JP6948072B2 - Ｃｄ８陽性ｔ細胞を誘導する方法 - Google Patents
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Description
多能性幹細胞からＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法に関する。
個々のＴ細胞は異なる特異性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のＴ細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の抗原に対する特異性を示すＴ細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は免疫細胞療法として臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで何代も継代培養するうちに、抗原特異的細胞傷害活性が低下するという問題もあった。
Ｔ細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、ＴＣＲ刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したＴ細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。
特定の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を有する多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞を製造する方法、並びに当該ｉＰＳ細胞からＴＣＲを維持したＴ細胞を再生させる方法が報告されている(特許文献１〜７および非特許文献１〜６）。これらの方法によって、特定のＴＣＲ遺伝子を有するＴ細胞を大量に得ることが可能となり、免疫細胞療法への応用が期待されている。
しかしながら例えばヒトの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞）からｉＰＳ細胞を誘導し、得られたｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を再生させた場合に、再生ＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性として元のＣＴＬ細胞と同等のものが得られたという報告は無い。
生体内で生成されるＣＴＬ細胞はＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ８はＣＤ８αβヘテロダイマー型であることが知られている。ＣＤ８αα型Ｔ細胞は自然免疫型と呼ばれるタイプのＴ細胞であり、ＭＨＣクラスＩ分子と十分な結合性を有しておらず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコレセプターとしての作用は弱い。ＣＤ８αα型Ｔ細胞はリンパ系組織においてはほとんど含まれておらず、粘膜組織において多く見られる。
Vizcardo, R., Masuda, K., Yamada, D., Ikawa, T., Shimizu, K., Fujii, S., Koseki, H., and Kawamoto, H. (2013). Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell 12, 31-36.
Nishimura, T., Kaneko, S., Kawana-Tachikawa, A., Tajima, Y., Goto, H., Zhu, D., Nakayama-Hosoya, K., Iriguchi, S., Uemura, Y., Shimizu, T., et al. (2013). Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 114-126.
Wakao, H., Yoshikiyo, K., Koshimizu, U., Furukawa, T., Enomoto, K., Matsunaga, T., Tanaka, T., Yasutomi, Y., Yamada, T., Minakami, H., et al. (2013). Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 546-558.
Themeli, M., Kloss, C.C., Ciriello, G., Fedorov, V.D., Perna, F., Gonen, M., and Sadelain, M. (2013). Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nat Biotechnol 31, 928-933.
Ando, M., Nishimura, T., Yamazaki, S., Yamaguchi, T., Kawana-Tachikawa, A., Hayama, T., Nakauchi, Y., Ando, J., Ota, Y., Takahashi, S., et al. (2015). A Safeguard System for Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Rejuvenated T Cell Therapy. Stem Cell Reports 5, 597-608.
Kitayama, S., Zhang, R., Liu, T.Y., Ueda, N., Iriguchi, S., Yasui, Y., Kawai, Y., Tatsumi, M., Hirai, N., Mizoro, Y., et al. (2016). Cellular Adjuvant Properties, Direct Cytotoxicity of Re-differentiated Vα24 Invariant NKT-like Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 6, 213-227.ここに挙げる文献はいずれも引用により本願の一部を構成する。
一の態様において、本願は多能性幹細胞からＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を製造する方法を提供することを目的とする。より詳細には、本願は多能性幹細胞から所望の抗原特異的細胞傷害活性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。なお、以下単に「ＣＤ８Ｔ細胞」という場合はＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を意味するものとする。他の態様において、本願は同一抗原特異性を有し、高い抗原特異性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を提供することを目的とする。
本願の一の態様においては、
（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を除く工程、および
（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を除く工程、および
（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
本願の他の態様においては、
（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質の共存下で、（１）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質の共存下で、（１）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
本願の方法において、多能性幹細胞としては所望の抗原に対して特異的な受容体を有するものが例示され、例えば再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）や、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有しているものが挙げられる。再構成されたＴＣＲを有している多能性幹細胞から本願の方法により誘導されたＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞は、元のＴＣＲの抗原特異性を維持した、抗原特異的細胞傷害活性を示す。再構成されたＣＡＲを有している多能性幹細胞も同様である。
多能性幹細胞としてはまた、ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞が例示される。ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞を用いる場合には、得られたＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へ公知の方法にて所望のＴＣＲを誘導することによって所望の抗原特異性を有する抗原特異的細胞傷害活性を示す細胞を得ることができる。
多能性幹細胞としてはまた、ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞が例示される。ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞を用いる場合には、得られたＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へ公知の方法にて所望のＴＣＲを誘導することによって所望の抗原特異性を有する抗原特異的細胞傷害活性を示す細胞を得ることができる。
本願の方法によって、同一の抗原特異性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に同一のTCR遺伝を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞が細胞培養物を構成する細胞の８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上含まれる細胞培養物を得ることができる。本願はまた、かかる細胞培養物を提供する。
