WO2017159087A1 - 免疫細胞療法用ｎｙ－ｅｓｏ１抗原特異的ｔ細胞の誘導方法 - Google Patents

免疫細胞療法用ｎｙ－ｅｓｏ１抗原特異的ｔ細胞の誘導方法 Download PDF

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cell
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宏 河本
裕 島津
喬子 増田
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • This application relates to a method for inducing T cells for immune cell therapy.
  • the present application relates to a method for inducing T cells for immune cell therapy in immune cell therapy in which NY-ESO1 antigen-specific T cells are transplanted.
  • TCRs T cell receptors
  • T cells immortalized, expanded and cloned A method for infinite increase by immortalizing T cells has also been proposed.
  • One cell is immortalized, expanded and cloned.
  • Examples of the immortalization of cells include a method by fusion with cancer cells and a method such as long-term culture by TCR stimulation and cytokine stimulation.
  • the T cells immortalized in this way are so-called cancer cells, and autotransplantation to return to the patient himself is dangerous. There is also a problem that the function is lowered in the cloning step.
  • NY-ESO1 is a cancer / testis antigen that is expressed in some of melanoma, esophageal cancer, multiple myeloma, and adult T-cell leukemia (ATL), but is not expressed in normal tissues other than the testis.
  • the NY-ESO1 antigen is one of the most clinically noticed and studied as a cancer antigen. Clinical trials have been conducted on cancer vaccine therapy using the NY-ESO1 antigen peptide.
  • TCR T cell receptor
  • This TCR gene therapy has at least the following three problems.
  • the TCR gene is introduced using a retroviral vector. That is, it is a gene therapy, and there is a possibility that T cells of a patient who has received the introduction will become cancerous.
  • Inhibition of endogenous TCR by siRNA is not complete, and unexpected reactivity that attacks a patient's tissue by swapping various endogenous TCRa chains or TCRb chains with introduced TCRa or TCRb chains. There is a risk of appearing.
  • An object of the present application is to provide a method for inducing T cells for immune cell therapy in immune cell therapy in which NY-ESO1 antigen-specific T cells are transplanted to another family.
  • the present application further aims to provide an immune cell therapy using T cells derived from the pluripotent stem cells.
  • the present application also aims to provide pluripotent stem cells having a T cell receptor gene specific for NY-ESO1 antigen.
  • the present application includes (1) a step of providing a human pluripotent stem cell having a T cell receptor gene specific for NY-ESO1 antigen, and (2) a step of inducing T cells from the pluripotent stem cell of step (1).
  • a method for inducing T cells for immunocytotherapy is provided.
  • iPS cells When iPS cells are induced as pluripotent stem cells, iPS cells derived from T cells are referred to as T-iPS cells.
  • the donor of the NY-ESO1 antigen-specific T cell may be a healthy person, a healthy person having the NY-ESO1 antigen, or a cancer patient.
  • a pluripotent stem cell having a T cell receptor gene specific for NY-ESO1 antigen introduces a T cell receptor gene specific for NY-ESO1 antigen into the pluripotent stem cell. Can be obtained.
  • the resulting pluripotent stem cell having a T cell receptor gene specific for NY-ESO1 antigen, T-iPS cells, T cells that are T progenitor cells or mature T cells are induced and used for immune cell therapy .
  • T progenitor cells or mature T cells obtained by the method of the present application can be used for cellular immunotherapy.
  • the mature T cells of the present application can be used particularly suitably not only in autologous transplantation but also in treatment by autologous transplantation to another person who has a certain HLA match.
  • transplanting T cells derived from others is contrary to the well-known common knowledge of immune cell therapy.
  • malignant tumors of the blood system such as leukemia
  • bone marrow transplantation that transplants hematopoietic stem cells is performed, but is usually transplanted from an HLA-type donor that matches the recipient so that the donor's bone marrow is not rejected by the recipient.
  • HLA-type donor that matches the recipient so that the donor's bone marrow is not rejected by the recipient.
  • donor T cells can recognize these mismatches as targets for attack.
  • the result is a so-called graft-versus-host reaction, a reaction in which a portion of the transplanted donor T cells attack the recipient body cells. If the HLA does not match, this graft-versus-host response occurs even more strongly. These are actually observed frequently after bone marrow transplantation. From such a background, it is common sense among medical personnel that “it is dangerous to transplant another person's T cells”.
  • T cells derived from pluripotent stem cells having a specific antigen-specific T cell receptor gene obtained by the present invention problems in conventional technical recognition can be unexpectedly solved. .
  • the T-iPS cell method which is the first aspect of the present application is not gene therapy, there is no risk of cell cancer due to gene transfer.
  • the reconstitution of endogenous TCR is suppressed and only the introduced TCR is expressed, so there is little risk of unexpected danger. It is safer if the expression of the endogenous TCR gene is controlled at the iPS stage. Since TCR-iPS cells can be handled as clones, the risk of damaging the gene can be avoided by identifying the gene insertion site and determining and using a safe clone.
  • the following effect is obtained because it is obtained by a method including a step of introducing a NY-ESO1 antigen-specific T cell receptor gene (TCR gene) into a pluripotent stem cell: 1) By introducing a TCR gene with guaranteed efficacy and safety, the quality of the transplanted T cells is guaranteed. 2) The TCR gene insertion site can be identified, a safe clone can be confirmed and used, and the problem of canceration of transplanted cells can be avoided in advance.
  • TCR gene NY-ESO1 antigen-specific T cell receptor gene
  • pluripotent stem cells having a specific antigen-specific T cell receptor are produced, T precursor cells or mature T cells are induced from the pluripotent stem cells and used for cell immunotherapy.
  • T precursor cells or mature T cells are induced from the pluripotent stem cells and used for cell immunotherapy.
  • T-iPS cells nor TCR-iPS cells need to be prepared for each patient, and many types of T-iPS cells and TCR-iPS cells can be prepared in advance.
  • FIG. 3 Photograph of iPS cell colonies derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells. T-iPS cells derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells were induced to differentiate into T cells. FACS analysis of the obtained cells confirmed that they were NY-EOS1 tetramer positive and CD3 positive cells. It NY-ESO1 tetramer positive CD3-positive cells in FIG. 3 is a CD8 single positive cells (left) and CD8 ⁇ + CD8 ⁇ + to have a surface trait (right) was observed.
  • FIG. 6 shows peptide-specific cytotoxic activity against LCL of mature T cells (CTL) regenerated from T-iPS cells derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells.
