CN112041431A - 产生t细胞谱系细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。在一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞或成熟T细胞。还提供了组合物、试剂盒及其用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2018年2月14日提交的美国临时申请No.62/630,497的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于产生T细胞谱系细胞的方法、组合物和试剂盒及其用途。具体地，本申请涉及用于产生祖细胞和成熟T细胞的方法、组合物和试剂盒及其用途。
背景技术
T细胞是适应性免疫的关键介质，并且可以被用作针对病原体和癌症免疫疗法的治疗剂。造血干细胞移植(HSCT)为广泛的恶性和非恶性病症提供了有效的治疗方法，但治疗前所需的预处理方案会导致T细胞恢复的延时(Krenger等，2011)。与在骨髓(BM)中发育的大多数其他造血谱系相反，T细胞发育需要源自BM的祖细胞迁移到胸腺，其中进入的淋巴细胞祖细胞接收关键信号以诱导其分化为T谱系细胞(Shah和Zuniga-Pflucker，2014)。
通过胸腺基质细胞递送至进入的淋巴细胞祖细胞的关键信号由Notch配体Delta-样-4介导，Notch配体Delta-样-4由皮质胸腺上皮细胞表达(Thompson和Zuniga-Pflucker,2011)。淋巴细胞祖细胞表达的Notch受体需要由载有Delta-样-4的细胞诱导的机械拉力以有效诱导Notch受体的激活(D'Souza等，2010；Gordon等，2015；Meloty-Kapella等，2012)。另外，T细胞发育已证实需要恒定且高水平的Notch受体激活(Schmitt等，2004)。在没有Notch1受体信号或Delta-样-4所诱导信号的情况下，在胸腺中T细胞的发育不会发生，取而代之的是其他淋巴细胞谱系如B细胞的发育。因此，胸腺内T细胞的发育基于Notch信号通路(Zuniga-Pflucker，2004)。
在HSCT的情形下，处理和老化分别导致的胸腺功能障碍或萎缩，加之移植的HSC能力有限，使得淋巴细胞抑制胸腺中T细胞的发育程度(Porter和June，2005)。这导致免疫监测不足，使患者易于感染和/或复发癌症，并且仍然是严重的临床挑战。
T细胞祖细胞(proT)的过继转移已成为一种有前途的策略，用以增强T细胞的重建，因为人或小鼠的proT细胞已经证实可定植入(engraft)免疫缺陷小鼠的胸腺，尽管它们源自异种或同种异体(Awong等，2009；Awong等，2013；Zakrzewski等，2006；Zakrzewski等，2008)。ProT细胞发育不成熟，并在宿主胸腺中经历阳性和阴性选择。因此，它们受限于受体的主要组织相容性复合体(MHC)产生的宿主耐受的T细胞，所述宿主耐受的T细胞可绕开与移植物抗宿主病(GVHD)相关的临床挑战。重要的是，proT细胞的定植(engraftment)可恢复胸腺的架构，并改善后续源自HSC的祖细胞在胸腺中的植入。除了其固有的再生医学特性外，proT细胞还可以用T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造，从而赋予对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性以治疗癌症，还可以用合成基因线路进行工程化改造以构建定制化的响应程序。
该领域中尚未解决的挑战是开发易于从不同来源的人造血干/祖细胞(HSPC)规模化产生大量proT细胞的临床相关系统。先前的方法依赖于鼠源的OP9细胞，该OP9细胞表达Notch配体Delta-样-1(DL1)或Delta-样-4(DL4)，然而，这种方法对临床转化提出了一些挑战(Awong等，2009；Awong等，2013)。大多数用于无基质细胞方法的策略都依赖于二维(2D)组织培养平台，从而将Notch配体、DL1或DL4固定在组织培养板上(Gehre等，2015；Reimann等，2012；Simons等，2017)。其他粘附受体配体，如血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，也属于这种形式(Shukla等，2017)。使用这些策略产生的人proT细胞已经显示可成功地重建免疫缺陷小鼠的胸腺。尽管该进展是令人鼓舞的，但使用这些方法产生proT细胞用于治疗，受限于临床生产对规模化的需求，并且其并非常规产生临床可用的大规模细胞数量的方法。理想状况下，真正可规模化的平台应允许proT细胞在封闭的自动化生物反应器系统中生长(Lipsitz等，2016)。
发明概述
