JP2023553419A - 遺伝子操作細胞およびその使用 - Google Patents

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Abstract

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびその派生細胞ならびにそれを使用する方法が提供される。組成物、ポリペプチド、ベクター、および製造方法もまた、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２０，７９９号、２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２０，９４８号、および２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２０，９８０号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
技術分野
本出願は、遺伝子操作された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびその派生細胞を提供する。同種細胞療法のためのキメラ抗原受容体を発現するためのｉＰＳＣまたはその派生細胞の使用もまた提供される。関係するベクター、ポリヌクレオチド、および医薬組成物もまた提供される。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してファイル名「ＣＮＴＹ－００１－ＷＯ－０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」および作成日２０２１年１１月１日の、１１３ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表として電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞の抗腫瘍活性を顕著に高める。ＣＡＲは、リンカーペプチド、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと連結された細胞外標的化ドメインを典型的に含む操作受容体である。従来、細胞外ドメインは、所与の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または細胞表面の標的に特異的な抗体の抗原結合断片（単鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖなど）からなる。細胞外ドメインは、ＣＡＲの腫瘍特異性を付与するのに対し、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されているＴ細胞を、ＴＡＡ／標的の会合時に活性化する。操作免疫エフェクター細胞は、がん患者に再注入され、そこでこれらの細胞は、ＣＡＲのＴＡＡ標的を発現している細胞と特異的に会合し、それらを死滅させる（Maus et al., Blood. 2014 Apr 24;123(17):2625-35；Curran and Brentjens, J Clin Oncol. 2015 May 20;33(15):1703-6）。
自己由来の患者特異的ＣＡＲ－Ｔ療法は、がんに対する、特にＣＤ１９ポジティブ血液悪性腫瘍に対する強力で潜在的な根治療法として出現した。しかし、自己Ｔ細胞は、オーダーメイドベースで生成しなければならず、このことは、依然として、生産コストおよび生産失敗のリスクが原因で大規模臨床応用への重大な制限要因となっている。ＣＡＲ－Ｔ技術の開発およびそのより広い応用もまた、例えば、ａ）固形腫瘍における非効率的な抗腫瘍応答、ｂ）養子移入されたＣＡＲ Ｔ細胞の免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への限られた透過および感受性、ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞の不十分な残留、ｄ）患者における、ＣＡＲ－Ｔによって媒介されるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む重篤な有害事象、ならびにｅ）製造に必要な時間を含む、いくつかの他の重要な欠点が原因で限られている。
したがって、免疫療法における効果的な使用のための治療的に十分で機能的な抗原特異的免疫細胞のまだ満たされない必要性がある。
一般的な一態様では、遺伝子操作人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはその派生細胞が提供される。細胞は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープ、好ましくは切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、不活性化細胞表面受容体とＩＬ－１５とがブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドの自己プロテアーゼペプチドなどの自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減、好ましくはＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失または発現低減を含む。
ｉ）ＣＤ１９抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントとインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、ｔＥＧＦＲバリアントとＩＬ－１５とが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドの自己プロテアーゼペプチドなどの自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減、好ましくはＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失または発現低減を含むｉＰＳＣ細胞またはその派生細胞もまた、提供される。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ細胞またはその派生細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数は、細胞染色体上の１つまたは複数の座位に組み込まれており、好ましくは、１つまたは複数の座位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａもしくはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のものであり、但し、外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の座位に組み込まれ、この組込みは、遺伝子の欠失または発現低減をもたらし、より好ましくは、外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数は、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれ、この組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減をもたらす。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からリプログラミングされている。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、リプログラミングされたＴ細胞に由来する。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドを含むまたはそれであるシグナルペプチドなどのシグナルペプチド；（ｉｉ）ＣＤ１９抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域などのヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメイン；（ｖ）ＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインなどの共刺激ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１９抗原と特異的に結合する抗体に由来するｓｃＦｖを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）シグナルペプチド；（ｉｉ）抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）ヒンジ領域；（ｉｖ）膜貫通ドメイン；（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインなどの共刺激ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドを含む、またはそれである。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＶＨＨドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域を含む。
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、
（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
（ｉｖ）配列番号２４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｖ）配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（ｖｉ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、
（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
（ｉｉ）配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
（ｉｉｉ）配列番号２４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｖ）配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（ｖ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；（ｉｉ）ｓｃＦＶまたはＶＨＨドメインを含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域；（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域；（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面タンパク質は、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面タンパク質は切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントである。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、またはそれからなる。好ましくは、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＩＬ－１５は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたは派生物は、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１のアミノ酸配列からなり、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号６６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号６６のアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＨＬＡ－Ｇは、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作ｉＰＳＣまたはその派生細胞は、
（１）（ｉ）配列番号１のアミノ酸を含むシグナルペプチド；（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域；（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインを有するＣＡＲをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
（２）配列番号７１のアミノ酸配列からなるｔＥＧＦＲバリアントと、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、ｔＥＧＦＲバリアントとＩＬ－１５とが、配列番号７３のアミノ酸配列を含む自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド
を含み、
ここで、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される２つの遺伝子、好ましくはＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれており、この組込みは、２つの遺伝子の欠失または発現低減をもたらす。
ある特定の実施形態では、（ｉ）第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉ）第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれており；（ｉ）第２の外因性ポリペプチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれており；（ｉｉ）第３の外因性ポリペプチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており；ここで、外因性ポリヌクレオチドの組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減し、好ましくは、第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み、第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、派生細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞である。
任意選択で、遺伝子操作ｉＰＳＣまたはその派生細胞は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｅまたは配列番号６９のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｇをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。好ましくは、第３の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａまたはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される遺伝子、好ましくはＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれている。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み；第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれており；第２の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれており；第３の外因性ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており；ここで、外因性ポリヌクレオチドの組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させるまたはその発現を低減し、好ましくは、第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み、第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み、第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、派生細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞である。
（ｉ）配列番号６１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなるｔＥＧＦＲバリアント、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１５をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、ｔＥＧＦＲが、自己プロテアーゼペプチドを介してＩＬ－１５と作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、または配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＬＡ－Ｇをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド
を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）細胞またはｉＰＳＣに由来するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞もしくはＴ細胞（すなわち、ｉＮＫもしくはｉＴ）もまた提供され、
ここで、第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それによりＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させる、またはその発現を低減する。
ある特定の実施形態では、本出願のｉＰＳＣ、ＮＫ細胞またはＴ細胞は、
（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＡＲをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する、またはそれからなるｔＥＧＦＲバリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するＩＬ－１５をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド
を含み、
ここで、第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドは、それぞれＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それによりＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させる、またはその発現を低減する。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み；第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉｉ）任意選択で、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド
を含むｉＰＳＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞もまた提供され、
ここで、第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それによりＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させる、またはその発現を低減する。
ある特定の実施形態では、（ｉ）第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉ）第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含み、第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドは、それぞれＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれている。
本出願の細胞を含む組成物もまた提供される。
ある特定の実施形態では、本出願の組成物は、さらに１つまたは複数の他の治療剤を含む、またはそれと組み合わせて使用することができる。このような他の治療剤の例には、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害薬、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血球、対象となる１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）が含まれるが、それに限定されない。
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、本出願の細胞または本出願の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法もまた提供される。
ある特定の実施形態では、がんは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
本出願の派生細胞を製造する方法であって、本出願のｉＰＳＣを細胞分化のための条件下で分化させて、それにより派生細胞を得ることを含む方法もまた提供される。
本出願の遺伝子操作ｉＰＳＣを得る方法であって、ｉＰＳＣ細胞に第１、第２、および任意選択で第３の外因性ポリヌクレオチドを導入して、それにより遺伝子操作ｉＰＳＣを得ることを含む方法がさらに提供される。任意の遺伝子操作方法を使用して本出願の遺伝子操作ｉＰＳＣを得ることができる。好ましくは、遺伝子操作は、標的化編集（targeted editing）を含み、より好ましくは、標的化編集は、欠失、挿入、またはイン／デルを含み、ここで、標的化編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって実行される。
培養の最終２４時間の組換えヒトＩＬ－１２の添加を含む分化プロトコルに人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を供することによって、この細胞をＮＫ細胞に分化させる方法もまた提供される。好ましくは、組換えＩＬ－１２は、ＩＬ１２ｐ７０を含む、またはＩＬ１２ｐ７０である。
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、不活性化細胞表面受容体とＩＬ－１５とが、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）もまた提供される。
本出願の他の実施形態は、それを必要とする対象におけるがんを治療することへの使用のための遺伝子操作ｉＰＳＣまたはその派生細胞を含む。
一部の実施形態では、本発明の操作ｉＰＳＣまたは派生細胞は、改善された残留性、増大した免疫細胞抵抗性、もしくは増大した免疫抵抗性を有する；またはゲノム操作ｉＰＳＣは、Τおよび／またはΝΚ細胞に対して増大した抵抗性を有し得る。特に、本発明のＩＬ－１５導入遺伝子は、本発明に従いｉＰＳＣ中にトランスフェクトされ、ＮＫ細胞に分化した後、本発明のＩＬ－１５導入遺伝子なしのｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞と比較した場合に、残留性の増大、消耗の減少および連続殺滅の増大を示す。本発明のゲノム操作ｉＰＳＣは、同じ機能的標的化ゲノム編集を有する造血系細胞を含む非多能性細胞に分化する潜在性を有する。一部の実施形態では、本発明のゲノム操作ｉＰＳＣは、中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹および前駆細胞、造血多能性前駆細胞、Τ細胞前駆細胞、ΝΚ細胞前駆細胞、Τ細胞、ΝΚΤ細胞、ΝΚ細胞、またはΒ細胞に分化する潜在性を有する。
一般的な一態様では、人工細胞死ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体と、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードし、ここで、不活性化細胞表面受容体とＩＬ－１５とは、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントである。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドを含む、またはそれである。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号７１のアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチドからなる。
セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、パニツムマブ、ポラツズマブ ベドチン、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む不活性化細胞表面受容体と、ＩＬ－１５とをコードするポリヌクレオチドもまた提供され、ここで、エピトープとサイトカインとは、Ｐ２Ａ配列によって作動可能に連結されている。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号７４、７９、８１、および８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本出願のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質もまた提供される。
本出願のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはその派生細胞もまた提供される。
本出願のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。
ある特定の実施形態では、ベクターは、
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）ターミネーターおよび／またはポリアデニル化シグナル配列；
（ｉｉｉ）左側相同配列；ならびに
（ｉｖ）右側相同配列
をさらに含む。
ある特定の実施形態では、左側相同配列は、配列番号８４のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、右側相同配列は、配列番号８５のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
上記の概要ならびに本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読む場合に、より十分に理解される。しかし、本出願は、図面に示される正確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
本出願の実施形態に従うベクター（プラスミド）を示す模式図である。図１Ａは、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化シグナル、およびｔＥＧＦＲ－ＩＬ１５コード配列を有するＣＩＩＴＡ標的化導入遺伝子プラスミドを示す。図１Ｂは、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化、および抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列を有するＡＡＶＳ１標的化導入遺伝子プラスミドを示す。図１Ｃは、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化、およびペプチド－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅコード配列を有するＢ２Ｍ標的化導入遺伝子プラスミドを示す。 （上記の通り。） Ｒｅｈ細胞およびＣＤ１９ノックアウト（ＣＤ１９ＫＯ）Ｒｅｈ細胞における経時的なＣＡＲ－ｉＮＫ細胞媒介性の標的細胞の細胞傷害性を実証するグラフである。 ＣＡＲ単独を発現しているｉＮＫ細胞と比較したＣＡＲ－ＩＬ１５を発現しているｉＮＫ細胞の機能性を示すグラフである。図３Ａは、ＣＡＲ ｉＮＫ細胞およびＣＡＲ／ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞から放出されたＩＬ－１５の濃度（ｐｇ／ｍｌ／細胞１×１ｅ６個／２４時間）を示すグラフを示す。図３Ｂは、ＣＡＲ ｉＮＫ細胞またはＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞を注射されたマウスの血液および肺中の２０日後のｉＮＫ細胞のパーセンテージを示すグラフを示す。図３Ｃは、ＣＡＲ ｉＮＫ細胞またはＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞を組換えＩＬ－１５と共におよび組換えＩＬ－１５なしに注射されたマウスの肺中のｉＮＫ細胞のパーセンテージを示すグラフを示す。 （上記の通り。） ＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞の増殖および連続殺滅を示すグラフである。図４Ａは、ＣＡＧ－ＣＡＲ／ＩＬ１５－ｉＮＫ細胞によるＣＤ１９＋ Ｒｅｈ細胞の経時的な連続殺滅を示すグラフを示す。図４Ｂは、ＣＡＧ－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞と比較したＣＡＧ－ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞の増大した増殖を示すグラフを示す。図４Ｃは、ＣＡＧ－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞と比較したＣＡＧ－ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞によるＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ細胞の経時的な標的連続殺滅の増大を示すグラフを示す。 （上記の通り。） ヒト組換えＩＬ１２存在下および非存在下のＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５発現ｉＮＫ細胞の細胞傷害性を示すグラフである。図５Ａは、ＩＬ１２の存在下および非存在下でＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞と共に培養した場合のＲａｊｉ細胞の経時的な死滅を示すグラフを示す。図５Ｂは、ＩＬ１２でプライミングされたＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞およびプライミングされていないＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞を注入されたマウスの平均全身発光平均輝度として測定された腫瘍成長を示すグラフを示す。 ＣＡＧ－ＣＡＲ発現ｉＮＫ細胞およびＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５－ｔＥＧＦＲ発現ｉＮＫ細胞におけるセツキシマブ誘導細胞除去を示すグラフである。図６Ａは、ＣＡＧ－ＣＡＲ発現細胞におけるアネキシン－Ｖ染色のパーセンテージを示すグラフを示す。図６Ｂは、ＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５－ｔＥＧＦＲ発現細胞におけるアネキシン－Ｖ染色のパーセンテージを示すグラフを示す。 （Ａ）２０：１、（Ｂ）１０：１、および（Ｃ）１：１のエフェクター対標的比でＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｋ５６２細胞の減少を経時的に測定するＩｎｃｕｃｙｔｅベースアッセイを示すグラフである。４つのｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１について標的細胞のみのカウントに対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウントおよび３つのＰＢ－ＮＫの平均。各データ点は、３つの反復の平均であり、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。 ３人のＰＢＭＣドナーから単離されたＰＢ－ＮＫおよびｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１のフローベースのＮＫ純度チェックを示すグラフである。 ４つのエフェクター対標的比でＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ標的細胞の経時的な減少を測定するＩｎｃｕｃｙｔｅベースアッセイを示すグラフである。（Ａ）１０：１、（Ｂ）５：１、（Ｃ）１：１、および（Ｄ）１：５のエフェクター対標的比でｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１と共培養されたＲｅｈおよびＲｅｈ－ＣＤ１９ＫＯにおける、標的細胞のみのカウントに対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウント。各データ点は、３つの反復の平均であり、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。 ４つのエフェクター対標的比でＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ標的細胞の経時的な減少を測定するＩｎｃｕｃｙｔｅベースアッセイを示すグラフである。（Ａ）１０：１、（Ｂ）５：１、（Ｃ）１：１、および（Ｄ）１：５のエフェクター対標的比でｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１と共培養されたＮＡＬＭ６およびＮＡＬＭ６－ＣＤ１９ＫＯにおける、標的細胞のみのカウントに対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウント。各データ点は、３つの反復の平均であり、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。 外因性ＩＬ２の支援なしの２１日残留アッセイの間のｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１およびＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５の累積拡大増殖倍率を示すグラフである。細胞を基礎ＮＫＣＭ中、３７℃、５％ ＣＯ２で１４日間培養した。３～４日毎に、すべての条件のものを回収し、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕでカウントし、適切な培地中に０．５×ｅ６／ｍＬで再懸濁し、次いで再びプレート培養した。２１日後に累積変化倍率を計算した。 ２１日残留アッセイの間のｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１およびＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５の累積拡大増殖倍率を示すグラフである。細胞を、６つのＩＬ２濃度：（Ａ）１０ｎＭ、（Ｂ）３ｎＭ、（Ｃ）１ｎＭ、（Ｄ）０．３ｎＭ、（Ｅ）０．１ｎＭ、（Ｆ）０ｎＭのうち１つを含有するＮＫＣＭ中、３７℃および５％ ＣＯ２で２１日間培養した。３～４日毎に、すべての条件のものを回収し、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕでカウントし、適切な培地中に０．５×ｅ６／ｍＬで再懸濁し、次いで再びプレート培養した。２１日後に累積変化倍率を計算した。 ＡＤＣＣアッセイのためのゲーティング戦略を示すグラフである。リンパ球について細胞をゲーティングし、続いてダブレットを排除し、続いてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）＋ ｉＮＫについてゲーティングし、最後にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ＋についてゲーティングし、死滅した治療用ｉＮＫ標的の％を決定した。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＮＩＲ＝Ｎｅａｒ－ＩＲ。 治療用ｉＮＫ細胞へのＥＧＦＲ染色を示すグラフである。未染色治療用ｉＮＫ（灰色ヒストグラム）または未編集ＷＴ ｉＮＫ（破線）と比較した、ＥＧＦＲで染色された治療用ｉＮＫ上のＥＧＦＲ ＰＥレベル（黒ヒストグラム）。 治療用ｉＮＫ細胞のセツキシマブ媒介ＡＤＣＣを示すグラフである。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（白三角）と比較した、セツキシマブによって媒介された治療用ｉＮＫ細胞の特異的細胞溶解率（黒三角）。ＩＬ－２活性化ＰＢＭＣを治療用ｉＮＫと２５：１のＥ：Ｔ比で１６時間共培養し、ｉＮＫの特異的細胞死滅率を決定した。各データ点は、３つ組ウェルの平均、エラーバー±標準偏差である。 抗ＨＬＡ－ＡＢＣ Ａｂによって媒介された補体細胞傷害性に対するＷＴ ｉＮＫ細胞のえり抜きの感受性を示すグラフである。 同種逃避（allo-evation）ＣＴＬ細胞傷害性および活性化アッセイのためのゲーティング戦略を示すグラフである。細胞を定量用ビーズおよびリンパ球についてゲーティングした。リンパ球内のダブレットを排除し、続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ陰性についてゲーティングし、続いてＣＴＶについて行ってｉＮＫ細胞を特定し、ＴＣＲαβについて行ってＴ細胞を特定した。Ｔ細胞内で、ＣＤ４ネガティブ、ＣＤ８ポジティブ細胞に続いてＣＤ２５について行って活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を特定した。主要なアッセイパラメーター、定量用ビーズ、生存ｉＮＫ細胞および活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を表示する。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＦＳＣ－Ｗ＝前方散乱幅、Ｌ－Ｄ＝ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ。 ｉＮＫ細胞のＣＴＬ媒介溶解を示すグラフである。ＦＡＣＳによる特異的ｉＮＫ溶解の評価。図１８Ａは、ｉＮＫおよびＴ細胞についてのゲーティングを示す。図１８Ｂは、５：１のＣＴＬ：ｉＮＫ比でＣＴＬと共培養されたｉＮＫ細胞の特異的溶解を示す。各記号は、１人のドナーを表し、白棒線は親野生型ｉＮＫ細胞であり、網がけ棒線は、編集されたβ２ＭＫＯ ｉＮＫ細胞である。 （上記の通り。） 共培養物中のｉＮＫ特異的ＣＴＬの活性化を示すグラフである。図１９Ａは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ２５発現のヒストグラムプロットを示す。破線は、単独で培養されたＴ細胞を示し、実線の白ヒストグラムは、親野生型ｉＮＫ細胞と共培養されたＴ細胞を示し、網がけヒストグラムは、編集されたβ２ＭＫＯ ｉＮＫ細胞と共培養されたＴ細胞を示す。図１９Ｂは、親ｉＮＫ細胞（白棒線）、β２ＭＫＯ ｉＮＫ細胞（網がけ棒線）との共培養物中の活性化Ｔ細胞、または標的を有さないＴ細胞のみ（斜線付き棒線）の頻度を示す。各記号は１人のドナーを表す。 同種逃避細胞傷害性アッセイのためのゲーティング戦略を示すグラフである。細胞からリンパ球をゲーティングし、続いてダブレットを排除し、続いてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）＋ ｉＮＫについてゲーティングし、最終的にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ＋についてゲーティングして死滅ｉＮＫ標的の％を決定した。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＮＩＲ＝Ｎｅａｒ－ＩＲ。 治療用ｉＮＫ細胞へのＨＬＡ－Ｅ染色を示すグラフである。ＨＬＡ－Ｅ＝白ヒストグラム、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照＝灰色に塗りつぶしたヒストグラム。 ＰＢＭＣへのＮＫＧ２Ａ染色を示すグラフである。ＰＢＭＣ試料を生存リンパ球についてゲーティングし（データは示さず）、続いてＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞（「ＮＫ細胞」）についてゲーティングした。次いで、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の頻度をＦＭＯに基づいて決定した。 治療用ｉＮＫ細胞（灰色棒線）のＷＴ（黒棒線）と比べた細胞死を、β２Ｍを欠損するｉＮＫ（白棒線）と比較して示すグラフである。新鮮解凍されたＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下で治療用ｉＮＫと共に２５：１のＥ：Ｔ比で７２時間共培養し、編集ｉＮＫのＷＴと比べた細胞死を決定した。各データ点は、３つ組ウェルの平均である。 未治療マウス（●）、または１０×１０６個（▽）および１５×１０６個（◆）（低温貯蔵）のｉＰＳＣ６１１で静脈内治療されたマウスの平均体重変化率を示すグラフである。処置群の≧５０％が存在する平均をプロットする。矢印は投薬日を表す。 未治療マウス（●）、ならびに１０×１０６個（▽）および１５×１０６個（◆）（低温貯蔵）のｉＰＳＣ６１１で週１回、３回にわたり静脈内治療されたマウスの平均全身平均輝度を示すグラフである。２１日目まで群をプロットする。これは、未治療対照が残った最終イメージング時点であり、％ＴＧＩを計算した時点である。矢印は投薬日を表す。 ｉＰＳＣ６１１で治療された担ＮＡＬＭ６マウスの生存率を示すグラフである。マウスを未治療のままにするか、または１０×１０６および１５×１０６個の低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１で週１回、３回にわたり静脈内治療した。生存の代替指標としての瀕死状態になった場合および過剰な腫瘍量の徴候を示している場合に、マウスを人道的に安楽死させた。 担ＮＡＬＭ６マウスの肺および血液中のｉＰＳＣ６１１の残留を示すグラフである。マウスを未治療のままにするか、または１５×１０６個の低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１の単回静脈内投与を受けさせた。注射の１週間後に、ＦＡＣＳ分析のために肺および血液を回収した。個別のマウスについてリンパ球１００，０００個あたりのｉＮＫ数をプロットし（〇）、群毎の平均を棒線によって表す。 １５×１０６個のｉＰＳＣ６１１で静脈内治療され、ＰＢＳ（●）、または４０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ（□）のＩＰ投与を受けたマウスの平均体重変化率を示すグラフである。 ＮＳＧマウスの肺および血液中のｉＰＳＣ６１１の存在を示すグラフである。マウスを未治療のままにするか（無治療）、または１日目に１５×１０６個のｉＰＳＣ６１１の単回静脈内投与を受けさせた。２および３日目に、２０ｍＬ／ｋｇ ＰＢＳ（●）、または４０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ（□）でマウスをＩＰ治療した。１および３日目にすべてのマウスにｒｈＩＬ－２の投与を受けさせた。５日目に、肺および血液を採取し、ＦＡＣＳ分析およびｉＰＳＣ６１１の検出のために処理した。セツキシマブ治療マウスの肺中にｉＮＫの有意な９６％の低減（ｐ＝０．０００２）および血液中にｉＮＫの９５％の低減（ｐ＝０．０３２１）があった。マウスあたりリンパ球１００，０００個あたりのｉＮＫの数としてデータを表し、平均±ＳＤと共にプロットした。
