the number of T cells that can respond to a specific epitope is 1 / 10,000 or less. In contrast, when T-progenitor cells derived from T-iPS are administered, almost all T cells produced in the thymus can survive thymic selection. The reason is that these T cells already express TCR that survived thymic selection. The naive T cells thus produced maintain the antigen specificity of the original killer T cells. That is, one progenitor cell can produce 10 6 antigen-specific T cells. This means that the number of cells administered to the patient is much smaller, which reduces costs.
  • OP9 cells and OP9 / DLL1 cells were obtained from RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Ibaraki, Japan).
  • Human iPS cells were prepared from cord blood hematopoietic progenitor cells at the RIKEN Center for Immunology and Allergy Science (Yokohama, Kanagawa, Japan).
  • the human iPS cells used can also be prepared by the method described in (Vizcardo et al, Cell Stem Cell, 12: 31-36, 2013).
  • the composition of each medium is as follows: *
  • the penicillin / streptomycin solution composition is penicillin 10000 U / mL and streptomycin 10000 ⁇ g / mL, so the final concentrations are 100 U / mL and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • penicillin / streptomycin solution is penicillin 10000 U / mL and streptomycin 10000 ⁇ g / mL, so the final concentrations are 100 U / mL and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • the collagenase solution was aspirated and washed away with 10 mL of PBS ( ⁇ ). Thereafter, 5 mL of 0.05% trypsin / EDTA solution was added, followed by incubation at 37 ° C. for 20 minutes. After culturing, the cells peeled off in a film form, so they were physically made fine by pipetting to separate the adherent cells. 20 mL of new medium A was added thereto, and further cultured at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the supernatant containing the floating cells was collected through a 100 ⁇ m mesh. After centrifuging at 4 ° C. and 1200 rpm for 7 minutes, the pellet was suspended in 10 mL of medium B. Of these, 1/10 were seeded on newly prepared OP9 / DLL1 cells, especially for FACS analysis. Cells obtained from a plurality of dishes were pooled, redistributed to the same number as the original number, and reseeded.
  • the cells were then seeded on OP9 / DLL1 cells.
  • cell sorting of the CD34lowCD43 + cell fraction was not performed.
  • this fraction is sorted, there are concerns that the number of cells obtained may be reduced and the cells may be damaged by sorting.
  • the efficiency of inducing differentiation into T cells may be lower than when sorting is not performed.
  • FACS analysis was performed to confirm the differentiation stage during the culture period, but many dead cells were observed during the culture in all periods. Therefore, at the time of FACS analysis, PI (Propidium Iodide), 7-AAD, etc. were used for analysis after removing dead cells.
  • PI Propidium Iodide
  • 7-AAD 7-AAD
  • Day 23 Blood cell colonies started to appear. Cells that loosely adhered to OP9 / DLL1 cells were gently pipetted multiple times and collected through a 100 ⁇ m mesh into a 50 mL conical tube. Centrifugation was performed at 4 ° C. and 1200 rpm for 7 minutes, and the pellet was suspended in 10 mL of medium B.
  • the cells loosely adhering to the OP9 / DLL1 cells were gently pipetted several times and collected into a 50 mL conical tube through a 100 ⁇ m mesh. After centrifuging at 4 ° C. and 1200 rpm for 7 minutes, the pellet was suspended in 10 mL of medium B. Of these, 1/10 were seeded on newly prepared OP9 / DLL1 cells, especially for FACS analysis.
  • CD7 + cells which are T progenitor cells, were observed, and some cells had differentiated to the CD7 + CD5 + stage.
  • FIG. 1 A diagram of the FACS analysis is shown in FIG.
  • Example B Transplantation of iPS cell-derived T progenitor cells into immunodeficient mice Human T by transplanting iPS cell-derived T progenitor cells made from human umbilical cord blood CD34 + cells obtained in Example A into immunodeficient NOG mice Clarified that cells are created.
  • Immunodeficient NOG mice were obtained from the Central Institute for Experimental Animals (Kawasaki City, Kanagawa Prefecture, Japan).
  • T progenitor cells were isolated using a cell sorter, and 10 5 cells were intravenously injected into NOG mice.
  • the administered T progenitor cells were induced into mature T cells in the thymus. At that time, autoreactive T cells were excluded by negative selection.
  • Example C Organ culture in mouse thymus of T progenitor cells prepared from T-iPS cells T precursor cells prepared from iPS cells not subjected to gene rearrangement in Examples A and B were injected into mice, and T cells in mouse thymus Differentiated. The generated polyclonal T cells did not attack the mice, indicating that “negative selection” occurred.
  • T-iPS cells were obtained from antigen-specific T cells, and T-progenitor cells prepared from T-iPS cells were cultured in the thymus of mice into which human HLA had been introduced.
  • a schematic diagram of Example C is shown in FIG.
  • LMP2-T-iPS cells were induced from killer T cells expressing HLA-A2402-restricted LMP2 antigen-specific TCR.
  • EB virus is a virus that causes infectious mononucleosis in the acute phase and sometimes causes cancer such as Burkitt lymphoma.
  • T cells are provided by healthy individuals who have a history of infection with EB virus.
  • the donor is a so-called EB virus carrier because the virus remains in the lymphocytes for a lifetime after infection. Therefore, this provider can be regarded as a chronic virus infected person although it does not develop.
  • LMP2 antigen-specific cytotoxic T lymphocytes i) The following medium was used.
  • Dendritic cell culture medium CellGro (CellGenix) T cell medium: ii) The sequence of LMP2 is: LMP2 antigen peptide: TYGPVFMSL LMP2 tetramer was purchased from MBL.
  • iii) Antigen-presenting cells As antigen-presenting cells, a Lymphoblastoid cell line (LCL) having HLA-A2402 established from healthy volunteers at Kyoto University Hospital Hematology Tumors Norimitsu Kadowaki Laboratory was used.
  • MoDC monocyte-derived dendritic cells
  • Monocytes were isolated using CD14 microbeads from the peripheral blood of healthy volunteers with HLA-A2402 who were also infected with EB virus. After washing, dendritic cell culture medium was added to adjust to 5 ⁇ 10 5 / mL. 2.
  • Cytokines were added to final concentrations of GM-CSF 800 U / mL (or 50 ng / mL) and IL-4 200 U / mL (or 40 ng / mL). The cells were seeded on a 6-well plate at 5 mL / well. Incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 . 3.