別の態様において、本願の方法によって得られる抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を患者へ投与することを含む、免疫細胞療法を提供する。
本願の方法により、所望の抗原特異性を有し、かつ強い抗原特異的細胞傷害活性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞培養物を得ることができる。
本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが例示される。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞である。特定のＨＬＡを有するヒト由来の細胞を用いて、免疫療法に用いられる細胞のバンクを製造することを考慮すると、ｉＰＳ細胞を用いるのが好ましい。
本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
本願明細書並びに請求の範囲において、「ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞」「ダブルポジティブＴ細胞」および「ＤＰ細胞」はいずれもＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を意味する。「ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞」、「ダブルネガティブＴ細胞」および「ＤＮ細胞」はいずれもＣＤ４陰性ＣＤ８陰性Ｔ細胞を意味する。「ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞」、「ＣＤ８Ｔ細胞」および「ＣＤ８ＳＰ細胞」はいずれも、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を意味する。特に断りの無い限り、「ＣＤ８Ｔ細胞」とする場合にはＣＤ８ααホモダイマーおよびＣＤ８αβヘテロダイマーの両方を包含する。「ＴＣＲ」はＴ細胞受容体を意味する。「ＣＴＬ細胞」は細胞傷害性Ｔ細胞を意味する。
所望の抗原特異性を有する再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有しているＴ細胞は、所望の抗原に特異的な再構成されたＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導することによって得ることができる。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導しても再構成済のＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013（本文献は引用により本願の一部を構成する。）等に報告されている。ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−細胞）が挙げられる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）細胞が好適に用いられる。
ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、ＣＤ３等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
癌や感染症に関連する抗原に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、当該抗原を発現する癌あるいは対象とする感染症に罹患している患者またはかかる癌や感染症の既往のある対象から単離し、増殖させても、健常人から得られた細胞から誘導してもよい。
特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、当該抗原特異的Ｔ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より特定の抗原特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。
ある抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球、例えば末梢血単核細胞を、当該抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。多くの疾患、例えば癌、自己免疫疾患、感染症等に関連する抗原タンパク質あるいはそのエピトープペプチドが知られており、目的に応じて適宜選択すれば良い。リンパ球を抗原にて刺激して抗原特異的ＣＴＬ細胞を誘導する方法は良く知られている。
所望の抗原特異性を有するＴ細胞にはまた、遺伝子操作によって得られるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。ＣＡＲ−Ｔ細胞は文献記載の方法によって得ることができるThemeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) および Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015)。（本文献は引用により本願の一部を構成する。）
上記のごとく得られる所望の抗原特異性を有するＴ細胞からiPS細胞を誘導する。Ｔ細胞からiPS細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に記載の方法を用いてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異的Ｔ細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してT-iPＳ細胞を得ることができる(Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)および Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011))。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
初期化因子がＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびpseudouridine(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたＲＮＡを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液は、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、penicillin/streptomycin、puromycin、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR, STEMCELL Technologies社）］などが例示される。
ｉＰＳ細胞誘導の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、Laminin-10（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
この他にも、血清を含有しない培地を用いてｉＰＳ細胞を樹立する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、HDAC1 siRNA Smartpool(TM)（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等が知られている。ｉＰＳ細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4, Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。誘導されたｉＰＳ細胞（T-iPS細胞）は由来するＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を維持する。
所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を得る他の方法としては、所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を多能性幹細胞へ導入する方法が挙げられる。
種々のがんに対する抗原特異的ＴＣＲ遺伝子が報告されている。ＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異的Ｔ細胞をがん患者から単離し、あるいは健常人より誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。抗原特異的ＴＣＲ遺伝子としては、特定の抗原特異性を有するキメラ抗原受容体遺伝子もまた含まれる。
所望の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞へ導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
本願の方法において、多能性幹細胞はＴ細胞以外の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞や、ＥＳ細胞であってもよい。本明細書ならびに請求の範囲で使用する「体細胞」なる用語は、精子、精母細胞、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化多能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全個体の体細胞もしくは疾患を有する個体の体細胞のいずれも包含される。また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は分化した細胞、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、組織前駆細胞、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等が例示される。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は、上記のＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法と同様の方法を用いることができる。