詳細な説明
様々な刊行物、論文および特許が、背景におよび本明細書全体にわたり引用または記載されており、これらの参照の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書内に含まれる文書、法律、材料、装置、物品などの説明は、本発明の状況を提供するためのものである。このような説明は、これらの事項のいずれかまたはすべてが、開示または請求された任意の発明に関して先行技術の一部を形成するという承認ではない。
特に定義しないかぎり、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。さもなければ、本明細書に使用されるある特定の用語は、本明細書に示される意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、複数参照を含むことに留意しなければならない。
特に述べないかぎり、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、すべての場合で「約」という用語によって修飾されているものと理解されたい。したがって、数値は、典型的には挙げられた値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、濃度範囲１％～１０％（ｗ／ｖ）は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書に使用される場合、数値範囲の使用は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、すべての可能な部分範囲、その範囲内の整数を含む、このような範囲内のすべての個別の数値およびそれらの値の分数を明示的に含む。
特に示さないかぎり、一系列の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その系列中の各要素を指すものと理解されたい。当業者は、日常的な実験方法にすぎないものを使用して本明細書に記載される出願の具体的な実施形態の多くの均等物を確認できることを認識している。このような均等物は、本出願によって包含されることが意図される。
本明細書に使用される場合、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有する（has）」、「有している（having）」、「含有する（contains）」もしくは「含有している（containing）」という用語またはその任意の他のバリエーションは、述べられた完全体または完全体の群の包含を意味するのであって、任意の他の完全体または完全体の群の除外を意味するものではないと理解され、包括的または非限定的であることが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品、または器具は、必ずしもそれらの要素だけには限定されず、明示的に列挙されていない、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または器具に固有の他の要素を含み得る。さらに、逆のことが明示的に述べられないかぎり、「または（or）」は、包含的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）、かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）、かつＢが真である（または存在する）、およびＡとＢとの両方が真である（または存在する）。
本明細書に使用される場合、挙げられた複数の要素の間の接続語「および／または」は、個別の選択肢および選択肢の組合せの両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用性をさす。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素の適用性を指す。第３の選択肢は、第１の要素および第２の要素を一緒にした適用性を指す。これらの選択肢の任意の１つは、この意味内に入り、したがって、本明細書に使用される場合の「および／または」という用語の要件を満たすと理解される。１つよりも多い選択肢の同時発生的適用性もまた、この意味内に入り、したがって、「および／または」という用語の要件を満たすと理解される。
本明細書に使用される場合、本明細書および特許請求の範囲にわたり使用される場合の「からなる（consists of）」という用語、または「からなる（consist of）」もしくは「からなっている（consisting of）」などのバリエーションは、挙げられた任意の完全体または完全体の群の包含を示すが、特定された方法、構造、または組成物に、さらなる完全体も完全体の群も追加することができない。
本明細書に使用される場合、本明細書および特許請求の範囲にわたり使用される場合の「から本質的になる（consists essentially of）」という用語、または「から本質的になる（consist essentially of）」もしくは「から本質的になっている（consisting essentially of）」などのバリエーションは、挙げられた任意の完全体または完全体の群の包含、および特定された方法、構造または組成物の基本または新規性質を著しくは変化させない、挙げられた任意の完全体または完全体の群の任意選択の包含を示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照のこと。
本明細書に使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。「哺乳動物」という用語は、本明細書に使用される場合、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト、その他、より好ましくはヒトが含まれるが、それに限定されない。
好ましい発明の構成要素の大きさまたは特徴を指す場合に本明細書に使用される「約」、「およそ」、「一般的に」、「実質的に」という用語、および同様の用語は、記載された大きさ／特徴が厳密な境界でもパラメーターでもなく、当業者によって理解されるような、機能的に同じまたは類似のそれからの軽微なバリエーションを排除しないことも理解すべきである。最低でも、数値パラメーターを含むこのような参照は、当技術分野において承認されている数学および工業原理（例えば、丸め、測定または他の系統誤差、製作公差など）を使用して最小有効数字を変動させないバリエーションを含む。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列（例えば、ＣＡＲポリペプチドおよびそれらをコードするＣＡＲポリヌクレオチド）に関連する「同一の」または「同一」率という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定して最大の一致のために比較およびアライメントした場合に同じである、２つ以上の配列もしくは部分配列、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定パーセンテージ有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。
配列比較のために、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、それと被験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要ならば部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき参照配列と比べた被験配列についての配列同一率を計算する。
比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性探索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行うことができる（一般的に、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照）。
配列同一率および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、それぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通して公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした場合に、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、またはそれを満たす、クエリ配列中の短いワード長Ｗを特定することによって高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための探索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アライメントスコアが増加できるかぎり、ワードヒットが、各配列に沿って両方向に伸長される。
累積スコアは、ヌクレオチド配列についてパラメーターＭ（マッチする残基対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下がった；１つもしくは複数の負スコアの残基アライメントの累積のせいで累積スコアがゼロ以下になった；またはいずれかの配列の末端に到達した場合に、各方向でのワードヒットの伸長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）。
配列同一率を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計解析を行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチがたまたま起こる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は参照配列と類似すると見なされる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書に使用される場合、「単離された」という用語は、生物学的構成要素（核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞など）が、その構成要素が自然に存在する生物の他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、細胞、ならびに組織から実質的に分離されている、それと別に産生される、またはそれらを除去して精製されていることを意味する。「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、したがって、標準的な精製方法および本明細書に記載された精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞を含む。「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、組成物の一部の場合があるが、それでもこの組成物が核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞の天然環境の一部でないならば、単離されている。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質のみならず、化学合成された核酸を包含する。
本明細書に使用される場合、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「核酸」または「ポリ核酸」と同義的に称される「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖もしくは一本鎖領域と二本鎖領域との混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、それに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの珍しい塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに多様な修飾を加えることができ；したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のみならず、ウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴の化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される相対的に短い核酸鎖を包含する。
「構築物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達すべきポリヌクレオチドを含む高分子または分子複合体を指す。「ベクター」は、本明細書に使用される場合、標的細胞への外来遺伝物質の送達または輸送を指示することが可能な任意の核酸構築物を指し、標的細胞で外来遺伝物質が複製および／または発現され得る。「ベクター」という用語は、本明細書に使用される場合、送達すべき構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子であり得る。ベクターは、組込み型または非組込み型であり得る。主要な種類のベクターには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、それに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、その他が含まれるが、それに限定されない。
「組込み」によって、構築物の１つまたは複数のヌクレオチドが細胞ゲノム中に安定的に挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列と共有結合的に連結されることが意味される。「標的化組込み」によって、構築物のヌクレオチドが細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡの予め選択された部位または「組込み部位」に挿入されることが意味される。「組込み」という用語は、本明細書に使用される場合、さらに、組込み部位に内因性配列またはヌクレオチドの欠失を伴うまたは伴わない、構築物の１つまたは複数の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を伴う工程を指す。挿入部位に欠失がある場合、「組込み」はさらに、欠失された内因性配列またはヌクレオチドの、１つまたは複数の挿入されたヌクレオチドによる置換を含み得る。
本明細書に使用される場合、「外因性」という用語は、参照された分子または参照された活性が宿主細胞中に導入される、または宿主細胞に対して外来であることを意味することが意図される。分子は、例えば宿主遺伝物質にコード核酸を導入することによって、例えば宿主染色体への組込みによって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、導入することができる。したがって、この用語は、コード核酸の発現に関連して使用される場合、発現可能な形態のコード核酸の細胞への導入を指す。「内因性」という用語は、宿主細胞中にその天然型で存在する、参照された分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関連して使用される場合、天然で細胞内に含有されるコード核酸であって、外因的導入されていないコード核酸の発現を指す。
本明細書に使用される場合、「対象となる遺伝子」または「対象となるポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡに転写され、場合によりポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。対象となる遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、それに限定されない。例えば、対象となる遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、自然界で見出されるポリペプチド）またはその断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する、天然ポリペプチドの変異体）またはその断片；操作ポリペプチドまたはペプチド断片、治療用ペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択可能マーカー、その他をコードし得る。
「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸断片への核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響することが可能な場合、このプロモーターは、そのコード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡは、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列と作動可能に連結され得る。
「発現」という用語は、本明細書に使用される場合、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を包含し、すべての天然転写後修飾および翻訳後修飾をさらに包含する。発現されたＣＡＲは、宿主細胞の細胞質内にある場合、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境内にある場合、または細胞膜に固定されている場合がある。
本明細書に使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。アミノ酸残基に関する従来の一文字または三文字コードが本明細書において使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語を、本明細書において互換的に使用して、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指すことができる。ポリマーは、直鎖または分岐であり得、修飾アミノ酸を含む場合があり、非アミノ酸が介在する場合がある。この用語はまた、自然にまたは介入によって；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識化構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば非天然アミノ酸を含む）の１つまたは複数の類似体のみならず、当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドもまた、この定義に含まれる。
本明細書に記載されるペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側で、Ｃ末端領域が右側である通常の慣例に従って記載される。アミノ酸の異性体形態は公知であるものの、特に明示的に示さないかぎり、表示されるのはＬ型アミノ酸である。
本明細書に使用される場合、「操作免疫細胞」という用語は、細胞の全遺伝物質に外因性遺伝物質をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で添加することによって遺伝的に改変された、免疫エフェクター細胞とも称される免疫細胞を指す。
本明細書に使用される場合、「ブタテシオウイルス－１ ２Ａペプチド」または「Ｐ２Ａペプチド」または「Ｐ２Ａ」は、ピコルナウイルスの「自己切断型ペプチド」を指す。Ｐ２Ａペプチドの平均長は、アミノ酸１８～２２個である。Ｐ２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ピコルナウイルスの一メンバーで最初に特定された（Ryan et al., J Gen Virol, 1991, 72(Pt 11): 2727-2732）。リボソームが２ＡペプチドのＣ末端でグリシル－プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドとの間の切断につながることが報告された（例えば、Donnelly et al., J Gen Virol., 2001, 82: 1013-1025参照）。本出願に有用な例示的なＰ２Ａペプチドは、配列番号７３と少なくとも９０％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、０４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本出願に有用なＰ２Ａペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）および免疫エフェクター細胞
ＩＰＳＣは、無制限の自己更新能を有する。ｉＰＳＣの使用は、細胞操作を可能にして、所望の免疫エフェクター細胞に拡大増殖および分化できる改変細胞の管理細胞バンクを産生し、大量の均一な同種治療用産物を供給する。
遺伝子操作ＩＰＳＣおよびその派生細胞が、本明細書に提供される。本明細書に提供される選択されたゲノム改変は、派生細胞の治療特性を高める。派生細胞は、機能的に改良されており、選択的モダリティーの組合せがｉＰＳＣのレベルでゲノム操作により細胞に導入された後の同種のオフザシェルフ細胞療法に適している。このアプローチは、ＣＲＳ／ＧＶＨＤによって媒介される副作用を低減することを助け、優れた有効性を提供しながら長期自己免疫を予防することができる。
本明細書に使用される場合、「分化」という用語は、専門化されていない（「分化決定されていない（uncommitted）」）またはあまり専門化されていない細胞が、専門化された細胞の特徴を獲得する過程である。専門化された細胞には、例えば、血液細胞または筋肉細胞が含まれる。分化した、または分化誘導された細胞は、細胞系列内でより専門化された（「分化決定された」）位置を占める細胞である。「分化決定された」という用語は、分化過程に適用された場合、分化経路において、正常な状況下で、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、正常な状況下で、異なる細胞型に分化することも、あまり分化していない細胞型に復帰することもできないポイントに進んだ細胞を指す。本明細書に使用される場合、「多能性」という用語は、細胞が身体または細胞体または胚のすべての系列を正しく形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から細胞を形成することができる種類の多能性幹細胞である。多能性は、完全な生物を生じることができない不完全または部分多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じることができるより原始的な、より多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）に至る、発生能の連続体である。
本明細書に使用される場合、「リプログラミング」または「脱分化」という用語は、細胞の能力を増大させる方法、または細胞をより低い分化状態に脱分化させる方法を指す。例えば、増大した細胞能を有する細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より大きな発生可塑性を有する（すなわち、より多い細胞型に分化できる）。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも低い分化状態にある細胞である。
本明細書に使用される場合、「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという用語は、全部で３つの胚葉または皮層：中胚葉、内胚葉、および外胚葉の組織に分化できる細胞に誘導または変化またはリプログラミングされている、分化した成体、新生児または胎児細胞から幹細胞が産生されることを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界で見られる場合の細胞を指さない。
「造血幹および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、もしくは「造血前駆体細胞」または「ＨＰＣ」という用語は、造血系列に分化決定されているが、さらなる造血分化が可能な細胞を指す。造血幹細胞には、例えば、多能性造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞が含まれる。造血幹および前駆細胞細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系列（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ球系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書に使用される場合、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞」は、その表面にＣＤ３４を発現するＨＰＣを指す。
本明細書に使用される場合、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫応答は、例えば、免疫エフェクター応答の促進を含む。免疫細胞の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、および骨髄系由来食細胞が含まれる。
本明細書に使用される場合、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、互換的に使用され、胸腺中で成熟を完了する白血球の一種であって、免疫系に様々な役割を有する白血球の一種を指す。Ｔ細胞は、例えば、体内の特異的外来抗原の特定ならびに他の免疫細胞の活性化および脱活性化を含む役割を有し得る。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株からのＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど、または哺乳動物から得られたＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴｈｌおよびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（ｇｄ Ｔ細胞）、その他を含むが、それに限定されない任意の種類のＴ細胞であり得、任意の発生段階であり得る。さらなる種類のヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈｌ７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。さらなる種類のメモリーＴ細胞には、中枢性メモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｒｎ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作Ｔ細胞を指し得る。Ｔ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化し得る。
「ＣＤ４＋ Ｔ細胞」は、表面にＣＤ４を発現し、細胞媒介免疫応答に関連する、Ｔ細胞のサブセットを指す。これらは、刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、分泌プロファイルは、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌を含み得る。「ＣＤ４」は、Ｔリンパ球上の分化抗原として本来定義される５５ｋＤ糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞上でも見出される。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーメンバーであって、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答における結合認識エレメントとして意味付けられる。Ｔリンパ球上で、それらはヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋ Ｔ細胞」は、表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性で、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する、Ｔ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞上ならびに細胞傷害性およびサプレッサーＴリンパ球上に見出される分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合複合体クラスＩ拘束性相互作用における結合認識エレメントである。
本明細書に使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６およびＣＤ４５の発現ならびにＴ細胞受容体（ＴＣＲ鎖）の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。ＮＫ細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＮＫ細胞などの遺伝子操作ＮＫ細胞を指し得る。ＮＫ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化し得る。
本明細書に使用される場合、「遺伝子インプリント」という用語は、原料細胞またはｉＰＳＣにおける優先的治療特質に寄与し、原料細胞由来ｉＰＳＣ、および／またはｉＰＳＣ由来造血系列細胞において保持され得る、遺伝的またはエピジェネティック情報を指す。本明細書に使用される場合、「原料細胞」は、リプログラミングによりｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、原料細胞由来ｉＰＳＣは、任意の造血系列細胞を含む特異的細胞型にさらに分化し得る。原料細胞由来ｉＰＳＣ、およびそれから分化した細胞は、時として、文脈に応じてまとめて「由来」または「派生」細胞と呼ばれる。例えば、本出願にわたり使用される場合の派生エフェクター細胞、または派生ＮＫもしくは「ｉＮＫ」細胞、または派生Ｔもしくは「ｉＴ」細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの自然／天然起源から得られたそれらの初代対応物と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書に使用される場合、優先的治療特質を付与する遺伝子インプリントは、ドナー、疾患、もしくは治療応答に特異的な、選択された原料細胞をリプログラミングすること、またはゲノム編集を使用して遺伝子改変されたモダリティーをｉＰＳＣに導入することのいずれかにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）親細胞株は、米国特許第８，５４６，１４０号明細書；同第９，６４４，１８４号明細書；同第９，３２８，３３２号明細書；および同第８，７６５，４７０号明細書に以前に記載されたエピソームプラスミドベースの工程などの、リプログラミング因子を非多能性細胞に導入するための任意の公知の方法を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞から生成される場合があり、これらの米国特許の完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれている。リプログラミング因子は、ポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、クローナルｉＰＳＣである、またはｉＰＳＣのプールから得られ、ゲノム編集は、１つまたは複数の選択された部位に１つまたは複数の標的化組込みおよび／またはイン／デルを作製することによって導入される。別の実施形態では、ｉＰＳＣは、これにより参照により本出願に組み込まれている米国特許第９２０６３９４号明細書および同第１０７８７６４２号明細書に記載されるように、抗原特異性および再構成されたＴＣＲ遺伝子を有するヒトＴ細胞から得られる（本明細書下記に「Ｔ－ｉＰＳ」細胞とも称される）。
特定の態様により、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントとインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、ｔＥＧＦＲバリアントとＩＬ－１５とがブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドなどの自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失または発現低減を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）細胞またはその派生細胞に関する。
Ｉ． キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現
本出願の実施形態により、ｉＰＳＣ細胞またはその派生細胞は、腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などのＣＡＲをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原を標的とする。
本明細書に使用される場合、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、抗原または標的に特異的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを少なくとも含む組換えポリペプチドを指す。標的細胞表面でのＣＡＲの細胞外ドメインと標的抗原との会合は、ＣＡＲのクラスター形成をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を再方向付けし、増殖、サイトカイン産生、食作用および／または標的抗原発現細胞の細胞死を主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的に媒介できる分子の産生をトリガーする。
本明細書に使用される場合、「シグナルペプチド」という用語は、新生ＣＡＲタンパク質を共翻訳的または翻訳後的に小胞体およびその後の表面発現に方向付ける、この新生タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）にあるリーダー配列を指す。
本明細書に使用される場合、「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、または「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、細胞膜の外側に位置するＣＡＲの一部であって、抗原、標的またはリガンドに結合することが可能な部分を指す。
本明細書に使用される場合、「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」という用語は、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接ドメイン、すなわちＣＡＲタンパク質の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを結び付けるＣＡＲの一部を指す。
本明細書に使用される場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜を通過して伸び、ＣＡＲを細胞膜にアンカーするＣＡＲの部分を指す。
本明細書に使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」、「細胞質シグナル伝達ドメイン」、または「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞膜の内側に位置するＣＡＲの部分であって、エフェクターシグナルを伝達することが可能な一部を指す。
本明細書に使用される場合、「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面について受容体の一次活性化を刺激的に調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）によって発現される分子を指す。刺激分子は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち抗原依存性一次活性化を開始する配列（「一次シグナル伝達ドメイン」と称される）、および共刺激シグナルの二次活性化を提供するために抗原非依存的に作用する配列（「共刺激シグナル伝達ドメイン」と称される）を含む。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインおよび／または抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、例えば、腫瘍抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり得る。本出願の抗原結合断片は、腫瘍抗原との高親和性結合、腫瘍抗原に対する高い特異性、腫瘍抗原を発現している細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＰＣ）、および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激する能力、ならびに単独で、または他の抗がん療法と組み合わせて投与された場合に、それを必要とする対象および動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害する能力を含むが、それに限定されない、１つまたは複数の所望の機能的性質を有する。
本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、広い意味で使用され、それには、モノクローナルまたはポリクローナルである、ヒト、ヒト化、複合およびキメラの抗体および抗体断片を含む免疫グロブリンまたは抗体分子が含まれる。一般に抗体は、特異的抗原に対して結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体の構造は周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて５つの主要クラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに細分類される。したがって、本出願の抗体は、５つの主要クラスまたは対応するサブクラスのいずれかであり得る。好ましくは、本出願の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つの明らかに別個の種類、すなわちカッパおよびラムダのうち１つに割り当てることができる。したがって、本出願の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインを含有し得る。特定の実施形態により、本出願の抗体は、ラットまたはヒト抗体の重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖および軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、各々が３つのドメイン（すなわち、相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有する軽鎖可変領域および重鎖可変領域からできている抗原結合領域を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と称される。
本明細書に使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、特異的腫瘍抗原に特異的に結合する単離された抗体は、腫瘍抗原に結合しない抗体を実質的に含まない）。加えて、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。
本明細書に使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、この集団を構成する個別の抗体は、起こり得る自然発生変異を除き同一であり、自然発生変異は少量存在する可能性がある。本出願のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、または組換えＤＮＡ方法によって製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスまたはラットから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
本明細書に使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、例えば、ダイアボディー、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディー（ｄｓダイアボディー）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディー）、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の部分から形成された多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ミニボディー、ナノボディー、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、または抗原に結合するが、完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体または親抗体断片が結合するものと同じ抗原に結合することが可能である。
本明細書に使用される場合、「一本鎖抗体」という用語は、アミノ酸約１５～約２０個の短いペプチド（例えばリンカーペプチド）によって結び付いた重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、当技術分野における従来型一本鎖抗体を指す。
本明細書に使用される場合、「単一ドメイン抗体」という用語は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む、または重鎖可変領域だけを含む、当技術分野における従来型単一ドメイン抗体を指す。
本明細書に使用される場合、「ヒト抗体」という用語はヒトによって産生された抗体、またはヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体であって、当技術分野において公知の任意の技術を使用して作製された抗体を指す。ヒト抗体のこの定義には、インタクトなもしくは完全長抗体、その断片、ならびに／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