  • CTL mature T cells
  • NY-ESO-1-positive adult T-cell leukemia strain in which mature T cells (CTL) regenerated from T-iPS cells derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells of A0201-positive healthy individuals do not express A0201 It was confirmed that it has no cytotoxic activity against ATN-1.
  • CTL mature T cells
  • NY-ESO-1-positive adult T-cell leukemia strain in which mature T cells (CTL) regenerated from T-iPS cells derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells of A0201-positive healthy individuals do not express A0201 It was confirmed that it has no cytotoxic activity against TL-Su.
  • NY-ESO-1-positive multiple myeloma cell line in which mature T cells (CTL) regenerated from T-iPS cells derived from NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells of A0201-positive healthy individuals do not express A0201 It was confirmed that it has no cytotoxic activity against KMS28BM.
  • CTL mature T cells
  • NY-ESO1 antigen peptide-specific T cells of A0201-positive healthy individuals express A0201-positive and NY-ESO-1 Survival of mice transplanted with TL-Om1 was prolonged.
  • mice transplanted with U266 were transplanted with U266.
  • pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and also has a self-proliferating ability.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, embryonic germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stems ( Examples include iPS) cells, cultured fibroblasts, bone marrow stem cells-derived pluripotent cells (Muse cells), and the like.
  • the pluripotent stem cell is preferably a mammalian pluripotent stem cell, more preferably a human pluripotent stem cell. Considering the production of a therapeutic cell bank using human-derived cells having a specific HLA, it is preferable to use iPS cells.
  • T cell means a cell expressing on its surface an antigen receptor, which is recognized as a T cell receptor (TCR). It has been reported, for example, in WO2011 / 096482 and Vizcardo ⁇ ⁇ ⁇ et al., 96Cell2Stem Cell 12, 31-36 2013 that iPS cells are induced from T cells.
  • iPS cells are obtained from desired antigen-specific T cells.
  • the T cells induced into iPS cells are preferably T cells that express CD3 and express at least one molecule selected from the group consisting of CD4 and CD8.
  • human T cells include helper / regulatory T cells that are CD4 positive cells, cytotoxic T cells that are CD8 positive cells, naive T cells (CD45RA + CD62L + cells), central memory T cells ( CD45RA ⁇ CD62L + cells), effector memory T cells (CD45RA ⁇ CD62L ⁇ cells), and terminal effector T cells (CD45RA + CD62L ⁇ cells).
  • Human T cells can be isolated from human tissues by a known technique.
  • the human tissue is not particularly limited as long as it is a tissue containing the T cell, and examples thereof include peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, umbilical cord blood, and lesioned tissue. Among these, peripheral blood and umbilical cord blood are preferable from the viewpoint of low invasiveness to humans and easy preparation.
  • a known technique for isolating human T cells includes, for example, flow cytometry using an antibody against a cell surface marker such as CD4 and a cell sorter as shown in the Examples described later.
  • desired T cells can be isolated using cytokine secretion or functional molecule expression as an index.
  • T cells have different cytokines secreted depending on Th1 type or Th2 type. Therefore, T cells having a desired Th type can be isolated by selecting such cytokines as indicators. .
  • cytotoxic (killer) T cells can be isolated using secretion or production of granzyme or perforin as an index.
  • NY-ESO1 antigen-specific cytotoxic T cells can be obtained by stimulating lymphocytes obtained from humans by a conventional method, such as peripheral blood mononuclear cells, with NY-ESO1 antigen or an epitope peptide thereof.
  • a conventional method such as peripheral blood mononuclear cells
  • a plurality of epitope peptides of NY-ESO1 antigen have been identified, and a method for inducing NY-ESO1 antigen-specific cytotoxic T cells is well known.
  • lymphocytes may be stimulated using cancer cells that express the NY-ESO1 antigen.
  • NY-ESO1 antigen-specific cytotoxic T cells can be derived from cells of a patient suffering from or expressing a history of NY-ESO1 antigen or from a healthy subject. Good.
  • T-iPS cells obtained from healthy human T cells the following effects are obtained: 1) Since various antigen-specific T cells can be induced from healthy human cells, T-iPS cells having many types of TCR genes can be prepared in advance. 2) Since it targets healthy people, it is easy to collect donors when creating a T-iPS bank.
  • antigen-specific T cells are considered to be collected from patients with infectious diseases or cancer. This is because antigen-specific T cells are amplified in the body of an infectious disease or cancer patient, and it is thought that it is easy to detect / collect specific reactive T cells.
  • the present application provides a method of collecting T cells specific for an antigen associated with a disease from a patient having such a disease and using it as a material for T-iPS cells for transplantation.
  • pluripotent stem cells obtained as described above.
  • the method described in Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013 may be used.
  • a desired antigen-specific T cell can be obtained from a subject who has acquired immunity against the disease to be treated, and a T-iPS cell can be obtained by introducing a yamanaka factor into this cell (Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663). -673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929 (2011)).
  • An induced pluripotent stem (iPS) cell is an artificial stem cell derived from a somatic cell having characteristics almost equivalent to those of an ES cell, which can be produced by allowing a specific reprogramming factor to act on a somatic cell ( K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666).
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, and ECAT15.
  • -2 Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, or Glis1, etc.
  • the reprogramming factor may be brought into contact with or introduced into a somatic cell by a known method according to its form.
  • a protein form it may be introduced into a somatic cell by techniques such as lipofection, fusion with a cell membrane permeable peptide (eg, HIV-derived TAT and polyarginine), and microinjection.
  • a cell membrane permeable peptide eg, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like.
  • the artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc., so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • selectable marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudoouridine may be used as an initialization factor (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • the culture medium for inducing iPS cells is, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture medium containing 10 to 15% FBS (in addition to LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. may be included as appropriate.) Or a commercially available culture medium [eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cell culture Culture medium (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology)) and the like.
  • FBS penicillin / streptomycin
  • puromycin puromycin
  • L-glutamine Non-essential amino acids
  • ⁇ -mercaptoethanol etc.
  • a commercially available culture medium eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate
  • iPS cell induction can be, for example, 37 ° C., 5% CO at 2 presence of about 4-7 days contacting the somatic cell with reprogramming factor on 10% FBS-containing DMEM or DMEM / F12 culture medium
  • the cells are then cultured on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and bFGF-containing primate ES cell culture medium is cultured about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor. Incubating at about 30 to about 45 days or more after the contact can give rise to ES-like colonies.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS (including LIF, penicillin / streptomycin, etc.) on feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • Puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be included as appropriate.
  • ES-like colonies can be generated.