多能性幹細胞を、ＤＰ細胞およびＤＮ細胞を含むＴ細胞集団へと分化誘導する。多能性幹細胞からＴ細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888に記載の方法が挙げられる（本文献は引用により本願の一部を構成する）。
一の態様において、多能性幹細胞を、ＯＰ９ストローマ細胞、例えばマウスのＯＰ９ストローマ細胞培養物と共培養して血球前駆細胞を得る。得られた血球前駆細胞を次いでＯＰ９／ＤＬＬ１細胞と共培養する。ＯＰ９／ＤＬＬ１共培養の際には培地にＩＬ−７、ＦｌＴ−３ＬおよびＳＣＦ（Stem Cell Factor）を添加する。かかる方法にて多能性幹細胞を分化誘導した場合、ＤＮ細胞およびＤＰ細胞を含む細胞培養物が得られる。
本発明者らはＤＮ細胞とＤＰ細胞の混合物をＣＤ３抗体により刺激した場合、ＤＮ細胞がＤＰ細胞を殺傷することを見出した。よって続くステップにおいて細胞培養物よりＤＮ細胞を取り除く。ＤＮ細胞を除いた細胞培養物はＤＮ細胞を実質的に含まないものが好ましく、例えばＤＮ細胞の含有量を５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％未満とすることが好ましい。以下、ＤＰ細胞とＤＮ細胞を含む細胞培養物よりＤＮ細胞を除去する工程を「ＤＰ細胞の濃縮」とし、ＤＮ細胞を除去した細胞培養物を「濃縮したＤＰ細胞培養物」として説明する。細胞培養物からＤＮ細胞以外の細胞を同時に、あるいは個別に除去する場合も同様に「ＤＰ細胞の濃縮」および「濃縮したＤＰ細胞培養物」という。
多能性細胞のＴ細胞への分化誘導の過程において、ＤＮ細胞およびＤＰ細胞を含む細胞培養物はＣＤ８ＳＰ細胞が含まれる場合がある。かかるＣＤ８ＳＰＣ細胞がＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞である可能性があり、ＤＰ細胞の濃縮、即ちＤＮ細胞の除去に当たってはＣＤ８ＳＰ細胞、特にＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞も同時に取り除くことが好ましい。細胞培養物からＤＮ細胞、ＣＤ８ＳＰ細胞を除く方法は限定的ではない。一の態様においてはＣＤ４抗体を結合させた担体、例えばＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ４陽性細胞を回収することによってＣＤ８ＳＰ細胞並びにＤＮ細胞を除去することができる。さらにＣＤ８βを結合させた担体、例えばＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ８ＳＰαβヘテロダイマー型Ｔ細胞を回収することによってＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞を除去することができる。他の態様としては、セルソーターにてＤＮ細胞画分を除去することによってＤＮ細胞を実質的に含まない細胞培養物を、あるいはセルソーターにてＤＰ細胞画分を集めることによって、ＤＮ細胞、ＣＤ８ＳＰ細胞を実質的に含まない細胞培養物を得ることができる。さらに、セルソーターにてＣＤ８ＳＰαβヘテロ接合型の細胞画分を集めることによってＣＤ８ＳＰααホモ接合型の細胞を実質的に含まない細胞培養物を集めることができる。
濃縮したＤＰ細胞培養物を、次いでＣＤ８ＳＰ細胞へと分化誘導する。ＤＰ細胞からＣＤ８ＳＰ細胞への誘導は、Ｔ細胞受容体に刺激を加えた時に生じる活性化経路の何れかを直接活性化することによって行うことができる。例えば、PMAとIonomysinを添加することによりTCR刺激に類似した形でT細胞を活性化することができる。TCRを介した刺激としては、例えば、ＤＰ細胞をＣＤ３抗体により刺激しながら培養することが例示される。ＣＤ３抗体による刺激に加え、ＩＬ−７およびＩＬ−２を培養液に添加するのが好ましい。ＣＤ３抗体を含む培養液による培養期間は３〜１０日間、例えば４〜８日、例えば約６日間とすればよい。
ＤＰ細胞培養物が、所望の抗原に対する特異的受容体、例えばＴＣＲを有する多能性幹細胞から誘導されたＤＰ細胞培養物である場合には、当該抗原による刺激あるいは、当該抗原を提示する抗原提示細胞による刺激を加えることによってもＤＰ細胞からＣＤ８ＳＰ細胞へ分化誘導することが可能である。同様に、CARを発現する場合は、CARが認識する抗原を可溶性分子として添加する、ビーズや培養器にコートして共培養する、別な細胞に発現させて共培養するなどの方法で刺激を入れることができる。
濃縮したＤＰ細胞培養物をＴ細胞受容体に刺激を加えた時に生じる活性化経路の何れかを直接活性化することによって分化誘導して得られるＣＤ８ＳＰ細胞はそのほとんどがＣＤ８αβヘテロダイマーを発現するＣＤ８αβ型のＴ細胞である。以下に示す参考例２において、ＤＰ細胞の濃縮を行わずにＤＮ細胞やＣＤ８ＳＰ細胞を含む細胞培養物からＣＤ３抗体刺激によるＣＤ８ＳＰ細胞を誘導した場合、得られた細胞のほとんどがＣＤ８ααホモダイマーであった。ＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞は抗原特異的細胞傷害活性が低いが、比較的高いＮＫ様細胞傷害活性を示す。
本願の別の態様として、ＤＮ細胞の除去を行わずにＤＮ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質と共に以下のＣＤ３抗体を含む培養液を含む培養を行ってもよい。ＤＮ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質としては、パーフォリン阻害剤、グランザイム阻害剤、Fas経路阻害剤、カスパーゼ阻害剤、NK活性化レセプター阻害抗体等が例示される。
本願の方法により、再構成されたＴＣＲ遺伝子あるいはＣＡＲ遺伝子を有する多能性幹細胞から分化誘導されるＣＤ８ＳＰ細胞は、強い抗原特異的細胞傷害活性を示す。例えばヒトＣＴＬ細胞からＴ-ｉＰＳ細胞を誘導し、Ｔ-ｉＰＳ細胞からＤＰ細胞の濃縮工程を経てＣＤ８ＳＰ細胞(再生ＣＴＬ細胞)を誘導した場合、最終的に得られる再生ＣＴＬ細胞として元のＣＴＬ細胞と遜色無い抗原特異的ＣＴＬ活性を示す細胞を得ることが可能である。なお、再構成されたＴＣＲ遺伝子あるいはCAR遺伝子を有する多能性幹細胞を用いる場合、Ｔ細胞を誘導する前に、ＴＣＲ遺伝子等の更なる再構成が起こらないようにするために、ＷＯ２０１６／０１０１４８に記載されている技術等を用いて、多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を開始してもよい。ＣＡＲ遺伝子を有する多能性幹細胞の作成法ならびにその多能性幹細胞からCAR発現T細胞の分化誘導については分献記載の方法によって得ることができる[Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) および Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015)]。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
本願のさらに別の態様においては、多能性幹細胞から分化誘導されるＣＤ８ＳＰ細胞培養物に所望の抗原特異性を有するTCR遺伝子を発現させることによって、所望の抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を得てもよい。本態様において、多能性幹細胞はＴＣＲ遺伝子あるいはＣＡＲ遺伝子を有しているものであっても、かかる遺伝子を有していないものであってもよい。所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子をＣＤ８ＳＰ細胞培養物に発現させるには、上記多能性幹細胞に所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を発現させる方法に準じて行えばよい。ＴＣＲを発現させる際に、生成したＣＤ８ＳＰ細胞が発現しているＴＣＲはｓｉＲＮＡ等により抑制すればよい。
あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞培養物から所望の抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を作製してもよい。CAR遺伝子をＣＤ８ＳＰ細胞に導入することによって、CAR発現細胞を得ることができる。
本願の方法により得られる抗原特異的ＣＴＬ細胞は、当該抗原自体、あるいは当該抗原提示する抗原提示細胞にて刺激する、もしくは抗ＣＤ３抗体により刺激するなど公知の方法によって、さらに増殖させた上で用いても良い。
多くのがんに発現しているタンパク質として、ＬＭＰ２、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１を含む数多くのものが知られている。これらのタンパク質のエピトープペプチドもがん抗原ペプチドとしてまた公知である。また、これらのがん抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子も数多くの公知のものがある。本願の方法によって、がんに対して特異的な細胞傷害活性を有する高品質のＣＤ８ＳＰ細胞を高い純度で含む細胞集団を得ることが可能となり、免疫細胞療法において有用である。