本明細書に使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の配列との配列相同性を増大させるように改変された非ヒト抗体であって、それにより、抗体の抗原結合特性が保持されるが、ヒト身体におけるその抗原性が低減される、非ヒト抗体を指す。
本明細書に使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、しばしば、所望の特異性、親和性、および能力を有する、哺乳動物の１種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応するのに対し、定常領域は、別種の哺乳動物（例えばヒト）に由来する抗体の配列に対応して、その種における免疫応答の誘発を回避する。
本明細書に使用される場合、「多重特異性抗体」という用語は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、ここで、その複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特異性を有し、その複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有する。実施形態では、第１および第２のエピトープは同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。実施形態では、第１および第２のエピトープは重複する、または実質的に重複する。実施形態では、第１および第２のエピトープは重複しない、または実質的に重複しない。実施形態では、第１および第２のエピトープは異なる抗原上、例えば異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。
本明細書に使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープまたは２つ以下の抗原と結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。実施形態では、第１および第２のエピトープは重複する、または実質的に重複する。実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体またはその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体またはその断片とを含む。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片とを含む。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するＶＨＨ、および第２のエピトープに対して結合特異性を有するＶＨＨを含む。
本明細書に使用される場合、「腫瘍抗原に特異的に結合する」抗原結合ドメインまたは抗原結合断片は、腫瘍抗原と１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、または１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を指す。「ＫＤ」という用語は、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られた解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表現される。抗体についてのＫＤ値は、本開示を考慮して当技術分野における方法を使用して決定することができる。例えば、抗原結合ドメインまたは抗原結合断片のＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えばバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、またはバイオレイヤー干渉法技術、例えばＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用することによって、決定することができる。
抗原結合ドメインまたは抗原結合断片のＫＤの値が小さいほど、抗原結合ドメインまたは抗原結合断片が標的抗原に結合する親和性は高い。
様々な実施形態では、本開示のＣＡＲにおける使用に適した抗体または抗体断片には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、マスクされた抗体（masked antibody）（例えばＰｒｏｂｏｄｙ（登録商標））、小モジュール免疫医薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）、イントラボディー、ミニボディー、単一ドメイン抗体可変ドメイン、ナノボディー、ＶＨＨ、ダイアボディー、タンデムダイアボディー（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗原特異的ＴＣＲに対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、それに限定されない。抗体および／または抗体断片は、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ科抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
一部の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディー、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディー、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディー、トリアボディー、またはデカボディー（decabody）である。一部の実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖ断片である。一部の実施形態では、抗原結合断片はＶＨＨである。
一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうち少なくとも１つは、単一ドメイン抗体またはナノボディーを含む。一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうち少なくとも１つは、ＶＨＨを含む。
一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグは、各々ＶＨＨを含む。
一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインは、各々ＶＨＨを含む。一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうち少なくとも１つは、ｓｃＦｖを含む。
一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグは、各々ｓｃＦｖを含む。
一部の実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインは、各々ｓｃＦｖを含む。
高い親和性および標的生体分子の特異的結合などの類似の機能的特徴を示す、免疫グロブリンドメインの代替的足場もまた、本開示のＣＡＲに使用され得る。このような足場は、より大きな安定性または低減した免疫原性などの改善された特徴を有する分子をもたらすことが示されている。本開示のＣＡＲに使用され得る代替的な足場の非限定的な例には、操作テネイシン由来テネイシンＩＩＩ型ドメイン（例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標））；操作ガンマ－Ｂクリスタリン由来足場または操作ユビキチン由来足場（例えば、Ａｆｆｉｌｉｎ）；操作フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメイン（例えば、モノボディー、ＡｄＮｅｃｔｉｎ（商標）、またはＡｄＮｅｘｉｎ（商標））；操作アンキリンリピートモチーフ含有ポリペプチド（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（商標））；操作低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ）（例えばＡｖｉｍｅｒ（商標））；リポカリン（例えば、アンチカリン）；操作プロテアーゼ阻害剤由来Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２）；操作プロテインＡ由来Ｚドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））；Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（例えば、Ｎａｎｏｆｆｉｔｉｎ（登録商標）またはアフィチン）；操作Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン（例えばＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標））；ＣＴＬＤ３（例えばテトラネクチン）；チオレドキシン（例えばペプチドアプタマー）；ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）；β－サンドイッチ（例えばｉＭａｂ）；ミニタンパク質；Ｃ型レクチン様ドメイン足場；操作抗体模倣物；およびその結合機能性を保持する前記の任意の遺伝子操作対応物が含まれる（Woern A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001)；Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002)；Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004)；Binz H et al., Nat Biolechnol 23: 1257-68 (2005)；Hey T et al., Trends Biotechnol 23:514-522 (2005)；Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005)；Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006)；Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)；Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18: 295-304；Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010)；Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれている）。
一部の実施形態では、代替的足場は、アフィリンまたはセンチリンである。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、細胞外タグ結合ドメインのＮ末端に位置し得る。リーダー配列は、任意選択で、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に細胞外タグ結合ドメインから切断され得る。当業者に公知の様々なリーダー配列のいずれかが、リーダー配列として使用され得る。リーダー配列が由来し得るペプチドの非限定的な例には、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、ＦｃεＲ、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖（ＨＣ）可変領域、ＣＤ８α、またはＴ細胞によって分泌される様々な他のタンパク質のいずれかが含まれる。様々な実施形態では、リーダー配列は、Ｔ細胞の分泌経路と適合性である。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）に由来する。
一部の実施形態では、リーダー配列は、ＧＭＣＳＦＲに由来する。一実施形態では、ＧＭＣＳＦＲリーダー配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと細胞質ドメインとの間にフレーム内融合された膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、細胞外タグ結合ドメインに寄与するタンパク質、シグナル伝達もしくは共シグナル伝達ドメインに寄与するタンパク質、またはまったく異なるタンパク質に由来し得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって選択または改変することができる。場合によっては、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに自然に関連するタンパク質の結合を避けるためにアミノ酸置換、欠失、または挿入によって選択または改変することができる。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインと結び付いたドメイン間の柔軟性および／または最適距離を可能にするためにさらなるアミノ酸を含む。
膜貫通ドメインは、天然または合成起源のいずれかに由来し得る。起源が天然の場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に有用な膜貫通ドメインの比限定的な例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα、βもしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、その場合、これは、ロイシンおよびバリンなどの主として疎水性の残基を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはバリンのトリプレットを、合成膜貫通ドメインの各末端に見出すことができる。
一部の実施形態では、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の膜貫通ドメインを利用することが望ましく、膜貫通ドメインは、ジスルフィド結合が可能なシステイン残基を含有し、それにより、結果として生じたキメラタンパク質は、それ自体と、または関連タンパク質のζ、ηもしくはＦｃεＲ１γ鎖の未改変バージョンとジスルフィド連結二量体を形成することができる。場合によっては、膜貫通ドメインは、このようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合することを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするように選択される、またはアミノ酸置換によって改変される。他の場合では、受容体複合体の他のメンバーとの物理的会合を保持するために、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γおよび－β、ＭＢ１（Ｉｇα．）、Ｂ２９またはＣＤ３－γ、ζ、もしくはηの膜貫通ドメインを採用することが望ましい。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列、または配列番号２３と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含み、ここで、タグ結合ドメイン、リンカー、および膜貫通ドメインは、互いにフレーム内である。
「スペーサー領域」という用語は、本明細書に使用される場合、一般的にタグ結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサー領域は、より大きな柔軟性およびタグ結合ドメインに対するアクセス可能性を提供するために使用することができる。スペーサー領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、およびもっとも好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。スペーサー領域は、天然分子のすべてまたは一部、例えばＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来し得る。あるいは、スペーサー領域は、天然スペーサー領域配列に対応する合成配列であり得、または完全合成スペーサー領域配列であり得る。本開示により使用され得るスペーサー領域の非限定的な例には、ヒトＣＤ８α鎖の一部、ＣＤ２８の部分細胞外ドメイン、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇヒンジ、またはその機能的断片が含まれる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインが膜貫通ドメインから最適距離であることを確実にするために、さらなる連結アミノ酸がスペーサー領域に付加される。一部の実施形態では、スペーサーがＩｇに由来する場合、スペーサーは、Ｆｃ受容体の結合を防止するために変異される場合がある。
一部の実施形態では、スペーサー領域は、ヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、または免疫グロブリン（ＩｇＧ）に由来し得る。例えば、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのキメラからのものであり得る。
ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンＩｇＧヒンジまたはその機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのキメラからのものである。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはヒンジ領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのコアヒンジ領域を含む。「コアヒンジ」という用語は、「短いヒンジ」（別名「ＳＨ」）という用語と互換的に使用することができる。適切なヒンジドメインの非限定的な例は、コア免疫グロブリンヒンジ領域であり、それには、ＩｇＧ１からのＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５７）、ＩｇＧ２からのＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５８）、ＩｇＧ３からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号５９）、およびＩｇＧ４からのＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号６０）が含まれる（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wypych et al., JBC 2008 283(23): 16194-16205も参照のこと）。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンヒンジの断片である。
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列、または配列番号２１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方は、ＣＤ８に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方は、ＣＤ２８に由来する。
ある特定の態様では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞質ドメインはまた、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
細胞質ドメインは、ＣＡＲを搭載する宿主細胞（例えばＴ細胞）の正常のエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の専門化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞傷害活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質の部分を指し、この部分は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に専門化された機能を実行するよう指示する。通常はシグナル伝達ドメイン全体が存在するものの、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される範囲で、このような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達するかぎり、無傷の鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な、シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことが意味される。
本開示のＣＡＲに使用できるシグナル伝達ドメインの非限定的な例には、例えば、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂに由来するシグナル伝達ドメインが含まれる。
一部の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、細胞質ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ７９Ａ、およびＨＶＥＭに由来する。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢに由来する。一実施形態では、４１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒｂに由来する。一実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号９に示されるアミノ酸配列、または配列番号９と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４０に由来する。一実施形態では、ＣＤ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、または配列番号１０と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０に由来する。一実施形態では、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８０に由来する。一実施形態では、ＣＤ８０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８６に由来する。一実施形態では、ＣＤ８６共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７に由来する。一実施形態では、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳに由来する。一実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに由来する。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。一実施形態では、２Ｂ４（ＣＤ２４４）共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２、３、４、５、６つまたはそれよりも多い共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序で配置することができる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの上流にある。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの下流にある。２つ以上の共刺激ドメインが含まれる場合、共刺激シグナル伝達ドメインの順序を切り替えることができる。
非限定的で例示的なＣＡＲの領域および配列は、表１に提供される。
Figure 2023553419000002
Figure 2023553419000003
Figure 2023553419000004
一部の実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗原に結合する。第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、１つよりも多い抗原または抗原中の１つよりも多いエピトープに結合し得る。例えば、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、８つまたはそれよりも多い抗原に結合し得る。別の例として、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、同じ抗原中の２、３、４、５、６、７、８つまたはそれよりも多いエピトープに結合し得る。
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する抗原の種類および数に依存し得る。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する、標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するために選択され得る。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、抗原（例えば、腫瘍細胞上のもの）に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することを介して対象となる腫瘍抗原を標的とするために遺伝的に改変することができる。本開示のＣＡＲにおける抗原結合ドメインに関する標的として作用し得る細胞表面マーカーの非限定的な例には、腫瘍細胞または自己免疫疾患に関連するものが含まれる。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、同じ腫瘍に関連する。一部の実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、異なる腫瘍に関連する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの自己免疫抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の自己免疫抗原に結合する。一部の実施形態では、２つ以上の自己免疫抗原は、同じ自己免疫疾患に関連する。一部の実施形態では、２つ以上の自己免疫抗原は、異なる自己免疫疾患に関連する。
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、神経膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞癌、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する。神経膠芽腫に関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２が含まれる。卵巣がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソセリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ネクチン－４、およびＢ７Ｈ４が含まれる。子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソセリン、ＨＥＲ２、およびＥＧＦＲが含まれる。肝臓がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰが含まれる。血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０が含まれる。膀胱がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例には、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６が含まれる。
抗原結合ドメインによって標的とされ得る抗原のさらなる例には、アルファ－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ ７３３、ＢｒＥ３－抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン増殖因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、ＫＣ４－抗原、ＫＳ－１－抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ－抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカーまたはがん遺伝子産物が含まれるが、それに限定されない。
一実施形態では、抗原結合ドメインによって標的とされる抗原はＣＤ１９である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４に示されるアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、抗原は、自己免疫疾患または障害に関連する。このような抗原は、細胞受容体および「自己」指向性抗体を産生する細胞に由来し得る。一部の実施形態では、抗原は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、１型糖尿病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン－バレー症候群、クローン病または潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患または障害に関連する。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲによって標的とされ得る自己免疫抗原には、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、ｓｎＲＮＰにおけるＳｍ抗原、島細胞抗原、リウマチ因子、および抗シトルリン化タンパク質、シトルリン化タンパク質およびペプチド、例えばＣＣＰ－１、ＣＣＰ－２（環状シトルリン化ペプチド）、フィブリノーゲン、フィブリン、ビメンチン、フィラグリン、コラーゲンＩおよびＩＩペプチド、アルファ－エノラーゼ、翻訳開始因子４Ｇ１、核周囲因子、ケラチン、Ｓａ（細胞骨格タンパク質ビメンチン）、関節軟骨構成要素、例えばコラーゲンＩＩ、ＩＸ、およびＸＩ、循環血清タンパク質、例えばＲＦ（ＩｇＧ、ＩｇＭ）、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、フェリチン、核構成要素、例えばＲＡ３３／ｈｎＲＮＰ Ａ２、Ｓｍ、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１、ストレスタンパク質、例えばＨＳＰ－６５、－７０、－９０、ＢｉＰ、炎症／免疫因子、例えばＢ７－Ｈ１、ＩＬ－１アルファ、およびＩＬ－８、酵素、例えばカルパスタチン、アルファ－エノラーゼ、アルドラーゼ－Ａ、ジペプチジルペプチダーゼ、オステオポンチン、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、受容体、例えばリポコルチン１、好中球核タンパク質、例えばラクトフェリンおよび２５～３５ｋＤ核タンパク質、粒状タンパク質、例えば殺菌透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、島細胞抗原、リウマチ因子、ヒストン、リボソームＰタンパク質、カルジオリピン、ビメンチン、核酸、例えばｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、およびＲＮＡ、リボ核粒子およびタンパク質、例えばＳｍ抗原（ＳｍＤ抗原およびＳｍＢ’／Ｂを含むが、それに限定されない）、Ｕ１ＲＮＰ、Ａ２／Ｂ１ ｈｎＲＮＰ、Ｒｏ（ＳＳＡ）、ならびにＬａ（ＳＳＢ）抗原が含まれるが、それに限定されない。
様々な実施形態では、本開示のＣＡＲに使用されるｓｃＦｖ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、ペプチドリンカーであり得、任意の天然アミノ酸を含み得る。リンカー中に含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＨｉｓおよびＴｈｅである。リンカーは、ＶＨおよびＶＬが相互に対して正しいコンフォメーションを形成し、それによりそれらが抗原との結合などの所望の活性を保持するようにＶＨとＶＬとを連結するために十分な長さを有するべきである。リンカーは、約５～５０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１５～２０アミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、ＧｌｙおよびＳｅｒ含有リンカー、ＧｌｙおよびＡｌａ含有リンカー、ＡｌａおよびＳｅｒ含有リンカー、ならびに他のフレキシブルリンカーである。
一実施形態では、リンカーはＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。一実施形態では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、配列番号３に示されるアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。別の実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。一実施形態では、（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列、または配列番号２５と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
他のリンカー配列は、任意の免疫グロブリン重鎖または軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ域、ＣＬまたはＣＨ１の部分を含み得る。使用され得る例示的なリンカーには、表１の配列番号２６～５６のうちいずれかが含まれる。さらなるリンカーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１９／０６０６９５号パンフレットに記載されている。
ＩＩ． 人工細胞死ポリペプチド
本出願の実施形態により、ｉＰＳＣ細胞またはその派生細胞は、人工細胞死ポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを含む。
本明細書に使用される場合、「人工細胞死ポリペプチド」という用語は、細胞療法の潜在的毒性またはさもなければ有害作用を予防するように設計された操作タンパク質を指す。人工細胞死ポリペプチドは、アポトーシスの誘導、タンパク質の合成阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写および転写後遺伝子調節ならびに／または抗体媒介性枯渇を媒介し得る。場合により、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘起する外因性分子、例えば抗体によって、人工細胞死ポリペプチドは活性化される。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、本明細書においてモノクローナル抗体特異的エピトープとも称される、抗体、特にモノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む不活性化細胞表面受容体を含む。ｉＰＳＣまたはその派生細胞によって発現された場合、不活性化細胞表面受容体は、シグナル伝達が不活性である、または顕著に欠損しているが、それでも抗体によって特異的に認識され得る。抗体の不活性化細胞表面受容体への特異的結合は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰメカニズムのみならず、毒素または放射性核種との抗体薬物複合体を用いた直接殺滅によってｉＰＳＣまたはその派生細胞の除去を可能にする。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、またはウステキヌマブを含むが、それに限定されない抗体によって特異的に認識されるエピトープから選択されるエピトープを含む。
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１およびＨＥＲ１としても知られる上皮増殖因子受容体は、細胞外リガンドの上皮増殖因子ファミリーのメンバーに対する細胞表面受容体である。本明細書に使用される場合、「切断型ＥＧＦＲ」、「ｔＥＧＦＲ」、「短いＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」は、ＥＧＦＲのＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを欠損する不活性ＥＧＦＲバリアントを指す。例示的なｔＥＧＦＲバリアントは、セツキシマブ結合エピトープを含有する天然ＥＧＦＲ配列のドメイン２の３２２～３３３、ドメイン３および４の全部ならびに膜貫通ドメインを含有する。細胞表面上のｔＥＧＦＲバリアントの発現は、必要に応じて、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などの、ｔＥＧＦＲに特異的に結合する抗体による細胞除去を可能にする。ｔＥＧＦＲは、ＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが存在しないせいで、ｉＰＳＣまたはその派生細胞によって発現された場合に不活性である。
本出願の例示的な不活性化細胞表面受容体は、ｔＥＧＦＲバリアントを含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現している操作免疫細胞における不活性化細胞表面受容体の発現は、操作免疫細胞が抗ＥＧＦＲ抗体と接触した場合にこの細胞の細胞自殺を誘導する。不活性化細胞表面受容体を使用する方法は、国際公開第２０１９／０７０８５６号パンフレット、同第２０１９／０２３３９６号パンフレット、同第２０１８／０５８００２号パンフレットに記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。例えば、ｔＥＧＦＲバリアントを含む不活性化細胞表面受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本開示の操作免疫細胞の投与を以前に受けた対象に、この対象における以前に投与された操作免疫細胞を除去するために有効な量の抗ＥＧＦＲ抗体を投与することができる。
ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブであり、好ましくは、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ポラツズマブ ベドチンによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ７９ｂの１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ７９ｂエピトープは、配列番号７８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７８のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、リツキシマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ２０の１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、配列番号８０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号８０のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、Ｈｅｒ２受容体またはＥｒｂＢの１つまたは複数のエピトープ、例えばトラスツズマブによって特異的に認識されるエピトープを含む。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号８２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号８２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、インターロイキン－１５またはインターロイキン－２などのサイトカインをさらに含む。
本明細書に使用される場合「インターロイキン－１５」または「ＩＬ－１５」は、ＴおよびＮＫ細胞の活性化および増殖を調節するサイトカイン、またはその機能的部分を指す。サイトカインの「機能的部分」（「生物学的活性部分」）は、完全長または成熟サイトカインの１つまたは複数の機能を保持するサイトカインの部分を指す。ＩＬ－１５に関するこのような機能には、ＮＫ細胞の生存促進、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化および増殖の調節のみならず、造血幹細胞からのＮＫ細胞発生の支援が含まれる。当業者によって認識されるように、多様なＩＬ－１５分子の配列が、当技術分野において公知である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は野生型ＩＬ－１５である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号７２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