  • GM-CSF was added to fresh dendritic cell medium to a concentration of 800 U / mL and IL-4 to a concentration of 200 U / mL. 5. 3 mL of new dendritic cell culture medium was added to each well. 6. On Day 6, immature MoDCs are recovered from the plate and suspended in a small amount of fresh dendritic cell medium. The cell concentration was adjusted to 5 ⁇ 10 5 / mL. 7.
  • GM-CSF (hereinafter, final concentration: 800 U / mL), IL-4 (200 U / mL), TNF- ⁇ (10 ng / mL), PGE 2 (1 ⁇ g / mL), 24 holes cells were seeded at approximately 5 X 10 5/1 mL / well to the plate. 8. The cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. 9. Peptide was added during the last 2 hours of the culture. The final concentration of peptide was 10 ⁇ M. 10. Dendritic cells (DC) were collected and washed twice with T cell medium. The number of DC cells was counted and adjusted to 2 ⁇ 10 5 / mL with T cell medium.
  • DC Dendritic cells
  • LCL LCL was collected from the culture and irradiated with 35 Gy. 2. Suspended in T cell medium and adjusted to 5 ⁇ 10 5 / mL. 3. Peptide was added at 100 nM and cultured for 2 hours. 4. LCL was collected, washed with T cell medium, and adjusted to 2 ⁇ 10 5 / mL.
  • T cells stimulated with LCL and dendritic cells were suspended in T cell medium and suspended at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / mL. 2.
  • IL-7 final concentration 5 ng / mL
  • IL-15 final concentration 1 ng / mL
  • First course of peptide stimulation with LCL 4.
  • LCL was further cultured for 2 hours in a medium supplemented with 100 nM peptide, and CTL was added thereto. 5.
  • IL-7 final concentration 5 ng / mL
  • IL-15 final concentration 1 ng / mL
  • LMP2-specific killer T cells CD8 positive LMP-2 tetramer positive cells
  • OUN-1 leukemia cell lines proliferated by peptide stimulation on 96-well U-bottom plates 0: 1, 1: 9, 1: 3, respectively.
  • 1: 1, and 3 1, and the ratio of dead cells to target cells in the presence or absence of peptide was determined by the ratio of Annexin V and PI (Propidium Iodide) found in the CFSE positive fraction .
  • Annexin V and PI Propidium Iodide
  • LMP2-T-iPS cells A. Activation of LMP2-specific CTL 1. CD8 positive cells were concentrated with MACS beads. 2. All cells were suspended in T cell medium, and IL-7 (final concentration 5 ng / mL) and IL-15 (final concentration 10 ng / mL) were added. Furthermore, Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 was added so that T cell: beads became 1: 1, and CD8 positive cells were activated by culturing for 2 days.
  • mice Organ culture of T progenitor cells in mouse thymus Organ culture in mouse thymus was performed according to the description of Kawamoto et al, Inetrnatinal Immunology, 9: 1011, 1997 (this document constitutes a part of this application by reference).
  • Mice CB6F1-Tg (HLA-A * 2402 / H2-Kb) A24.01) in which the HLA-A2402 gene was introduced into C57BL6 mice were purchased from Taconic Biosciences, Inc. and used. Normal C57BL6 mice were used as control mice.
  • HLA-2402 transgenic mice or control mice were mated with Rag2KO mice.
  • the fetus was removed on the 15th day of gestation, and the thymus was obtained from the fetus.
  • the fetal thymus was cultured for 6 days on a filter suspended on RPMI1640 medium containing deoxyguanosine (dGuo). This treatment kills thymocytes and only the cells on the thymic environment side survive.
  • dGuo deoxyguanosine
  • the obtained dGuo-treated fetal thymus was put into a 96-well V bottom plate one by one, 0.2 ml of RPMI1640 medium was added to each, and DP cells purified with Max beads were added thereto. After the plate is placed in a plastic bag and sealed, the gas in the bag is replaced with a mixed gas of 5% CO 2 , 25% N 2 , and 70% O 2 , and the bag is placed in an incubator at 37 ° C. DP cells and dGuo-treated thymus tissue were co-cultured under oxygen conditions. On day 7 of the culture, the culture was taken out, crushed by being sandwiched between glass slides, and the crushed material was suspended in the medium, whereby T cells obtained as floating cells were collected and analyzed.
  • T cells were subjected to flow cytometry analysis.
  • the transferred cells remained at the DP cell stage.
  • mature T cells were generated in co-culture with human HLA-2402 expressing thymus. Almost all T cells generated were positive for LMP2 tetramer (ie, the original TCR was released) (FIG. 6).
  • Lymphoblastoid cell line collected from healthy volunteers with HLA-A2402, transferred from Kyoto University Hospital Hematology Tumors Norikami Kadowaki Laboratory (Kyoto, Japan) as antigen-presenting cells B cell blast-like cell line) was used.
  • target cells THP1 cells (acute monocytic leukemia cell line) transferred from Kyoto University Hospital Hematology Tumors Norimitsu Kadowaki Laboratory (Kyoto, Japan) were used.
  • LMP2 antigen peptide TYGPVFMSL (419-427)
  • Medium ⁇ MEM medium containing 20% fetal calf serum (life technologies, cat # 11900-073)
  • the generated CD8-positive cells were isolated and cultured for 13 days in the presence of antigen-presenting cells and LMP2 peptide.
  • the THP1 leukemia cell line used as target cells was labeled with CFSE.
  • the above cells (killer T cells) and THP1 cells are mixed in a 96-well U-bottom plate at 0: 1, 1: 3, 1: 1, 3: 1, and 9: 1, respectively, in the presence or absence of peptides.
  • the cells were cultured for 4 hours, and the dead cell ratio of the target cells was assayed by the ratio of Annexin V positive cells found in the CFSE positive fraction (FIG. 7).
  • the target cells When the peptide was not added, the target cells were hardly killed, but as the amount of peptide added increased, the target cells were killed more efficiently. The killing ability was not inferior to that of the original killer T cells (FIG. 5). That is, sufficiently strong antigen-specific cytotoxic activity was confirmed.
  • Example C shows that T-iPS cell-derived progenitor cells can differentiate normally in the thymic environment where HLA molecules are present, and antigen-specific CTLs are induced by antigen stimulation.