  • somatic cells to be initialized themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (YoshidaoshiY, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5 : 237-241 or WO2010 / 013845). (The literature described in this paragraph constitutes part of this application by reference)
  • HDAC histone deacetylase
  • small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC1293, M344, siRNA against HDAC And shRNA (eg, nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (TM) (Millipore), HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc.), MEK inhibitors (for example, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901).
  • VPA valproic acid
  • TM HDAC1 siRNA Smartpool
  • HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc. HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc.
  • MEK inhibitors for example, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901.
  • Glycogen synthase kinase-3 inhibitors eg, Bio and CHIR99021
  • DNA methyltransferase inhibitors eg, 5-azacytidine
  • histone methyltransferase inhibitors eg, BIX-012
  • Small molecule inhibitors such as 4, nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a), L-channel calcium agonist (eg Bayk8644), butyric acid, TGF ⁇ inhibitor or ALK5 inhibitor (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA against p53), ARID3A inhibitors (eg siRNA and shRNA against ARID3A), miR-291-3p, miR-294, miR MiRNAs such as -295 and mir-302, Wnt Signaling (eg soluble Wnt3a), neuropeptide Y, prostaglandin
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a culture medium selective culture medium
  • a drug resistance gene expressed in conjunction with a gene expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • iPS cells can be selected by adding a luminescent substrate in the case of a luminescent enzyme gene. Induced iPS cells (T-iPS cells) maintain the T cell receptor gene of the derived T cells.
  • a NY-ESO1 antigen-specific TCR gene is introduced into a pluripotent stem cell.
  • the Rag1 or Rag2 gene is disrupted by a genome editing technique or the like at the stage of NY-ESO1 antigen pluripotent stem cells, and then TCR genes are induced to differentiate into T cells.
  • the TCR gene may also be used to isolate a desired antigen-specific T cell from a cancer patient, or from a healthy person, and isolate the TCR gene from the T cell.
  • a desired antigen-specific TCR gene is introduced into a pluripotent stem cell derived from a donor cell, such as an iPS cell.
  • the TCR gene may be placed on an appropriate vector and introduced into iPS cells.
  • it can be introduced into somatic cells by techniques such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, vectors, lipofection, liposomes, microinjection and the like.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • the artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used.
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc. so that TCR can be expressed, and, if necessary, a drug resistance gene (for example, kanamycin resistance).
  • Gene ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene and other selectable marker sequences, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG and other reporter gene sequences it can.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • a pluripotent stem cell having a desired TCR gene is induced to differentiate into a T progenitor cell or a mature T cell.
  • Examples of the method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to T cells include the methods described in Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888.
  • Rag1 is used at the stage of pluripotent stem cells using the technique described in WO2016 / 010148.
  • the Rag2 gene may be disrupted by a genome editing technique or the like, and then differentiation induction into T cells may be started.
  • T progenitor cell refers to a stage of a cell immediately before receiving a positive selection / negative selection from a stage corresponding to a hematopoietic stem cell which is the most undifferentiated cell among hematopoietic cells. To the equivalent of. T cell differentiation is described in Blood B 111: 1318 (2008) and Nature mm Immunology 11: 585 (2010).
  • T cells are roughly classified into ⁇ T cells and ⁇ T cells, and ⁇ T cells include killer T cells and helper T cells.
  • This application covers all T cells.
  • T cell includes both T progenitor cells and T mature cells, and preferably refers to a T cell that expresses CD3 and expresses at least one molecule selected from the group consisting of CD4 and CD8. Shall. T cells having CTL activity are preferred, and CD4 negative CD8 positive cells.
  • T cells containing the same NY-ESO1 antigen-specific TCRs (regenerative T cells) by inducing differentiation into pluripotent stem cells having NY-ESO1 antigen-specific TCRs and sorting them appropriately using FACS or the like (regenerative T cells) can be obtained.
  • the purity of the cell population can be further increased.
  • iPS cells having NY-ESO1 antigen-specific TCR 90% or more, preferably 95% or more of T cells contained in the culture have the same NY-EOS1-specific TCR. T cell cultures can be obtained.
  • NY-ESO1 antigen has been confirmed at a high rate in various types of solid cancers and blood system cancers.
  • the present application can be applied to immune cell therapy for cancers that express such NY-ESO1 antigen.
  • the present application provides a T cell preparation targeting the NY-ESO1 antigen.
  • NY-ESO1 antigen-specific T cells can be induced from a healthy person, T-iPS cells can be produced from such cells, and T cells produced from the T-iPS cells can be used. After confirming the function of T cells regenerated from the T-iPS cells using normal human cells from which the T-iPS cells are derived, the T-iPS cells are banked and stored. The HLA of a patient suffering from a cancer expressing the NY-ESO1 antigen to be treated is examined, a suitable HLA-derived cell is selected from the banked T-iPS cells, and T cells prepared from the T-iPS cells are selected. Can be used for cell immunotherapy. If T-iPS cells are pre-induced to T cells and cryopreserved, they can be administered more rapidly to more patients. In addition, the administered cells will eventually be rejected, so there is no need to consider the risk of canceration of the administered cells.
  • the induced T cells are suspended in an appropriate medium, such as physiological saline or PBS, and administered to a target patient whose HLA matches a certain level or more.
  • an appropriate medium such as physiological saline or PBS
  • the donor is an HLA haplotype homo
  • at least one of the HLA haplotypes is matched.
  • Administration to the patient may be performed intravenously.
  • the dose is not limited, but in the case of mature T cells, the dose is 10 6 -10 7 cells / kg and is intravenously administered to the patient one or more times. In the case of T-progenitor cells, the dose may be about 1/10 to 1/1000 of the dose.
  • the number of cells to be administered is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's age, sex, height, weight, target disease, symptoms, and the like.
  • the optimal number of cells to be administered may be appropriately determined by clinical trials.
  • T cells can target various antigens, and the method of the present application can be applied to immune cell therapy for various diseases such as cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, and allergies.
  • NY-ESO1 gene is highly expressed in melanoma, esophageal cancer, multiple myeloma, adult T-cell leukemia (ATL), etc., and NY-ESO1 antigen-specific T-iPS cells or TCR-iPS cells to CTL cells When differentiation-induced cells are used, application to immunocell therapy of these various cancers expressing the NY-ESO1 gene is possible.
  • iPS cells from NY-ESO1 antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) (NY-ESO1-T-iPS) and regeneration of NY-ESO1-antigen-specific CTL from NY-ESO1-T-iPS
  • LCL Lymphoblastoid cell line
  • IL-2 final concentration 12.5 U / mL
  • IL-7 final concentration 5 ng / mL
  • IL-15 final concentration 1 ng / mL
  • IL-2 final concentration 12.5 U / mL
  • IL-7 final concentration 5 ng / mL
  • IL-15 final concentration 1 ng / mL
  • the T cells were suspended in a T cell medium containing no cytokine and seeded on feeder cells. 4). On the second day, half of the medium was replaced with iPS cell culture medium, and from the next day, half of the medium was replaced daily with iPS cell culture medium, and the culture was continued.