本願の実施例にて示すように、本願の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞を投与することによって、ヒト腫瘍播種マウスモデルに対する治療効果が確認された。また、この再生細胞を投与したマウスで他の組織が損傷を受けるなどの副作用はみられていない。さらに、投与した細胞ががん化するような事象は観察されていない。本発明の方法は、癌や感染症に特異的な抗原に特異的なＣＴＬ細胞を患者に投与する免疫細胞療法において、有効性、安全性とも、臨床応用できるレベルに相当近いと考えられる。
本願によって、様々な抗原をターゲットとする免疫細胞療法用Ｔ細胞製剤が提供される。具体例として、健常人から特定の抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、かかる細胞からＴ−ｉＰＳ細胞を作製し、そのＴ−ｉＰＳ細胞から本願の方法によりＣＤ８ＳＰ細胞を作成することができる。Ｔ−ｉＰＳ細胞が由来する健常人の細胞を用いてそのＴ−ｉＰＳ細胞から本願の方法にて再生されたＣＤ８ＳＰ細胞の機能を確認した上で、そのＴ−ｉＰＳ細胞をバンク化して保存しておく。あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞を作成し、増殖させた上で小分けにしてバンク化して保存しておくことが考えられる。
治療対象とする当該抗原を発現するがんに罹った患者のＨＬＡを調べ、バンク化したＴ−ｉＰＳ細胞から適合するＨＬＡ由来の細胞を選択し、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞から本願の方法にて誘導したＣＤ８ＳＰ細胞を用いて細胞免疫治療が可能である。あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞を保存しておけば、患者へ迅速に必要な細胞を届けることができる。
本願の免疫細胞療法においては、誘導されたＣＤ８ＳＰ細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳに懸濁してＨＬＡが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのＨＬＡ型は、完全に一致する場合、ドナーがＨＬＡハプロタイプホモ（ホモ接合型）の場合には、少なくともその一方のＨＬＡハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量は限定的ではないが、１０６−１０７細胞／ｋｇで、１回ないし複数回、患者へ経静脈投与する。
頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するひとをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中である（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）。（本文献は引用により本願の一部を構成する。）本願の方法を用いて、免疫細胞療法のためのＣＤ８ＳＰ細胞を作製するに当たり、多能性幹細胞としてかかるハプロタイプホモ接合型のドナー由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞が特に好適に用いられる。
投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。Ｔ細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対象とした免疫細胞療法への応用が可能である。
T-iPS細胞の樹立
末梢血単核細胞、自己LCLセルラインおよびC1R-A*24:02セルラインの準備
HLA-A*24:02を有する健常人ボランティアから末梢血単核細胞（PBMC）を、骨髄単核細胞を白血病患者から常法にしたがって単離した。末梢血Ｂリンパ球をEpstein-Barr virus (EBV)にて形質転換して自己B-lymphoblastoid cell line (自己)を得た。またヒトLCL細胞株であるC1RにHLA-A*24:02遺伝子を導入してHLA A*24:02のみを発現するC1R-A*24:02細胞株を得た。
末梢血単核細胞、自己LCLセルラインおよびC1R-A*24:02セルラインの準備
HLA-A*24:02を有する健常人ボランティアから末梢血単核細胞（PBMC）を、骨髄単核細胞を白血病患者から常法にしたがって単離した。末梢血Ｂリンパ球をEpstein-Barr virus (EBV)にて形質転換して自己B-lymphoblastoid cell line (自己)を得た。またヒトLCL細胞株であるC1RにHLA-A*24:02遺伝子を導入してHLA A*24:02のみを発現するC1R-A*24:02細胞株を得た。
LMP2およびWT1ペプチド特異的CTLの増殖
健常人ボランティアから得たPBMC2.5x105を、９６ウェルのＵ底プレート(Falcon)の各ウェルに播種し、10％ヒトAB血清(Sigma)、ペニシリン(100 U/ml)-ストレプトマイシン(100 μg/ml)混合溶液(Nacalaitesque)およびLMP2 (TYGPVFMSL:配列番号１)またはWT1 (CYTWNQMNL:配列番号２)(Tsuboi, A et al. (2002)Cancer Immunol Immunother 51, 614-620)合成ペプチド(10 μｇ／ｍｌ; Eurofins)を添加したRPMI 1640培地中で培養した。２日後、組み換えヒトIL-2 (12.5 U/ml)(Peprotech)、IL-7(10 ng/ml) (Peprotech)およびIL-21(30 ng/ml)(Peprotech)を各ウェルに加えた。
健常人ボランティアから得たPBMC2.5x105を、９６ウェルのＵ底プレート(Falcon)の各ウェルに播種し、10％ヒトAB血清(Sigma)、ペニシリン(100 U/ml)-ストレプトマイシン(100 μg/ml)混合溶液(Nacalaitesque)およびLMP2 (TYGPVFMSL:配列番号１)またはWT1 (CYTWNQMNL:配列番号２)(Tsuboi, A et al. (2002)Cancer Immunol Immunother 51, 614-620)合成ペプチド(10 μｇ／ｍｌ; Eurofins)を添加したRPMI 1640培地中で培養した。２日後、組み換えヒトIL-2 (12.5 U/ml)(Peprotech)、IL-7(10 ng/ml) (Peprotech)およびIL-21(30 ng/ml)(Peprotech)を各ウェルに加えた。
四量体染色法により抗原特異的CTLを含むCD8陽性Ｔ細胞を単離した。100 nMのLMP2またはWT1合成ペプチドと共に予め培養し、放射線照射したHLA-A*24:02+ LCLと得られた細胞を共培養した。培養２日後、IL-2、IL-7およびIL-21を、最初の刺激と同じ濃度で加えた。CTL細胞はその後２週間毎にLCLで刺激して増幅させた。得られたCTL細胞を「元のCTL細胞」という。
LMP2およびWT1特異的T-iPSCの樹立
腫瘍抗原特異的T-iPS細胞を、非特許文献１に記載の方法をわずかに改変した方法により樹立した。簡単には、腫瘍抗原特異的CTLを、CD8マイクロビーズ(Milteny Biotec)またはFACSAria IIIセルソーター(BD Biosciences)により濃縮した。1x106 個の濃縮した腫瘍抗原特異的CTLを、４つの山中因子およびMOI 3のSV40ラージT抗原(LTa) (Addgene)を含むセンダイウイルスベクターを用いて形質転換した(Nishimura, K. et al., (2011) J Biol Chem 286, 4760-4771)。スピンインフェクション後、形質転換細胞を、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上に播種し、10％ ヒトAB血清およびIL-2 (12.5U/ml)、IL-7 (10 ng/ml)、IL-21 (30 ng/ml)を添加したT細胞培地であるRPMI-1640中で培養した。２日目に、培地の半分を、20％ノックアウト血清代替添加物(Gibco)、非必須アミノ酸 (0.1 mM) (Gibco)、2-メルカプトエタノール (10 mM) (Nacalai Tesque)および塩基性線維芽細胞増殖因子(5 ng/ml) (Wako)を添加したヒトiPSC培地であるダルベッコ改変イーグル培地／F12 (Sigma)に交換した。コロニーは、２１〜３５日目に出現し始めた。各コロニーを採取し、増殖させた。
腫瘍抗原特異的T-iPS細胞を、非特許文献１に記載の方法をわずかに改変した方法により樹立した。簡単には、腫瘍抗原特異的CTLを、CD8マイクロビーズ(Milteny Biotec)またはFACSAria IIIセルソーター(BD Biosciences)により濃縮した。1x106 個の濃縮した腫瘍抗原特異的CTLを、４つの山中因子およびMOI 3のSV40ラージT抗原(LTa) (Addgene)を含むセンダイウイルスベクターを用いて形質転換した(Nishimura, K. et al., (2011) J Biol Chem 286, 4760-4771)。スピンインフェクション後、形質転換細胞を、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上に播種し、10％ ヒトAB血清およびIL-2 (12.5U/ml)、IL-7 (10 ng/ml)、IL-21 (30 ng/ml)を添加したT細胞培地であるRPMI-1640中で培養した。２日目に、培地の半分を、20％ノックアウト血清代替添加物(Gibco)、非必須アミノ酸 (0.1 mM) (Gibco)、2-メルカプトエタノール (10 mM) (Nacalai Tesque)および塩基性線維芽細胞増殖因子(5 ng/ml) (Wako)を添加したヒトiPSC培地であるダルベッコ改変イーグル培地／F12 (Sigma)に交換した。コロニーは、２１〜３５日目に出現し始めた。各コロニーを採取し、増殖させた。
LMP2ペプチド特異的CTLから得たT-iPS細胞、WT1ペプチド特異的CTLから得たT-iPS細胞のクローンをそれぞれ一つずつ選択して以下の実験に供した。以下それぞれLMP2-T-iPS細胞およびWT1-T-iPS細胞という。
従来法によるT-iPS細胞からCD8SP細胞の誘導