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Abstract

　本願は治療を必要とする対象へ、再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞を誘導して得られるT前駆細胞を投与することを含む、免疫細胞療法を提供する。多能性幹細胞としては、再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有するiPS細胞（T-iPS）が例示される。患者へ成熟T細胞でなくT前駆細胞を投与することにより、より効率的で安全な免疫療法を提供することができる。

Description

再構成されたＴ細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞由来のＴ前駆細胞を用いる免疫細胞療法
　本願は免疫細胞療法に関する。具体的には、再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞由来のT前駆細胞を用いる免疫細胞療法に関する。本願はまた、免疫細胞療法に用いるために多能性幹細胞からT前駆細胞を誘導する方法に関する。
　特定の抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を増幅し、これを治療に利用する新しい方法が提案されている。この研究の主要な対象はがん患者である。具体例としては、がん抗原特異的細胞傷害性T細胞から大量のiPS細胞（induced pluripotent stem cells; 人工多能性幹細胞）（以下T細胞からつくられたiPS細胞を「T－iPS細胞」と略称する）をつくり、そのT－iPS細胞から患者の治療に利用できるT細胞を誘導する（Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31－36, 2013, 本文件は引用により本願に組み込まれる）。この方式の利点は：
i）T－iPS細胞からつくられるT細胞はすべて元の抗原に特異的である。
ii）T－iPS細胞からつくられるT細胞は若く活性がある。
iii）iPS細胞の段階で増幅させることによって、所望のT細胞を無限につくることができる。
　T－iPS細胞はT細胞レセプター（以下「TCR」と略称する）遺伝子が再構成された元のがん抗原特異的細胞傷害性T細胞の遺伝子構造を受けついでおり、かかるT－iPS細胞から誘導されるT細胞にもこのがん抗原に対する特異性は受け継がれる。
　従来から行われているin vitroで増幅させたT細胞を用いる細胞移入治療では、移入するT細胞がすでに何代か継代されたものであり、がん細胞を殺す活性が低下していることが問題とされていたが、T－iPS細胞を用いる方法により、若く活性のある再生T細胞を大量に提供することが可能となる。
Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31－36, 2013, 本文件は引用により本願に組み込まれる
　上記のT－iPS細胞から誘導されたT細胞を用いる細胞免疫療法は、なお改良の余地があると考えられる。それは以下の点である。
i）T－iPS細胞よりT細胞を誘導すると、誘導の過程でTCRα鎖遺伝子の二次的な再構成が起こって、元の抗原特異性とは異なる特異性を示すT細胞が生じる可能性がある。そのようなT細胞の中には危険な自己反応性T細胞が含まれている可能性もある。
ii）in vitroで再生させたT細胞は、正常に（胸腺で）つくられるナイーブT細胞ほど機能的に健全であるかどうか分からない。
iii）一人の患者の治療に必要な大量のT細胞をつくるために手間がかかるためにコストが高い。
iv)i)では不測のTCR鎖の入れ替えによって自己反応性T細胞ができると述べたが、元のTCRのままでも危険な反応性を示すことはありうる。T－iPS細胞の元のT細胞は胸腺の負の選択や末梢での末梢性寛容を受けずに存在していた細胞であるからその元のT細胞を持っていた人の中では自己反応性は無いと類推できる。しかし、自己反応性であるにかかわらず偶然生き延びていた細胞である可能性もある。また、再生T細胞を他人に投与するような戦略で使う場合は、正常組織を攻撃する反応性を有している可能性はさらに高くなる。
　本願は誘導された成熟T細胞でなく「T細胞へ分化する能力をもつ造血前駆細胞」（以下「T前駆細胞」という）を移植する方法を提供する。細胞療法を受ける患者の胸腺の中でT細胞に分化させることにより、仮に再生T細胞が患者の体の成分に対して反応性を有している場合には除去されるので、安全性が保証される。さらに、生体内で最終分化をさせることにより再生T細胞が高品質になり、また少量の前駆細胞から大量の質の良いT細胞が産生されるのでコストも抑えることができる。
　具体的には本願は下記を提供する：
[1]　再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞をin vitroで誘導してT前駆細胞を得ることを特徴とする、免疫細胞療法用T前駆細胞を得る方法。
[2]　T前駆細胞がCD34+CD5+CD4－CD8－細胞、CD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞、CD45RA+CD10+CD7－CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3－CD4+CD8－細胞およびCD4+CD8+細胞からなる群から選択される、[1]記載の方法。
[3]　再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞が、ヒト細胞傷害性T細胞から誘導されたiPS細胞である、[1]または[2]記載の方法。
[4]　ヒト細胞傷害性T細胞が、ヒト末梢血単核球を抗原により刺激して誘導された細胞傷害性T細胞である、[3]記載の方法。
[5]　抗原ががん抗原であり、免疫細胞療法ががん患者を治療するために行われる、[4]記載の方法。
[6]　再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞からT前駆細胞を得、治療を必要とする対象へ当該T前駆細胞を投与することを含む、免疫細胞療法。
[7]　T前駆細胞がCD34+CD5+CD4－CD8－細胞、CD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞、CD45RA+CD10+CD7－CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3－CD4+CD8－細胞およびCD4+CD8+細胞からなる群から選択される、[6]記載の免疫細胞療法。
[8]　再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞が、ヒト細胞傷害性T細胞から誘導されたiPS細胞である、[6]または[7]記載の免疫細胞療法。
[9]　ヒト細胞傷害性T細胞が、ヒト末梢血単核球を抗原により刺激して誘導された細胞傷害性T細胞である、[8]記載の免疫細胞療法。
[10]　抗原ががん抗原であり、治療を必要とする対象が、がんを患っている患者である、[9]に記載の免疫細胞方法。
本願の一態様である、がん患者の免疫細胞療法の概略図を示す。 実施例AにてiPS細胞から誘導したT前駆細胞のFACS解析図。 実施例Bの概略図。 実施例Cの概略図。 実施例CでiPS細胞誘導に用いたLMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性を示す図。 実施例CでLMP2抗原特異的TCRを有するT前駆細胞をヒトHLA－A2402発現胸腺組織と共培養して得られた細胞のFACS解析図。 実施例CでLMP2抗原特異的TCRを有するT前駆細胞をヒトHLA－A2402発現胸腺組織と共培養して得られたCD8陽性細胞を、抗原提示細胞とLMP2ペプチドの存在下で培養して得た細胞のキラー活性を示す図。
　本願発明の一実施態様である、がん治療のためにがん抗原に特異的なT前駆細胞を誘導して患者へ投与する免疫細胞療法について図１に概略を説明する。
　まず、がん抗原に特異的な細胞傷害性T細胞（以下「CTL」と略称することもある）から公知の方法によりiPS細胞を誘導する。得られたiPS細胞（T－iPS細胞）からインビトロでT前駆細胞を誘導する。このT前駆細胞をがん患者へ投与する。
　患者へ投与されたT前駆細胞は胸腺に移住し、胸腺にて成熟T細胞（ナイーブT細胞）へと誘導される。得られる成熟T細胞は再構成されたT細胞レセプター遺伝子を維持している。ナイーブT細胞はT－iPS細胞を誘導する前に細胞傷害性T細胞を誘導した際に用いたがん抗原で刺激されることによって、活性化された抗原特異的細胞傷害性T細胞となり、がんを特異的に攻撃する。
　本願において「T前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択/負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。T前駆細胞を具体的に説明する。
　ヒト骨髄中の造血幹細胞は一般にCD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞(+は細胞表面に発現していること、－は発現していないことを示す）として特定される。T細胞への分化は、まずT－B－ミエロイド系へ分化が限定されたCD45RA+CD10+細胞になり、次にCD7、CD5を順次発現する。CD7を発現する段階では前駆細胞はT細胞へ分化しやすいように能力が偏った状態になる。胸腺中の最も未分化な前駆細胞はCD34+CD5+CD4－CD8－細胞であり、胸腺中で分化して一度CD3－CD4+CD8－細胞段階を経てからCD4+CD8+細胞となる。この段階でT細胞レセプターを発現し、正の選択と負の選択を受けた後に成熟したCD3+CD4+CD8－細胞あるいはCD3+CD4－CD8+細胞となる。従って、本願で定義する「T前駆細胞」はCD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞からCD4+CD8+細胞までということになる。なお、T細胞の分化についてはBlood 111:1318（2008）, Nature Immunology 11: 585（2010）（これらの文献は引用により本願に組み込まれる)に説明されている。