本发明人开发了一种无细胞的基于珠子的系统，用于从小鼠或人的造血干/祖细胞(HSPC)和诱导性多能干细胞(iPSC)产生T细胞谱系细胞。不与板结合的Notch配体的悬液(例如DL4-μbead)可有效产生T谱系细胞，所述T谱系细胞包括T细胞祖细胞和成熟T细胞。
因此，本公开提供了产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，以及(b)分离T细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，所述悬浮支持物是颗粒。
在另一个实施方案中，所述悬浮支持物是微珠。
在一个实施方案中，所述具有Notch配体的干细胞或祖细胞为悬浮培养。
在另一个实施方案中，所述干细胞选自：造血干细胞/祖细胞(HSPC)、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一个实施方案中，所述干细胞是人干细胞，任选地为CD34+或CD34+CD38-/loHSPC。
在另一个实施方案中，所述干细胞是CD34+造血前体细胞，任选地为从iPSC分化而来的CD34+造血前体细胞。
在另一个实施方案中，所述Notch配体是DL1或DL4。
在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞(proT)。
在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是人类细胞，且所述proT细胞具有CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-表型。
在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是小鼠细胞，任选地为谱系-CD117+Sca-1+小鼠细胞，且所述proT细胞具有CD25+或CD25+CD90+表型。
在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞培养于无基质细胞的培养基。
在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞与至少一种T细胞共刺激分子一起培养，所述T细胞共刺激分子结合至悬浮支持物，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子是VCAM1。
本公开还提供了T细胞谱系细胞，其中所述细胞由以下方法产生，所述方法包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，以及(b)分离T细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是T细胞祖细胞、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
本公开还提供了一种悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物(任选地为微珠)，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物。
在一个实施方案中，所述悬浮支持物是微珠，并且(i)所述微珠直径为6.5-100μm，任选地为20-30μm，和/或(ii)所述Notch配体的C-末端区域缀合至所述微珠。
本公开还提供了所述悬浮Notch配体用于产生T细胞谱系细胞的用途。
本公开还提供了试剂盒，包含：(i)悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物；以及(ii)所述悬浮Notch配体用于产生T细胞谱系细胞的用途说明书。
本公开进一步提供了试剂盒，包含：(i)悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物；以及(ii)培养基。
在试剂盒的一个实施方案中，所述悬浮Notch配体包含缀合至微珠的DL4。
在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含(iii)结合至悬浮支持物的至少一种T细胞共刺激分子，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子为VCAM1。
本公开还提供了治疗患有需要增加T细胞数量的病况的受试者的方法，其包括：
(i)产生T细胞谱系细胞，包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，和(b)分离T细胞谱系细胞；以及
(ii)对受试者施用有效量的T细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞。