  • the penicillin / streptomycin solution consisted of 10000 U / mL penicillin and 10000 ⁇ g / mL streptomycin, with final concentrations of 100 U / mL and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • OP9 cells 6 ml of 0.1% gelatin / PBS solution was placed in a 10 cm culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes or more. Confluent OP9 cells were detached with a trypsin / EDTA solution and seeded in a 10 cm culture dish coated with a 1/4 equivalent amount of gelatin. Medium A was added to medium A to 10 ml. 10 ml of medium A was newly added to the OP9 cell culture dish seeded after 4 days so that the total volume became 20 ml.
  • iPS cells Induction of blood cell progenitor cells from iPS cells
  • the medium of OP9 cells used for co-culture was aspirated and replaced with fresh medium A.
  • the medium of the iPS cell culture dish was aspirated and 10 ml of fresh medium A was added.
  • the iPS cell mass was cut with an EZ-passage roller. The cut iPS cell mass was floated by pipetting with a 200 ul pipetman, and approximately 600 iPS cell masses were visually seeded on OP9 cells.
  • the cells were combined once and then redistributed to the same number to reduce the variation between dishes.
  • Day 1 (medium exchange) It was confirmed whether the iPS cell mass started to adhere and differentiate, and the medium was replaced with 20 ml of fresh medium A.
  • Day 5 (change medium half amount) Half of the medium was replaced with 10 ml of fresh medium A.
  • Day 9 (medium exchange) Half of the medium was replaced with 10 ml of fresh medium A.
  • Day 13 Transfer induced mesoderm cells from OP9 cells to OP9 / DLL1 cells
  • the medium was aspirated and the medium on the cell surface was washed away with HBSS (+ Mg + Ca). Thereafter, 10 ml of a 250 U collagenase IV / HBSS (+ Mg + Ca) solution was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the Collagenase solution was aspirated and washed away with 10 ml of PBS ( ⁇ ). Thereafter, 5 ml of 0.05% trypsin / EDTA solution was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 20 minutes. After culturing, the cells were peeled off in a film form, so they were physically made fine by pipetting, and the adherent cells were separated.
  • FACS analysis is performed to confirm the differentiation stage during the culture period, and many dead cells are observed during the culture in all periods. Therefore, at the time of FACS analysis, PI (PropidiumAIodide), 7-AAD, etc. were used for analysis after removing dead cells.
  • PI PropidiumAIodide
  • 7-AAD 7-AAD
  • sequences of TCR ⁇ chain and ⁇ chain of NY-ESO-1 were determined by a conventional method.
  • Example 1 The function of the regenerated CTL obtained in Example 1 was evaluated in vitro.
  • A. Evaluation of peptide-specific cytotoxic activity Target cells that have NY-ESO-1 peptide antigen reacted with their own LCL to determine whether the resulting regenerated CTL has NY-ESO1 peptide-specific CTL activity in vitro The cytotoxic activity was evaluated.
  • Autologous LCL was reacted with NY-ESO-1 peptide (1 ⁇ M, 100 nM, 10 nM, 1 nM and no peptide (0 nM)) for 2 hours.
  • LCL was recovered, and regenerated CTL and LCL were mixed at a ratio of 1: 3, 1: 1, 3: 1, and 9: 1, and then cultured for 5 hours in an environment of 37 ° C.
  • cytotoxic activity was evaluated by the ratio of Annexin V positive cells. The results are shown in FIG. As a result, it was shown that the cytotoxic activity was increased depending on the peptide concentration and the number of cells, and it was confirmed that the cytotoxic activity was specific to NY-ESO-1 antigen.
  • regenerated CTL impaired A0201-positive and NY-ESO1 expressing cell lines TL-Om1 (FIG. 6A solid line) and U266 (FIG. 7A solid line) in a cell number-dependent manner. Further, since the cytotoxic activity against TL-Om1 and U266 was suppressed by administration of an anti-HLA antibody (FIG. 6A dashed line, FIG. 7A dashed line), it was shown to be antigen-specific cytotoxic activity. That is, the obtained regenerated CTL recognizes NY-ESO1 in a HLA-A0201 restriction and exhibits killer activity.
  • Example 1 The function of the regenerated CTL obtained in Example 1 was evaluated in vivo. It was examined whether the cytotoxic activity of Example 2 was similarly observed in vivo. 1 ⁇ 10 7 TL-Om-1 cells were intraperitoneally administered to immunodeficient NOG mice. Next, PBS was administered to one mouse and 1 ⁇ 10 7 regenerated CTLs were administered to the other mouse on the 1st, 2nd, 4th, 7th, 9th, and 11th days, and the survival was analyzed. The results are shown in FIG. In the group administered with the regenerated CTL obtained in Example 2, the survival was significantly prolonged.
  • mice received 1 ⁇ 10 7 U266 cells intraperitoneally.
  • PBS was administered to one mouse and 1 ⁇ 10 7 regenerated CTLs were administered to the other mouse on the first, third, fifth, eighth, fifteenth, and twenty-second days, and the survival was analyzed.
  • the results are shown in FIG. In the group to which the regenerated CTL was administered, survival was significantly prolonged (FIG. 9). From the above, it was confirmed that regenerated CTL has cytotoxic activity against cancer cells expressing NY-EOS1 even in vivo.