　本願においては、再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞を用い、これをT前駆細胞へ分化誘導する。多能性幹細胞から造血細胞を誘導する場合、必ずしも正常の骨髄造血で見られる分化過程を正確に再現している訳ではないが、培養中でも上記のそれぞれの段階に相当する細胞は順次生成していると考えられる。従って、多能性幹細胞から分化誘導する系の中で生じた細胞でも、上記の造血幹細胞からCD4+CD8+細胞までの各分化段階にあたる細胞を本願明細書ならびに請求の範囲においてT前駆細胞とする。具体的には、CD34+CD5+CD4－CD8－細胞、CD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞、CD45RA+CD10+CD7－CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3－CD4+CD8－細胞およびCD4+CD8+細胞が例示され、好ましいT前駆細胞として例えばCD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞等を用いてもよい。
　特定の抗原に特異的な再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞を得る方法としては、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12、 31－36 2013 （本文献は引用により本願に組み込まれる)に記載の方法が例示される。具体的には、特定の抗原に特異的な細胞障害性T細胞を得、この細胞障害性T細胞へ初期化因子を導入してiPS細胞を得る方法などを用いることができる。
　人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる細胞であり、ES細胞（胚性幹細胞）とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663－676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861－872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917－1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101－106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon－coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon－coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。
　初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c－Myc、N－Myc、L－Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15－2、Tcl1、beta－catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、SV40またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795－797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525－528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467－2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269－1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568－574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475－479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132－135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197－203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459－461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912－8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649－643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491－503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167－74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096－100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713－720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225－9.、Park IH, et al. (2008)、Nature 451:141－6 に記載の組み合わせなどが例示される。（これらの文献は引用により本願に組み込まれる)
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤（例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標） (Millipore)、HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など）、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase－3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5－azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX－01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L－channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA－83－01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR－291－3p、miR－294、miR－295およびmir－302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663－676, 2006; Cell, 131, pp.861－872, 2007; Science, 318, pp.1917－1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945－949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949－953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。（本パラグラフに記載した文献は引用により本願に組み込まれる)
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5－メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618－630）（これらの文献は引用により本願に組み込まれる)。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15% FBS（fetal bovine serum）を含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液（例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX－WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
　培養法の例としては、たとえば、37℃、5% CO2存在下にて、10% FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10% FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日又はそれ以上経過後にES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。（これらの文献は引用により本願に組み込まれる)