参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞より非特許文献１の方法にてＴ細胞を誘導した。35日目までは、下記実施例1と同じ操作を行った。誘導35日目の細胞をFACSにて解析した。LMP2抗原特異的T細胞を含む細胞培養物中、DP細胞は12.0％、DN細胞は68.0％含まれていた（図１）。この細胞をCD3抗体による刺激下で６日間培養したところ、CD8SP細胞を68.9％含む細胞培養物が得られた。得られたCD8SP細胞は、LMP2テトラマーに特異的であり、ほぼ全てがCD8ααホモダイマー型Ｔ細胞であった(図２）。また、得られた細胞のTCR遺伝子を解析したところ、元のLMP2特異的CTLのTCR遺伝子と同一であった(データ示さず）。以下、得られた細胞を再生CTL細胞という。
参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞より非特許文献１の方法にてＴ細胞を誘導した。35日目までは、下記実施例1と同じ操作を行った。誘導35日目の細胞をFACSにて解析した。LMP2抗原特異的T細胞を含む細胞培養物中、DP細胞は12.0％、DN細胞は68.0％含まれていた（図１）。この細胞をCD3抗体による刺激下で６日間培養したところ、CD8SP細胞を68.9％含む細胞培養物が得られた。得られたCD8SP細胞は、LMP2テトラマーに特異的であり、ほぼ全てがCD8ααホモダイマー型Ｔ細胞であった(図２）。また、得られた細胞のTCR遺伝子を解析したところ、元のLMP2特異的CTLのTCR遺伝子と同一であった(データ示さず）。以下、得られた細胞を再生CTL細胞という。
元のLMP2特異的CTL細胞並びに再生CTL細胞のペプチド特異的細胞傷害活性を、LMP2ペプチドでパルスしたHLA A*24:02陽性ヒト白血病細胞株であるTHP1を対象に調べた。CTL細胞と白血病細胞株をエフェクター：ターゲット（E:T）比0:1、1:9、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図３および図４に示す。また、ＥＴ比３：１に固定した場合の両者の細胞傷害活性を図５に示す。再生CTL細胞のペプチド特異的細胞傷害活性は元のCTL細胞の約1/100程度であった。
また、再生CTL細胞のK562細胞に対するNK細胞様細胞傷害活性を調べた。結果を図６に示す。再生CTL細胞は高いNK様細胞傷害活性を有していることが確認された。
参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞クローンを使用した。図７に概略を示す手順にて、T-iPS細胞からT細胞を再生させた。
１）T-iPS細胞からDP細胞およびDN細胞を含む細胞群への分化
使用した培地は下記である。
＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとした。
１）T-iPS細胞からDP細胞およびDN細胞を含む細胞群への分化
使用した培地は下記である。
OP9細胞の準備
０．１％ゼラチン／ＰＢＳ溶液５ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、室温で３０分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
４日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
０．１％ゼラチン／ＰＢＳ溶液５ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、室温で３０分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
４日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
OP9/DLL1細胞（２４穴プレート）の準備
コンフルエントになったOP9/DLL1細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量を全量12mlのmedium Aに懸濁し、24穴プレートに0.5mlずつ播種した。播種２日後にOP9/DLL1細胞培養ディッシュを使用した。
コンフルエントになったOP9/DLL1細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量を全量12mlのmedium Aに懸濁し、24穴プレートに0.5mlずつ播種した。播種２日後にOP9/DLL1細胞培養ディッシュを使用した。
T-iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
T-iPS細胞培養ディッシュ（６ｃｍディッシュ）より解離液を用いてiPS細胞コロニーを回収し、ピペッティングにより細かく砕いた。４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Aに懸濁させた。およそ６ｃｍディッシュ１枚分の細かく砕いたiPS細胞塊を予め用意したOP9細胞上に播種した。
T-iPS細胞培養ディッシュ（６ｃｍディッシュ）より解離液を用いてiPS細胞コロニーを回収し、ピペッティングにより細かく砕いた。４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Aに懸濁させた。およそ６ｃｍディッシュ１枚分の細かく砕いたiPS細胞塊を予め用意したOP9細胞上に播種した。
Ｄａｙ １ （培地交換）
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A ２０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ ５ （培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ ９ （培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ １３ （誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえた）
培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液６ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（−）１０ｍｌで洗い流した。その後２ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２５分培養した。培養後、medium Aを8ml加え細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。さらに３７℃で４５分間培養した。
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A ２０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ ５ （培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ ９ （培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ １３ （誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえた）
培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液６ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（−）１０ｍｌで洗い流した。その後２ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２５分培養した。培養後、medium Aを8ml加え細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。さらに３７℃で４５分間培養した。
培養後、浮遊細胞を含む上清を、７０μｍのメッシュを通して回収した。４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。このうち１／５０をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。(図８）
Day 15 (細胞の継代)
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。10cmディッシュ2〜3枚分を1枚のディッシュに集約した。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。10cmディッシュ2〜3枚分を1枚のディッシュに集約した。
Day 22 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始めた。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 29 (細胞の継代):
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 36 (細胞の継代):
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、 50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、 50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
DP細胞の濃縮（DN細胞およびCD8SP細胞の除去）
下記培養液を使用した。
下記培養液を使用した。
Day 40: DP細胞の濃縮（DN細胞およびCD8SP細胞の除去）