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Abstract

（１）ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および （２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程 を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞は、好ましくはヒトから単離あるいは誘導されたＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導し（Ｔ－ｉＰＳ）、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞を再生することによって調製される。

Description

免疫細胞療法用ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法
　本願は免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。本願は特に、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。
　個々のＴ細胞は異なる特異性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のＴ細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の特異性を示すＴ細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで何代も継代培養するうちに、がん細胞を殺す活性が低下するという問題もあった。
　Ｔ細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、ＴＣＲ刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したＴ細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。
　ＮＹ－ＥＳＯ１はメラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）の一部で発現が認められるが、正常組織では精巣以外には発現しない、がん・精巣抗原である。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原はがん抗原として最も臨床的に注目され研究が進められている抗原の一つである。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチドを用いた癌ワクチン療法について、臨床試験が行われている。
　ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ＝T cell receptor）遺伝子が単離されている。ＴＣＲ遺伝子を患者の正常Ｔ細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体内に戻す（自家移植）遺伝子治療について臨床試験が実施されており、特定のがん種で有効であると報告されている。(非特許文献１～３）。ＴＣＲを発現させる際には、患者の正常Ｔ細胞がもともと発現しているＴＣＲをｓｉＲＮＡ等により抑制することが行われている。
る。
　このＴＣＲ遺伝子療法には、少なくとも以下の３つの問題がある。１）レトロウイルスベクターを用いてＴＣＲ遺伝子の導入が行われるが、これはすなわち遺伝子治療であり、導入を受けた患者のＴ細胞ががん化する可能性がある。２）ｓｉＲＮＡによる内因性ＴＣＲの抑制は完全ではなく、多様な内因性ＴＣＲａ鎖やＴＣＲｂ鎖と導入したＴＣＲａ鎖やＴＣＲｂ鎖とのスワッピング等により、患者の組織を攻撃するような想定外の反応性が出現する危険性がある。３）患者ごとにＴ細胞の回収、遺伝子改変、投与を行う必要があり、事前準備ができず治療に時間がかかる。
ＷＯ２０１１／０９６４８２ ＷＯ２０１６／０１０１５３ ＷＯ２０１６／０１０１５４ ＷＯ２０１６／０１０１５５
Robbins PF et al., J Clin Oncol. 2011; 29(7): 917-924 Robbins PF et al., Clin Cancer Res. 2015; 21(5): 1019-1027 Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013 Vizcardo et al., Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013. Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006) Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011) Anticancer Research 32(12); 5201-5209, 2012 Jurgens et al, Journal of Clinical Investigation, 26:22, 2006 Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006 Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 Blood 111:1318(2008) Nature Immunology 11: 585(2010)
　本願は、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法を提供することを目的とする。本願はさらに、当該多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞を用いる免疫細胞療法を提供することを目的とする。
　本願はまた、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を提供することを目的とする。
　本願は（１）ＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
　本願の第１の態様において、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞は提供者からＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を単離または誘導し、当該Ｔ細胞から多能性幹細胞を誘導する。多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を誘導する場合、Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞をＴ－ｉＰＳ細胞という。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞の提供者は健常人であっても、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原を有する健常人あるいは癌患者であってもよい。
　本願の第２の態様において、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞は、多能性幹細胞へＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を導入することによって得ることができる。
　得られたＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞、Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞であるＴ細胞を誘導し、これを免疫細胞療法に用いる。
　本願の方法で得られるＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞は、細胞免疫療法に用いることができる。細胞免疫療法においては、本願の成熟Ｔ細胞は自家移植のみならず、ＨＬＡが一定以上一致した他人への他家移植による治療において特に好適に用いることができる。
　他人由来のＴ細胞を移植するというアイデアは、従来よく知られている免疫細胞療法の常識に反するものでる。例えば血液系の悪性腫瘍（白血病など）では、造血幹細胞を移植する骨髄移植が行われるが、ドナーの骨髄がレシピエントによって拒絶されないように、通常はレシピエントと一致したＨＬＡ型のドナーから移植される。しかしながら他人間においては、ＨＬＡ以外の多くのタンパク分子においてアミノ酸配列が不一致であり、ドナーＴ細胞はこれらの不一致を攻撃対象と認識し得る。その結果、移植したドナーＴ細胞の一部がレシピエントの体の細胞を攻撃する反応であるいわゆる移植片対宿主反応が生じる。ＨＬＡが一致していない場合は、この移植片対宿主反応はさらに強く起こる。これらは実際に骨髄移植後に高頻度に認められている。そのような背景から、医療関係者の間では「他人のＴ細胞を移植するのは危険」というのは常識である。
　しかるに本願の発明により得られる特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞を用いることにより、従来の技術認識における問題を予想外にも解決することができる。
　すなわち、本願の第１の態様であるＴ－ｉＰＳ細胞法は遺伝子治療ではないので、遺伝子導入に起因する細胞癌化の危険性は生じない。またｉＰＳ細胞から再生されるＣＴＬでは内在性のＴＣＲの再構成が抑制され導入したＴＣＲしか発現しないので、想定外の危険が生じる危険が少ない。また、ｉＰＳ段階で内在性ＴＣＲ遺伝子の発現を制御すればより安全である。ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞はクローンとして扱えるので、遺伝子挿入箇所を同定して安全なクローンを確定して用いることで遺伝子を傷つける危険性を回避できる。
　さらに、本願の第２の態様ではＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子（ＴＣＲ遺伝子）を多能性幹細胞に導入する工程を含む方法にて得られることから、下記の効果が得られる：
１）効果並びに安全性が保障されたＴＣＲの遺伝子を導入することにより、得られる移植用Ｔ細胞の品質が保証される。
２）ＴＣＲ遺伝子挿入箇所を同定し、安全なクローンを確定して用いることができ、移植細胞のがん化の問題を予め回避できる。
３）多能性幹細胞へＴＣＲ遺伝子挿入して得られる多能性幹細胞をＴ細胞へ分化させる場合、分化過程で導入ＴＣＲが先に発現することから細胞が元々もっている（以下内因性と表記）ＴＣＲが再構成されず、想定外の反応が出現することがほとんどない。
　本願においては、特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体を有する多能性幹細胞をつくり、当該多能性幹細胞からＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を誘導してこれを細胞免疫療法に用いる。かかる方法を採ることにより移植する細胞は単一の特異性を有するＴ細胞になるために移植片対宿主反応を起こす心配がなく、自家移植のみならず他家移植が可能になることを初めて見出した。すなわち、本願によってはじめて「Ｔ細胞を他人に移植する」ことが可能となる。
　今まで提案されている種々のｉＰＳ細胞から分化誘導させたＴ細胞以外の細胞や組織を移植する治療法では、当該細胞が一生涯生着し続けることが期待されている。従って、他家移植を前提とするｉＰＳ細胞ストック事業においてｉＰＳ細胞から分化誘導される細胞を移植する際には、患者は免疫抑制剤を飲み続ける必要がある。この点は、自家ｉＰＳ細胞と比して不利な点である。しかるに、本願におけるＴ－ｉＰＳまたはＴＣＲ－ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞の場合、一定期間後に拒絶される。すなわちドナーとレシピエント間でＨＬＡが一定以上一致するとはいえ、他人間ではマイナー組織適合抗原が一致しないのでいずれは拒絶される。この点で、ｉＰＳ細胞を用いた他の細胞の他家移植とは全く異なり予想外の優れた効果が示される。
　Ｔ－ｉＰＳ細胞、ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞ともに患者ごとにつくる必要はなく、あらかじめ多くの種類のＴ－ｉＰＳ細胞やＴＣＲ－ｉＰＳ細胞をつくっておくことができる。よってＴ－ｉＰＳ細胞、ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞レベル、またはかかる細胞から誘導したＴ前駆細胞もしくはＴ細胞レベルでバンク化することが可能である。すなわち、本願によってはじめて「Ｔ細胞を他人に移植する」を施行する体制の構築が大幅に加速されることになった。また、治療までの時間が短縮できるだけでなく、移植する前に移植細胞の品質の確認ができるというメリットもある。