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720－15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1%以上、15%以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237－241またはWO2010/013845）（これらの文献は引用により本願に組み込まれる)。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲であってもよい。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによってiPS細胞を選択することもできる。
　特定の抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導する方法は公知の方法を用いればよい。例えばがん抗原特異的な細胞障害性T細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球を、治療対象とするがんに特異的ながん抗原にて刺激して得ることができる。種々のがんについてがん抗原が特定されており、がん抗原あるいはそのエピトープペプチドを用いて細胞障害性T細胞を誘導する方法も良く知られている。または、治療対象とするがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。あるいは、治療対象とするがんに罹患したドナーより、当該がんに特異的ながん抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導して用いてもよい。
　誘導された細胞障害性T細胞に初期化因子、例えばヤマナカ因子を遺伝子導入し、iPS細胞を誘導する。初期化の効率をあげるためにヤマナカ因子に加えてSV40を加えてもよい。誘導されたiPS細胞はがん抗原特異的細胞障害性T細胞由来の再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有している。以下、再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有するiPS細胞をT－iPS細胞という。
　T－iPS細胞から再生したT細胞を、元の患者ではなくて、他の患者に使うことも可能である。例えば予め特定のHLA型を有するヒトより採取したリンパ球より、特定のがん抗原特異的な細胞傷害性T細胞を誘導し、かかる細胞よりiPSを誘導して得られるT－iPS細胞の細胞バンクを作成しておくことができる。この場合、リンパ球の提供者は患者であってもよいが、健常人であってもよい。
　頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するヒトをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において行われている（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012) （この文献は引用により本願に組み込まれる)）。同様のドナーから採取したリンパ球細胞から、治療対象とするがんに特異的ながん抗原を用いてＣＴＬ細胞を誘導し、かかるＣＴＬ細胞からT－iPS細胞を誘導してT－iPS細胞バンクを作製すると、汎用性の高いT－iPS細胞バンクとなる。
　T－iPS細胞バンクにおいては、各細胞株につきドナーのHLA情報と抗原の情報を登録する。
　T－iPS細胞バンクを利用する場合、対象とする患者のHLA型ならびに罹患しているがんの種類に基づき、適切なT－iPS細胞を選択する。選ばれたT－iPS細胞をT前駆細胞ヘ分化誘導し、患者へ投与する。また、T－iPS細胞ではなくT前駆細胞へ分化誘導させた細胞を凍結保存してバンク化しておけば、患者に対してより迅速な治療を提供することができる。
　本願の免疫細胞療法においては、誘導されたT前駆細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やPBSに懸濁してHLAが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのHLA型が一定以上一致する場合とは、両者が完全に一致する場合と、一座不一致や二座不一致などのようなHLAの一部が不一致であるが生着が期待できる程度には一致しているということである。ドナーがHLAハプロタイプホモの場合には、その一方のHLAハプロタイプが一致する場合が例示される。
　本願明細書において、「再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有している多能性幹細胞」とは、上記方法にて得られたiPS細胞に限定されず、組織や臓器の細胞に分化する能力とほぼ無限に増殖する能力をもつ多能性幹細胞であってかつ再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有している細胞であればよい。例えば、再構成されたT細胞レセプター遺伝子をＥＳ細胞やiPS細胞に導入して得られる細胞が例示される。TCR遺伝子の多能性幹細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006(本文件は引用により本願に組み込まれる)に記載の方法に準じて行えば良い。種々の抗原に対して特異的なＴＣＲ遺伝子の多くが知られている。例えばEBウイルス関連抗原特異的TCR遺伝子はJurgens et al, Journal of Clinical Investigation, 26:22, 2006 (本文件は引用により本願に組み込まれる)に開示されている。またWT1抗原特異的TCR遺伝子は例えばAnticancer Research 32(12); 5201－5209, 2012 (本文件は引用により本願に組み込まれる)に開示されている。
　再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有している多能性幹細胞を、T前駆細胞へと分化誘導する。T前駆細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879－6888(この文献は引用により本願に組み込まれる) に記載の方法が挙げられる。具体的には多能性幹細胞を、OP9ストローマ細胞、例えばマウスのOP9ストローマ細胞培養物と共培養して血球前駆細胞を得、得られた血球前駆細胞を次いでOP9ストローマ細胞並びにDLL1細胞と共培養する。OP9/DLL1共培養の際には培地にIL－7、FlT－3LおよびSCF（Stem Cell Factor）を添加する。
　引用した文献はES細胞より成熟T細胞を誘導する方法を説明するものであるが、本願の方法に用いるために、成熟T細胞となる前のT前駆細胞を取り出して用いることができる。T前駆細胞は、常法により細胞表面のマーカーを確認して選別することができる。例えば、下記細胞をT前駆細胞として用いることができる：
CD34+CD5+CD4－CD8－細胞、CD34+CD38－CD45RA－CD10－細胞、CD45RA+CD10+CD7－CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5－細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3－CD4+CD8－細胞およびCD4+CD8+細胞。
　得られたT前駆細胞を患者へ投与する。T前駆細胞は、適当な媒体、例えば生理的食塩水やPBSに懸濁して対象とする患者へ投与する。患者への投与経路は静脈注射、胸腺内注射などが例示される。
　投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。体重約70ｋｇの成人男子ががん患者である場合、T前駆細胞を静脈注射により投与する場合には、106～108個の細胞を、胸腺内投与の場合は105～107個の細胞を投与することが例示される。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
　患者へ投与されたT前駆細胞は胸腺に移住し、胸腺にて成熟T細胞（ナイーブT細胞）へと誘導される。得られる成熟T細胞は再構成されたT細胞レセプター遺伝子を維持している。ナイーブT細胞はT－iPS細胞を誘導する前の細胞傷害性T細胞を誘導した際に用いたがん抗原で刺激することによって、活性化された抗原特異的細胞傷害性T細胞となり、がんを特異的に攻撃する。がん抗原にて刺激するには、例えばがん抗原ペプチドを患者へ投与すればよい。
　本願の方法により、下記の効果が得られる：
i）安全性の保障
　T前駆細胞を患者に投与した場合、T細胞は患者の胸腺中でつくられる。胸腺では、もし自己反応性T細胞が出現しても負の選択で排除される。
ii）再生T細胞の品質の改良
　胸腺中でつくられたナイーブT細胞は、正常な機能を持つ健全なものであると期待できる。
iii）患者へ投与すべき細胞数が比較的少ない
　胸腺へ移住する1個の前駆細胞は、少なくとも106個の未成熟T細胞をつくり出すことが期待できることが知られている。正常には、未成熟T細胞は胸腺による正負の選択を経るので、ナイーブT細胞として末梢に移行できるのはせいぜい5%である。しかも、特定のエピトープに反応できるT細胞は、1/10,000以下である。これに対して、T－iPSから誘導されたT前駆細胞を投与した場合、胸腺でつくられるほとんどすべてのT細胞は胸腺による選択を生き延びることができる。その理由は、これらのT細胞は、すでに胸腺の選択を生き延びたTCRを発現しているからである。そしてこのようにつくられたナイーブT細胞は、元のキラーT細胞の抗原特異性を維持している事である。すなわち、1個の前駆細胞は106個の抗原特異的T細胞をつくり出すことができる。ということは、患者に投与する細胞数は格段に少なくてすみ、コスト削減になる。
　以下実施例に基づき本願をより詳細に説明する。下記実施例は例示のためのものであり、いかなる意味においても本願を限定するものではない。
実施例Ａ
　iPS細胞からT前駆細胞の誘導