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを180μLのMACSバッファーに懸濁した。CD4抗体を結合させたMACS beads 20μL加え、15分４℃で反応させた。以下MACSプロトコルどおりにMACSカラムを用いてCD4陽性細胞を回収した。濃縮前と濃縮後のCD4/CD8のFACSパターンを図９に示す。濃縮前は、DP細胞が27.6％、DN細胞が51.8％、CD8SP細胞が18.4%含まれていたが、濃縮によってDP細胞を96.3％、DN細胞を0.263%およびCD8SP細胞を0.072%含む細胞培養物とした。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを180μLのMACSバッファーに懸濁した。CD4抗体を結合させたMACS beads 20μL加え、15分４℃で反応させた。以下MACSプロトコルどおりにMACSカラムを用いてCD4陽性細胞を回収した。濃縮前と濃縮後のCD4/CD8のFACSパターンを図９に示す。濃縮前は、DP細胞が27.6％、DN細胞が51.8％、CD8SP細胞が18.4%含まれていたが、濃縮によってDP細胞を96.3％、DN細胞を0.263%およびCD8SP細胞を0.072%含む細胞培養物とした。
濃縮DP細胞からＣＤ８αβＳＰ細胞の誘導
上記で得た濃縮DP細胞培養物を最終濃度が5x105細胞/mlとなるようにmedium Dで懸濁した。予め準備したOP9/DLL1細胞培養ディッシュの培地を吸引し、細胞懸濁液を1ml/wellとなるよう播種し、培養した。6日後細胞を回収し、FACSにて確認を行った。結果を図１０に示す。
上記で得た濃縮DP細胞培養物を最終濃度が5x105細胞/mlとなるようにmedium Dで懸濁した。予め準備したOP9/DLL1細胞培養ディッシュの培地を吸引し、細胞懸濁液を1ml/wellとなるよう播種し、培養した。6日後細胞を回収し、FACSにて確認を行った。結果を図１０に示す。
得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は95.3％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、その87.5％がCD8αβ型T細胞であった。以下、得られた細胞を再生ＣＤ８αβＳＰ細胞という。
一方、40日目においてDN細胞のみを含む細胞画分を濃縮してDN細胞を約99%含む細胞培養物を得た。得られたDN細胞濃縮培養物を、上記と同様にしてCD3抗体により刺激して6日間培養した。同じくLMP2テトラマー陽性、CD3陽性のCD8SP細胞が得られたが、得られたCD8SP細胞の約87％がCD8αα型T細胞であった。
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞の増殖
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞を、LMP2抗原を提示する抗原提示細胞(APC)にて刺激して増殖させた。
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞を、LMP2抗原を提示する抗原提示細胞(APC)にて刺激して増殖させた。
抗原提示細胞APCの準備
自己LCLにLMP2抗原ペプチド：TYGPVFMSL（配列番号１）を添加して培養し、APCとして用いた。LCLをカルチャーボトルから回収し、50Gy放射線照射を行った。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを5x106/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。ペプチドを最終濃度が100nMになるように添加し、2時間37℃でインキュベーションおこなった。
自己LCLにLMP2抗原ペプチド：TYGPVFMSL（配列番号１）を添加して培養し、APCとして用いた。LCLをカルチャーボトルから回収し、50Gy放射線照射を行った。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを5x106/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。ペプチドを最終濃度が100nMになるように添加し、2時間37℃でインキュベーションおこなった。
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞のAPCによる刺激
上記で用意したペプチド添加LCLを、4℃、1200rpmで5分間遠心した。ペレットを4x105/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞も同様に、4℃、1200rpmで5分間遠心した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞ペレットを1x106/mlの濃度でx2 medium Eに懸濁した。24穴プレートに上記ペプチド刺激LCL懸濁液とＣＤ８αβＳＰ細胞懸濁液それぞれ0.5mlを混和し、共培養を行った。
共培養14日目のFACSパターンを図１１に示す。7日目に培地を新しいこの刺激を7日から14日毎に繰り返し刺激を行い増幅させた。３回試験を行った。各回の細胞の増幅曲線を図１２に示した。
上記で用意したペプチド添加LCLを、4℃、1200rpmで5分間遠心した。ペレットを4x105/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞も同様に、4℃、1200rpmで5分間遠心した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞ペレットを1x106/mlの濃度でx2 medium Eに懸濁した。24穴プレートに上記ペプチド刺激LCL懸濁液とＣＤ８αβＳＰ細胞懸濁液それぞれ0.5mlを混和し、共培養を行った。
共培養14日目のFACSパターンを図１１に示す。7日目に培地を新しいこの刺激を7日から14日毎に繰り返し刺激を行い増幅させた。３回試験を行った。各回の細胞の増幅曲線を図１２に示した。
再生ＣＤ８αβＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性
再生ＣＤ８αβＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性を参考例２と同じ方法にて試験した。結果を図１３に示す。また、E:T比を3:1として参考例で得た元のCTL細胞とその細胞傷害活性を比較した。結果を図１３に示す。再生ＣＤ８αβＴ細胞(再生CD8αβCTL細胞)は、元のCTL細胞と比べて遜色のないペプチド特異的細胞傷害活性を示した。
再生ＣＤ８αβＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性を参考例２と同じ方法にて試験した。結果を図１３に示す。また、E:T比を3:1として参考例で得た元のCTL細胞とその細胞傷害活性を比較した。結果を図１３に示す。再生ＣＤ８αβＴ細胞(再生CD8αβCTL細胞)は、元のCTL細胞と比べて遜色のないペプチド特異的細胞傷害活性を示した。
DP細胞とDN細胞との共培養
実施例１と同じプロトコルに従って、参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞クローンをDay 40まで培養した。得られた細胞培養物をFACSによりDP細胞とDN細胞にソートし、それぞれCell Trace VioletとCFSEにてラベルした。DP細胞、DN細胞の純度はいずれも99％以上である。3×104個のDP細胞に、DN細胞を混合比が1:0、3:1、1:1、および1:3となるよう混合し、CD3抗体の存在/非存在下で5時間培養した。得られた細胞をAnnexin VとPIにて染め、両方についてネガティブな細胞を生存細胞とした。Violet陽性細胞、即ちDP細胞における生細胞の％、並びに培養開始時のDP細胞に対する生存細胞の割合を図１４に示す。CD3抗体刺激下でDN細胞がDP細胞を殺傷していることがわかる。
実施例１と同じプロトコルに従って、参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞クローンをDay 40まで培養した。得られた細胞培養物をFACSによりDP細胞とDN細胞にソートし、それぞれCell Trace VioletとCFSEにてラベルした。DP細胞、DN細胞の純度はいずれも99％以上である。3×104個のDP細胞に、DN細胞を混合比が1:0、3:1、1:1、および1:3となるよう混合し、CD3抗体の存在/非存在下で5時間培養した。得られた細胞をAnnexin VとPIにて染め、両方についてネガティブな細胞を生存細胞とした。Violet陽性細胞、即ちDP細胞における生細胞の％、並びに培養開始時のDP細胞に対する生存細胞の割合を図１４に示す。CD3抗体刺激下でDN細胞がDP細胞を殺傷していることがわかる。
WT1特異的CD8SP細胞のWT1ペプチド特異的細胞傷害活性
参考例１で得たWT1-T-iPS細胞から実施例１と同じ手順にて再生CD8SP細胞を誘導した。40日目にDP細胞を84.7%含有する濃縮DP細胞培養物を得た。得られた濃縮DP細胞培養物をCD3Abにて刺激して、再生CD8SP細胞を含む細胞培養物を得た。得られた再生CD8SP細胞培養物の89.2%がCD8αβ型T細胞であった。再生CD8SP細胞のWT1抗原特異的細胞傷害活性を評価した。
参考例１で得たWT1-T-iPS細胞から実施例１と同じ手順にて再生CD8SP細胞を誘導した。40日目にDP細胞を84.7%含有する濃縮DP細胞培養物を得た。得られた濃縮DP細胞培養物をCD3Abにて刺激して、再生CD8SP細胞を含む細胞培養物を得た。得られた再生CD8SP細胞培養物の89.2%がCD8αβ型T細胞であった。再生CD8SP細胞のWT1抗原特異的細胞傷害活性を評価した。
C1R A*24:02（ヒトLCL細胞株）にWT1ペプチド（CYTWNQMNL：配列番号２）を様々な濃度で加え2時間培養した。各C1R A*24:02を回収し、再生CD8SP細胞とC1R A*24:02をＥ：Ｔ比0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１５に示す。
ペプチド濃度および細胞数依存的に細胞傷害活性が高まっていることが示され、再生CD8SP細胞がWT1抗原特異的な細胞傷害活性を持つことが裏付けられた。