在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是成熟的T细胞。
在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
本申请的其他特征和优点通过以下详细描述将变得显而易见。然而应当理解，同时发明详述和具体实施例表明了本申请优选的实施方案仅用于阐释，因为通过该发明详述，在本申请的实质和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
现在将结合附图描述本发明的实施方案，其中：
图1显示了DL4-Fc构建体的设计和生物素化。A)描绘了DL4-Fc融合构建体，其组分包含人DL4的胞外结构域、纯化目标和人IgG3的Fc区(IgG3Fc)。B)在非还原条件下使用抗生物素(上图)和抗人IgG(下图)对化学生物素化的DL4-Fc进行蛋白质印迹分析。
图2显示了第一代DL4-μbead对Notch报告细胞的激活。A)化学生物素化的DL4-Fc蛋白与SA包被的珠子缀合，以形成随机定向的第一代DL4-μbead，范围从50nm金纳米颗粒(GNP)到100μmμbead。B)将3x104个3T3-N1Cluc细胞孵育于用hIgG预处理的板上作为阴性对照，或孵育于用所示不同浓度的DL4-Fc处理的板。或者，将所述细胞与不同数量的DL4-μbead孵育于未经处理的板上。各种条件下珠子的数量以总计表示，表面积相同，且因此DL4-Fc分子的总数相同。铺板后24小时，裂解该细胞并分析萤光素酶活性。
图3显示了使用第一代DL4-μbead从小鼠HSC诱导的T细胞发育。将小鼠胎肝来源的HSPC与未缀合的μbead或DL4-μbead以及含有FBS、SCF、IL-7和Flt3-L的培养基孵育7天。收获共培养物，并使用流式细胞仪分析T谱系(CD25+)、B谱系(CD19+)或髓样(CD11b+)细胞的存在。图中的数字表明每个象限内的细胞百分比。
图4显示了DL4-Fc的位点特异性生物素化。A)DL4-Fc融合构建体经过重新设计以在其C末端包括BirA识别序列(AviTagTM)，生物素部分可通过BirA酶与其结合。B)在还原条件下使用抗人IgG(上图)和抗生物素(下图)对化学生物素化的DL4-Fc进行蛋白质印迹分析。
图5显示了第一代和第二代DL4-μbead激活Notch的不同能力。A)将BirA生物素化的DL4-Fc蛋白缀合至SA包被的珠子上，以形成定向的第二代DL4-μbead。B)将3x104个3T3-N1Cluc细胞在与板结合的IgG-或DL4-Fc对照上或与第一代或第二代DL4-μbead(25μm)一起孵育。铺板后24小时，裂解细胞并分析萤光素酶活性。
图6显示了μbead大小对Notch激活的影响的评估。将大小范围从6.5μm到100μm的DL4-μbead与3x104个3T3-N1Cluc细胞孵育过夜。包括了与板结合的(PB)IgG和DL4-Fc分别作为阴性和阳性对照。各种情况下珠子的数量以总计表示，表面积相同，且因此DL4-Fc分子的总数相同。铺板后24小时，裂解细胞并分析萤光素酶活性。
图7显示了不同浓度的DL4-Fc和不同组成的μbead诱导的Notch激活。A)通过将增加量的DL4-Fc缀合至恒定数量的直径25μm SA包被的μbead来制备DL4-μbead。使用包括直径25μm的磁性μbead，以评估改变μbead核心组成对激活Notch能力的影响。B)将生物素化的DL4-Fc与相等大小的SA-μbead或蛋白-G-μbead结合，以确定是否结合至Fc区同等有效地激活了Notch。将DL4-μbead与3x104个3T3-N1Cluc细胞孵育过夜。包括了与板结合的IgG作为阴性对照的。铺板后24小时，裂解细胞并分析萤光素酶活性。
图8显示了使用第二代DL4-μbead从小鼠HSPC诱导T细胞的发育。将1x103、3x103或8x103个小鼠胎肝来源的HSPC和未缀合的μbead或DL4-μbead以10：1(珠子：细胞)的比例与含有FBS、SCF、IL-7和Flt3-L的培养基孵育7天。收获共培养物，并使用流式细胞仪分析T谱系(CD25+)、B谱系(CD19+)或髓样(CD11b+)细胞的存在。图中的数字表示各个象限内的细胞百分比。
图9显示了对HSPC与DL4-μbead比率的优化。在以下条件下培养小鼠胎肝来源的HSPC 7天：未缀合的μbead、与板结合的DL4-Fc(PB-DL4)或3倍滴定的DL4-μbead。针对CD11b+髓样和CD19+B谱系细胞的抑制以及proT(CD90+CD25+)细胞的出现，使用流式细胞仪分析培养物。
图10显示了源自与DL4-μbead共培养的HSPC的人T谱系细胞的发育进程。A)将人脐血来源的CD34+细胞和未缀合的μbead、与板结合的DL4-Fc或DL4-μbead在补充有StemSpanTMT细胞祖细胞扩增补充剂的StemSpanTMSFEM II中培养14天。每两天(箭头处)收获细胞，并使用流式细胞仪分析CD34、CD5、CD1a和CD7的表面表达。B)还对细胞计数以评估总细胞扩增。通过将指定天的总数除以第0天起始培养的初始接种量来计算倍数扩增。