本明細書に使用される場合、「インターロイキン－２」は、ＴおよびＮＫ細胞の活性化および増殖を調節するサイトカイン、またはその機能的部分を指す。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２は野生型ＩＬ－２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２は、配列番号７６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７６のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、サイトカインと、好ましくは自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されたモノクローナル抗体特異的エピトープを含む。自己プロテアーゼペプチドの例には、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるペプチド配列が含まれるが、それに限定されない。一実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドの自己プロテアーゼペプチドを含む、またはそれである。ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）またはＩＬ－２と自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結された切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む。特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号７４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、シグナル配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、シグナル配列は、配列番号７７と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列、または配列番号２１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列、または配列番号２３と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、抗体によってその細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインで特異的に認識される１つまたは複数のエピトープを含む。一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、エピトープと膜貫通領域との間にヒンジ領域をさらに含む。一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、抗体によって特異的に認識される１つよりも多いエピトープを含み、エピトープは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得、エピトープは、（ＧＧＧＧＳ）ｎの配列［配列中、ｎは１～８の整数である］（配列番号２５）を有するフレキシブルペプチドリンカーなどのペプチドリンカーを介して互いに連結され得る。一部の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ＩＬ－１５またはＩＬ－２などのサイトカインをさらに含む。ある特定の実施形態では、サイトカインは、不活性化細胞表面受容体の細胞質ドメイン中にある。好ましくは、サイトカインは、抗体によって特異的に認識されるエピトープと直接的に、または本明細書に記載されるものなどの自己プロテアーゼペプチドを介して間接的に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、サイトカインは、自己プロテアーゼペプチドを介して膜貫通領域と結び付けることによってエピトープと間接的に連結されている。
非限定的で例示的な不活性化細胞表面受容体の領域および配列は、表２に提供される。
Figure 2023553419000005
Figure 2023553419000006
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号７９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号８１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号８３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
ＩＩＩ． ＨＬＡの発現
ある特定の実施形態では、本出願のｉＰＳＣまたはその派生細胞は、免疫逃避に関係する１つまたは複数のタンパク質、例えば非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドを導入することによってさらに改変することができる。特に、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、すべてのＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を消失させ、「自己喪失」応答を通じてＮＫ細胞による溶解に細胞を脆弱なままにする。外因性ＨＬＡ－Ｅ発現は、ＮＫ媒介性溶解に対する抵抗性につながり得る（Gornalusse et al., Nat Biotechnol. 2017 Aug; 35(8): 765-772）。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたはその派生細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）およびヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）のうち少なくとも１つをコードする第３の外因性ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号６５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号６５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、配列番号６８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、好ましくは配列番号６８を含む。
ある特定の実施形態では、第３の外因性ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ｅとリンカーを介して融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質と作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、第３の外因性ポリペプチドは、配列番号６６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、第３の外因性ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ｇとリンカーを介して融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質と作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、第３の外因性ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
ＩＶ． 他の任意選択のゲノム編集
上記細胞の一実施形態では、１つまたは複数の選択された部位でのゲノム編集は、他のさらなる人工細胞死ポリペプチド、標的化モダリティー、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的活性タンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはゲノム操作されたｉＰＳＣもしくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、残留、および／または生存を促進するタンパク質をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含み得る。
一部の実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成性、誘導性、時間的、組織、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１つまたは複数の外因性プロモーター；または（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１を含む選択された部位、またはゲノム安全領域（genome safe harbor）の基準を満たす他の座位に含まれる１つまたは複数の内因性プロモーターと作動的に連結されている。一部の実施形態では、上記方法を使用して生成されたゲノム操作ｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、ＥｒｂＢ２またはＣＤ７９ｂを含むタンパク質をコードする１つまたは複数の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ゲノム操作ｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳｌ、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、Ｈｌｌ、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なる安全領域座位に組み込まれている。タンパク質をコードする他の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＥＴレポーター、恒常性サイトカイン、ならびに阻害性チェックポイント阻害タンパク質、例えばＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ４のみならず、ＣＤ４７／シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）軸を標的とするタンパク質をコードするものを含み得る。一部の他の実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して生成されたゲノム操作ｉＰＳＣは、標的化モダリティー、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節およびモジュレーション、またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、残留、および／もしくは生存を抑制するタンパク質に関連する１つまたは複数の内因性遺伝子にイン／デルを含む。
Ｖ． ｉＰＳＣ中の選択された座位での標的化ゲノム編集
本出願の実施形態により、外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数は、ｉＰＳＣの染色体上の１つまたは複数の座位に組み込まれている。
本明細書において互換的に使用されるゲノム編集（genome editing）、またはゲノム編集（genomic editing）、または遺伝子編集は、ＤＮＡが標的化細胞のゲノムにおいて挿入、欠失、および／または置換される種類の遺伝子操作である。標的化ゲノム編集（targeted genome editing）（「標的化ゲノム編集（targeted genomic editing）」または「標的遺伝子編集」と互換的）は、ゲノム中の予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換を可能にする。内因性配列が標的化編集の間に挿入部位で欠失または破壊された場合、罹患配列を含む内因性遺伝子を、配列欠失または破壊が原因でノックアウトまたはノックダウンすることができる。したがって、標的化編集はまた、内因性遺伝子発現を正確に破壊するために使用することができる。同様に、挿入部位での内因性配列の欠失を有するまたは有さずにゲノム中の予め選択された部位に１つまたは複数の外因性配列を挿入することを伴う工程を指す「標的化組込み」という用語も本明細書に使用される。
標的化編集は、ヌクレアーゼ非依存性アプローチ、またはヌクレアーゼ依存性アプローチのいずれかにより達成することができる。ヌクレアーゼ非依存性標的化編集アプローチでは、相同組換えは、挿入すべき外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって、宿主細胞の酵素機構を経由してガイドされる。
あるいは、標的化編集は、特異的低頻度切断エンドヌクレアーゼによる二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入により、より高い頻度で達成することができる。このようなヌクレアーゼ依存性標的化編集は、ＤＳＢに応答して起こる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復メカニズムを利用する。外因性遺伝物質を含有するドナーベクターなしで、ＮＨＥＪは、しばしば、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（イン／デル）につながる。比較として、相同アームのペアによって隣接される外因性遺伝物質を含有するドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝物質を、相同組換えによる相同組換え修復（ＨＤＲ）の間にゲノムに導入し、「標的化組込み」をもたらすことができる。
特異的および標的化ＤＳＢを導入することが可能な、利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイド下ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）システムが含まれるが、それに限定されない。そのうえ、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂｌインテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムはまた、標的化組込みに有望なツールである。
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」によって、１つまたは複数のジンクフィンガーを経由してＤＮＡと配列特異的に結合するポリペプチドドメインが意味される。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位により安定化された、ジンクフィンガー結合ドメイン内のアミノ酸約３０個のドメインである。ジンクフィンガーの例には、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、およびＣ４ジンクフィンガーが含まれるが、それに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計／組成が、主として合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰの設計および結合データのデータベース記憶情報内の処理情報のための置換規則およびコンピューター処理アルゴリズムの適用の結果として生じた、自然界に存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；および同第６，５３４，２６１号明細書を参照のこと；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレットおよび同第０３／０１６４９６号パンフレットも参照のこと。「選択された」ジンクフィンガードメインは、その産生が主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的工程に起因する、自然界に見出されないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書および同第７，９７２，８５４号明細書により詳細に記載されており、それらの完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれている。当技術分野におけるＺＦＮのもっとも認められた例は、ＦｏｋｌヌクレアーゼのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインと融合されたヌクレアーゼを含む標的ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」によって、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合を担う、ＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインが意味される。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、植物病原体キサントモナス（Xanthomonas）属によって感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に進入し、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列と結合し、それらのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列での遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、エフェクター可変数の不完全３４アミノ酸リピート（an effector-variable number of imperfect 34 amino acid repeats）に依存し、これらのリピートは、リピート可変二残基（repeat variable-diresidue）（ＲＶＤ）と呼ばれる選択リピート位置に多型を含む。ＴＡＬＥＮは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書により詳細に記載されている。当技術分野におけるＴＡＬＥＮのもっとも認められている例は、ＦｏｋｌヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとの融合ポリペプチドである。
対象方法に用いられる標的ヌクレアーゼの別の例は、標的化Ｓｐｏｌｌヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどと融合された、ヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏｌ ｌポリペプチドを含むポリペプチドであって、対象となるＤＮＡ配列に対して特異性を有するポリペプチドである。例えば、その開示が、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６１／５５５，８５７号明細書を参照のこと。
本出願に適した標的ヌクレアーゼのさらなる例には、個別で使用されるにせよ、組み合わせて使用されるにせよ、Ｂｘｂｌ、ｐｈｉＣ３ ｌ、Ｒ４、ＰｈｉＢＴｌ、およびＷｐ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０ｌ－ｌが含まれるが、それに限定されない。
標的ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然および組換えヌクレアーゼ；ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼ、その他が含まれる。例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主構成要素：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。共発現された場合、これらの２つの構成要素は、ＰＡＭおよびＰＡＭ近くのシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される複合体を形成する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて、Ｃａｓ９を標的選択配列にガイドするためのキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成することができる。次いで、トランスフェクションまたは形質導入を介してこれらの２つの構成要素を哺乳動物細胞に送達することができる。別の例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、２つの主構成要素：（１）ＣＰｆ１エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡを含む。共発現された場合、これらの２つの構成要素は、ＰＡＭおよびＰＡＭ近くのシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ｃｒＲＮＡを組み合わせて、Ｃｐｆ１を標的選択配列にガイドするためのキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成することができる。次いで、トランスフェクションまたは形質導入を介してこれらの２つの構成要素を哺乳動物細胞に送達することができる。
ＭＡＤ７は、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＴＮ－３’ＰＡＭ部位を優先し、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない、細菌ユーバクテリウム レクタレ（Eubacterium rectale）に起源をもつ操作Ｃａｓ１２ａバリアントである。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公報番号第２０１８／２３６５４８号を参照のこと。
ＤＩＣＥ媒介挿入は、リコンビナーゼのペア、例えばｐｈｉＣ３１およびＢｘｂｌを使用して外因性ＤＮＡの一方向性組込みを提供するが、この一方向性組込みは、各酵素自体の小さなａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位に厳密に限定される。これらの標的ａｔｔ部位が哺乳動物ゲノムに自然には存在しないので、それらは、ゲノム中の所望の組込み部位に最初に導入されなければならない。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１５／０１４０６６５号明細書を参照のこと。
本出願の一態様は、標的化ゲノム組込みのための１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組込み部位に特異的な相同アームのペアをさらに含み、標的化組込みの方法は、細胞に構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、および所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮ媒介挿入を可能にすることを含む。なお別の実施形態では、細胞における標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、および所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮ媒介挿入を可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、Ｃｐｆ１発現カセットおよび所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃｐｆ１媒介挿入を可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、Ｃａｓ９発現カセットおよび所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９媒介挿入を可能にすることを含む。なおさらに別の実施形態では、細胞における標的化組込みの方法は、ＤＩＣＥリコンビナーゼのペアの１つまたは複数のａｔｔ部位を含む構築物を細胞における所望の組込み部位に導入すること、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、およびＤＩＣＥリコンビナーゼのための発現カセットを導入して、ＤＩＣＥ媒介標的化組込みを可能にすることを含む。
標的化組込みのための部位には、ゲノム安全領域が含まれるが、それに限定されない。ゲノム安全領域は、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に、理論的には宿主細胞にも生物にも有害作用をもたずに対応することができるヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域である。ある特定の実施形態では、標的化組込みのためのゲノム安全領域は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲおよびＲＵＮＸ１遺伝子からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の座位である。
他の実施形態では、標的化組込みのための部位は、挿入部位での内因性遺伝子の欠失または発現低減のために選択される。本明細書に使用される場合、遺伝子の発現に関する「欠失」という用語は、遺伝子の発現を打ち消す任意の遺伝子改変を指す。遺伝子の発現の「欠失」の例には、例えば、遺伝子の発現を打ち消す、遺伝子のＤＮＡ配列の除去または欠失、遺伝子の座位での外因性ポリヌクレオチド配列の挿入、および遺伝子内の１つまたは複数の置換が含まれる。
標的欠失のための遺伝子には、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の遺伝子が含まれるが、それに限定されない。複数のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質は、同種拒絶の問題を避けるために同種レシピエントにおいて組織適合性がマッチしなければならない。ＭＨＣ－クラスＩ欠損もしくはＭＨＣ－クラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＭＨＣ欠損」は、ＭＨＣクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現を欠如している、またはそれをもはや維持していない、またはそのレベルが低減しており、その結果、減少または低減したレベルが、他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低い細胞を指す。ＭＨＣクラスＩ欠損は、ＭＨＣクラスＩ座位（染色体６ｐ２ｌ）の任意の領域の機能的欠失、またはベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子およびタパシン遺伝子を含むが、それに限定されない１つもしくは複数のＭＨＣクラス－Ｉ関連遺伝子の欠失もしくはその発現レベルの低減によって達成することができる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、すべてのＭＨＣクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞は、ＭＨＣ－Ｉ欠損である。ＭＨＣクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰを含むが、それに限定されないＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または低減によって達成することができる。ＣＩＩＴＡは、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を経由して機能する転写補助活性化因子である。ＣＩＩＴＡヌル細胞はＭＨＣ－ＩＩ欠損である。ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の座位に組み込まれており、それにより、組込みを有する遺伝子の発現を欠失または低減する。
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の染色体の１つまたは複数の座位に組み込まれ、好ましくは、１つまたは複数の座位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａもしくはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される遺伝子のものであり、但し、１つまたは複数の座位のうち少なくとも１つは、ＭＨＣ遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子のものである。好ましくは、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＭＨＣクラス－Ｉ関連遺伝子、例えば、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子またはタパシン遺伝子の座位；およびＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子、例えば、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の座位；および任意選択でさらにはＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲおよびＲＵＮＸ１遺伝子からなる群から選択される安全領域遺伝子の座位に組み込まれている。より好ましくは、外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数は、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれている。
ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれ；（ｉｉ）第２の外因性ポリペプチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれ；（ｉｉｉ）第３の外因性ポリペプチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており；ここで、外因性ポリヌクレオチドの組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させる、またはその発現を低減する。
ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉ）第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉｉ）第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉ）第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；（ｉｉｉ）第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
派生細胞
別の態様では、本発明は、ｉＰＳＣの分化に由来する細胞、派生細胞に関する。上記のように、ｉＰＳＣ細胞に導入されたゲノム編集は、派生細胞内に保持される。ｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞のある特定の実施形態では、派生細胞は、ＨＳＣ（造血幹および前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、単球およびマクロファージを含むが、それに限定されない造血細胞である。ある特定の実施形態では、派生細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫エフェクター細胞である。
ある特定の実施形態では、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントとインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、ｔＥＧＦＲバリアントとＩＬ－１５とが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドの自己プロテアーゼペプチドなどの自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ関連遺伝子およびＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子およびタパシン遺伝子からなる群から選択されるＭＨＣクラス－Ｉ関連遺伝子、ならびにＲＦＸＡＮＫ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、およびＣＩＩＴＡ遺伝子からなる群から選択されるＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子、好ましくはＢ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失または発現低減を含む、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞またはＴ細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）およびヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）のうち少なくとも１つをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチドと、配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドを含むＮＫ細胞またはＴ細胞もまた提供され、
ここで、第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドは、それぞれＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それにより、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減する。
ある特定の実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み；第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；第３の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、不活性化細胞表面受容体とＩＬ－１５とが自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）もまた、提供される。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ ＨＰＣは、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）シグナルペプチド；（ｉｉ）ＣＤ１９抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）ヒンジ領域；（ｉｖ）膜貫通ドメイン；（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む。
派生細胞を製造する方法もまた、提供される。方法は、細胞分化のための条件下でｉＰＳＣを分化させ、それにより、派生細胞を得ることを含む。
本出願のｉＰＳＣは、当技術分野において公知の任意の方法によって分化させることができる。例示的な方法は、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８８４６３９５号明細書、同第８９４５９２２号明細書、同第８３１８４９１号明細書、国際公開第２０１０／０９９５３９号パンフレット、同第２０１２／１０９２０８号パンフレット、同第２０１７／０７０３３３号パンフレット、同第２０１７／１７９７２０号パンフレット、同第２０１６／０１０１４８号パンフレット、同第２０１８／０４８８２８号パンフレットおよび同第２０１９／１５７５９７号パンフレットに記載されている。分化プロトコルは、フィーダー細胞を使用する場合またはフィーダーを含まない場合がある。フィーダー細胞は、第２の細胞型の支援のための刺激、増殖因子および栄養素を提供するので、本明細書に使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第２の細胞型と共培養されて第２の細胞型が増殖、拡大増殖、または分化できる環境を提供する、１つの細胞型を説明する用語である。
本発明の別の実施形態では、本発明のｉＰＳＣ派生細胞は、培養の最終２４時間の組換えヒトＩＬ－１２ｐ７０の添加を含む分化プロトコルにｉＰＳＣ細胞を供することによってこの細胞をＮＫ細胞に分化させる方法により調製されるＮＫ細胞である。分化プロトコルにＩＬ－１２を含ませることによって、ＩＬ－１２でプライミングされた細胞は、ＩＬ－１２の非存在下で分化された細胞と比較して迅速な細胞殺滅を示す（図５Ａ）。さらに、ＩＬ－１２条件を使用して分化された細胞は、改善されたがん細胞増殖阻害を示す（図５Ｂ）。
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
（１）ＣＡＲをコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による本発明に有用なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させずにＣＡＲのコード配列を変化させる（例えば、置換、欠失、挿入など）ことができることが、当業者によって認識されている。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、本出願のＣＡＲをコードする核酸配列を変えることができることが、当業者によって理解されている。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲをコードする。特定の実施形態では、ＣＡＲをコードする単離された核酸は、配列番号６２と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用なＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本開示を考慮してプラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなどの当業者に公知の任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、例えばプラスミドである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含み得る。プロモーターは、構成性、誘導性、または抑制性プロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができるいくつかの発現ベクターが、当技術分野において公知であり、それらを細胞でのＣＡＲの産生のために本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用なＣＡＲの標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’にかけて、（ａ）プロモーター；（ｂ）本出願の実施形態によるＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列；および（ｃ）ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを有する外因性ポリヌクレオチド含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターもまた使用することができ、その例には、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列もまた使用することができ、その例には、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号６２と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターはさらに、外因性ポリヌクレオチドに隣接する左側相同アームおよび右側相同アームを含む。本明細書に使用される場合、「左側相同アーム」および「右側相同アーム」は、外因性ポリヌクレオチドに隣接する核酸配列のペアを指し、これらの核酸配列は、外因性ポリヌクレオチドの特定された染色体座位への組込みを容易にする。左側および右側アーム相同アームの配列は、対象となる組込み部位に基づき設計することができる。一部の実施形態では、左側または右側アーム相同アームは、組込み部位の左側または右側配列と相同である。
ある特定の実施形態では、左側相同アームは、配列番号９０と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、右側相同アームは、配列番号９１と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号９２と少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号９２のポリヌクレオチド配列を含む。
（２）不活性化細胞表面受容体をコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による発明に有用な不活性化細胞表面受容体をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに不活性化細胞表面受容体のコード配列を変化させる（例えば、置換、欠失、挿入など）ことができることが、当業者によって認識されている。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、本出願の不活性化細胞表面受容体をコードする核酸配列を変えることができることが、当業者によって理解されている。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、本明細書に記載される任意の不活性化細胞表面受容体、例えば、モノクローナル抗体特異的エピトープを含むものと、サイトカイン、例えばＩＬ－１５またはＩＬ－２とをコードし、ここで、モノクローナル抗体特異的エピトープとサイトカインとは、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、単離された核酸は、抗体、例えば、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープを含む不活性化細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを有する不活性化細胞表面受容体をコードする。好ましくは、不活性化細胞表面受容体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブ、好ましくはセツキシマブによって特異的に認識されるエピトープを含む。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、ＣＤ７９ｂの１つまたは複数のエピトープ、例えば、ポラツズマブ ベドチンによって特異的に認識されるエピトープを有する不活性化細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、ＣＤ２０の１つまたは複数のエピトープ、例えば、リツキシマブによって特異的に認識されるエピトープを有する不活性化細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、Ｈｅｒ２受容体の１つまたは複数のエピトープ、例えば、トラスツズマブによって特異的に認識されるエピトープを有する不活性化細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドを含む、またはそれである。