ペプチド濃度および細胞数依存的に細胞傷害活性が高まっていることが示され、再生CD8SP細胞がWT1抗原特異的な細胞傷害活性を持つことが裏付けられた。
再生CD8SP細胞による細胞傷害活性を元のWT1特異的CTL細胞の細胞傷害活性と比較した。結果を図１６に示す。再生CD8SP細胞は元のCTLとほぼ同等のWT1ペプチド特異的なキラー活性を有することが分かった。以下実施例３〜５において再生CD8SP細胞を再生CTL細胞という。
WT1特異的CD8SP細胞のTCR特異的細胞傷害活性（対白血病細胞株）
実施例2で得た再生CTL細胞を用いて、WT1を内因性に発現する白血病細胞株および患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性について評価した。
内因性にWT1タンパク質を発現し、HLA A*24:02陽性のヒト白血病細胞株であるHL60およびTHP1を対象に、再生CTL細胞のin vitroで細胞傷害活性を評価した。TCR特異的な細胞傷害活性であるか否かを評価するため、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞株をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた後の白血病細胞株を再生CD8SP細胞と混合した。再生CTLと白血病細胞株を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１７に示す。
実施例2で得た再生CTL細胞を用いて、WT1を内因性に発現する白血病細胞株および患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性について評価した。
内因性にWT1タンパク質を発現し、HLA A*24:02陽性のヒト白血病細胞株であるHL60およびTHP1を対象に、再生CTL細胞のin vitroで細胞傷害活性を評価した。TCR特異的な細胞傷害活性であるか否かを評価するため、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞株をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた後の白血病細胞株を再生CD8SP細胞と混合した。再生CTLと白血病細胞株を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１７に示す。
いずれの白血病細胞株に対しても細胞数依存的に細胞傷害活性が高まった。一方で、HLA-I阻害抗体により細胞傷害活性が阻害された。これらの結果より、WT1-T-iPS細胞から誘導した再生CTL細胞は、内因性のWT1抗原に対してTCR特異的な細胞傷害活性を示すことが確認された。
WT1特異的CD8SP細胞のTCR特異的細胞傷害活性(対初代白血病細胞）
WT1高発現HLA A*24:02陽性の患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性を、実施例３と同様にして評価した。細胞傷害活性がTCR依存性であるか否かを評価するために、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた。白血病細胞として、WT1を高発現している細胞を3種類選んで試験を行った。再生CTL細胞と白血病細胞を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１８に示す。
WT1高発現HLA A*24:02陽性の患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性を、実施例３と同様にして評価した。細胞傷害活性がTCR依存性であるか否かを評価するために、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた。白血病細胞として、WT1を高発現している細胞を3種類選んで試験を行った。再生CTL細胞と白血病細胞を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１８に示す。
いずれの腫瘍細胞に対しても再生CTL細胞数依存的に細胞傷害活性が増加した。また、かかる細胞傷害活性はHLA-I阻害抗体により阻害された。これらの結果より、WT1-T-iPS細胞から再生したCTL細胞は、患者由来の初代白血病細胞に対してもWT1抗原特異的な細胞傷害活性を持つことが裏付けられた。
マウスの異種移植の系を用いたin vivoでの機能評価
実験の概略を図１９に示す。免疫不全マウスであるNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug /Jic (NOG)（公益財団法人実験動物中央研究所より購入）を用いた。8-10週齢のNOGマウスへ、WT1高発現HLA A*24:02陽性、CD33陽性の白血病細胞株HL60、２×104細胞をＰＢＳに懸濁したものを腹腔内に投与した（０日）。1、8、15および22日にPBS(コントロール）または再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）を5x106細胞ずつ腹腔内へ投与した。各群5匹で行った。CD8SP細胞の生存を確保するために、IL-2およびIL-7の腹腔内投与を週3回、4週間行った。37日と52日に末梢血を採取し、末梢血中の腫瘍細胞（CD33陽性細胞）および再生CTL細胞（CD8陽性細胞）の存在を確認した。また、各マウスの生存期間を確認した（図２０、２１）。
実験の概略を図１９に示す。免疫不全マウスであるNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug /Jic (NOG)（公益財団法人実験動物中央研究所より購入）を用いた。8-10週齢のNOGマウスへ、WT1高発現HLA A*24:02陽性、CD33陽性の白血病細胞株HL60、２×104細胞をＰＢＳに懸濁したものを腹腔内に投与した（０日）。1、8、15および22日にPBS(コントロール）または再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）を5x106細胞ずつ腹腔内へ投与した。各群5匹で行った。CD8SP細胞の生存を確保するために、IL-2およびIL-7の腹腔内投与を週3回、4週間行った。37日と52日に末梢血を採取し、末梢血中の腫瘍細胞（CD33陽性細胞）および再生CTL細胞（CD8陽性細胞）の存在を確認した。また、各マウスの生存期間を確認した（図２０、２１）。
図２０から明らかなように、PBSを投与したマウスにおいては、末梢血中に腫瘍細胞が流入し、血中にCD8T細胞は認められなかった。一方で再生CTL細胞を投与したマウスにおいては、血中へのCD８T細胞の移行が確認され、また末梢血への腫瘍細胞の移行が認められなかった。また、コントロールと比べて再生CTL細胞を投与したマウスでは顕著に長い生存期間が確認された。
試験終了後、全てのマウスを解剖して組織の損傷の有無を調べた。再生CTL細胞を投与したマウスにおいて、組織の損傷等は特に認められなかった。
WT1ペプチド特異的TCR-iPS細胞からのCD8SP細胞の誘導
WT1抗原特異的TCRを導入したiPS細胞の作製
導入する対象の細胞としては京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて作製された、日本で二番目の頻度のHLAハプロタイプをホモで有する単核細胞由来のiPS細胞を用いた。
WT1抗原特異的TCRを導入したiPS細胞の作製
導入する対象の細胞としては京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて作製された、日本で二番目の頻度のHLAハプロタイプをホモで有する単核細胞由来のiPS細胞を用いた。
WT1ペプチド特異的TCR遺伝子を導入したiPS細胞はWO 2016/010154に記載の方法にて調製した。用いたWT1ペプチド特異的TCR遺伝子は実施例2で示された再生WT1特異的CTLからクローニングしたものである。以下、導入するTCRをWT1-TCRとする。
１) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルスベクターの作製
独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチーム（日本国茨城県つくば市）より提供されたCS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクターを用い、GatewayシステムによりWT1-TCRを導入したCS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRを作製した。
独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチーム（日本国茨城県つくば市）より提供されたCS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクターを用い、GatewayシステムによりWT1-TCRを導入したCS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRを作製した。
２) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルス上清の作製
CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRをX-treamGENE9（ロシュ社）を用いてパッケージング細胞LentiX-293Tに導入した。翌日に培地交換を行い、2日目にレンチウィルスを含む培養上清を回収し、レンチウィルス上清として用いた。
CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRをX-treamGENE9（ロシュ社）を用いてパッケージング細胞LentiX-293Tに導入した。翌日に培地交換を行い、2日目にレンチウィルスを含む培養上清を回収し、レンチウィルス上清として用いた。