图11显示了对用DL4-μbead产生的成熟人T细胞的存在的分析。将人脐带血来源的CD34+细胞与DL4-μbead在补充有StemSpanTM T细胞祖细胞扩增补充剂的StemSpanTMSFEMIIII中进行培养。在第28和47天，收获细胞并分析CD34、CD5、CD1a、CD4、CD8和CD3的表面表达。如箭头所示，显示了SP设门的细胞、DP设门的细胞或DN设门的细胞的CD3共表达。
图12显示DL4-μbead诱导了源自G-CSF和Plerixafor(PLX)动员的外周血(mPB)的CD34+细胞的T细胞的发育。经G-CSF和PLX处理5天的脐带血和成人(n＝3)来源的3x103个CD34+细胞，与9,000个DL4-μbead共同孵育。A)在第14天，针对细胞表面标志物CD5、CD7和CD34的表达，使用流式细胞仪分析T细胞发育进程。B)在第14天，使用血细胞计数器进行细胞计数，并基于起始细胞数计算倍数扩增。将使用脐带血(CB)的扩增率用作比较器。
图13显示了使用DL4-μbead对从诱导性多能干细胞(iPSC)产生T细胞的早期及晚期诱导。首先诱导人iPSC分化为中胚层命运(mesoderm fate)，然后分化为CD34+造血前体命运。A)将3x103个MACS富集的CD34+细胞与27x103个DL4-μbead共同孵育，并在第6、8、10和12天使用流式细胞仪针对CD5、CD7和CD34的细胞表面表达分析其向T细胞发育的进程。B)使用针对T细胞共受体CD4和CD8以及CD3的细胞表面标志物分析来自D14、D28和D35的培养物中成熟T细胞的存在。倒三角形表示分析的天数。RCN：相对细胞数。
图14显示了对从T细胞来源的iPSC(T-iPSC)产生T细胞的早期和晚期诱导。将T-iPSC诱导为中胚层命运，然后是造血前体命运。将3x103个MACS富集的CD34+细胞与27x103个DL4-μbead共同孵育，并在第12天(D12)和24天(D24)用流式细胞仪针对CD5、CD7(早期T细胞发育)和CD4、CD8、CD3和TCRαβ(晚期T细胞发育)的细胞表面表达分析其向T细胞发育的进程。
图15显示了重组VCAM1-Fc的生物素化。重组VCAM1-Fc经过基因工程改造后由VCAM-1细胞外结构域、IgG3 Fc结构域和Avi标签生物素化位点组成，类似于DL4-Fc。VCAM1-Fc在HEK293T细胞中表达，分泌到培养基中，随后使用缀合了蛋白G的珠子进行纯化，并使用BirA酶在体外生物素化。在聚丙烯酰胺凝胶上对来自可得自R&D Systems(R&D)的市售VCAM1-Fc、实验室纯化的VCAM1-Fc(-Fc)条带在体外生物素化VCAM1-Fc(生物素)的样本进行电泳。使用Western免疫印迹分析，A)用抗VCAM-1抗体比较VCAM-Fc样本之间的大小和浓度，以及B)用抗生物素抗体检测生物素化蛋白的存在。
图16显示了VCAM-1和DL4对人T细胞发育的复合作用。将生物素化的VCAM1-Fc(VCAM)与DL4-Fc(DL4)以不同的比例结合至μbead，如所示，并与未缀合的μbead(UN)和DL4-μbead进行比较。DL4-Fc的量保持恒定在1μg/2x105 SA-μbead，而VCAM-Fc以0.01μg(对于100：1)、0.1μg(对于10：1)、1μg(对于1：1)和10μg(对于1:10)进行添加。然后将DL4：VCAM1-μbead与3x103个CB来源的CD34+细胞共同孵育，并在第7天针对CD34、CD7和CD5细胞表面标志物分析T细胞发育进程。
图17显示了将T细胞祖细胞(proT)定植入免疫缺陷的NOD-SCID IL2rγnull(NSG)小鼠胸腺中。将人CB来源的CD34+细胞与DL4-μbead共同孵育7天。使用流式细胞仪分选CD34+CD7+T细胞祖细胞(proT)，并将3x105个该细胞由静脉内注射至免疫缺陷的NSG小鼠中。如图所示，以3-4天的间隔给予IL-7加强注射。3周后，收获并处理胸腺。使用流式细胞仪分析，鉴定出存活(DAPI-)人造血干细胞(CD45+)。此外，使用细胞表面标志物CD19(B细胞)、CD33(髓样细胞)、CD3、CD4和CD8(T细胞)对电子设门的(electronically-gated)存活CD45+细胞进行谱系分析。
图18显示了proT细胞定植入胸腺中，以及它们随后迁移到骨髓和二级淋巴器官脾脏中。将从第7天的CB-HSPC/DL4-μbead培养物中分选出的ProT细胞注射入NSG小鼠。注射后12周，获取并处理胸腺(T)、骨髓(BM)和脾脏(S)，以使用流式细胞仪评价CD45+人造血干细胞的植入情况(上图)。如图所示，通过针对人CD45+细胞进行电子设门，使用各器官细胞表面标志物CD3、CD4、CD8和TCRαβ确定成熟T细胞的存在。