ある特定の実施形態では、切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントは、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、ポラツズマブ ベドチンによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号７８と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、リツキシマブによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号８０と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、トラスツズマブによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号８２と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、８２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体をコードする単離された核酸は、配列番号７５と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用な不活性化細胞表面受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含み得る。プロモーターは、構成性、誘導性、または抑制性プロモーターであり得る。核酸を細胞に送達することができるいくつかの発現ベクターは当技術分野において公知であり、細胞での不活性化細胞表面受容体の産生のために本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用な不活性化細胞表面受容体の標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’にかけて、（ａ）プロモーター；（ｂ）不活性化細胞表面受容体、例えば、切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む不活性化細胞表面受容体と、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードするポリヌクレオチド配列であって、ｔＥＧＦＲバリアントとＩＬ－１５とが、自己プロテアーゼペプチド、例えば、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドによって作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド配列、および（ｃ）ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを有する外因性ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターもまた使用することができ、その例には、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列もまた使用することができ、その例には、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７５と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、外因性ポリヌクレオチドに隣接する左側相同アームおよび右側相同アームをさらに含む。
ある特定の実施形態では、左側相同アームは、配列番号８４と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、右側相同アームは、配列番号８５と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号８６と少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号８６のポリヌクレオチド配列を含む。
（３）ＨＬＡ構築物をコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による発明に有用なＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させずにＨＬＡ構築物のコード配列を変化させる（例えば、置換、欠失、挿入など）ことができることが、当業者によって認識されている。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、本出願のＨＬＡ構築物をコードする核酸配列を変えることができることが、当業者によって理解されている。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、シグナルペプチド、例えば、ＨＬＡコード配列、例えば、成熟Ｂ２Ｍおよび／または成熟ＨＬＡ－Ｅのコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド、例えばＨＬＡ－Ｇシグナルペプチドを含むＨＬＡ構築物をコードする。一部の実施形態では、ＨＬＡコード配列は、４×ＧＧＧＧＳリンカーによって作動可能に連結されたＨＬＡ－ＧおよびＢ２Ｍ、ならびに／または３×ＧＧＧＧＳリンカーによって作動可能に連結されたＢ２ＭおよびＨＬＡ－Ｅをコードする。特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸は、配列番号６７と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸は、配列番号７０と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７０のポリヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用なＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本開示を考慮してプラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなどの当業者に公知の任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、例えばプラスミドである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含み得る。プロモーターは、構成性、誘導性、または抑制性プロモーターであり得る。核酸を細胞に送達することができるいくつかの発現ベクターが、当技術分野において公知であり、それらを細胞でのＨＬＡ構築物の産生のために本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による発明に有用なＨＬＡ構築物の標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’にかけて、（ａ）プロモーター；（ｂ）ＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列、および（ｃ）ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを有する外因性ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターもまた使用することができ、その例には、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列もまた使用することができ、その例には、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが含まれるが、それに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、成熟Ｂ２Ｍ、および成熟ＨＬＡ－Ｅを含み、ＨＬＡ－ＧとＢ２Ｍとは、４×ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１）によって作動可能に連結されており、Ｂ２Ｍ導入遺伝子とＨＬＡ－Ｅとは、３×ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号２５）によって作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物は、配列番号６７と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ＨＬＡ構築物は、配列番号７０と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号７０のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、外因性ポリヌクレオチドに隣接する左側相同アームおよび右側相同アームをさらに含む。
ある特定の実施形態では、左側相同アームは、配列番号８７と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、右側相同アームは、配列番号８８と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号８９と少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％同一のポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号８９のポリヌクレオチド配列を含む。
（４）宿主細胞
別の一般的な態様では、本出願は、本出願のベクターおよび／または本出願の構築物をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示を考慮して当業者に公知の任意の宿主細胞を、本出願の外因性ポリヌクレオチドの組換え発現のために使用することができる。特定の実施形態により、組換え発現ベクターは、化学的トランスフェクション、熱ショック、またはエレクトロポレーションなどの従来方法によって宿主細胞中に形質転換され、そこで、このベクターは、宿主細胞ゲノム中に安定的に組み込まれ、それにより組換え核酸が効果的に発現される。
宿主細胞の例には、例えば、対象となるベクターもしくは構築物の産生に有用な本出願のベクターもしくは単離された核酸を含有する組換え細胞；または好ましくは１つもしくは複数の染色体座位に組み込まれた、本出願の１つもしくは複数の単離された核酸を含有する操作ｉＰＳＣもしくはその派生細胞が含まれる。本出願の単離された核酸の宿主細胞はまた、本出願の１つまたは複数の単離された核酸を含む免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。免疫エフェクター細胞は、本出願の操作ｉＰＳＣの分化によって得ることができる。当技術分野における任意の適切な方法を、本開示を考慮して分化のために使用することができる。免疫エフェクター細胞はまた、本出願の１つまたは複数の単離された核酸を免疫エフェクター細胞にトランスフェクトして得ることができる。
組成物
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害薬、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血球、対象となる１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、組成物は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくは派生細胞、ならびに薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物である。「医薬組成物」という用語は、本明細書に使用される場合、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の単離されたポリペプチド、本出願の宿主細胞、および／または本出願のｉＰＳＣもしくはその派生細胞を薬学的に許容され得る担体と一緒に含む産物を意味する。本出願のポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞ならびにそれらを含む組成物はまた、本明細書に言及された治療応用のための医薬品の製造に有用である。
本明細書に使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、マイクロスフェア、リポソーム封入、または医薬製剤における使用のための当技術分野において周知の他の材料を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特徴が特定の適用のための投与経路に依存することが理解されている。本明細書に使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、本明細書に記載される組成物の有効性または本明細書に記載される組成物の生物学的活性を妨害しない無毒の材料を指す。特定の実施形態により、本開示を考慮して、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞における使用に適した任意の薬学的に許容され得る担体を使用することができる。
薬学的に許容され得る担体を用いた薬学的活性成分の製剤化は、当技術分野において、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例えば、21st edition (2005)およびその後の任意の版）から公知である。さらなる成分の非限定的な例には、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張性調節剤、保存剤、安定化剤、およびキレート剤が含まれる。１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体が、本出願の医薬組成物の製剤化に使用され得る。
使用方法
別の一般的な態様では、本出願は、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に本出願の細胞および／または本出願の組成物の治療有効量を投与することを含む。ある特定の実施形態では、疾患または状態はがんである。がんは、例えば、固形がんまたは液性がんであり得る。がんは、肺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経膠腫、神経膠芽腫、および他の固形腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫／病（ＨＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および他の液性腫瘍からなる群から選択され得る。好ましい実施形態では、がんは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
本出願の実施形態により、組成物は、単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の治療有効量を含む。本明細書に使用される場合、「治療有効量」という用語は、対象において所望の生物学的または医学的応答を誘発する活性成分または構成要素の量を指す。治療有効量は、定まった目的に関して経験的および日常的に決定することができる。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物に関連して本明細書に使用される場合、治療有効量は、それを必要とする対象における免疫応答をモジュレートする細胞および／または医薬組成物の量を意味する。
特定の実施形態により、治療有効量は、以下の効果のうち１、２、３、４つ、またはそれよりも多くを達成するために十分な治療法の量を指す：（ｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の重症度を低減または回復させる；（ｉｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の持続時間を低減する；（ｉｉｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の進行を予防する；（ｉｖ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を後退させる；（ｖ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の発生または開始を予防する；（ｖｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の再発を予防する；（ｖｉｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院を低減する；（ｖｉｉｉ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院期間を低減する；（ｉｘ）治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の生存期間を増大させる；（ｘｉ）対象における治療すべき疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を阻害または低減する；および／または（ｘｉｉ）別の治療法の予防または治療効果を高めるまたは改善する。
治療有効量または投薬量は、治療すべき疾患、障害または状態、投与手段、標的部位、対象の生理状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、および治療が予防的であるか治療的であるかなどの様々な要因により変動し得る。治療投薬量は、最適には安全性および有効性を最適化するように設定される。
特定の実施形態により、本明細書に記載される組成物は、対象への意図される投与経路に適するように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与に適するように製剤化することができる。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、当業者に公知の任意の好都合な方法で投与することができる。例えば、本出願の細胞は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、植込み、および／または移植によって対象に投与することができる。本出願の細胞を含む組成物は、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、胸膜内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与することができる。ある特定の実施形態では、本出願の細胞は、対象のリンパ球除去を行ってまたは行わずに投与することができる。
本出願の細胞を含む医薬組成物は、典型的には選択されたｐＨに緩衝化された無菌液体製剤、典型的には細胞懸濁物を有する等張水溶液の状態で、または任意選択でエマルジョン、分散物、もしくはその他として提供することができる。組成物は、細胞の完全性および生存能ならびに細胞組成物の投与に適した担体、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、その他を含み得る。
無菌注射剤は、ふさわしい量の適切な溶媒中に、本出願の細胞を所望により様々な他の成分と共に組み入れることによって調製することができる。このような組成物は、細胞組成物用の使用およびヒトなどの対象への投与に適した、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、その他を含み得る。細胞組成物を提供するために適した緩衝剤は、当技術分野において周知である。使用される任意の媒体、希釈剤、または添加剤は、本出願の細胞の完全性および生存能を保つことに適合する。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、任意の生理学的に許容され得る媒体中に入れて投与することができる。本出願の細胞を含む細胞集団は、細胞の精製された集団を含み得る。当業者は、様々な周知の方法を使用して細胞集団中の細胞を容易に決定することができる。本出願の遺伝子改変細胞を含む細胞集団における純度の範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約１００％であり得る。投薬量は、当業者によって容易に調製され得、例えば、純度の低下は、投薬量の増大を必要とし得る。
本出願の細胞は、一般的に、細胞および／または細胞を含む医薬組成物が投与される対象の体重１キログラムあたりの細胞（個／ｋｇ）に基づく用量として投与される。一般的に、細胞用量は、投与の様式および位置に応じて、約１０４～約１０１０個／ｋｇ体重、例えば、約１０５～約１０９、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、または約１０５～約１０６の範囲内である。一般に、全身投与の場合、本出願の免疫細胞が腫瘍および／またはがんの領域に投与される領域投与よりも高い用量が使用される。例示的な用量範囲には、１×１０４～１×１０８、２×１０４～１×１０８、３×１０４～１×１０８、４×１０４～１×１０８、５×１０４～６×１０８、７×１０４～１×１０８、８×１０４～１×１０８、９×１０４～１×１０８、１×１０５～１×１０８、１×１０５～９×１０７、１×１０５～８×１０７、１×１０５～７×１０７、１×１０５～６×１０７、１×１０５～５×１０７、１×１０５～４×１０７、１×１０５～４×１０７、１×１０５～３×１０７、１×１０５～２×１０７、１×１０５～１×１０７、１×１０５～９×１０６、１×１０５～８×１０６、１×１０５～７×１０６、１×１０５～６×１０６、１×１０５～５×１０６、１×１０５～４×１０６、１×１０５～４×１０６、１×１０５～３×１０６、１×１０５～２×１０６、１×１０５～１×１０６、２×１０５～９×１０７、２×１０５～８×１０７、２×１０５～７×１０７、２×１０５～６×１０７、２×１０５～５×１０７、２×１０５～４×１０７、２×１０５～４×１０７、２×１０５～３×１０７、２×１０５～２×１０７、２×１０５～１×１０７、２×１０５～９×１０６、２×１０５～８×１０６、２×１０５～７×１０６、２×１０５～６×１０６、２×１０５～５×１０６、２×１０５～４×１０６、２×１０５～４×１０６、２×１０５～３×１０６、２×１０５～２×１０６、２×１０５～１×１０６、３×１０５～３×１０６個／ｋｇ、その他が含まれるが、それに限定されない。そのうえ、用量は、単回用量が投与されるか、または複数回用量が投与されるかを説明するために調整することができる。有効用量と見なされるものの正確な決定は、各対象にとって個別の要因に基づき得る。
本明細書に使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、すべて、対象において必ずしも識別可能ではないが、対象において識別可能であり得る、がんに関係する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメーターの回復または反転を指すことが意図される。「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語はまた、疾患、障害、または状態の後退を引き起こす、進行を予防する、または少なくとも進行を減速することを指し得る。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態、例えば、腫瘍またはより好ましくはがんに関連する１つまたは複数の症状の軽減、その発生もしくは開始の予防、またはその持続時間の低減を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態の再発の予防を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態を有する対象の生存時間の増大を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、対象における疾患、障害、または状態の除去を指す。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害薬、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血球、対象となる１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される。
略語
Figure 2023553419000007
[実施例１]
細胞株の作製
ｉＰＳＣの作製
その完全な開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，５４６，１４０号明細書；同第９，６４４，１８４号明細書；同第９，３２８，３３２号明細書；および同第８，７６５，４７０号明細書に以前に記載されたようなエピソームプラスミドに基づく工程を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）親細胞株を生成した。
ベクター（プラスミド）の産生
対象となる導入遺伝子をプロモーター、ターミネーター、および相同アームと共にコードする遺伝子断片（ｇＢｌｏｃｋｓ）を設計し、ＩＤＴ，Ｉｎｃ．で化学合成によって合成した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｐｌｕｓキット（タカラバイオ；滋賀県、日本）を製造業者のプロトコルにより使用してｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片をｐＵＣ１９プラスミド中に集合させた。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇからの反応産物、すなわち発現構築物を、増幅のために製造業者のプロトコルによりＳｔｂｌ３細菌細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中に形質転換した。ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者のプロトコルにより使用して、細菌細胞培養物から、増幅された発現構築物からのベクター（プラスミド）を精製した。精製プラスミドＤＮＡに研究用等級のシーケンシングを行い、制限消化によって評価して、導入遺伝子の配列を確認した。精製プラスミドＤＮＡの濃度を吸光度によって測定した。そのうえ、Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍおよびＡ２６０／Ａ２３０ｎｍでの吸光度比を測定して、それぞれ残留ＲＮＡおよびタンパク質レベルを評価した。
ＣＩＩＴＡ標的化プラスミド
ＣＩＩＴＡ標的化プラスミドは、ＣＡＧプロモーター（配列番号６３）、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化（配列番号６４）、およびｔＥＧＦＲ－ＩＬ１５コード配列を含有する。ｔＥＧＦＲ－ＩＬ１５導入遺伝子は、天然ＥＧＦＲ配列のドメイン２の残基３２２～３３３、ドメイン３および４のすべてならびに膜貫通ドメインを含有するｔＥＧＦＲ－ＩＬ１５（配列番号７１）をコードする。ｔＥＧＦＲ－ＩＬ１５導入遺伝子に、フレーム内Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７３）、次いで完全長ＩＬ－１５配列（配列番号７２）が続く。ＣＩＩＴＡ標的化導入遺伝子プラスミドの模式図を図１Ａに示す。
ＡＡＶＳ１標的化プラスミド
ＡＡＶＳ１標的化プラスミドは、ＣＡＧプロモーター（配列番号６３）、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化（配列番号６４）、および抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列（配列番号６２）を含有する。コードされたＣＡＲは、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖに続き、ＣＤ２８の残基１１４～２２０およびＣＤ３ゼータアイソフォーム３の残基５２～１６３と結び付いたＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドを含有する。ＡＡＶＳ１標的化導入遺伝子プラスミドの模式図を図１Ｂに示す。
Ｂ２Ｍ標的化プラスミド
Ｂ２Ｍ標的化プラスミドは、ＣＡＧプロモーター（配列番号６３）、ＳＶ４０ターミネーター／ポリアデニル化（配列番号６４）、およびペプチド－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅコード配列（配列番号６７）を含有する。Ｂ２Ｍ－導入遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号６６）は、ＨＬＡ－Ｇからのシグナルペプチドに続く、アミノ酸９つのペプチドＶＭＡＰＲＴＬＩＬが４×ＧＧＧＧＳリンカーと結び付いたもの、成熟Ｂ２Ｍ配列が３×ＧＧＧＧＳリンカーと結び付いたもの、次いで成熟ＨＬＡ－Ｅ配列（配列番号６５）を含有する。Ｂ２Ｍ標的化導入遺伝子プラスミドの模式図を図１Ｃに示す。
Ｂ２Ｍ（エクソン２）およびＣＩＩＴＡ（エクソン１）への導入遺伝子の挿入は、コード配列の破壊をもたらし、完全長配列の翻訳を防止する。Ｂ２Ｍの発現喪失は、固有のＭＨＣクラスＩ集合を防止し、発現を妨害する。ＣＩＩＴＡの喪失は、ＨＬＡ ＩＩ遺伝子の転写を防止し、ＭＨＣクラスＩＩの発現を防止する。ＡＡＶＳ１座位のイントロン１への導入遺伝子の挿入は、コード配列のいかなる変化ももたらさない。Ｃｐｆ１ゲノムヌクレアーゼ切断部位の５’および３’側に存在し、標的座位特異的配列の５００～１２００ｂｐを含むように相同アーム配列を設計した。
ＣＡＲ操作ｉＰＳＣ細胞株の樹立
細胞株の樹立は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＣＡＲ操作ｉＰＳＣの拡大増殖、細胞選別、および細胞クローニングステップからなった。関連精製プラスミドＤＮＡと、単一標的座位（Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、またはＡＡＶＳ１のいずれか）に特異的な組換えＣｐｆ１ ｕｌｔｒａ／ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体とを用いて、トランスフェクションおよびエレクトロポレーションの３連続ラウンドを行った。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（商標）ソフトウェア設計ツールを使用して、すべてのオフターゲット部位スコアが２未満（０～１００）のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択した（表３）。大多数の潜在的オフターゲット部位は、遺伝子間であった。
Figure 2023553419000008
簡潔には、親細胞株からのｉＰＳＣ細胞のバイアルを解凍して、Ｈ１１５２ Ｒｈｏキナーゼ阻害薬を有するＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に入れ、ペレットにし、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物を、Ｈ１１５２を有するＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を含有するビトロネクチンコーティング済み６ウェルプレートのウェルに移し、３７℃、５％ ＣＯ２、低Ｏ２でインキュベートした。１つのウェルからの細胞をＴ－７５フラスコに入れて拡大増殖させた。フラスコが６０～７０％の集密度に達したとき、これを拡大増殖させて別のＴ－７５フラスコに入れた。このフラスコが６０～７０％の集密度になったとき、細胞をトランスフェクションのために使用した。ｉＰＳＣ細胞を含有するＴ－７５フラスコにＨ１１５２を添加し、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２、低Ｏ２でインキュベートした。
インキュベーションに続き、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、フラスコから解離させ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中に再懸濁した。細胞をカウントし、Ｈ１１５２を有するＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を含有するビトロネクチン予備コーティング済みＴ－７５フラスコに、トランスフェクションに適した細胞密度で蒔いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ幹細胞試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および精製プラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に調製し、インキュベートした。精製プラスミドＤＮＡを含有するトランスフェクションミックスを細胞に添加し、次いで３７℃、５％ ＣＯ２、低Ｏ２でインキュベートした。
トランスフェクション後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、フラスコから解離させ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中に再懸濁した。次いで細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄し、カウントし、さらなるＯｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中にエレクトロポレーションに適した細胞密度で再懸濁した。Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡとＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃｐｆ１ Ｕｌｔｒａヌクレアーゼ（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）とを組み合わせることによって、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。トランスフェクトされた細胞にＲＮＰ複合体およびＣｐｆ１エレクトロポレーションエンハンサーを添加し、エレクトロポレーションした。次いで、予温され、ビトロネクチンでコーティング済みの、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地およびＮＵ７０２６を含有する２４ウェルプレートのウェルに、エレクトロポレーションされた細胞を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２、低Ｏ２でインキュベートした。
ビトロネクチンコーティング済みのプレート上のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で相同組換え修復が起こるように細胞を最短１０日間培養した。２４ウェルプレート上の細胞が６０～７０％の集密度になった後、それらを解離させ、増殖させて６ウェルプレートの１つのウェルに入れた。集密に達した後で、６ウェルプレートの１つのウェルを増殖させてＴ－７５フラスコに入れた。細胞を最短１０日間培養して維持し、その後、挿入された導入遺伝子の存在および／または欠失した内因性遺伝子の非存在について培養物をフローサイトメトリーによって分析した。次いで、細胞をフローサイトメトリー選別に供して、改変された集団を単離した。
各ラウンドのトランスフェクションおよびエレクトロポレーションの後、拡大増殖され、操作された細胞を、導入遺伝子特異的抗体を使用する蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって安定組込み体について選別した。操作の格ラウンド後の選別は、以前のラウンドからのマーカーを含み、すべてのそれぞれのマーカーについて集団を十分に濃縮するために複数ラウンドの選別を必要とし得る。ヒトＨＬＡ－Ｅ、ヒトＥＧＦＲ、およびヒトＣＤ１９－Ｆｃの融合タンパク質に対する蛍光標識抗体を使用してＭａｃｓＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏ細胞分取器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で選別を行った。
全部で３つの操作ステップおよび必要な選別ラウンドの完了後、限界希釈クローニングによって単一細胞クローンを単離した。ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄し、プレートから解離させた。細胞をＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中に再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過し、カウントし、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中に１０００個／ｍＬの最終密度まで希釈した。次いで、２００μＬのアリコート中の細胞を、ＣｌｏｎｅＲ（商標）補助剤（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）１ｍＬを有するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（Ａｍｓｂｉｏ；Ａｂｉｎｇｔｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）９ｍＬに移し、１００μＬ／ウェルでプレート播種し、２４時間休ませた。休ませた後、コロニーが直径およそ２ｍｍになるまで培地を４８時間毎に交換し、その時点で単一コロニーを有するウェルを目視検査によって特定し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を含有する２つ組のビトロネクチンコーティング済みプレートに分割した。細胞が５０％よりも大きい集密度に達するまで培地を毎日交換した。工程に使用するために単一細胞株を６ウェルプレート中で拡大増殖させるためにプレートの一方を使用し、他方を特徴付けのために使用した。
造血前駆細胞（ＨＰＣ）の分化
凍結保存細胞バンクから解凍されたｉＰＳＣ細胞を、ビトロネクチンコーティング済みプレート上、Ｈ１１５２ Ｒｈｏキナーゼ阻害薬を補充したＥ８培地中で増殖させた。ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて解離させ、Ｅ８培地＋Ｈ１１５２を有するビトロネクチンプレート上に再播種することにより、ｉＰＳＣ細胞を２回継代した。ＴｒｙｐＬＥ処理による解離、２回の継代後、ｉＰＳＣ細胞をもう１回ＴｒｙｐＬＥで処理し、細胞をＨ１１５２加ＨＤＭ－Ｉ培地中、最適濃度で再懸濁した。ＨＤＭ培地は、ＩＭＤＭ培地、ＨａｍのＦ１２培地、ビタミンＡ不含ＣＴＳ Ｂ２７補助剤、非必須アミノ酸、２－リン酸アスコルビン酸Ｍｇ、モノチオグリセロール、およびヘパリンを含有する。ＨＤＭ－Ｉ培地は、ＨＤＭ＋ＣＨＩＲ９９０２１ ＧＳＫ３阻害薬、ＦＧＦ２、およびＶＥＧＦを含有する。次いで、再懸濁された細胞を、規模に応じて適切な容器内に播種した。翌日（Ｄ１）、培地の８０％を新鮮ＨＤＭ－Ｉ培地で置換した。２、３、および４日目に、培地の８０％を除去し、ＨＤＭ－ＩＩ培地（ＨＤＭ培地＋ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、およびＶＥＧＦ）で置換した。５日目にＨＰＣは細胞凝集物から出芽して培養物中に出現し始める場合がある、ＨＰＣが出現し始めた２日後にそれらを回収したが、８日目以降に回収するものとした。５日目から始めて、培地の８０％を毎日除去し、除去された培地中にＨＰＣがあればそれを遠心分離によって収集し、細胞をＨＤＭ－ＩＩＩ（ＨＤＭ＋ＢＭＰ４、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＩＬ３）中に再懸濁し、培養物に添加し戻した。次いで、ＨＰＣを８日目または９日目に回収した（ＨＰＣの最初の出現日に応じて）。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の分化および活性化
ＨＰＣを分化させて、ＮＫまたはＴ細胞を生成した。細胞を解凍し、洗浄し、レトロネクチン／ＤＬＬ４コーティングＧ－Ｒｅｘバイオリアクター中に播種した。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、特異的サイトカイン、および増殖因子を、リンパ球系列への分化ならびにそれに続くＮＫまたはＴ細胞の成熟および活性化のために使用した。回収の間に、培養物を濃縮し、洗浄し、規定された凍結保存用培地を使用して製剤化し、Ｍ１充填ステーションを使用してＡＴバイアルに充填した。バイアルを目視検査し、速度制御フリーザー中で凍結保存し、ＬＮ２フリーザーの気相中で保管した。
ＮＫおよびＴ細胞は、フィーダー細胞を使用して分化させることもできる。簡潔には、クラスＩ分子、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬおよび膜貫通を発現するように操作されたＫ５６２骨髄性白血病細胞を、ＨＣＰと共にＮＫまたはＴ細胞の分化を促進するために十分な時間培養する。
[実施例２]
ＣＤ１９を標的とした細胞傷害性アッセイ
ＣＤ１９特異的標的細胞殺滅を実証するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アッセイ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して細胞傷害性を測定した。ＣＤ１９－ノックアウトＲｅｈ Ｂ白血病細胞株を樹立した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイに使用するためにＥｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）からのレンチウイルスを使用して、細胞にまたＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄを形質導入した。次に、親およびＣＤ１９－ノックアウトＲｅｈ Ｂ細胞白血病細胞を、ＦＭＣ６３ ＣＤ２８ｚ ＣＡＲ（抗ＣＤ１９）を発現しているｉＮＫ細胞と共に１：１のエフェクター対標的細胞比で共培養した。標的細胞死を７２時間測定した。ＣＡＲ ｉＮＫ細胞は、ＣＤ１９ポジティブ標的細胞を効果的に死滅させた（図２）。
[実施例３]
ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫアッセイ
ＩＬ－１５導入遺伝子（ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ）を発現するように操作されたｉＮＫ細胞がＩＬ－１５を放出する能力を検査するために、ＣＡＲ ｉＮＫまたはＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞を培地中で単独培養した、またはＫ５６２骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣ）と１：１のエフェクター対標的比で共培養した。２４、２８、７２または９６時間インキュベートした後に上清を収集し、ＭＳＤイムノアッセイ（カタログ番号Ｋ１５１ＵＲＫ－４）を使用して製造業者のプロトコル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）によりＩＬ－１５濃度についてアッセイした。培地のみおよびＫ５６２標的を伴う場合の両方で、ＩＬ－１５導入遺伝子を発現するように操作されたｉＮＫ細胞は、培地中への優れたＩＬ－１５の放出を示した（図３Ａ）。
ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ残留を検査するために、ＣＡＲ ｉＮＫまたはＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞（１０Ｅ６個の細胞）を０日目に免疫欠損ＮＳＧ（商標）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に静脈内注射した。注射後２０日目に、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ５６＋細胞（注入されたｉＮＫ細胞）の存在について蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して血液および肺を分析した。注入された細胞がヒトＩＬ－１５導入遺伝子を有した場合のみ、それらは、２０日後に検出可能であった（図３Ｂ）。