材料　OP9細胞、OP9/DLL1細胞はいずれも理研バイオリソースセンター（日本国茨城県つくば市）より入手した。
　ヒトiPS細胞は理研免疫・アレルギー科学総合研究センター（日本国神奈川県横浜市）にて臍帯血造血前駆細胞から作製したものを用いた。なお、使用したヒトiPS細胞は（Vizcardo et al, Cell Stem Cell, 12:31－36, 2013）に記載の方法で作製することもできる。
各培地の組成は下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 *ペニシリン/ストレプトマイシン溶液の組成はペニシリン10000U/mL，ストレプトマイシン10000μg/mLであるため，最終濃度はそれぞれ100U/mL, 100μg/mLとなる
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 *ペニシリン/ストレプトマイシン溶液の組成はペニシリン10000U/mL，ストレプトマイシン10000μg/mLであるため、最終濃度はそれぞれ100U/mL, 100μg/mLとなる。
0）　OP9細胞の準備
　100mmディッシュ（Falcon）へ6mLの0.1％ゼラチンを投入し、37℃にて30分間インキュベートした後、ゼラチン溶液を捨て、medium Aを10mL投入した。
　コンフルエントなOP9培養細胞よりディッシュへ細胞を播種した。
　4日後に10mLのmedium Aを投入した(最終量20mL)。
1）iPS細胞から血球前駆細胞の誘導
Day 0 (iPS細胞とOP9細胞の共培養開始)
　OP9細胞培養物の培地を新しいmedium Aに交換した。
　100mmディッシュ（Falcon）中で培養したコンフルエントなヒトiPS細胞培養物より培地を除き、新しいmedium A10mLを添加した。
　ディッシュの底に塊状に張り付いて生育しているヒトiPS細胞をEZ－passageローラーで剥がした。得られたiPS細胞塊をピペッティングすることで分散させ、培地中に浮遊させた。目視でおよそ600個のiPS細胞塊（およそ1×106細胞）をOP9細胞上に播種した。
　ヒトiPS細胞1クローンあたり3枚のディッシュを用いた。継代に際しては各ディッシュの細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することで、ディッシュ間のばらつきを減らした。
Day 1 (１日経過後、培地交換)
　培地を新しいmedium A 20mLに交換した。
Day 5　(５日経過後、培地半量交換)
　半量分の培地を新しいmedium A 10mLに交換した。
Day 9  (９日経過後、培地半量交換)
　半量分の培地を新しいmedium A 10mLに交換した。
2）血球前駆細胞からT細胞分化誘導
Day 13 （１３日経過後）　ここまでの培養で、iPS細胞は中胚葉細胞へと分化している。誘導された中胚葉細胞を、OP9細胞上から下記手順にてOP9/DLL1細胞上へ移しかえた。
　培地を吸引し、HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。
　その後250U　collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液10mLを加え、37℃で45分間培養した。　
　Collagenase溶液を吸引し、PBS(－)10mLで洗い流した。その後5mLの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え、37℃で20分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるのでピペッティングにより物理的に細かくして、接着細胞同士を離した。ここに新しいmedium Aを20mL加え、さらに37℃で45分間培養した。
　培養後、浮遊細胞を含む上清を、100μｍのメッシュを通して回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mLのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールし、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
　得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために、抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、iPS細胞が造血前駆細胞へ分化していることを確認した。
　次いで細胞をOP9/DLL1細胞に播種した。この工程においてCD34lowCD43+細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージが懸念される。ソーティングしなかった場合に比べてT細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
　培養期間中に分化段階を確認するためにFACS解析を行ったが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられた。そのためFACS解析時にはPI (Propidium Iodide)、7－AADなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。
Day 16 (１６日経過後、細胞の継代)
　OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μmのメッシュを通して50mLコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mLのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 23 (２３日経過後、細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始めた。
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μmのメッシュを通して50mLコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mLのmedium Bに懸濁させた。
Day 30 (３０日経過後、細胞の継代): CD7+CD5+細胞が現れ始めた。
　OP9/DLL1細胞は底面に接着し、密集しているためグレーに見えた。T前駆細胞はOP9上に緩く結合して増えるため、OP9に対して色が明るくみえた。ただし細胞が凝集したようなはっきりとしたコロニーとして見えるわけではなく、丸く明るい粒のようなものが複数個集まっていた。
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μmのメッシュを通して50mLコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mLのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
　T前駆細胞が誘導されているかどうかを確かめるために、抗CD5抗体、抗CD7抗体を用いてFACS解析した。T前駆細胞であるCD7+細胞がみられるようになり、一部の細胞はCD7+CD5+段階にまで分化していた。FACS解析の図を図２に示す。
実施例Ｂ
　iPS細胞由来T前駆細胞の免疫不全マウスへの移植
　実施例Aで得たヒト臍帯血中のCD34+細胞からつくったiPS細胞由来のT前駆細胞を、免疫不全のNOGマウスに移植することでヒトT細胞がつくられることを明らかにした。
　免疫不全NOGマウスは公益財団法人実験動物中央研究所(日本国神奈川県川崎市)より入手した。
1）T前駆細胞の免疫不全マウスへの移植
　セルソーターを用いてCD7+T前駆細胞を分離し、105個をNOGマウスに静注した。
2）レシピエントマウスで成熟型ヒトT細胞を検出
　移植8週間後にマウスを殺し、解析した。成熟型のCD4+T細胞とCD8+T細胞が胸腺と脾臓中に検出された。
3）レシピエントマウス中で負の選択が起こっていた。
　レシピエントマウスでは、GVH反応はみられなかった。ヒトの抹消血T細胞をマウスに移植するとマウスは死亡することが知られているので、何の症状も出なかったということは、レシピエントマウスの体の分子に反応性のあるT細胞は負の選択によって排除されていることを意味するものであった。本試験の手順と結果を図３にまとめた。
　予備試験にて確認されたように、投与されたT前駆細胞は胸腺で成熟T細胞へと誘導された。その際に自己反応性T細胞は負の選択により排除された。
実施例Ｃ
　T－iPS細胞から作製したT前駆細胞のマウス胸腺における器官培養
　実施例ＡおよびＢでは遺伝子再構成をしていないiPS細胞から作製したT前駆細胞をマウスに注射し、マウス胸腺の中でT細胞を分化させた。生成したポリクローナルなT細胞はマウスを攻撃することがなかったことから、「負の選択」が起こった事を示した。
　本実施例においては抗原特異的T細胞からT－iPS細胞を得、T－iPS細胞から作製したT前駆細胞をヒトのHLAが遺伝子導入されているマウスの胸腺にて、器官培養を行った。実施例Ｃの概略図を図４に示す。
１）LMP2－T－iPS細胞の調製
　HLA－A2402拘束性のLMP2抗原特異的なTCRを発現するキラーT細胞からiPS細胞(LMP２－T－iPS細胞）を誘導した。
　EBウイルスは急性期には伝染性単核球症の原因となり、また時にバーキットリンパ腫などのがんの原因ともなるウイルスである。本実施例でT細胞を提供しているのは、EBウイルスに感染歴のある健常人である。このウイルスは、感染後リンパ球内に生涯にわたってとどまるので、この提供者はいわゆるEBウイルスキャリアーである。従ってこの提供者は、発症はしてないが、慢性ウイルス感染者とみなすことができる。