実施例１において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。 ＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。 ＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞を、Ｔ細胞へ分化誘導した。得られた細胞のＦＡＣＳ解析により、ＮＹ－ＥＯＳ１テトラマー陽性、ＣＤ３陽性細胞であることが確認された。 図３のＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー陽性ＣＤ３陽性細胞がＣＤ８シングルポジティブ細胞であること（左側）およびＣＤ８α＋ＣＤ８β＋の表面形質を持っていること（右側）が確認された。 ＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ－Ｏｍ１に対する細胞傷害活性を有すること、並びにかかる活性が抗ＨＬＡ抗体で抑制されること（点線）を確認した。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ－ＥＳＯ－１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株ＡＴＮ－１に対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ－ＥＳＯ－１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ－Ｓｕに対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する細胞傷害活性を有すること、並びにかかる活性が抗ＨＬＡ抗体で抑制されること（点線）を確認した。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ－ＥＳＯ－１陽性の多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ－ＥＳＯ－１陽性の多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ２８ＢＭに対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ－Ｏｍ１を移植したマウスの生存を延長した。 Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ－ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を移植したマウスの生存を延長した。
　本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが例示される。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞である。特定のHLAを有するヒト由来の細胞を用いて、治療法の細胞バンクを製造することを考慮すると、iPS細胞を用いるのが好ましい。
　本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と賞される抗原受容体を発現している細胞を意味する。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導してもＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に報告されている。
　本願の第１の態様においては、所望の抗原特異的Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を得る。ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）が挙げられる。
　ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
　ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球、例えば末梢血単核球を、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原のエピトープペプチドは複数が同定されており、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法も良く知られている。または、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現するがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。
　ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現する癌に罹患している患者またはかかる癌の既往のある対象の細胞から誘導しても、健常人から誘導してもよい。健常人のＴ細胞から得たＴ－ｉＰＳ細胞を用いる場合には、下記の効果が得られる：
　１）健常人の細胞から種々の抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができるため、予め多くの種類のＴＣＲ遺伝子を有するＴ－ｉＰＳ細胞をつくっておくことができる。
　２）健常人を対象とするので、Ｔ－ｉＰＳバンクを作製にあたってドナーを集めやすい。
　一般に抗原特異的なＴ細胞は感染症やがんの患者本人から採取することが考えられている。それは、抗原特異的Ｔ細胞は感染症やがん患者の体内で増幅されており、特定の反応性のＴ細胞を検出／採取しやすいと考えられているからである。本願ではそのように疾病を有する患者から疾病に関連する抗原に特異的なＴ細胞を採取し、それを他家移植用のＴ－ｉＰＳ細胞の材料にする方法を提供する。
　特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より特定の抗原特異性、例えばＮＹ－ＥＳＯ１抗原に特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。
　上記のごとく得られるＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的なＴ細胞から多能性幹細胞を誘導する。Ｔ細胞から多能性幹細胞細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に記載の方法を持いてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異的Ｔ細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してＴ－ｉＰＳ細胞を得ることができる(Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)および Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011))。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
　初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
　タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
　初期化因子がＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、５－メチルシチジンおよびpseudouridine(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたＲＮＡを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
　ｉＰＳ細胞誘導のための培養液は、例えば、１０～１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、penicillin/streptomycin、puromycin、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ－ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR,Stemcell Technology社）］などが例示される。
　ｉＰＳ細胞誘導の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４～７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約３０～約４５日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約２５～約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ－５（WO2009/123349）、Ｌａｍｉｎｉｎ－１０（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
　この他にも、血清を含有しない培地を用いてｉＰＳ細胞を樹立する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
　ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、HDAC1 siRNA Smartpool(TM)（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ－８３－０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５およびｍｉｒ－３０２などのｍｉＲＮＡ、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等が知られている。ｉＰＳ細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３～約５×１０６細胞の範囲である。
　ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。誘導されたｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）は由来するＴ細胞のＴ細胞受容体遺伝子を維持する。
　本願の第２の態様においては、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を多能性幹細胞へ導入する。
　種々のがんについてＮＹ－ＥＳＯ１抗原多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導をＴＣＲ遺伝子が報告されている。ＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異的Ｔ細胞をがん患者から単離し、あるいは健常人より誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。本願においては、所望の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子をドナー細胞から誘導された多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞へ導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
　所望のＴＣＲ遺伝子を有している多能性幹細胞を、Ｔ前駆細胞または成熟Ｔ細胞へと分化誘導する。多能性幹細胞からＴ細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888に記載の方法が挙げられる。また、多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する前に、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起こらないようにするために、ＷＯ２０１６／０１０１４８に記載されている技術等を用いて、多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を開始してもよい。
　本明細書ならびに請求の範囲において「Ｔ前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択／負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。Ｔ細胞の分化についてはBlood 111:1318(2008)およびNature Immunology 11: 585(2010)に説明されている。