ＩＬ－１５導入遺伝子がＣＡＧ－ＣＡＲ／ＩＬ－１５細胞の残留にｉｎ ｖｉｖｏで及ぼす影響をさらに検査するために、試験１日目に１×１０７個のＣＡＧ－ＣＡＲまたはＣＡＧ－ＣＡＲ／ＩＬ－１５細胞をマウスに静脈内注入した。試験の持続時間の間、マウスの半数に外因性組換えヒトＩＬ－１５（毎日１μｇ／マウス、腹腔内）を補充した。試験８日目に、肺を回収し、フローサイトメトリー分析のために処理した。Ｆｉｘａｂｌｅ ＬｉｖｅＤｅａｄ ＮｅａｒＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）、抗ｈｕＣＤ４５、抗ｈｕＣＤ５６で試料を染色した。分析の間、ｉＮＫ細胞をＣＤ５６／ＣＤ４５ダブルポジティブ細胞として定義し、生きた細胞集団のパーセンテージとして記録した（図３Ｃ）。
ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞が死滅を引き起こす能力を複数ラウンドの標的誘発にわたり検査するために、各ラウンドでの細胞溶解活性の定量のためのＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイと平行して、繰り返し刺激についてバルク培養物を用いて連続殺滅アッセイを設定した。ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞を、照射されたＲｅｈ細胞（２Ｇｙ）と共に１：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で３～４日間培養した。結果は、ＣＡＲ／ＩＬ－１５－ｉＮＫ細胞が消耗前に７ラウンドの間連続殺滅を引き起こすことを示した（図４Ａ）。バルク培養の終わりに、Ｒｅｈ標的細胞は検出不可能であった。ＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞をＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕｅでカウントして、拡大増殖を追跡し、その後のバルク培養およびＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイの設定を可能にする。エフェクター集団として以前のバルク培養から回収された細胞を使用して、５：１、１：１、１：５の複数のＥ：ＴでＩｎｃｕｃｙｔｅベースの殺滅アッセイを、各バルク培養と平行して設定した。
次に、ＣＡＲ／ＩＬ－１５－ｉＮＫ細胞を、ＩＬ－１５を発現していないＣＡＲ－ｉＮＫ細胞と比較した。ＣＡＲ／ＩＬ－１５－ｉＮＫ細胞は、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞と比較して優れた増殖を示した（図４Ｂ）。ＣＡＲ／ＩＬ－１５－ｉＮＫ細胞はまた、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞と比較してＲａｊｉ細胞の優れた連続殺滅を示した（図４Ｃ）。
[実施例４]
サイトカイン強化細胞傷害アッセイ
インターロイキン－１２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）の産生を刺激するサイトカインである。ＩＬ－１２がＣＡＲ／ＩＬ－１５ ｉＮＫ細胞の標的細胞傷害性に対する効果を有したかどうかを決定するために、標準的なプロトコルで（ＩＬ－１２なし）、または１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を含めて、培養の最終２４時間にｉＮＫ細胞を分化させた。ｉＮＫ細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ殺滅アッセイに使用して、Ｒａｊｉ ＣＤ１９＋ Ｂ細胞白血病細胞株（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の殺滅についての有効性を決定した。ＩＬ－１２でプライミングされた細胞は、ＩＬ－１２の非存在下で分化した細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞の迅速な殺滅を実証した（図５Ａ）。
ＩＬ－１２でプライミングされたｉＮＫ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成に対する効果についてさらに検査した。ルシフェラーゼ標識バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉを、試験０日目に雌性ＮＳＧ（商標）マウスの静脈内（ｉｖ）に植え込んだ。マウスに、１×１０７個の未プライミングまたはＩＬ１２プライミングＣＡＧ－ＣＡＲ－ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞を試験１、４、および７日目に静脈内注入した。試験期間にわたり１日目に開始して、マウスに腹腔内組換えヒトＩＬ－２（１００，０００ＩＵ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＃２００－０２）を週３回補充した。未治療群を対照として役立てた。マウスにルシフェリン（ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を注射し、その後ＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してイメージングした。ルシフェリン基質と、Ｒａｊｉ腫瘍細胞によって産生されたホタルルシフェラーゼ酵素との反応は、生物発光シグナルとして測定される光を産生する。データを平均全身生物発光平均輝度±ＳＤとして表す。２０日目の試験終了時に５０％および６２％腫瘍増殖阻害が、それぞれプライミングされていないおよびＩＬ－１２でプライミングされたｉＮＫ治療で観察された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）（図５Ｂ）。
[実施例５]
除去アッセイ
セツキシマブ、ＥＧＦＲ阻害薬を投薬することにより抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の標的として作用することが意図される除去特徴としてｔＥＧＦＲを発現するようにＣＡＲ／ＩＬ１５ ｉＮＫ細胞を操作した。導入遺伝子から発現されたＥＧＦＲを有するまたは有しないｉＮＫ細胞をヒトＰＢＭＣと共培養した。漸増する用量のセツキシマブを添加してＡＤＣＣを促進し、細胞を３時間インキュベートした。対照細胞をヒトＩｇＧ１で処理した。結果を図６Ａ～６Ｂに示す。ＡＤＣＣアッセイにおいてＥＧＦＲ発現ｉＮＫ細胞だけが用量依存的な細胞死（アネキシンＶ染色）を示した。このデータは、セツキシマブを使用してＣＡＲ／ＩＬ１５／ｔＥＧＦＲ ｉＮＫ細胞を効率的に除去できることを実証している。
[実施例６]
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの欠失
本出願に記載されたプラスミド構築物を設計して、本出願の発明に有用な外因性ポリペプチドの組込みを標的化し、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子の発現を同時に欠失または低減する。Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ標的化プラスミドを使用するＩＰＳＣのゲノム操作を上記のように行う。ＮＫ細胞への分化後、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩの発現の確認を、ＨＬＡ Ｉ（アルファ鎖）およびＨＬＡ ＩＩ（アルファまたはベータ鎖）に特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーを使用して確認する。
[実施例７]
非古典的ＨＬＡの発現
非古典的ＨＬＡタンパク質、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇをさらに発現させるために本出願のｉＮＫ細胞を操作する。ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーによって発現を全ステージで確認する。
[実施例８]
Ｋ５６２細胞のｉＮＫ媒介性溶解
ｉＮＫ細胞がＮＫ細胞の基本的機能性を誘発する能力を実証するために、Ｋ５６２細胞を死滅させる能力について、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージングプラットフォームを使用して３人のＰＢＭＣドナーからのｉＮＫクローンｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１および初代末梢血ＮＫ（ＰＢ－ＮＫ）細胞を評価した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅプラットフォームは、蛍光標識標的細胞のリアルタイム定量を可能にし、その枯渇は、標的溶解の測定値として役立つ。
Ｋ５６２細胞株の生成および拡大増殖
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞Ｋ５６２細胞株をＡＴＣＣから得た。標準的Ｓａｒｔｏｒｉｕｓプロトコルに従ってＫ５６２細胞にＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルスを形質導入した。形質導入された細胞を選択し、１ｕｇ／ｍＬ ピューロマイシンを含有するＩＭＤＭ培地中で培養した。細胞密度を１ｅ５個／ｍＬ～１ｅ６個／ｍＬの間に保って２～３日毎に分割しながら細胞を培養した。
ＮＫの単離
３人のドナーからのＰＢＭＣを３７℃で解凍し、３００Ｇで３分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＿１０ｎｇ／ｍＬ Ｉｌ－１５中に再懸濁し、一晩休ませた。ＣＤ５６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、部品１３０－０５０－４０１）を製造業者が推奨するプロトコルにより使用して、休止ＰＢＭＣからＮＫ細胞を単離した。
ＮＫ純度のチェック
ＣＡＲ－ｉＮＫクローンおよびＰＢ－ＮＫドナーを、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ ｆａｌｃｏｎ ３５３０７７）中に細胞１００Ｋ個／ウェルとなるようにプレート播種し、３００×Ｇで３分間遠心分離し、上清をシンクに振り落とすことによりすべての洗浄ステップを実行した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１：１０００希釈（ＰＢＳに）したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ生存能染色剤（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１００ｕｌにより室温（ＲＴ）で１５分間染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液ＢＳＡ（ＢＤ）中で２回洗浄した。ＴｒｕｓｔａｉｎＦｃＸ、ヒトＦｃ受容体遮断薬を、ＢＤ ＦＡＣＳ染色剤で１：１００希釈し、希釈物５０ｕｌを各ウェルに加え、４Ｃで３０分間インキュベートした。細胞をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液ＢＳＡ（ＢＤ）中で２回洗浄した。ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４に対するｍＡｂをＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１：１００希釈することによって染色カクテルを作った。細胞を染色カクテル５０ｕｌで染色し、遮光しながら４Ｃで３０分間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液を使用して細胞を２回洗浄し、ＢＤ安定化固定液１００ｕｌ中で固定した。ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３ Ｌｉｔｅを用いてすべての試料を同じ電圧で流した。ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２を使用してフローサイトメトリーのデータを分析した。
Figure 2023553419000009
Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイの設定
２０：１のＥ：Ｔウェルについて４×１０５／ウェル、１０：１のＥ：Ｔウェルについて２×１０５／ウェル、および１：１のＥ：Ｔウェルについて２×１０４／ウェルの最終エフェクター数でＣＡＲ－ｉＮＫおよびＰＢ－ＮＫエフェクター細胞クローンを９６ウェル平底プレート（ＢＤカタログ番号３５３０７２）のウェルのＮＫＣＭ培地１００μＬ中に添加した。ＩＭＤＭ ５００ｍＬおよびＨａｍのＦ－１２栄養素ミックス５００ｍＬを基本培地としてＮＫＣＭアッセイ培地を作製した。基本培地に２％、ＣＴＳ Ｂ－２７補助剤、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、ビタミンＡ不含、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、２５０μＭ ２－リン酸アスコルビン酸Ｍｇ、１００μＭ モノ－チオ－グリセロール、１％ ＧｌｕｔａＭａｘおよび２ｍＭ ニコチンアミドを補充した。
続いて、２×１０４個のＫ５６２－ＮＬＲ細胞を各ウェルのＮＫＣＭ培地１００μＬ中に添加した。各ＣＡＲ－ｉＮＫエフェクター細胞について３つ組のウェルでアッセイを行った。アッセイプレートを室温で１５分間休ませて、細胞を沈降させた。５％ ＣＯ２を有する３７℃インキュベーター中のＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３機器にプレートを入れた。機器のスキャンタイプを、イメージフェーズおよび赤色捕捉時間４００ｍｓの赤色チャネルと共にホールウェルリードに設定した。機器のスキャン頻度を３時間毎７２時間の読取りに設定した。ホールウェル分析パラメーターをＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイのために選択した。ＲＣＵ閾値を２．０に設定し、半径を１００μｍに設定し、エッジスプリットはオンとした。
分析
ＮＬＲカウント／ウェルのデータをすべてのウェルについてすべての時点でＩｎｃｕｃｙｔｅ ２０２０Ａソフトウェアからエクスポートし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにペーストした。標的細胞のみのウェルにおけるＮＬＲカウントの平均に対するパーセンテージとして規準化標的カウントについての値を計算するために、各３つ組値を各標的細胞株に適した標的細胞のみのウェルの平均（Ｎ＝３）で割り、この値に１００を乗じた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）でデータをグラフ表示した。３つ組の規準化ＮＬＲ標的カウント値を、Ｘ軸の各時点についてＹ軸上にグラフ化した。
結果
ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１およびＰＢ－ＮＫ細胞は、２０：１、１０：１および１：１のエフェクター対標的比でＫ５６２細胞を死滅させる能力を示した。図７Ａ～Ｃに示されるように、Ｉｎｃｕｃｙｔｅに基づくアッセイは、（Ａ）２０：１、（Ｂ）１０：１、および（Ｃ）１：１のエフェクター対標的比でＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｋ５６２細胞の減少を経時的に測定した。標的細胞に対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウントは、４つのｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１および３つのＰＢ－ＮＫの平均だけをカウントする。
純度に関して、ＰＢ－ＮＫ細胞は、単離後にＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋が８７％～９６％の間であった。ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１は、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋が９８．８％であった。ＰＢ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３＋が２０．１５％～０．１９５％の間、およびＣＤ３＋／ＣＤ５６＋が１９．１％～０．０７５％の間であった。ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１は、Ｃｄ３＋が０．０８％、およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋が０．０４８％であった（図８）。
[実施例９]
ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞を使用するＣＤ１９＋細胞のＩｎ Ｖｉｔｒｏ除去
ＣＡＲ－ｉＮＫクローン、ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現してＣＤ１９＋がんを標的とするように操作されたものである。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生存細胞イメージングプラットフォームを使用して、その枯渇がエフェクター標的細胞殺滅の有効性の測定値として役立つ蛍光標識標的細胞のリアルタイム定量により、ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１の細胞溶解活性を複数のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で実証した。ナイーブにＣＤ１９を発現しているまたはＣＤ１９ノックアウト（ＫＯ）のＲｅｈおよびＮＡＬＭ６細胞株の同質遺伝子ペアを使用して、ＣＤ１９＋標的細胞のＣＡＲ媒介溶解を実証した。
標的細胞株のＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ形質導入
ＲｅｈおよびＮＡＬＭ６細胞をＡＴＣＣから得た。細胞株にＩｎｃｕｃｙｔｅ ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄレンチウイルス試薬（ＥＦ１α；プロモーター、ピューロマイシン選択）を製造業者のプロトコルにより、８μｇ／ｍＬポリブレンを有する培地中でＭＯＩ ３で形質導入した。ＮＬＲ形質導入細胞を選択し、１０％ ＦＢＳおよび１μｇ／ｍＬピューロマイシンを有するＲＰＭＩ中で細胞株を培養した。
Ｒｅｈ－ＣＤ１９ＫＯおよびＮＡＬＭ６－ＣＤ１９ＫＯ標的株の生成
Ａｍａｘａ ４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒについての製造業者のプロトコルにより、親ＲｅｈおよびＮＡＬＭ６細胞（以前にＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄを形質導入したもの）にＬｏｎｚａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－９システムを使用してＲｅｈ－ＣＤ１９ＫＯおよびＮＡＬＭ６－ＣＤ１９ＫＯを生成した。使用されたカスタムのＣＤ１９ＫＯ ｃｒＲＮＡについての標的配列は、ＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡであった。ヒトＣＤ１９ポジティブ選択キットＩＩを製造業者のプロトコルにより使用してＣＤ１９＋細胞を除去し、ＣＤ１９発現をフローサイトメトリーによりアッセイした。ＲＰＭＩ－１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ ピューロマイシン中で細胞株を培養した。
Figure 2023553419000010
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＣＡＲ－ｉＮＫ殺滅アッセイの設定
２×１０５（１０：１）、１×１０５（５：１）、２×１０４（１：１）、または４×１０３（１：５）個の各ＣＡＲ－ｉＮＫエフェクター細胞クローンを９６ウェル平底プレート（ＢＤカタログ番号３５３０７２）のウェルのＮＫＣＭ培地１００μＬ中に添加し、続いて、２×１０４個のＲｅｈ－ＮＬＲ、Ｒｅｈ－ＣＤ１９ＫＯ－ＮＬＲ、ＮＡＬＭ６－ＮＬＲ、またはＮＡＬＭ６－ＣＤ１９ＫＯ－ＮＬＲ細胞をＮＫＣＭ培地１００μＬ中に添加した。各ＣＡＲ－ｉＮＫエフェクター細胞について３つ組のウェルでアッセイを行った。アッセイプレートを室温で１５分間休ませて、細胞を沈降させた。５％ ＣＯ２を有する３７℃インキュベーター中のＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３機器にプレートを入れた。機器のスキャンタイプを、イメージフェーズおよび赤色補足時間４００ｍｓの赤色チャネルと共にホールウェルリードに設定した。機器のスキャン頻度を２時間毎７２時間の読取りに設定した。ホールウェル分析パラメーターをＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイのために選択した。ＲＣＵ閾値を２．０に設定し、半径を１００μｍに設定し、エッジスプリットはオンとした。
分析
ＮＬＲカウント／ウェルのデータをすべてのウェルについてすべての時点でＩｎｃｕｃｙｔｅ ２０２０Ａソフトウェアからエクスポートし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにペーストした。標的細胞のみのウェルにおけるＮＬＲカウントの平均に対するパーセンテージとして規準化標的カウントについての値を計算するために、各３つ組値を各標的細胞株に適した標的細胞のみのウェルの平均（Ｎ＝３）で割り、この値に１００を乗じた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）でデータをグラフ表示した。３つ組の規準化ＮＬＲ標的カウント値を、Ｘ軸上の各時点についてＹ軸上にグラフ化した。
結果
ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１細胞によるＲｅｈおよびＮＡＬＭ６細胞の両方の抗原特異的溶解が、一連のエフェクター対標的比にわたり示された。試験された各Ｅ：Ｔ比でＣＤ１９＋細胞は、マッチするＣＤ１９ＫＯ株よりも速く、より完全に死滅した。
４つのＥ：Ｔ比は、Ｒｅｈ細胞に対して一連の細胞溶解活性を示した（図９）。親Ｒｅｈ細胞と比較してＲｅｈ ＣＤ１９ＫＯ細胞ではより低い細胞溶解活性が観察された。図９は、４つのエフェクター対標的比でのＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ標的細胞の経時的な減少を測定するＩｎｃｕｃｙｔｅに基づくアッセイの結果を示す。ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１と（Ａ）１０：１、（Ｂ）５：１、（Ｃ）１：１、および（Ｄ）１：５のＥ：Ｔ比で共培養されたＲｅｈおよびＲｅｈ－ＣＤ１９ＫＯにおける標的細胞のみのカウントに対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウント。図１０は、４つのエフェクター対標的比でＮｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ標的細胞の減少を経時的に測定するＩｎｃｕｃｙｔｅに基づくアッセイの結果を示す。ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１と（Ａ）１０：１、（Ｂ）５：１、（Ｃ）１：１、および（Ｄ）１：５のＥ：Ｔ比で共培養されたＮＡＬＭ６およびＮＡＬＭ６－ＣＤ１９ＫＯにおける標的細胞のみのカウントに対するパーセンテージとしての規準化標的細胞カウント。
[実施例１０]
ｉＮＫ細胞のＩｎ Ｖｉｔｒｏ残留
単一細胞ｉＮＫクローンｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１を操作してＮＫ恒常性サイトカインＩＬ－１５を分泌させた。２１日残留アッセイにおいて、様々なレベルのＩＬ－２（１０ｎＭ～０ｎＭ）の存在下で、ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１のｉｎ－ｖｉｔｒｏ残留を、バルク非操作「野生型」（ＷＴ）ｉＮＫ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５細胞およびＮＫ細胞白血病株ＫＨＹＧ－１と比較した。３～４日毎に細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕｅでカウントし、新鮮培地中に再播種した。ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕから収集された生存細胞カウントを使用して累積拡大増殖倍率を計算した。
２１日残留アッセイ
１．５×１０６個のｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１、ＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５またはＫＨＹＧ－１不死化ＮＫ細胞を、２４ウェルプレートの個別のウェルの、６つの異なる濃度のＩＬ２を含有する合計３ｍＬのＮＫＣＭ中に０．５×ｅ６個／ｍＬで添加した。１．５×１０６個のＫＨＹＧ－１不死化ＮＫ細胞もまた、２４ウェルプレートの個別のウェルの、６つの異なる濃度のＩＬ２を含有する合計３ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ ＨＩ ＦＢＳ＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ中に０．５×ｅ６個／ｍＬで添加した。両方のプレートを、５％ ＣＯ２を有する３７℃インキュベーターセットに移した。
７２または９６時間毎に、細胞を回収し、それぞれ１５ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞を３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを基礎ＲＰＭＩアッセイ培地３ｍＬ中に再懸濁した。２００マイクロリットルの細胞を取り出して、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕでカウントした。
カウント後、細胞を再び３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、対応する濃度のＩＬ２を含有するＮＫＣＭアッセイ培地またはＲＰＭＩアッセイ培地中に細胞を０．５×ｅ６個／ｍＬで再懸濁した。０．５×ｅ６個／ｍＬの細胞を３ｍＬ／ウェルで再びプレート播種した。細胞を３ｍＬ未満の体積に０．５×ｅ６個／ｍＬとなるように再懸濁した場合、全体積をプレート播種した。再懸濁体積が２００ｕＬ未満になった場合は、細胞株を再プレート播種しなかった。１４日目の終わりに、アッセイを終了し、細胞を捨てた。
分析
ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕを使用して細胞カウントおよび細胞生存率を取得した。変化倍率を計算するために使用された集団は、生存細胞／ｍＬであった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．４．３）を用いてデータをグラフ表示した。
結果
単一細胞クローンｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１は、外因性ＩＬ－２の非存在下でＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５よりも長くｉｎ－ｖｉｔｒｏで残留した（図１１）。細胞を基礎ＮＫＣＭ中で５％ ＣＯ２、３７℃で１４日間培養した。３～４日毎に、すべての条件のものを回収し、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕでカウントし、適切な培地中に０．５×ｅ６／ｍＬで再懸濁し、次いで再プレート播種した。２１日後、累積変化倍率を計算した。単一細胞クローンｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１は、外因性ＩＬ－２の非存在下でＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５よりも長くｉｎ－ｖｉｔｒｏで残留したが、これは、ＩＬ－１５導入遺伝子が機能性であり、意図される作用様式、すなわち高い残留を表すことを示している。ｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１によって放出されるＩＬ－１５は、細胞の恒常性生存を支援するために十分であるが、マイトジェン拡大増殖を引き起こすには不十分である。
外因性ＩＬ－２支援は、ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１およびＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５の両方の残留を増大させた（図１２Ａ～Ｆ）。１０ｎＭ（図１２Ａ）、３ｎＭ（図１２Ｂ）、１ｎＭ（図１２Ｃ）、０．３ｎＭ（図１２Ｄ）、０．１ｎＭ（図１２Ｅ）、０ｎＭ（図１２Ｆ）の６つのＩＬ２濃度のうち１つを含有するＮＫＣＭ中で細胞を５％ ＣＯ２、３７℃で２１日間培養した。３～４日毎に、すべての条件のものを回収し、ＶｉＣｅｌｌ Ｂｌｕでカウントし、適切な培地中に０．５×ｅ６個／ｍＬで再懸濁し、次いで再プレート播種した。２１日後に、累積変化倍率を計算した。外因性ＩＬ－２の支援は、ｉＮＫ１２４８－ｉＰＳＣ６１１およびＷＴ ｉＮＫ１４８７－ｉＰＳＣ００５の両方の残留を増大させたが、これは、ｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１の限られたマイトジェン拡大増殖を可能にするためにさらなる恒常性サイトカインが必要であることを示している。操作ＩＬ－１５と外因性ＩＬ－２との組合せが治療用ｉＮＫの制御されない増殖を誘発するかを決定するために、ＩＬ－２の存在下で細胞の２週間の培養を行い、ｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１をＩＬ－２依存性ＮＫ白血病株ＫＨＹＧ－１と比較した。ｉＮＫ１２４８－ＩＰＳＣ６１１ではなく、ＫＨＹＧ－１は、２週間の培養にわたり対数増殖を示した。
[実施例１１]
セツキシマブによる治療用ｉＮＫ細胞のＩｎ Ｖｉｔｒｏ除去
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、細胞表面抗原を認識している抗体でコーティングされた標的細胞が、Ｆｃ受容体を保持するエフェクター細胞によって溶解される、細胞免疫防御メカニズムである。ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ、および好酸球を含む多様な免疫細胞によって、それらのＦｃ受容体、特にＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）を介する、結合した免疫グロブリンの認識により媒介され得る。
セツキシマブは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインを標的としたキメラマウス－ヒト抗体である。これは、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株に対するＡＤＣＣをそのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を介して媒介することが実証されている（Kurai, 2007）。
インターロイキン（ＩＬ）－２活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に培養した場合、ｉＰＳＣ由来ＮＫ（ｉＮＫ）開発候補６１１（例えば治療用ｉＮＫ）がＥＧＦＲを発現し、アイソタイプ対照抗体と比較してセツキシマブによって媒介されるＡＤＣＣに感受性であるかを評価するために、以下の実験を行った。
初代エフェクター細胞の単離および培養
同意した健康成人ドナーのバフィーコート（Ｂｌｏｏｄｗｏｒｋｓ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）からＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配をかけた遠心分離によって末梢単核血球（ＰＢＭＣ）を収集した。実験に使用する前に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および５５ｍＭ ｂ－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で、細胞を１×１０６個／ｍＬで一晩培養した。
ＡＤＣＣアッセイ
ｉＮＫ細胞を２．５ｍＭ ＣＴＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中３つ組で標的として２．５×１０４個／ウェルの細胞をプレート播種した。エフェクター細胞の添加前に、セツキシマブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を１０ｐｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度で治療用ｉＮＫ標的と共に３０分間予備インキュベートした。２５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で３つ組のウェル／条件でＩＬ－２活性化エフェクターＰＢＭＣを添加し、培養物を５％ ＣＯ２、３７％Ｃｏインキュベーター中で１６時間インキュベートした。死滅した細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用するフローサイトメトリーによって特定した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を獲得し、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアで分析した。
フローサイトメトリー
細胞あたりの結合抗体数（ＡＢＣ）の決定のために、２×１０５個の治療用ｉＮＫ細胞を暗条件のＲＴで１５分間ＥＧＦＲ－ＰＥ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で標識し、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で洗浄し、暗条件のＲＴで１０分間、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定した。ＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の単一チューブをＰＢＳ ５００ｍＬで製造業者のプロトコルにより復元した。同じ電圧および設定を使用して標識治療用ｉＮＫ細胞およびＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ＰＥチューブをＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得し、すべての試料をＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアで分析した。ＰＥ対抗体の既知の比を使用することによって、細胞あたりのＰＥ分子数を細胞あたりの抗体数に変換することができる。ＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズをＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａによりゲーティングした。続いてＰＥ蛍光をヒストグラムとして視覚化し、４つの別個のピークの各々についてゲート設定した。幾何平均蛍光を各ＰＥピークについてエクスポートし、ＡＢＣの計算のために使用した。
ＡＤＣＣアッセイの分析のために、細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＰＢＳ中に製造業者のプロトコルに従って再懸濁した。抗体の添加前に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ受容体ブロッキング溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＦｃ受容体（ＦｃＲ）との非特異的結合を遮断した。ＣＤ５６およびＣＤ１６に対する抗体と共に細胞をＲＴで２０分間インキュベートし、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定する前に、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３回洗浄した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を収集し、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアですべてのＦＣＳファイルを分析した。
前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱面積（ＳＳＣ－Ａ）に基づきリンパ球をゲーティングした。前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）対前方散乱の高さ（ＦＳＣ－Ｈ）ゲートに基づきシングレットを排除した。ＣＴＶ＋治療用ｉＮＫ標的またはＣＴＶ－エフェクター細胞にゲート設定し、続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲについてポジティブに標識されたＣＴＶ＋治療用ｉＮＫ細胞にゲート設定した。図１３に示されるように、細胞からリンパ球をゲーティングし、続いてダブレットを排除し、続いてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）＋ｉＮＫをゲーティングし、最終的にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ＋をゲーティングして、死滅した治療用ｉＮＫ標的の％を決定した。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＮＩＲ＝Ｎｅａｒ－ＩＲ。
分析
細胞あたりの結合抗体数（ＡＢＣ）を計算するために、以下の式を使用してＬｏｇ１０幾何平均－ＰＥに対してＬｏｇ１０ ＰＥ分子数／ビーズの直線回帰をプロットした：ｙ＝ｍｘ＋ｃ［式中、ｙはＬｏｇ１０蛍光に等しく、ｘは、Ｌｏｇ１０ ＰＥ分子数／ビーズに等しい］。上記の式を使用し、各試料についての幾何平均蛍光値に基づきＡＢＣ値を補間することによって、各試料についての細胞あたりの結合抗体数を決定した。
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＮＩＲ＋ＣＴＶ＋標的が死滅ｉＮＫと見なされ、自然ｉＮＫ細胞死がエフェクター細胞を添加せずに（０：１のＥ：Ｔで）培養されたｉＮＫ細胞によって決定される次式を使用して、ＡＤＣＣアッセイについての特異的細胞溶解率を（Kim, 2007）のように計算した。
結果
幾何平均蛍光強度値を使用して、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ技術によって治療用ｉＮＫについてのＡＢＣ値を７，３４１と計算した（図１４および表６）。図１４は、ＥＧＦＲで染色された治療用ｉＮＫ上のＥＧＦＲ ＰＥレベル（黒ヒストグラム）を未染色の治療用ｉＮＫ（灰色ヒストグラム）または未編集ＷＴ ｉＮＫ（破線）と比較して示す。フローサイトメトリーにより治療用ｉＮＫ細胞上のＥＧＦＲ発現が、７，３４１のＡＢＣ値で観察された。このレベルのＥＧＦＲは、ｉＮＫとＩＬ－２活性化ＰＢＭＣとの共培養において２．０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０でセツキシマブによって媒介されたＡＤＣＣ活性を観察するために十分であった。
Figure 2023553419000011
ＩＬ－２活性化ＰＢＭＣとｉＮＫ細胞との共培養物へのセツキシマブの添加は、治療用ｉＮＫ標的のＡＤＣＣを２．０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０で濃度依存的に媒介した（図１５）。図１５は、セツキシマブ（黒三角）によって媒介される治療用ｉＮＫ細胞の特異的細胞溶解率をヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（白三角）と比較して示す。ＩＬ－２活性化ＰＢＭＣを２５：１のＥ：Ｔ比で治療用ｉＮＫと１６時間共培養し、ｉＮＫの特異的細胞死滅率を決定した。各データ点は、３つ組のウェルの平均、エラーバー±標準偏差である。いくらかのバックグラウンド殺滅が最高濃度の抗体で観察されたものの、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の添加は、治療用ｉＮＫ標的のＡＤＣＣを媒介しなかった。
[実施例１２]
Ｂ２Ｍノックアウトを使用する抗体および補体の逃避
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する同種細胞療法産物は、多くの疾患のためのオフザシェルフ治療として使用される潜在性を有するが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子における不適合性のせいで宿主による激しい免疫応答を生成するおそれがある。ＨＬＡクラスＩ分子に対してＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介される免疫応答に加えて、一部の患者は、これらの多型性タンパク質に対する既存の抗体（Ａｂ）を有し得る（１、２）。ＨＬＡクラスＩ分子に対するＡｂが実際に存在するならば、エフェクター細胞の補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）の潜在性がある。ＨＬＡクラスＩ分子に対するＡｂによる結合を除去するための戦略は、ＨＬＡクラスＩタンパク質に共通のサブユニットをコードし、細胞表面発現に必要な、ベータ－２ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）の欠失による。
ＣＤＣアッセイは、補体タンパク質の存在下でＡｂがどれだけよく細胞殺滅を誘導するかを測定するための簡単な方法である（３）。血漿のみならず血清は、補体カスケードと称される補体タンパク質の全範囲を含有する。しかし、これらの分子は不安定であり、したがって、ＣＤＣアッセイに使用する前に収集された血清試料を素早く凍結させなければならない。代替として、ウサギ補体を、ヒト補体に代わるアッセイにおける試薬として使用することができる。患者（４）からの潜在的ＨＬＡクラスＩ力価をモデル化するために共通の汎ＨＬＡ－ＡＢＣ Ａｂを使用して、ｉＮＫ細胞を検査して、野生型（ＷＴ）ＨＬＡクラスＩ発現ｉＮＫ細胞の感度およびＢ２Ｍノックアウト（ＫＯ）クローン６１１ ｉＮＫ細胞のＣＤＣからの防御を実証した。
補体媒介細胞傷害アッセイ