a）LMP2抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の増幅
i)以下の培地を用いた。
樹状細胞用培地: CellGro (CellGenix)
Ｔ細胞用培地：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ii) LMP2の配列は下記である：
ＬＭＰ２抗原ペプチド：ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ
LMP2テトラマーはMBLより購入した。
iii) 抗原提示細胞
　抗原提示細胞としては京都大学病院血液腫瘍内科門脇則光研究室にて健常人ボランティアから樹立されたHLA－A2402を有するLymphoblastoid cell line （LCL）を用いた。
ヒト末梢血より単球由来樹状細胞（MoDC）の誘導
1.　HLA－A2402を有しかつEBウイルス既感染者でもある健常人ボランティアの末梢血よりCD14 microbeadsを用いて単球を単離した。洗浄後、樹状細胞用培地を加え、5 x 105/mLに調整した。
2.　最終濃度GM－CSF 800 U/mL （or 50 ng/mL）、IL－4 200 U/mL （or 40 ng/mL）になるようサイトカインを加えた。6－well plateに5 mL/wellで播いた。37℃、5% CO2でインキュベートした。
3.　インキュベートを3日間 (以下”Day 3”様に記載する) した後に、培養上清を2.5 mL/wellずつ、静かに取って捨てた。
4.　新しい樹状細胞用培地にGM－CSFを800 U/mL、IL－4を200 U/mLの濃度になるように加えた。
5.　各wellに3 mLずつ、新しい樹状細胞用培地を加えた。
6.　Day 6に未成熟MoDCをプレートから回収し、少量の新しい樹状細胞用培地に浮遊させ。5 X 105/mLになるように細胞濃度を調整した。
7.　GM－CSF （以下、最終濃度: 800 U/mL）、IL－4 （200 U/mL）、TNF－α （10 ng/mL）、PGE2 （1 μg/mL）を加え、24穴プレートに約5 X 105/1 mL/wellで細胞を播種した。
8.　37℃、5% CO2で24時間培養した。
9.　上記培養の最後の2時間にペプチドを加えた。ペプチドの最終濃度は10μMとした。
10.　樹状細胞（DC）を回収し、T細胞用培地で2回洗浄した。DCの細胞数を数え、T細胞用培地で2 X 105/mLに調製した。
B. ヒト末梢血よりT細胞の単離と樹状細胞との共培養
1.　Aと同一の健常人ボランティアの末梢血より、CD3 microbeadsを用いてMACSにてT細胞を単離した。洗浄後、T細胞用培地を加え、2 x 106/mLに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
2.　24穴プレートに、DC浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well、T細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた。（DC: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）
3.　3日目にIL－7（最終濃度5 ng/mL）、IL－15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。
4.　 14日目に細胞を回収した。
C.　LCLへのペプチド添加
1.　LCLを培養中から回収し、35Gyの放射線照射を行った。
2. 　T細胞用培地に浮遊させ、5 X 105/mLとなるように調整した。
3. 　ペプチドを100nMで添加し2時間培養した。
4.　 LCLを回収し、T細胞用培地で洗浄後、2 X 105/mLとなるように調整した。
D. LCLと樹状細胞で刺激したT細胞の共培養
1.　樹状細胞で刺激したT細胞をT細胞用培地に浮遊させ、2 X 106 cells/mLの濃度に懸濁した。
2.　 24穴プレートに、ペプチドを加えて培養したLCL浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well、T細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた（LCL: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）。同時にペプチドを100nMとなるように添加した。
3.　3日目にIL－7（最終濃度5 ng/mL）、IL－15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したT細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激1クール目)
4.　再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し、ここに CTLを加えた。
5.　3日目にIL－7（最終濃度5 ng/mL）とIL－15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したT細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激2クール目)
4.　フローサイトメトリー解析により、CD8陽性T細胞中にCD8陽性LMP－2テトラマー陽性細胞が80%以上の割合で検出されることを確認した。
E. LMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
1.　標的細胞として用いるOUN－1白血病細胞株をCFSEラベルし、T細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド1nM存在下で2時間培養を行った。
2.　96穴U底プレートに、ペプチド刺激によって増殖したLMP2特異的キラーT細胞（CD8陽性LMP－2テトラマー陽性細胞）とOUN－1白血病細胞株をそれぞれ0:1、1:9、1:3、1：1、3：1となるように混合し、ペプチド存在下もしくは非存在下において標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)の比率によって検定した。図５に示す。
3.　LMP2特異的キラーT細胞は標的細胞に対し、抗原特異的キラー活性を示すことを確認した。
b) LMP2－T－iPS細胞の樹立
A.　LMP2特異的CTLの活性化
1.　MACS beadsによりCD8陽性細胞を濃縮した。
2.　全ての細胞をT細胞用培地に浮遊させ、IL－7（最終濃度5 ng/mL）、IL－15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。さらにDynabeads Human T－Activator CD3/CD28をT細胞：beadsが1：1となるように添加し、2日間培養することでCD8陽性細胞を活性化した。
B. センダイウィルスによる山中4因子とSV40の導入
1.　活性化させたLMP2特異的CTLをT細胞用培地に浮遊させ、山中4因子とSV40が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま2日間培養した。
2.　T細胞用培地で洗浄し、さらにIL－7（最終濃度5 ng/mL）、IL－15（最終濃度 1ng/mL）を加えたT細胞用培地で2日間培養した。
3.　全ての細胞を回収後、IL－7（最終濃度5 ng/mL）、IL－15（最終濃度 1ng/mL）を添加したT細胞用培地でT細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
4.　2日目にiPS細胞用培地にて半量交換し、翌日から毎日iPS細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。
C. iPS細胞コロニーのピックアップ
1.　3週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2.　200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3.　各クローンを個別に樹立し、そのうちのひとつをLMP2－T－iPS細胞として以下の実験に用いた。
２）LMP2－T－iPS細胞からT前駆細胞の誘導
　LMP2－T－iPS細胞を実施例Ａの手順にしたがって処理し、培養35－40日間にCD4CD8共陽性細胞(double positive: DP)を得た。
３）マウス胸腺におけるＴ前駆細胞の器官培養
　マウス胸腺における器官培養はKawamoto et al, Inetrnatinal Immunology, 9:1011, 1997（本文献は引用により本願の一部を構成する)の記載に従って行った。
　C57BL6マウスにHLA－A2402遺伝子を導入したマウス（CB6F1－Tg(HLA－A*2402/H2－Kb)A24.01）をTaconic Biosciences, Inc.から購入して用いた。コントロールマウスには正常なC57BL6マウスを用いた。
　免疫不全のレシピエントマウスを得るためHLA－2402遺伝子導入マウスまたはコントロールマウスとRag2KOマウスを交配した。交配により妊娠したマウスから、胎齢15日目に胎仔を取り出し、その胎仔から胸腺を得た。胎仔胸腺を6日間デオキシグアノシン（dGuo）を含むRPMI1640培地上に浮遊させたフィルターの上に置いて培養した。この処理により胸腺細胞は死滅し、胸腺環境側の細胞だけが生き残る。