　Ｔ細胞には大きく分けてαβＴ細胞とγδＴ細胞があり、αβＴ細胞にはキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞が含まれる。本願は全てのＴ細胞を対象とする。Ｔ細胞はＴ前駆細胞およびＴ成熟細胞のいずれをも含むものとし、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞を言うものとする。好ましくはＣＴＬ活性を有するＴ細胞であり、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞である。ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを有する多能性幹細胞をＴ細胞へ分化誘導し、ＦＡＣＳ等を用いて適宜ソートすることによって、同一のＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを含むＴ細胞（再生Ｔ細胞）から構成される細胞集団を得ることができる。多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を行うことにより、より細胞集団の純度を上げることができる。例えばＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを有するｉＰＳ細胞をＴ細胞へ分化誘導することによって、培養物に含まれる９０％以上、好ましくは９５％以上のＴ細胞が同一のＮＹ－ＥＯＳ１特異的ＴＣＲを有するＴ細胞培養物を得ることができる。
　いろいろな種類の固形がんや血液系のがんで高率にＮＹ－ＥＳＯ１抗原の発現が確認されている。本願は、かかるＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現する癌の免疫細胞療法へ応用することができる。
　本願によって、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原をターゲットとするＴ細胞製剤が提供される。具体例として、健常人からＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、かかる細胞からＴ－ｉＰＳ細胞を作製し、そのＴ－ｉＰＳ細胞から作製したＴ細胞を用いることができる。Ｔ－ｉＰＳ細胞が由来する健常人の細胞を用いてそのＴ－ｉＰＳ細胞から再生されたＴ細胞の機能を確認した上で、そのＴ－ｉＰＳ細胞をバンク化して保存しておく。
　治療対象とするＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹った患者のＨＬＡを調べ、バンク化したＴ－ｉＰＳ細胞から適合するＨＬＡ由来の細胞を選択し、当該Ｔ－ｉＰＳ細胞から作製したＴ細胞を用いて細胞免疫治療が可能である。Ｔ－ｉＰＳ細胞を予めＴ細胞まで分化誘導させた上で凍結保存しておけば、より多くの患者により迅速に投与できる。また投与した細胞はいずれ拒絶されるので投与細胞のがん化のリスクは考えなくてよい。
　本願の免疫細胞療法においては、誘導されたＴ細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳに懸濁してＨＬＡが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのＨＬＡ型は、完全に一致する場合、ドナーがＨＬＡハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のＨＬＡハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量は限定的ではないが、成熟Ｔ細胞とする場合には１０６－１０７細胞／ｋｇで、１回ないし複数回、患者へ経静脈投与する。Ｔ前駆細胞とする場合には、その１０分の１－１０００分の１程度の投与量でよい。
　投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
　Ｔ細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対象とした免疫細胞療法への応用が可能である。
　ＮＹ－ＥＳＯ１遺伝子はメラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）などにおいて高発現しており、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的なＴ－ｉＰＳ細胞またはＴＣＲ－ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＮＹ－ＥＳＯ１遺伝子を発現するこれら種々の癌の免疫細胞療法への応用が可能である。
ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からのｉＰＳ細胞の作製（ＮＹ－ＥＳＯ１－Ｔ－ｉＰＳ）と、ＮＹ－ＥＳＯ１－Ｔ－ｉＰＳからのＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬの再生
１）ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬの誘導並びに増幅
　健常人由来のリンパ芽球細胞株ＬＣＬ（Lymphoblastoid cell line）を用い、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬを誘導し、これを増幅した。用いた材料を以下に示す。
ｉ）培地
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
ｉｉ）　ＮＹ－ＥＳＯ１ペプチド
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）
Jaeger E et al. J.Exp.Med.187:265-270(1998)
ｉｉｉ）　ＬＣＬ（Lymphoblastoid cell line）
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にてＨＬＡ－Ａ０２０１陽性健常人ボランティアから採取されたＬＣＬを用いた。
Ａ．　ヒト末梢血からのＴ細胞の単離とペプチドによる刺激
１．　健常人ボランティアの末梢血より単核球をＦｉｃｏｌｌによって精製し、Ｔ細胞培地で懸濁した。
２．　９６穴Ｕ底プレートに１穴あたり２．５ｘ１０５／ｍＬとなるように細胞を播種し、ペプチドを１００ｎＭとなるように添加した。
３．　３日目にＩＬ－２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加え、１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。
Ｂ．　ＬＣＬへのペプチド添加
１．　ＬＣＬを回収し、３５Ｇｙの放射線照射を行った。
２．　Ｔ細胞用培地に浮遊させ、５×１０５／ｍＬとなるように調整した。
３．　ペプチドを１００ｎＭとなるよう添加し２時間培養した。
４．　ＬＣＬを回収し、Ｔ細胞用培地で洗浄後、２×１０５／ｍＬとなるように調整した。
Ｃ．　ペプチドをパルスしたＬＣＬとＴ細胞との共培養
１．　ペプチド刺激を加えた後、２週間培養したＴ細胞を回収し、洗浄後にＴ細胞用培地に懸濁し、２×１０６／ｍＬに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
２．　２４穴プレートに、ペプチドを加えて培養したＬＣＬの浮遊液（２×１０５／ｍＬ）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ、Ｔ細胞浮遊液（２×１０５／ｍＬ）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた（ＬＣＬ：Ｔ＝１×１０５／ｗｅｌｌ：１×１０６／ｗｅｌｌ＝１：１０）。
３．　３日目にＩＬ－２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激１クール目）
４．　再度１００ｎＭのペプチドと加えた培地でＬＣＬを２時間培養し、ここにＣＴＬを加えた。
５．　３日目にＩＬ－２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激２クール目）
６．　再度１００ｎＭのペプチドと加えた培地でＬＣＬを２時間培養し、ここにＣＴＬを加えた。
７．　３日目にＩＬ－２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激３クール目）
８．　フローサイトメトリー解析により、ＣＤ８陽性ＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー陽性分画がＣＤ８陽性Ｔ細胞中に約１０％の割合で検出されることを確認した。結果を図１に示す。
２）　ＮＹ－ＥＳＯ１－Ｔ－ｉＰＳ細胞の樹立
Ａ．　センダイウィルスによる山中４因子とＳＶ４０の導入
１．　FACS AriaによりＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞をソートした。ソートしたＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＣＴＬをＴ細胞用培地に浮遊させ、山中４因子とＳＶ４０が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま２日間培養した。
２。Ｔ細胞用培地で洗浄し、さらにＩＬ－２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えたＴ細胞用培地で２日間培養した。
３．　全ての細胞を回収後、サイトカインを含まないＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
４．　２日目にｉＰＳ細胞用培地に半量交換し、翌日から毎日ｉＰＳ細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。
Ｂ．　ｉＰＳ細胞コロニーのピックアップ
１．３週間後にｉＰＳ細胞コロニーを目視により確認した。
２．　２００ｕｌチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
３．　各クローンを個別にｉＰＳ細胞として樹立した。得られたクローンの写真を図２に示す。
３）　ＮＹ－ＥＳＯ１－Ｔ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化誘導
使用した培地は下記である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 ＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび　１００μｇ／ｍＬとした。
ＯＰ９細胞の準備
　０．１％　ゼラチン／ＰＢＳ溶液６ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、３７℃で３０分以上静置した。コンフルエントになったＯＰ９細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
　４日後に播種したＯＰ９細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
ｉＰＳ細胞からの血球前駆細胞誘導
　共培養に使用するＯＰ９細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またｉＰＳ細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを１０ｍｌ加えた。EZ-passageローラーでｉＰＳ細胞塊を切った。カットしたｉＰＳ細胞塊を２００ｕｌピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ６００個のｉＰＳ細胞塊をＯＰ９細胞上に播種した。
　ｉＰＳ細胞１クローンあたり３枚以上のディッシュを用い、継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。
Ｄａｙ　１　（培地交換）
ｉＰＳ細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A　２０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　５　（培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A　１０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　９　　（培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A　１０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　１３　（誘導した中胚葉細胞をＯＰ９細胞上からＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上へ移しかえる）