ｉＮＫ細胞、ＷＴ ００５およびクローン６１１を、ＲＰＭＩ－１６４０基本培地中に４×１０ｅ６個／ｍＬになるように希釈した。ｉＮＫ細胞を、ポリプロピレン、Ｕウェル、９６ウェルプレート（５０ｕＬ／ウェル）中に細胞２００Ｋ個／ウェルで播種した。試料を３つ組で播種した。ＡｂをＲＰＭＩ－１６４０に４０ｕｇ／ｍＬとなるように希釈し、５０ｕＬ／ウェル（最終１０ｕｇ／ｍＬ）で分注した。使用直前に幼若ウサギ補体（ＢＲＣ）を解凍し、次いでＲＰＭＩ－１６４０で１：５希釈し、１００ｕＬ／ウェル（最終１０％ ＢＲＣ）で分注した。各ウェルの終体積は２００ｕＬであった。両方のｉＮＫ細胞型について、４つの条件：Ａ、添加なし（ＲＰＭＩ－１６４０のみ）；Ｂ、アイソタイプＡｂ＋ＢＲＣ；Ｃ、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ Ａｂ＋ＢＲＣ；およびＤ、抗ＣＤ５２ Ａｂ＋ＢＲＣがあった。次いで、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした。
インキュベーション期間の後、プレートを１２００ＲＰＭで１分間遠心分離し、デカンテーションして、ＲＰＭＩ－１６４０をＢＲＣと共に除去し、２００ｕＬ／ウェルのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳで置換した。次いで、トリパンブルーを使用して細胞をカウントして、生存細胞および死滅細胞の両方を採点した。
分析
細胞生存率をグラフ表示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計解析した。スチューデントのＴ検定を使用して生存率における統計的有意差を評価した。確率値（ｐ）が≦０．０５であった場合に、試料間の差を有意と見なした。
結果
解凍および遠心分離した時点で、Ｅａｓｙｓｅｐ緩衝液１ｍＬ中に細胞を再懸濁し、トリパンブルーを使用して生存率についてカウントした。ＣＤＣアッセイに使用する前に、細胞は高い生存率を有することが見出された。ＷＴ００５：２４．６×１０ｅ６／ｍＬ、生存率９５％、クローン６１１ ｉＮＫ細胞：２２．６×１０ｅ６／ｍＬ、生存率９３％。
ｉＮＫ細胞からのＢ２Ｍの除去は、ＨＬＡ－ＡＢＣ分子に対するＡｂおよび補体の存在下で補体媒介細胞傷害から防御する。図１６に示されるように、新鮮解凍されたＷＴ００５およびクローン６１１ ｉＮＫ細胞の両方は、単独でまたはアイソタイプＡｂ＋ＢＲＣと一緒に、ＲＰＭＩ－１６４０中で１時間培養された場合、高い生存率を維持することが見出された。対照的に、ＷＴ００５ ｉＮＫ細胞だけがＨＬＡ－ＡＢＣ Ａｂ＋ＢＲＣの存在下で死滅し、クローン６１１ ｉＮＫ細胞には無効であった。クローン６１１ ｉＮＫ細胞が補体媒介殺滅にまだ感受性であったことを証明するために、本発明者らはＣＤ５２に対するＡｂを含めた。抗ＣＤ５２ Ａｂ＋ＢＲＣの添加は、両方のｉＮＫ細胞の殺滅をもたらした。
[実施例１３]
β２Ｍ欠損のｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞とβ２Ｍ発現野生型ｉＮＫ細胞との間のＣＴＬ活性化およびｉＮＫ細胞溶解の比較
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する同種細胞療法産物は、多くの疾患のためのオフザシェルフ治療として使用される潜在性を有するが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子における不適合性のせいで宿主による激しい免疫応答を生成するおそれがある（Lanza, et al. Nat Rev Immunol. 2019 Dec;19(12):723-733）。とりわけ、ミスマッチのクラスＩ ＨＬＡ担持細胞の直接溶解は、クラスＩ ＨＬＡ分子と相互作用する宿主ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を介して起こる（Felix, et al. Nat Rev Immunol. 2007 Dec;7(12):942-53）。宿主ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化はベータ－２ミクログロブリン（β２Ｍ）の欠失によって妨害され、β２Ｍは、すべてのクラスＩ ＨＬＡ遺伝子に共通のサブユニットをコードし、それらの表面発現に必要である（Krangel, et al. Cell. 1979 Dec;18(4):979-91;およびZijlstra, et al. Nature. 1989 Nov 23;342(6248):435-8）。
ここで、β２Ｍ欠損（ＫＯ）となるように遺伝子編集されたｉＰＳＣ由来ＮＫ（ｉＮＫ）を、複数のドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）と共に培養して、それらが、β２Ｍを発現する野生型ｉＮＫと比較してＣＴＬ活性化およびｉＮＫ細胞の溶解を誘導するかを決定する。
エフェクター細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の生成
同意した健康成人ドナーから単離された凍結保存末梢単核血球（ＰＢＭＣ）を購入し（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、使用まで液体窒素中で保管した。親ｉＰＳＣ株と特異的反応性を有するＣＴＬを生成した。簡潔には、５×１０７個のＰＢＭＣからヒトＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の説明書に従ってＴ細胞を単離し、親ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞と共にＩＬ２を有する培地中で共培養することによって３回プライミングし、続いてＴ細胞をもう１ラウンド単離し、次いで、ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１５を有する培地中でＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８刺激試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により拡大増殖させた。拡大増殖された１０７個／ｍｌの細胞をＣＳ－１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）緩衝液中で凍結保存した。
同種逃避細胞傷害性およびＣＴＬ活性化アッセイ
ｉＮＫ細胞を製造業者の説明書に従って５μＭ ＣＴＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、標的として９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中に細胞５×１０４個／ウェルを２つ組でプレート播種した。凍結保存されたＣＴＬを解凍し、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で３つ組のウェル／条件で添加し、培養物を５％ ＣＯ２、３７％ Ｃｏインキュベーター中で４８時間インキュベートした。
フローサイトメトリー
細胞を１×ＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄し、製造業者のプロトコルに従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。抗体の添加前に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ受容体ブロッキング溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＦｃ受容体（ＦｃＲ）への非特異的結合を遮断した。ＴＣＲａｂ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５に対する抗体と共に細胞をＲＴで２０分間インキュベートし、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に３回洗浄し、その後、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を収集し、すべてのＦＣＳファイルをＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアで分析した。
リンパ球および定量用ビーズを、前方散乱の高さ（ＦＳＣ－Ｈ）および側方散乱面積（ＳＳＣ－Ａ）に基づきゲーティングした。前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）ｖｓ前方散乱の高さ（ＦＳＣ－Ｈ）ゲートに基づきシングレットを除去した。生存細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＮＩＲ染色陰性としてゲーティングした。ＣＴＶおよびＴＣＲαβに基づき、Ｔ細胞（ＴＣＲαβポジティブ、ＣＴＶネガティブ）およびｉＮＫ細胞（ＣＴＶポジティブおよびＴＣＲαβネガティブ）をゲーティングした。Ｔ細胞ゲート内で、ＣＤ８ポジティブおよびＣＤ４ネガティブ細胞を選択した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内で、ＣＤ２５の発現を評価し、ＣＤ２５ポジティブゲートは、標的なしに単独で培養されたＴ細胞間で最小のポジティブバックグラウンド事象を捕捉することを決定した（図１７）。図１７に示すように、細胞から定量用ビーズおよびリンパ球をゲーティングした。リンパ球内で、ダブレットの排除に続き、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲネガティブのゲーティングを行い、続いてｉＮＫ細胞を特定するためのＣＴＶおよびＴ細胞を特定するためのＴＣＲαβについてのゲーティングを行った。Ｔ細胞内で、ＣＤ４ネガティブ、ＣＤ８ポジティブ細胞、続いてＣＤ２５についてゲーティングして活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を特定した。主なアッセイパラメーターである定量用ビーズ、生存ｉＮＫ細胞および活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＦＳＣ－Ｗ＝前方散乱幅、Ｌ－Ｄ＝ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ。
分析
獲得されたＣＴＶ＋ゲート事象カウントを定量用ビーズゲートからの事象カウントで割ることによって各ウェルについての生存ｉＮＫ数を規準化した。各ドナー条件についての２つ組のウェルの平均を計算値のために使用した。ＣＴＬによるｉＮＫ細胞の特異的溶解を次式によって決定した。
ここで、ｉＮＫｃは、所与のｉＮＫ：ＣＴＬ共培養条件における規準化ＣＴＶ＋事象カウントであり；ｉＮＫａは、対応する対照ｉＮＫのみの条件における規準化ＣＴＶ＋事象カウントである。アッセイ結果の有意性を決定するために、アッセイ値のスチューデントの対応のないｔ検定によってｐ値を決定した、ｎ＝３人の個別のドナー。
結果
親ｉＮＫ細胞の特異的殺滅は、親ｉＮＫ細胞と共培養された場合、ＣＴＬの６４～８４％の活性化に対応する８６～９８％で観察された。編集されたβ２ＭＫＯ ｉＮＫの間で、β２ＭＫＯ ｉＮＫ細胞と共培養されたＣＴＬの１～３％の活性化に対応する０．５～２１％の特異的殺滅が観察された。ｉＮＫ殺滅およびＣＴＬ活性化の両方は、β２ＭＫＯ ｉＮＫ細胞を標的として使用した場合に有意に低減した。
ｉＮＫ細胞を単独でまたはＣＴＬと共に５：１のＣＴＬ：ｉＮＫ比で、４８時間インキュベートし、次いで、生きたｉＮＫ細胞をフローサイトメトリーによって測定した（図１８Ａ）。親ｉＮＫは、８６～９８％の特異的溶解を示したのに対し、β２ＭＫＯ ｉＮＫは、０．５～２１％の特異的溶解を示した（図１８Ｂ）。
ＣＴＬを単独でまたはｉＮＫと共に５：１のＣＴＬ：ｉＮＫ比で、４８時間インキュベートし、次いで、ＣＤ２５発現によるＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化をフローサイトメトリーによって測定した（図１９Ａ）。ＣＴＬの６４～８４％が親野生型ｉＮＫによって活性化したのに対し、１～３％がβ２ＭＫＯ ｉＮＫによって活性化し、０．５～５％は、標的細胞が存在せずに活性化した（図１９Ｂ）。
[実施例１４]
β２Ｍ－／－／ＨＬＡ－Ｅ＋ｉＮＫ細胞のＰＢＭＣ媒介殺滅
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する同種細胞療法産物は、多くの疾患のためのオフザシェルフ治療として使用される潜在性を有するが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子における不適合性のせいで宿主による激しい免疫応答を生成するおそれがある。宿主ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を除去するための戦略は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に共通のサブユニットをコードし、ＭＨＣクラスＩの表面発現に必要なベータ－２ミクログロブリン（β２Ｍ）の欠失による（Krangel, et al. Cell. 1979 Dec;18(4):979-91；およびZijlstra, et al. Nature. 1989 Nov 23;342(6248):435-8）。
しかし、このアプローチの限界は、ＣＤ８による操作ｉＰＳＣ細胞産物の拒絶が打ち消され得るものの、これらのＭＨＣクラスＩ陰性細胞が、「ミッシングセルフ」のせいでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって溶解され得ることである（Bix, et al. Nature 349, 329-331 (1991)；Liao, et al. Science 253, 199-202 (1991)）。
宿主ＮＫ細胞による溶解を制限するためのアプローチは、ｉＰＳＣ由来細胞産物の表面でのＨＬＡ－Ｅの過剰発現による（Gornalusse, et al. Nat Biotechnol. 2017 Aug;35(8):765-772；Hoerster, et al. Front Immunol. 2021 Jan 29;11:586168）。ＨＬＡ－Ｅは、他のＨＬＡクラスＩ分子のシグナル配列に由来するペプチドを提示し、抑制性ＮＫ受容体複合体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと結合する最小限に多型のリガンドである（Braud, et al. Nature 349, 329-331 (1991)；Miller, et al. J Immunol. 2003 Aug 1;171(3):1369-75）。
ここで、β２Ｍ－／－であるように編集されているが、ＨＬＡ－Ｅを発現するｉＰＳＣ由来ＮＫ（ｉＮＫ）（例えば、治療用ｉＮＫ）を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と培養して、これらの細胞が、β２Ｍを欠如し、ＨＬＡ－Ｅを発現しないｉＮＫと比較して、ＰＢＭＣによる殺滅に対する感度が低いかどうかを決定する。
初代エフェクター細胞の単離および培養
同意した健康成人ドナーのバフィーコート（Ｂｌｏｏｄｗｏｒｋｓ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）からＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配をかけた遠心分離によって末梢単核血球（ＰＢＭＣ）を収集し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０中で凍結保存した。
同種逃避細胞傷害性アッセイ
ｉＮＫ細胞を２．５μＭ ＣＴＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者の説明書に従って標識し、標的として２．５×１０４個／ウェルの細胞を９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３つ組でプレート播種した。凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、２５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で３つ組のウェル／条件で添加し、培養物を５％ ＣＯ２、３７％ Ｃｏインキュベーター中で７２時間インキュベートした。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用するフローサイトメトリーによって死滅細胞を特定した。試料をＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアで分析した。
フローサイトメトリー
細胞あたりの結合抗体数（ＡＢＣ）の決定のために、１×１０５個のｉＮＫ細胞をマウスＩｇＧ１ ＰＥアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＨＬＡ－Ｅ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で暗条件のＲＴで１５分間標識し、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で洗浄し、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により暗条件のＲＴで１０分間固定した。ＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の単一チューブをＰＢＳ ５００ｍＬで製造業者のプロトコルにより復元した。同じ電圧および設定を使用して標識ｉＮＫ細胞およびＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ＰＥチューブをＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得し、すべての試料をＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアで分析した。ＰＥ対抗体の既知の比を使用することによって、細胞あたりのＰＥ分子数を細胞あたりの抗体数に変換することができる。ＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズをＦＳＣ－Ａ ｖｓ ＳＳＣ－Ａによりゲーティングした。続いてＰＥ蛍光をヒストグラムとして視覚化し、４つの別個のピークの各々についてゲート設定した。各ＰＥピークについて幾何平均蛍光をエクスポートし、ＡＢＣの計算のために使用した。
ＮＫ細胞の表現型決定のために、細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、１×ＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＰＢＳ中に製造業者のプロトコルに従って再懸濁した。抗体の添加前に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ受容体ブロッキング溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＦｃ受容体（ＦｃＲ）との非特異的結合を遮断した。ＣＤ３、ＣＤ５６およびＣＤ１６に対する抗体と共に細胞をＲＴで２０分間インキュベートし、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定する前に、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３回洗浄した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を収集し、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアですべてのＦＣＳファイルを分析した。
同種逃避細胞傷害性アッセイの分析のために、細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＰＢＳ中に製造業者のプロトコルに従って再懸濁した。抗体の添加前に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｆｃ受容体ブロッキング溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＦｃ受容体（ＦｃＲ）との非特異的結合を遮断した。ＣＤ５６およびＣＤ１６に対する抗体と共に細胞をＲＴで２０分間インキュベートし、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で固定する前に、細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３回洗浄した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を収集し、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１ソフトウェアですべてのＦＣＳファイルを分析した。
リンパ球を、前方散乱の面積（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱面積（ＳＳＣ－Ａ）に基づきゲーティングした。前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）ｖｓ前方散乱の高さ（ＦＳＣ－Ｈ）ゲートに基づきシングレットを除去した。ＣＴＶ＋ ｉＮＫ標的またはＣＴＶ－エフェクター細胞に関してゲート設定し、続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲについてポジティブに標識されたＣＴＶ＋ ｉＮＫ細胞に関してゲート設定した（図２０）。細胞からリンパ球をゲーティングし、続いてダブレットを排除し、続いてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）＋ｉＮＫをゲーティングし、最終的にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｎｅａｒ－ＩＲ＋をゲーティングして、死滅したｉＮＫ標的の％を決定した。ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積、ＳＳＣ－Ａ＝側方散乱面積、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱の高さ、ＣＴＶ＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＮＩＲ＝Ｎｅａｒ－ＩＲ。
分析
細胞あたりの結合抗体数（ＡＢＣ）を計算するために、以下の式を使用してＬｏｇ１０幾何平均－ＰＥに対してビーズあたりＬｏｇ１０ ＰＥ分子の直線回帰をプロットした：ｙ＝ｍｘ＋ｃ［式中、ｙはＬｏｇ１０蛍光に等しく、ｘは、ビーズあたりのＬｏｇ１０ ＰＥ分子数に等しい］。上記の式を使用すること、およびアイソタイプ対照バックグラウンド値を引いた後の各試料についての幾何平均蛍光値に基づきＡＢＣ値を補間することによって、各試料についての細胞あたりの結合抗体数を決定した。
各ｉＮＫ群についてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＮＩＲ＋ＣＴＶ＋標的に対する率の平均（死滅ｉＮＫ）を決定し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＮＩＲ＋ＣＴＶ＋ ＷＴ ｉＮＫ標的に対する率の平均で割ることにより、同種逃避アッセイについての細胞死を計算した。結果を「ＷＴ ｉＮＫと比べた細胞死」として表現する。
結果
００４株から編集されたｉＮＫ細胞に関して、フローサイトメトリーによってＨＬＡ－Ｅの発現を３．６２５の値のＡＢＣにより測定した。治療用ｉＮＫ細胞上のＨＬＡ－Ｅの発現は、ＨＬＡ－Ｅネガティブのβ２Ｍ ＫＯ ｉＮＫと比較してＰＢＭＣと共に培養された場合に細胞死の低減を観察するために十分であった。
ＨＬＡ－Ｅを発現している治療用ｉＮＫ細胞についてのＡＢＣ値は、幾何平均蛍光強度値を使用してＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅによって３，６２５と計算された（図２１；ＨＬＡ－Ｅ＝白ヒストグラム、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照＝灰色で塗りつぶしたヒストグラム）。
ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞上で発現される抑制性受容体であるヘテロ二量体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと結合する。ＣＤ９４はまた、ＮＫＧ２Ｃとペアを形成して活性化受容体を形成できるので、それはここでは評価されなかった。２人のドナーに対してＰＢＭＣ環境内のＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の頻度を測定した。凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、ＮＫ細胞マーカーを発現している細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋／－）について染色し、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の頻度を評価した。ドナー１において、ＮＫ細胞の６３．７％はＮＫＧ２Ａを発現したのに対し、ドナー２は４４．１％のＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞を含有した（図２２）。ＰＢＭＣ試料を生存リンパ球についてゲーティングし、続いてＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞（「ＮＫ細胞」）についてゲーティングした。次いで、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の頻度をＦＭＯに基づき決定した。
ドナーミスマッチのＰＢＭＣおよび編集されたｉＮＫ細胞を２５：１のＥ：Ｔ比で７２時間インキュベートし、ｉＮＫ細胞の生存率をフローサイトメトリーによって測定した。表面ＨＬＡを欠如するｉＮＫ細胞（ｂ２Ｍ ＫＯ、白棒線）は、ドナー１および２とのＰＢＭＣ共培養で、ＷＴと比べた細胞死（黒棒線）にそれぞれおよそ２．２５および１．５倍の増加を示した。ＨＬＡ－Ｅを発現する治療用ｉＮＫ細胞は、ＷＴ ｉＮＫのレベルまで細胞死を低減した（灰色棒線）（図２３および表７）。新鮮解凍されたＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下で治療用ｉＮＫと２５：１のＥ：Ｔ比で７２時間共培養し、方法に記載するように、編集されたｉＮＫの細胞死をＷＴと比べて決定した。各データ点は、３つ組のウェルの平均である。
Figure 2023553419000012
[実施例１５]
ｉＮＫ細胞の抗腫瘍有効性のＩｎ Ｖｉｖｏ評価
本研究の目的は、凍結保存されたｉＰＳＣ６１１ ＣＤ１９ｉＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。本研究の第２の目的は、凍結保存されたｉＰＳＣ６１１ ＣＤ１９ｉＮＫの単回投与７日残留を評価することである。
動物
本研究のために、雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）を使用した。試験開始時に、マウスは７～９週齢であり、出発体重は平均２３グラムであった。任意の実験手順を行う前に、動物を１週間順応させた。
オートクレーブをかけた水および照射された食物（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０、Ｌａｂ Ｄｉｅｔ）を自由に提供し、動物を１２時間の明暗サイクルで維持した。使用前にケージ、床敷、および給水ボトルをオートクレーブにかけ、それらを隔週交換した。実験動物の管理と使用に関する指針に従って実験を実行した。
腫瘍
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５μｇ／ｍＬ ピューロマイシン、および１０％（ｖ／ｖ） ＨＩ ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地中でＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ（ＡＬＬ）腫瘍細胞（Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＬ１５１）を維持した。各マウスは、合計体積０．２ｍＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中の１×１０５個のＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ細胞の投与を受けた。
有効性試験デザインおよび治療
腫瘍細胞の植込み日を試験０日目に指定した。ＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ腫瘍細胞を静脈内に植え込み、生物発光シグナル（範囲６４，１２０～１４１，４００ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ；平均＝９２，６４９±１９，９２５ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）によってマウスをＮ＝１０の治療群に無作為化した。
ｉ．ｖ．のＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ腫瘍細胞の植込み後１、８、および１５日目に、１０×１０６または１５×１０６個の凍結保存ｉＰＳＣ６１１治療用ｉＮＫ細胞を解凍し、体積０．２ｍＬの乳酸リンゲル／５％ ヒト血清アルブミン中に再懸濁したものを静脈内注射した（群２、３）。群１を未治療対照として残した（表８、有効性試験デザイン）。
Figure 2023553419000013
すべてのマウスは、１、２、４、７、８、１０、１２、１５、１７、１９、２１、２３、２５、および２８日目にマウス１匹あたり０．２ｍＬ中に１００，０００国際単位（ＩＵ）の用量で腹腔内組換えヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）２００－０２）の投与を受けた。簡潔には、凍結乾燥ｒｈＩＬ－２（１ｍｇ）を２０００ｇで１分間遠心分離し、１００ｍＭ酢酸 １ｍＬ中に再懸濁および可溶化し、次いで、ＰＢＳ中０．１％ ＢＳＡ ４ｍＬと混合した。使用まで１ｍＬのアリコートを－８０℃で凍結し、その時点でこのアリコートを環境温度で解凍し、５００，０００ＩＵ／ｍＬの終濃度のためにＰＢＳ ３ｍＬと混合した。
ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓ５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標））を使用する生物発光イメージングによって腫瘍量を評価した。簡潔には、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ルシフェリン（ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）ルシフェリン、Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））をｉ．ｐ．注射し、酸素中２．５～３．５％気化イソフルランにより麻酔し、ルシフェリン注射の２０分後に腹側および背側自動撮影でイメージングした。腹側および背側イメージの平均輝度を加算することによって総全身生物発光を計算する。
動物の体重および生物発光を週２回モニタリングした。臨床徴候について動物を毎日モニタリングした。瀕死の状態の場合または連続する３回の測定で動物が本来の体重の≧２０％を失った場合、個別の動物を試験から排除し、人道的に安楽死させた。
場合によっては、支持栄養および水分補給を提供して、試験でのマウスの健全を保証した。治療日（１、８、および１５日目）にすべてのマウスにＨｙｄｒｏＧｅｌ（登録商標）を自由に提供した。
残留試験
ｉＰＳＣ６１１細胞の単回用量残留を評価するための組織試料採取用のサテライト動物のさらなるコホートを指定した。０日目に１０匹の雌性ＮＳＧマウスに前記のようにＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ細胞を静脈内に植え込んだ。１日目に、マウスは、１５×１０６個の低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１細胞の単回静脈内注射を受けた（群３）。群１は、未治療対照のままであった（表９、残留試験デザイン）。すべての動物は、１、３、５、および７日目に前記のように調薬した組換えヒトＩＬ－２の投与を受けた。
Figure 2023553419000014
８日目に、試験された全マウスおよびナイーブ年齢マッチマウス１匹を人道的に安楽死させ、試料を採取した。心穿刺によりリチウムヘパリンコーティングチューブ（ＢＤ ３６５９６５）内に全血を収集した。右心室経由で肺にＰＢＳをｉｎ ｓｉｔｕでフラッシュし、トリミングし、処理まで氷水上の１×緩衝液Ｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、１３０－０９５－９２７）２．４ｍＬ中に入れた。頸部リンパ節を回収し、処理まで氷水上の１×緩衝液Ｓ ２．４ｍＬに入れた。
ＰＢＳ １．５ｍＬが入った９６ウェル２ｍＬ深型ウェルプレートに移すことによって血液を処理した。プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清をデカンテーションした。細胞ペレットをＡＣＫ溶解溶液７５０μＬ中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートし、その時点でＰＢＳ ７５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清をデカンテーションした。ＡＣＫの溶解を上記のように２回繰り返した。ＡＣＫ溶解の完了後、結果として生じた細胞ペレットをＰＢＳ １５０μｌ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ染色および分析のために９６ウェルＵ底プレートに移した。
Figure 2023553419000015
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ肺解離キットを使用して組織を処理した。簡潔には、２０×緩衝液Ｓ １ｍＬを無菌水１９ｍＬと混合することによって１×緩衝液Ｓを調製した。溶解するまで１分ごとに優しく倒立させることを用いて１×緩衝液Ｓ ３ｍＬで酵素Ｄを復元した。溶解するまで１分ごとに優しく倒立させることにより１×緩衝液Ｓ １ｍＬで酵素Ａを復元した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ内の１×緩衝液Ｓ中に組織を個別に収集した。処理の直前に、酵素Ｄ １００μＬおよび酵素Ａ １５μＬを各チューブに添加した。プログラム「ｍ＿ｌｕｎｇ＿０１．」のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒにチューブを置いた。次いでチューブをＭＡＣＳｍｉｘ Ｔｕｂｅ Ｒｏｔａｔｏｒ上で３７℃のインキュベーションに３０分間置き、続いて、プログラム「ｍ＿ｌｕｎｇ＿０２．」のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用してさらに機械的に解離させた。次いで、５０ｍＬチューブ上に置いたＭＡＣＳ ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒ（７０μｍ）を通して試料を濾過し、ＰＢＳ １０ｍＬで洗浄した。懸濁物を３００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引し、プレート培養、染色、およびＦＡＣＳ分析のために細胞ペレットを１０×１０６個／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁した。
血液、肺および頸部リンパ節からの細胞懸濁物を９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ ｆａｌｃｏｎ ３５３０７７）中におよそ細胞１ｅ６個／ウェルでプレート培養した。すべての洗浄ステップを３００×Ｇで３分間の遠心分離によって実行し、上清をシンクに振り落とした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１：１０００希釈（ＰＢＳ中）したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）５０μｌにより、室温（ＲＴ）で１５分間染色した。Ｆｃ受容体遮断薬（Ｉｎｎｏｖｅｘ ＮＢ３０９）５０μｌを各ウェルに添加し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液ＢＳＡ（ＢＤ）中で２回洗浄した。ＣＤ４５およびＣＤ５６に対するｍＡｂをＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液で１：２０希釈することによって染色カクテルを作った。染色カクテル５０μｌで細胞を染色し、遮光しながら４Ｃで３０分間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液を使用して細胞を２回洗浄し、ＢＤ安定化固定液１００μｌ中で固定した。ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３ Ｌｉｔｅを用いて同じ電圧ですべての試料を流し、すべての事象を収集した。ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２を使用してフローサイトメトリーのデータを分析した。
ＣＤ４５＋およびＣＤ５６＋の生きたシングレットとしてｉＮＫ細胞を定義し、１００Ｋ個の生存リンパ球あたりのｉＮＫ細胞数として表現する。ｉＮＫ治療を受けなかった対照群の最大＋１標準偏差（ＳＤ）として検出下限（ＬＬＯＤ）を定義した。ＬＬＯＤを上回る試料をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにプロットした。
分析
式を使用して、体重を平均群体重における変化率としてグラフ表示する：
式中、「Ｗ」は、特定日の治療群の平均体重を表し、「Ｗ０」は、治療開始時の同じ治療群の平均体重を表す。
腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、％ＴＧＩ＝（１－Ｔ／Ｃ）１００として計算される、治療群および対照群の全身平均輝度間の差として定義される。式中、Ｔは、治療群の平均輝度であり、Ｃは、対照群の平均輝度である。
生存率の評価のために、結果を腫瘍植込み後の日数に対する生存パーセンテージとしてプロットする。過剰な腫瘍量（乱れた／もじゃもじゃの被毛、猫背の姿勢、不活発、または後肢脱力など）を示す有害臨床徴候を死亡の代理終点として使用する。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存分析を利用して生存期間の中央値を決定する。
延命率（ＩＬＳ）を％ＩＬＳ＝ＳＴ／ＳＣとして計算する［式中、ＳＴは、治療群の生存日数中央値であり、ＳＣは、対照群の生存日数中央値である］。治療または腫瘍量に無関係の有害臨床徴候または死亡のせいで代理終点に到達しなかった動物は、生存期間評価のために打ち切った。
腫瘍の生物発光データ、体重、生存期間、および残留をグラフ表示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．０．１）を利用して統計解析した。通常の二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＴｕｋｅｙ多重比較を９５％信頼区間と共に使用して、腫瘍生物発光についての統計的有意性を評価した。確率値（ｐ）が≦０．０５であった場合に、群間の差を有意と見なした。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定をＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定と共に使用して生存確率についての統計的有意性を評価した。通常の二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＴｕｋｅｙ多重比較を９５％信頼区間と共に使用して、残留についての統計的有意性を評価した。確率値が≦０．０５であった場合に、群間の差を有意と見なした。
結果
低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１細胞は、体重および臨床所見によって決定された場合に忍容性良好であった。ｉＰＳＣ６１１は、両方の用量レベルで有意な抗腫瘍有効性を実証した。ｉＰＳＣ６１１細胞で治療されたマウスでは高い延命が観察された。低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１は、注射の１週間後に限られたｉｎ ｖｉｖｏ残留を有した。
ｉＰＳＣ６１１細胞で治療されたＮＡＬＭ６－Ｆｌｕｃ－Ｐｕｒｏ担腫瘍マウスまたは腫瘍のみ対照の群平均体重変化を図２４にグラフ表示する（未治療マウス（●）、または１０×１０６個（▽）および１５×１０６個（◆）のｉＰＳＣ６１１（低温貯蔵）細胞で静脈内治療されたマウスの平均体重変化率）。治療群の≧５０％が存在する平均をプロットする。矢印は、投薬日を示す。ｉＰＳＣ６１１細胞の投与を受けているいかなる群にも、腫瘍のみ対照にも、有意な体重減少（治療開始から＞１０％の減少）は観察されなかった。
統計的に有意な抗腫瘍活性が、１０×１０６個および１５×１０６個のｉＰＳＣ６１１低温貯蔵細胞で観察された（表１１）。腫瘍増殖を図２５に示す（未治療マウス（●）、ならびに１０×１０６個（▽）および１５×１０６個（◆）のｉＰＳＣ６１１（低温貯蔵）細胞で週に１回、３回にわたり静脈内治療されたマウスの平均全身平均輝度）。未治療対照群が残り、％ＴＧＩが計算された時点である最終イメージング時点の２１日目まで群をプロットする。矢印は投薬日を表す。
Figure 2023553419000016
すべての治療群について延命率（％ＩＬＳ）を計算した。１０×１０６個および１５×１０６個の低温貯蔵細胞のｉＰＳＣ６１１の投与を受けている群について腫瘍のみ対照よりも高い生存率が観察された（表１２、図２６）。
Figure 2023553419000017
ＮＡＬＭ６担腫瘍マウスへのｉＮＫの注射の１週間後の血液および組織中の新鮮および低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１の残留を評価した。生存細胞の低い回収率が頸部リンパ節試料について観察された。したがって、これらを分析しなかった。
肺および血液のＦＡＣＳ分析は、低温貯蔵ｉＰＳＣ６１１の限られた残留を示した（図２７）。マウスを未治療のままとするか、または１５×１０６個のｉＰＳＣ６１１低温貯蔵細胞の単回静脈内用量の投与を受けさせた。注射の１週間後に、ＦＡＣＳ分析のために肺および血液を回収した。１００，０００個のリンパ球あたりのｉＮＫの数を個別のマウスについてプロットし（ｏ）、群あたりの平均を棒線によって表す。注射の１週間後に、ｉＰＳＣ６１１を注射されたマウス５匹中２匹の肺および血液中にｉＮＫが検出された。
[実施例１６]
ｉＮＫ細胞の除去のＩｎ Ｖｉｖｏ評価
本研究の目的は、アービタックス（セツキシマブ）を使用する凍結保存ｉＰＳＣ６１１ ＣＤ１９ｉＮＫ細胞のｖｉｖｏ除去を評価することである。
動物
この研究のために、雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）を使用した。研究開始時に、マウスは１０～１２週齢であり、出発体重は平均２４．３グラムであった。任意の実験手順を行う前に、動物を１週間馴らした。