　得られたdGuo処理胎仔胸腺を96穴Vボトムプレートに一つずつ投入し、それぞれに0.2mlのRPMI1640培地を入れ、そこにマックスビーズで精製したDP細胞を加えた。プレートをプラスチックバッグの中に置いて封入した後にバッグ内のガスを５％CO2、25%N2、70%O2という組成の混合ガスに置換して、バッグごと37℃のインキュベータに置いて高酸素条件下でDP細胞とdGuo処理胸腺組織を共培養した。
　培養7日目に培養物を取り出し、スライドガラスの間に挟んですりつぶして破砕し、破砕したものを培地中へ浮遊させることによって、浮遊細胞として得られるT細胞を回収、解析した。
フローサイトメトリー解析
　得られたT細胞をフローサイトメトリー解析に供した。コントロールのマウス胸腺との共培養では移入した細胞はDP細胞段階にとどまっていた。一方ヒトHLA－2402発現胸腺との共培養では、成熟T細胞が生成した。生成したT細胞はほぼすべてLMP2テトラマー陽性（すなわち、元のTCRを出していた）であった（図６）。
キラー活性測定
　抗原提示細胞として京都大学病院血液腫瘍内科門脇則光研究室（日本国京都府京都市）より譲渡された、HLA－A2402を有する健常人ボランティアから採取されたLymphoblastoid cell line （LCL）（B細胞芽球様細胞株）を用いた。
　標的細胞として、京都大学病院血液腫瘍内科門脇則光研究室（日本国京都府京都市）より譲渡されたＴＨＰ１細胞（急性単球性白血病細胞株）を用いた。
　ＬＭＰ２抗原ペプチド：ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（４１９－４２７）
　培地：２０％ウシ胎仔血清含有αＭＥＭ培地（life technologies, cat #11900－073）
　生成したCD8陽性細胞を単離し、抗原提示細胞とLMP2ペプチドの存在下に13日間培養した。
　標的細胞として用いるTHP1白血病細胞株をCFSEラベルした。96穴U底プレートに上記細胞（キラーT細胞）とTHP1細胞をそれぞれ0:1、1:3、1：1、3：1、9：1となるように混合し、ペプチド存在下もしくは非存在下において4時間培養し、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinV陽性細胞の比率によって検定した（図７）。
　ペプチドを添加していない時は殆ど標的細胞を殺していないのに対して、ペプチドの添加量の増加に応じて、より効率よく殺傷した。殺傷能力は元になったキラーT細胞（図５）と比べて遜色がなかった。すなわち、十分強い抗原特異的細胞傷害活性が確認された。
　実施例Ｃにより、T－iPS細胞由来の前駆細胞が、HLA分子が存在する胸腺環境の中で正常に分化でき、かつ抗原刺激により抗原特異的ＣＴＬが誘導されることが示された。

Claims (10)

  1. 再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞をin vitroで誘導してT前駆細胞を得ることを特徴とする、免疫細胞療法用T前駆細胞を得る方法。
  2. T前駆細胞がCD34+CD5+CD4-CD8-細胞、CD34+CD38-CD45RA-CD10-細胞、CD45RA+CD10+CD7-CD5-細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5-細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3-CD4+CD8-細胞およびCD4+CD8+細胞からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
  3. 再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞が、ヒト細胞傷害性T細胞から誘導されたiPS細胞である、請求項１または２記載の方法。
  4. ヒト細胞傷害性T細胞が、ヒト末梢血単核球を抗原により刺激して誘導された細胞傷害性T細胞である、請求項３記載の方法。
  5. 抗原ががん抗原であり、免疫細胞療法ががん患者を治療するために行われる、請求項４記載の方法。
  6. 再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞からT前駆細胞を得、治療を必要とする対象へ当該T前駆細胞を投与することを含む、免疫細胞療法。
  7. T前駆細胞がCD34+CD5+CD4-CD8-細胞、CD34+CD38-CD45RA-CD10-細胞、CD45RA+CD10+CD7-CD5-細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5-細胞、CD45RA+CD10+CD7+CD5+細胞、CD3-CD4+CD8-細胞およびCD4+CD8+細胞からなる群から選択される、請求項６記載の免疫細胞療法。
  8. 再構成されたT細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞が、ヒト細胞傷害性T細胞から誘導されたiPS細胞である、請求項６または７記載の免疫細胞療法。
  9. ヒト細胞傷害性T細胞が、ヒト末梢血単核球を抗原により刺激して誘導された細胞傷害性T細胞である、請求項８記載の方法。
  10. 抗原ががん抗原であり、治療を必要とする対象が、がんを患っている患者である、請求項９記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016010148A1 (ja) * 2014-07-18 2016-01-21 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から免疫細胞療法用ｔ細胞を誘導する方法
US10472610B2 (en) 2014-05-21 2019-11-12 Kyoto University Method for generating pancreatic bud cells and therapeutic agent for pancreatic disease containing pancreatic bud cells
US11426430B2 (en) 2017-02-13 2022-08-30 Assistance Publique—Hopitaux de Paris Method for generating T cells progenitors
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG B. ET AL.: "Generating CTLs against the subdominant EBV LMP antigens bytransit expression of an A20 inhibitor with EBV LMP proteins inhuman DCs", GENE THER., vol. 19, no. 8, 2012, pages 818 - 827 *
NISHIMURA T. ET AL.: "Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.", CELL STEM CELL, vol. 12, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages 114 - 126, XP055218131, DOI: doi:10.1016/j.stem.2012.11.002 *
VIZCARDO R. ET AL.: "Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD 8(+) T cells.", CELL STEM CELL, vol. 12, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages 31 - 36, XP055240588, DOI: doi:10.1016/j.stem.2012.12.006 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10472610B2 (en) 2014-05-21 2019-11-12 Kyoto University Method for generating pancreatic bud cells and therapeutic agent for pancreatic disease containing pancreatic bud cells
WO2016010148A1 (ja) * 2014-07-18 2016-01-21 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から免疫細胞療法用ｔ細胞を誘導する方法
US11426430B2 (en) 2017-02-13 2022-08-30 Assistance Publique—Hopitaux de Paris Method for generating T cells progenitors
US11638723B2 (en) 2017-02-13 2023-05-02 Assistance Publique—Hopitaux de Paris Method for generating T cells progenitors
US11642376B2 (en) 2017-02-13 2023-05-09 Assistance Publique—Hopitaux de Paris Method for generating T cell progenitors
RU2797260C2 (ru) * 2017-02-13 2023-06-01 Ассистанс Публик - Опито Де Пари Способ получения предшественников т-клеток

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