培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ　collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液１０ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（－）１０ｍｌで洗い流した。その後５ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２０分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。
　ここに新しいmedium Aを２０ｍｌ加え、さらに３７℃で４５分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、１００μｍのメッシュを通して回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。このうち１／１０をＦＡＣＳ解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
　得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４３抗体を用いてＦＡＣＳ解析した。ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。
Ｃ．　血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
　次いで細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。この工程において、ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
　培養期間中に分化段階を確認するためにＦＡＣＳ解析を行うが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられる。そのためＦＡＣＳ解析時にはＰＩ（Propidium Iodide）、７－ＡＡＤなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。
Ｄａｙ　１６　（細胞の継代）
　ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。
Ｄａｙ　２３　（細胞の継代）：　血液細胞コロニーが見え始めた。
　ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。
Ｄａｙ　３６　：　ＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
　ＮＹ－ＥＳＯ１特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３抗体、ＮＹ－ＥＳＯ１テトラマーを用いてＦＡＣＳ解析した。　Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり、大部分の細胞はＣＤ３＋ＮＹ－ＥＳＯ１テトラマー＋にまで分化していることが確認された。ＦＡＣＳ解析結果を図３に示す。
　また、同じ細胞を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体を用いてさらにＦＡＣＳ解析したところこれらの細胞はＣＤ４－ＣＤ８＋細胞であることが確認された（図４左）。また、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体により解析したところ、ＣＤ８α＋ＣＤ８β＋の表面形質を持っていることが確認された（図４右）。
　さらにNY-ESO-1のＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列を常法により決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例１で得られた再生ＣＴＬの機能をin vitroで評価した。
Ａ　ペプチド特異的細胞傷害活性の評価
　得られた再生ＣＴＬがin vitroでＮＹ－ＥＳＯ１ペプチド特異的ＣＴＬ活性を持つかどうかを、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド抗原を自家のＬＣＬと反応させた細胞を標的として、細胞障害活性を評価した。
　自家ＬＣＬをＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよびペプチドなし（０ｎＭ））と２時間反応させた。ＬＣＬを回収し、再生ＣＴＬとＬＣＬを１：３、１：１、３：１、９：１の割合で混合後、３７℃５％ＣＯ２の環境下で５時間培養を行った。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性細胞の割合で、細胞障害活性を評価した。結果を図５に示す。その結果、ペプチド濃度および細胞数依存的に細胞障害活性が高まっていることが示され、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原特異的な細胞障害活性を持つことが裏付けられた。
Ｂ　Ａ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ１を発現する細胞株に対する細胞障害活性の評価
　Ａ０２０１を有しかつＮＹ－ＥＳＯ－１を発現している成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ－Ｏｍ１および多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する、得られた再生ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。陰性コントロールにはＡ０２０１を発現しないＮＹ－ＥＳＯ－１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株（ＡＴＮ－１、ＴＬ－Ｓｕ）および多発性骨髄腫株（ＲＰＭＩ８２２６、ＫＭＳ２８ＢＭ）を使用した。結果を図６Ａ～Ｃ並びに図７Ａ～Ｃに示す。
　再生ＣＴＬはＡ０２０１陽性かつＮＹ－ＥＳＯ１を発現する細胞株であるＴＬ－Ｏｍ１（図６Ａ　実線）およびＵ２６６（図７Ａ　実線）を細胞数依存的に障害することが分かった。またこのＴＬ－Ｏｍ１およびＵ２６６に対する細胞障害活性は抗ＨＬＡ抗体を投与することにより抑制されることから（図６Ａ破線、図７Ａ破線）抗原特異的な細胞障害活性であることが示された。即ち、得られた再生ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ０２０１拘束性にＮＹ－ＥＳＯ１を認識し、キラー活性を発揮する。
　実施例１で得られた再生ＣＴＬの機能をin vivoで評価した。
　実施例２の細胞障害活性がin vivoでも同様に認められるかどうかを検討した。
　免疫不全ＮＯＧマウスに１×１０７個のＴＬ－Ｏｍ－１細胞を腹腔内投与した。次に一方のマウスにはＰＢＳを、もう一方のマウスには１×１０７個の再生したＣＴＬを第１、２、４、７、９、１１病日に投与し、その生存を解析した。結果を図８に示す。実施例２で得た再生ＣＴＬを投与した群では有意に生存の延長が認められた。
　マウスに１×１０７個のＵ２６６細胞を腹腔内投与した。次に一方のマウスにはＰＢＳを、もう一方のマウスには１×１０７個の再生したＣＴＬを第１、３、５、８、１５、２２病日に投与し、その生存を解析した。結果を図９に示す。再生したＣＴＬを投与した群では有意に生存の延長が認められた（図９）。以上より再生ＣＴＬはin vivoでもＮＹ－ＥＯＳ１を発現するがん細胞に対する細胞傷害活性を有することが確認された。

Claims (20)

  1. （１）ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
    （２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程
    を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
  2. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞から多能性幹細胞を誘導することによって得られる、請求項１記載の方法。
  3. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹患しているあるいは同疾患の既往のあるヒトから得られたＴ細胞である、請求項２記載の方法。
  4. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＮＹ－ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹患したことのないヒトから得られたＴ細胞である、請求項２に記載の方法。
  5. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞へＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を導入することによって得られた多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、Ｒａｇ２あるいはＲａｇ２遺伝子を欠失したものである、請求項１～５いずれかに記載の方法。
  7. 抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡ型に完全に一致あるいは一部が一致するＨＬＡ型を有するヒト由来の多能性幹細胞である、請求項１～６いずれかに記載の方法。
  8. 抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡの何れか一方のハプロタイプをホモで有しているハプロタイプホモ接合型のＨＬＡを有しているヒトから得られたＴ細胞である、請求項７記載の方法。
  9. ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である請求項１～８いずれかに記載の方法。
  10. 免疫細胞療法が、がんを治療するためのものである、請求項１～９いずれかに記載の方法。
  11. がんがＮＹ－ＥＳＯ１遺伝子を発現するがんである、請求項１０記載の方法。
  12. がんが、メラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
  13. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ－Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１～１２いずれかに記載の方法。
  14. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである、請求項１～１３いずれかに記載の方法。
  15. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有する免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
  16. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ－Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１５記載の免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
  17. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである請求項１５記載の免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
  18. 同一のＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を９０％以上含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
  19. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ－Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１８記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
  20. ＮＹ－ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである請求項１８記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
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