オートクレーブをかけた水および照射された食物（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０、Ｌａｂ Ｄｉｅｔ）を自由に提供し、動物を１２時間の明暗サイクルで維持した。使用前にケージ、床敷、および給水ボトルをオートクレーブにかけ、それらを隔週交換した。実験動物の管理と使用に関する指針に従って実験を実行した。
試験デザインおよび治療
体重によりマウスをＮ＝５の群に無作為化した（範囲２３．１～２５．７グラム；平均＝２４．３±０．８５グラム）（表１３、試験デザイン）。
ｉＰＳＣ６１１細胞の植込み日を試験１日目に指定した。１日目に、解凍し、体積０．２ｍＬの乳酸リンゲル／５％ ヒト血清アルブミン中に再懸濁した１５×１０６個の凍結保存ｉＰＳＣ６１１細胞をマウスに静脈内注射した（群２、３）。群１は、未治療対照として残した。
群１、２、および３のすべてのマウスは、１および３日目に、０．２ｍＬ中に１００，０００国際単位（ＩＵ）／マウスの用量で組換えヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）２００－０２）の腹腔内投与を受けた。簡潔には、凍結乾燥ｒｈＩＬ－２（１ｍｇ）を２０００ｇで１分間遠心分離し、１００ｍＭ酢酸 １ｍＬ中に再懸濁および可溶化し、次いでＰＢＳ中０．１％のＢＳＡ ４ｍＬと混合した。使用まで１ｍＬのアリコートを－８０℃で凍結し、その時点でこのアリコートを環境温度で解凍し、５００，０００ＩＵ／ｍＬの終濃度のためにＰＢＳ ３ｍＬと混合した。
２および３日目に、マウスに腹腔内抗体療法を受けさせた。群２に２０ｍＬ／ｋｇ ＰＢＳをＩＰ投薬した。群３に４０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブを体積２０ｍＬ／ｋｇでＩＰ投薬した。
動物の体重を毎日記録した。臨床徴候について動物を毎日モニタリングした。
Figure 2023553419000018
試料採取
５日目に、試験されたすべてのマウスを人道的に安楽死させ、試料を採取した。心穿刺によりリチウムヘパリンコーティングチューブ（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ３６５９６５）内に血液を収集した。右心室経由で肺にＰＢＳをｉｎ ｓｉｔｕでフラッシュし、トリミングし、処理まで氷水上のＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に入れた。
以下のプロトコルに従って２ラウンドのＡＣＫ溶解により血液を処理した。血液を２ｍｌ深型ウェルプレートに移し、チューブをＰＢＳ １ｍｌですすいだ。深型ウェルを３００×Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、各ウェルにＡＣＫ １ｍＬを添加した。プレートを２分間インキュベートし、次いでＰＢＳ １ｍＬを添加して浸透圧溶解を停止させた。プレートを３００×Ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した。必要に応じてＡＣＫ溶解をさらに１～２回繰り返した。ＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液２００μＬ中に試料を再懸濁し、染色のために９６ウェルＵ底プレートに移した。
機械的解離および温和な酵素消化を使用して肺を単一細胞懸濁物になるまで処理した。簡潔には、培地の入っていない皿に肺組織を移し、カミソリの刃またはメスを使用して均一なペーストになるまで細切した（大きさ＜１ｍｍ）。細切された組織を、１０％コラーゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、１５％ ＤＮアーゼＩ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、および７５％ ＲＰＭＩ １６４０培地を含有する消化用培地２ｍＬに移し、振盪プラットフォーム上にて３７℃で２０分間インキュベートした。シリンジプランジャーのゴム端を使用して組織を５０ｍＬ尖形チューブ上の７０μｍナイロンメッシュストレーナーに通して、細胞懸濁物を得た。懸濁物を、５０ｍＬ尖形チューブ上の新しい７０μｍナイロンメッシュストレーナーに通して濾過し、ＲＰＭＩ １０ｍＬですすいだ。細胞懸濁物１５ｍＬ尖形チューブに移し、５００×Ｇで１０分間、ブレーキを低にして室温で遠心分離した。上清を取り出し、捨てた。細胞をＰＢＳ １０ｍＬ中に再懸濁し、カウントし、１０×１０６個／ｍＬに調整し、プレート培養、染色、およびＦＡＣＳ分析の前に１回のＡＣＫ溶解ステップを受けさせた。
Figure 2023553419000019
肺からの細胞懸濁物を、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ ｆａｌｃｏｎ ３５３０７７）中に細胞およそ１ｅ６個／ウェルでプレート培養した。すべての洗浄ステップを３００×Ｇで３分間で遠心分離することおよび上清をシンクに振り落とすことによって実行した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１：１０００希釈（ＰＢＳ中）したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）５０μｌを用いて室温（ＲＴ）で１５分間染色した。Ｆｃ受容体遮断薬（Ｉｎｎｏｖｅｘ ＮＢ３０９）５０μｌを各ウェルに添加し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液ＢＳＡ（ＢＤ）中で２回洗浄した。ＣＤ４５およびＣＤ５６に対するｍＡｂをＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液で１：２０希釈することによって染色カクテルを作った。染色カクテル５０μｌで細胞を染色し、遮光しながら４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液を使用して細胞を２回洗浄し、ＢＤ安定化固定剤１００μｌ中で固定した。ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３ Ｌｉｔｅを用いて同じ電圧ですべての試料を流し、すべての事象を収集した。ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２を使用してフローサイトメトリーのデータを分析した。
ＣＤ４５＋およびＣＤ５６＋であった生存シングレットとしてｉＮＫ細胞を定義し、１００Ｋ個の生存リンパ球あたりのｉＮＫ細胞数として表現した。ｉＮＫ治療を受けなかった対照群の最大＋１標準偏差（ＳＤ）として検出下限（ＬＬＯＤ）を定義した。ＬＬＯＤを上回る試料をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにプロットした。
分析
式を使用して、体重を平均群体重における変化率としてグラフ表示する：
式中、「Ｗ」は、特定日の治療群の平均体重を表し、「Ｗ０」は、治療開始時の同じ治療群の平均体重を表す。
体重および残留をグラフ表示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．０．１）を利用して統計解析した。Ｗｅｌｃｈ補正を行う対応のない片側ｔ検定を９５％信頼区間と共に使用して、除去についての統計的有意性を評価した。確率値が≦０．０５であった場合に群間差を有意と見なした。
結果
セツキシマブ治療を受けたマウスの肺および血液中でｉＰＳＣ６１１細胞は有意に低減した。マウスの群平均体重変化を図２８にグラフ表示する（ＰＢＳ（●）、または４０ｍｇ／ｋｇセツキシマブ（□）のＩＰ投与を受け、１５×１０６個のｉＰＳＣ６１１で静脈内治療されたマウスの平均体重変化率）。ｉＰＳＣ６１１細胞および抗体の投与を受けているいずれの群においても有意な体重減少（治療開始から＞１０％の減少）は観察されなかった。
ＮＳＧマウスにｉＰＳＣ６１１を注射した４日後に血液および肺におけるｉＮＫの存在を評価した。肺のＦＡＣＳ分析によって、ＰＢＳ治療マウスと比べてセツキシマブの投与を受けたマウスの肺内のｉＮＫ数に有意な９６％の低減が示された（ｐ＝０．０００２）。図２９に示すように、血液のＦＡＣＳ分析によって、ＰＢＳ治療マウスと比べてセツキシマブの投与を受けたマウスの血液中のｉＮＫ数に有意な９５％の低減が示された（ｐ＝０．０３２１）。
上記の実施形態の広い発明概念から逸脱せずにそれを変更できることが当業者によって認識されている。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないと理解され、本明細書によって定義されるような本発明の精神および範囲内に改変を包含することが意図される。

Claims (101)

  1. （ｉ）ＣＤ１９抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、前記不活性化細胞表面受容体と前記ＩＬ－１５とが自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減
    を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはその派生細胞。
  2. ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  3. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、前記細胞の染色体上の１つまたは複数の座位に組み込まれており、前記１つまたは複数の座位が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａまたはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択され、但し、前記外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の座位に組み込まれており、それにより前記遺伝子の欠失または発現低減をもたらす、請求項１または２に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  4. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の前記座位に組み込まれている、請求項１または２に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  5. Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  6. 全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からリプログラミングされている、請求項１～５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  7. リプログラミングされたＴ細胞に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞。
  8. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）シグナルペプチド；
    （ｉｉ）前記ＣＤ１９抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）ヒンジ領域；
    （ｉｖ）膜貫通ドメイン；
    （ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）共刺激ドメイン
    を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  9. 前記シグナルペプチドが、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドを含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  10. 前記細胞外ドメインが、前記ＣＤ１９抗原と特異的に結合する抗体に由来するｓｃＦｖを含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  11. 前記ヒンジ領域がＣＤ２８ヒンジ領域を含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  12. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  13. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  14. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  15. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記シグナルペプチド；
    （ｉｉ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記ヒンジ領域；
    （ｉｖ）配列番号２４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記膜貫通ドメイン；
    （ｖ）配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記共刺激ドメイン
    を含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  16. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む前記シグナルペプチド；
    （ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む前記細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む前記ヒンジ領域；
    （ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む前記膜貫通ドメイン；
    （ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む前記細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む前記共刺激ドメイン
    を含む、請求項８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  17. 前記不活性化細胞表面タンパク質が、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  18. 前記不活性化細胞表面タンパク質が切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントである、請求項１７に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  19. 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  20. 前記Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  21. 前記ｔＥＧＦＲバリアントが、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  22. 前記ＩＬ－１５が、配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  23. 前記自己プロテアーゼペプチドが、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  24. 前記ＨＬＡ－Ｅが、配列番号６６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または前記ＨＬＡ－Ｇが、配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～２３のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  25. （ｉ）前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；
    （ｉｉ）前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；かつ
    （ｉｉｉ）前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、
    請求項１～２４のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  26. （ｉ）前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれており；
    （ｉｉ）前記第２の外因性ポリペプチドが、ＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれており；かつ
    （ｉｉｉ）前記第３の外因性ポリペプチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており；
    前記外因性ポリヌクレオチドの組込みが、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減し、好ましくは、前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み、前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み、前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む、
    請求項１～２５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  27. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の派生細胞。
  28. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２７に記載の派生細胞。
  29. （ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）任意選択で、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド
    を含み、
    前記第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それにより、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞。
  30. （ｉ）前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み；
    （ｉｉ）前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；かつ
    （ｉｉｉ）前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含み、
    前記第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドが、それぞれＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれている、
    請求項２９に記載のｉＰＳＣ、ＮＫ細胞またはＴ細胞。
  31. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
  32. ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害薬、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血球、対象となる１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含む、またはそれと組み合わせて使用される、請求項３１に記載の組成物。
  33. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項１～３０のいずれか一項に記載の細胞または請求項３１および３２のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む方法。
  34. 前記がんが非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の派生細胞を製造する方法であって、前記ｉＰＳＣ細胞を細胞分化のための条件下で分化させて、それにより前記派生細胞を得ることを含む方法。
  36. 前記ｉＰＳＣが、未改変ｉＰＳＣをゲノム操作することによって得られ、前記ゲノム操作することが標的化編集を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記標的化編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって実行される欠失、挿入、またはイン／デルを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をＮＫ細胞に分化させる方法であって、分化プロトコル下において培養の最終２４時間に組換えヒトＩＬ－１２を含有する培地中で前記ｉＰＳＣを培養することを含めて、前記分化プロトコルに前記ｉＰＳＣを供することを含む方法。
  39. 前記組換えＩＬ－１２が、ＩＬ１２ｐ７０を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. （ｉ）ＣＤ１９抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、前記不活性化細胞表面受容体と前記ＩＬ－１とが、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減
    を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）。
  41. ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４０に記載のＣＤ３４＋ ＨＰＣ。
  42. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、前記細胞の染色体上の１つまたは複数の座位に組み込まれており、前記１つまたは複数の座位が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａまたはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択され、但し、前記外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の座位に組み込まれており、それにより前記遺伝子の欠失または発現低減をもたらす、請求項４０または４１に記載のＣＤ３４＋ ＨＰＣ。
  43. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の前記座位に組み込まれている、請求項４２に記載のＣＤ３４＋ ＨＰＣ。
  44. Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する、請求項４０～４３のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋ ＨＰＣ。
  45. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）シグナルペプチド；
    （ｉｉ）前記ＣＤ１９抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）ヒンジ領域；
    （ｉｖ）膜貫通ドメイン；
    （ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインなどの共刺激ドメイン
    を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋ ＨＰＣ。
  46. モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体と、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）またはインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインとをコードするポリヌクレオチドであって、前記モノクローナル抗体特異的エピトープと前記サイトカインとが、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
  47. 前記不活性化細胞表面受容体が、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープを含む、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記不活性化細胞表面受容体が、切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む、請求項４６～４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記ｔＥＧＦＲバリアントが、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  51. 配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１５を含有する、請求項４６～５０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記自己プロテアーゼペプチドが、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６～５１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記ｔＥＧＦＲバリアントが、配列番号７１のアミノ酸配列からなる、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記ＩＬ－１５が、配列番号７２のアミノ酸配列からなる、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記自己プロテアーゼペプチドが、配列番号７３のアミノ酸配列からなる、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
  56. 配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチドからなる、請求項４６～５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  57. セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、パニツムマブ、ポラツズマブ ベドチン、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む不活性化細胞表面受容体と、ＩＬ－１５とをコードするポリヌクレオチドであって、前記エピトープおよびサイトカインが、Ｐ２Ａ配列によって作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
  58. 前記不活性化細胞表面受容体が、配列番号７４、７９、８１、および８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. 請求項４６～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
  60. 請求項４６～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはその派生細胞。
  61. 請求項４６～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  62. （ｉ）プロモーター；
    （ｉｉ）ターミネーターおよび／またはポリアデニル化シグナル配列；
    （ｉｉｉ）左側相同配列；ならびに
    （ｉｖ）右側相同配列
    をさらに含む、請求項６１に記載のベクター。
  63. 前記左側相同配列が、配列番号８４のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のベクター。
  64. 前記右側相同配列が、配列番号８５のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項６２または６３に記載のベクター。
  65. 配列番号８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項６１～６４のいずれか一項に記載のベクター。
  66. （ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体と、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、前記不活性化細胞表面受容体と前記ＩＬ－１５とが、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減
    を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはその派生細胞。
  67. ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６６に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  68. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、前記細胞の染色体上の１つまたは複数の座位に組み込まれており、前記１つまたは複数の座位が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌ ｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａまたはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択され、但し、前記外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の座位に組み込まれており、それにより前記遺伝子の欠失または発現低減をもたらす、請求項６６または６７に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  69. 前記外因性ポリヌクレオチドのうち１つまたは複数が、前記ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の前記座位に組み込まれている、請求項６６または６７に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  70. Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  71. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）シグナルペプチド、
    （ｉｉ）抗原と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
    （ｉｉｉ）ヒンジ領域、
    （ｉｖ）膜貫通ドメイン、
    （ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン、および
    （ｖｉ）共刺激ドメイン
    を含む、請求項６６～７０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  72. 前記シグナルペプチドが、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドを含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  73. 前記細胞外ドメインが、前記抗原と特異的に結合するＶＨＨドメインを含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  74. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ２８ヒンジ領域を含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  75. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  76. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  77. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  78. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記シグナルペプチド；
    （ｉｉ）配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記ヒンジ領域；
    （ｉｉｉ）配列番号２４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記膜貫通ドメイン；
    （ｉｖ）配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記共刺激ドメイン
    を含む、請求項７１または７３に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  79. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む前記シグナルペプチド；
    （ｉｉ）前記抗原と特異的に結合するｓｃＦＶまたはＶＨＨドメインを含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む前記ヒンジ領域；
    （ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む前記膜貫通ドメイン；
    （ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む前記細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む前記共刺激ドメイン
    を含む、請求項７１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  80. 前記不活性化細胞表面タンパク質が、イブリツモマブ チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される、請求項６６～７９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  81. 前記不活性化細胞表面タンパク質が、切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  82. 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドを含む、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  83. 前記Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減を有する、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  84. 前記ｔＥＧＦＲバリアントが、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項８１に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  85. 前記ＩＬ－１５が、配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  86. 前記自己プロテアーゼペプチドが、配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６～８５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  87. 前記ＨＬＡ－Ｅが、配列番号６６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または前記ＨＬＡ－Ｇが、配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  88. （ｉ）前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；かつ
    （ｉｉ）前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、
    請求項６７～８７のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  89. （ｉ）前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１遺伝子の座位に組み込まれており；
    （ｉｉ）前記第２の外因性ポリペプチドが、ＣＩＩＴＡ遺伝子の座位に組み込まれており；かつ
    （ｉｉｉ）前記第３の外因性ポリペプチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており；
    ここで、前記外因性ポリヌクレオチドの組込みが、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減し、好ましくは、前記第１の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含み、前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み、かつ前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む、
    請求項６６～８８のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたは派生細胞。
  90. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞である、請求項６６～８９のいずれか一項に記載の派生細胞。
  91. （ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する切断型上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアント、配列番号７３のアミノ酸配列を有する自己プロテアーゼペプチド、および配列番号７２のアミノ酸配列を有するインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）任意選択で、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド
    を含み、
    前記第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれており、それによりＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるまたはその発現を低減する、
    ｉＰＳＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞。
  92. （ｉ）前記第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含み；かつ
    （ｉｉ）前記第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含み、
    前記第１、第２および第３の外因性ポリヌクレオチドが、それぞれＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の座位に組み込まれている、
    請求項９１に記載のｉＰＳＣ、ＮＫ細胞またはＴ細胞。
  93. 請求項６６～９２のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
  94. ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害薬、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血球、対象となる１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含む、またはそれと組み合わせて使用される、請求項９３に記載の組成物。
  95. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項６６～９２のいずれか一項に記載の細胞または請求項９３および９４のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む方法。
  96. 前記がんが非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項９５に記載の方法。
  97. 請求項６６～９０のいずれか一項に記載の派生細胞を製造する方法であって、前記ｉＰＳＣを細胞分化のための条件下で分化させて、それにより前記派生細胞を得ることを含む方法。
  98. 前記ｉＰＳＣが、未改変ｉＰＳＣをゲノム操作することによって得られ、前記ゲノム操作することが、標的化編集を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記標的化編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって実行される欠失、挿入、またはイン／デルを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 請求項６６～９０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ細胞をＮＫ細胞に分化させる方法であって、分化プロトコル下において培養の最終２４時間に組換えヒトＩＬ－１２ｐ７０を含む培地中で前記ｉＰＳＣ細胞を培養することを含めて、前記分化プロトコルに前記ｉＰＳＣ細胞を供することを含む方法。
  101. （ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド
    （ｉｉ）モノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体とインターロイキン１５（ＩＬ－１５）とをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、前記不活性化細胞表面受容体と前記ＩＬ－１５とが、自己プロテアーゼペプチドによって作動可能に連結されている、第２の外因性ポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうち１つまたは複数の欠失または発現低減
    を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）。
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