３) WT1-TCR transduced-T-iPS細胞の樹立
iPS細胞をTryp LE Select (ライフテクノロジーズ社)を用いて完全な単一細胞とした。遠心後、ペレットをレンチウィルス上清で懸濁し、30℃、3000rpmで1時間遠心しiPS細胞に感染させることでWT1-TCRをiPS細胞に導入した。
感染後、フィーダー細胞（ＭＦＦ）上に播種して培養し、14日後にWT1-TCRが導入されたiPS細胞をVenusタンパク質の発現によって蛍光顕微鏡下で選択した。各クローンを個別に樹立した。ひとつのクローンを選択して以下の試験に供した。以下TCRを導入して得たiPS細胞を「TCR-iPS細胞」という。
iPS細胞をTryp LE Select (ライフテクノロジーズ社)を用いて完全な単一細胞とした。遠心後、ペレットをレンチウィルス上清で懸濁し、30℃、3000rpmで1時間遠心しiPS細胞に感染させることでWT1-TCRをiPS細胞に導入した。
感染後、フィーダー細胞（ＭＦＦ）上に播種して培養し、14日後にWT1-TCRが導入されたiPS細胞をVenusタンパク質の発現によって蛍光顕微鏡下で選択した。各クローンを個別に樹立した。ひとつのクローンを選択して以下の試験に供した。以下TCRを導入して得たiPS細胞を「TCR-iPS細胞」という。
得られたTCR-iPS細胞を実施例１と同じ手順（図７）にてDP細胞とDN細胞を含む細胞培養物を得た（図２２）。得られた細胞培養物中、DP細胞は79.1%、DN細胞は12.0％、CD8SP細胞は6.60%含まれていた。MACSビーズを用いてDP細胞を濃縮し、濃縮DP細胞培養物から培地（medium D）ではなく下記(medium D')を用いる以外は、実施例と同一の方法にてCD8SP細胞へと誘導した。
即ち、濃縮DP細胞培養物を最終濃度が5x105細胞/mlとなるようにmedium D'で懸濁した。予め準備したOP9/DLL1細胞培養ディッシュの培地を吸引し、細胞懸濁液を1ml/wellとなるよう播種し、培養した。6日後細胞を回収し、FACSにて確認を行った。結果を図２３に示す。
得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は87.86％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、得られたCD8SP細胞の79.7%がCD8αβ型T細胞であった。
得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は87.86％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、得られたCD8SP細胞の79.7%がCD8αβ型T細胞であった。
TCR-iPS細胞から再生したCTLと実施例2で示したT-iPS細胞から再生したCTLの細胞傷害活性を比較した。両者は同じTCRを発現している。図16と同じくC1R A*24:02（ヒトLCL細胞株）にWT1ペプチド（CYTWNQMNL：配列番号２）を様々な濃度で加え2時間培養した。各C1R A*24:02を回収し、再生CD8SP細胞とC1R A*24:02をＥ：Ｔ比3:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図２４に示す。TCR-iPS細胞から再生したCTLとT-iPS細胞から再生したCTLは同等の抗原特異的細胞傷害活性を示した。
Claims (23)
- （１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を除く工程、および
（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖のヘテロ接合型であるＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法。 - 工程（２）において、細胞培養物よりＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖のホモ接合型であるＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞がさらに除去される、請求項１に記載の方法。
- 工程（２）で得られる細胞培養物が、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を実質的に含まない、請求項１または２に記載の方法。
- （１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
（２）パーフォリン阻害剤、グランザイム阻害剤、Fas経路阻害剤、カスパーゼ阻害剤、NK活性化レセプター阻害抗体からなる群から選択されるＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞に対する細胞傷害活性を抑制する物質の共存下で、（１）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法。 - 多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞が、HLAハプロタイプホモ接合型のiPS細胞である、請求項５に記載の方法。
- 多能性幹細胞が所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体遺伝子を有し、当該抗原に特異的な細胞傷害活性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導される、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子を有する、請求項７に記載の方法。
- 多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子を有するヒトＴ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞である、請求項８に記載の方法。
- 多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子をヒト多能性幹細胞へ導入して得られたＴＣＲ−ｉＰＳ細胞である、請求項８に記載の方法。
- ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、Ｔ細胞受容体に刺激を加えた時に起こる活性化経路のいずれかの部分を直接活性化することによる、請求項７〜１０いずれかに記載の方法。
- ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、抗CD3抗体を用いることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
- ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、当該所望の抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
- ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、当該所望の抗原を提示する抗原提示細胞による刺激を加えることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
- ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、キメラ抗原受容体の標的抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１１に記載の方法。
- 誘導されたＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へ、所望の抗原に特異的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を導入する工程を更に含み、当該抗原に特異的な細胞傷害活性を有するＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞を作製する、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
- 誘導されたＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞へ、所望の抗原に特異的なＴ細胞受容体を導入する、請求項１６に記載の方法。
- 得られた所望の抗原に特異的なＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程を更に含む、請求項７〜１７いずれかに記載の方法。
- 得られた抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、T細胞受容体に刺激を加えた時に起こる活性化経路のいずれかの部分を直接活性化することによる、請求項１８に記載の方法。
- 得られた抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、抗CD3抗体を用いることによって行われる、請求項１８に記載の方法。
- 得られた抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、当該所望の抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１８に記載の方法。
- 得られた抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、当該所望の抗原を提示する抗原提示細胞による刺激によって行われる、請求項２１に記載の方法。
- 得られた抗原特異的ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、キメラ抗原受容体の標的抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１８に記載の方法。
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