图19显示了从细胞组分中分离磁性DL4-μbead。将2x105个CD34+CB来源的HSPC与1.8x106个氧化铁包被的DL4-μbead在T25烧瓶中一起培养。A)在培养的第5天，确定CD34+CD7+proT细胞的百分比。B)然后对培养物进行AutoMACS介导的分离，其中磁性颗粒从未结合的细胞组分中分离。阴性部分(Negative fraction)表示未结合至仪器的磁性探头的组分。阳性为结合的部分。使用血球计数器计数各部分的珠子和细胞的含量，并与原始混合物(预分选)进行比较。各部分的细胞数显示于左侧条块，珠子数显示于右侧条块。
发明详述
如上所述，本发明人开发了一种无细胞的基于珠子的系统，用于从干细胞或祖细胞如小鼠或人的造血干/祖细胞(HSPC)或诱导性多能干细胞(iPSC)产生T细胞谱系细胞。不与板结合的Notch配体的悬液(例如DL4-μbead)可有效产生T谱系细胞，所述T谱系细胞包括T细胞祖细胞和成熟T细胞。
I.产生细胞的方法
因此，本公开提供了一种产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。
术语“T细胞谱系细胞”是指显示T细胞或其前体或祖细胞的至少一种表型特征的细胞，所述特征可将所述细胞区别于其他淋巴样细胞和红系或髓样谱系的细胞。这些表型特征可包括在细胞或其前体或祖细胞上表达一种或多种T谱系特异性蛋白，或T细胞特异性的生理、形态学、功能或免疫学特征。
T细胞谱系细胞可以是：(a)定向为T细胞谱系的祖细胞或前体细胞(“T细胞祖细胞”或“proT细胞”，如本文所述)；(b)CD25+未成熟的T细胞；(c)经过CD4或CD8谱系定向的细胞(例如CD4+CD8loTCRint细胞)；(d)表征为TCR基因重排；(e)CD4+CD8+双阳性(DP)的前体胸腺细胞；(f)CD4-CD8+或CD4+CD8-以及任选的TCRhi；(g)CD3+CD90+；(h)CD4-CD8+或CD4+CD8-和TCRhi的单阳性(SP)细胞；(i)TCR-αβ+和/或TCR-γδ+；(j)表征为多个Vβ链(如Vβ-3、-6和17a)中任一个的表达；或(k)成熟和功能性或活化的T细胞，其可表征为TCR/CD3hi、CD4-CD8+或CD4+CD8-。
在一个实施方案中，T细胞谱系细胞是“T细胞祖细胞”或“proT细胞”。如本文所用，术语“T细胞祖细胞”或“proT细胞”是指能够成长为成熟T细胞或淋巴细胞的T细胞。
在一个实施方案中，T细胞祖细胞是人T细胞祖细胞。人T细胞祖细胞的表型包括CD34+CD7+和CD7+CD5+CD1a-。在另一个实施方案中，所述T细胞祖细胞是小鼠T细胞祖细胞。小鼠T细胞祖细胞的表型包括CD25+。
在另一个实施方案中，T细胞谱系细胞是特征在于CD4+CD8+或CD4+CD8+CD3+表型的CD4和CD8双阳性(DP)细胞。在另一个实施方案中，T细胞谱系细胞是特征在于CD4-CD8+、CD4+CD8-或CD4-CD8+CD3+、CD4+CD8-CD3+的CD4或CD8单阳性(SP)细胞。
如本文所用，术语“悬浮支持物”是指当与Notch配体或其他T细胞共刺激分子缀合时允许Notch配体(或共刺激分子)悬浮在培养基中的任何材料。所述悬浮支持物可以由多种材料制成，并且可以具有多种形式。可用作悬浮支持物的支持物实例，包括但不限于：颗粒、珠子(包括微珠)、蛋白、脂质、核酸分子、过滤器、纤维、筛网、网、管、中空纤维、生物组织和它们的任何组合。
在一个实施方案中，所述悬浮支持物是颗粒。具体的可以是任何形状，包括但不限于：球形、椭圆形、杆形或矩形。所述颗粒可以为多种材料，包括但不限于：天然或合成聚合物、天然或合成蜡、陶瓷、金属、生物材料或其组合。
在一个实施方案中，悬浮支持物是微珠。如本文所用，术语“微珠”或“μbead”是指直径为0.01μm(10nm)至500μm，任选地为1-200μm的球状或基本为球状的珠子。在另一个实施方案中，所述微珠直径为6.5-100μm，任选地为20-30μm，24-26μm或25μm。
本文考虑了各种类型的微珠。在一个实施方案中，所述微珠是聚合物、二氧化硅或磁性微珠。在其他实施方案中，所述微珠是聚苯乙烯微珠、金纳米颗粒或Dynabead。在另一个实施方案中，所述微珠是乳酸和乙醇酸(PLGA)的共聚物。
将蛋白缀合至支持物的各种方法是本领域已知的。蛋白可以直接或间接缀合至悬浮支持物，例如微珠。
在一个实施方案中，本文所述的Notch配体使用生物素/链霉亲和素系统缀合至悬浮支持物。在此，所述Notch配体被生物素化，然后缀合至链霉亲和素包被的悬浮支持物(例如，链霉亲和素包被的微珠)。在另一个实施方案中，本文所述的Notch配体通过蛋白G或蛋白A缀合至悬浮支持物。
如本文所用，术语“Notch配体”是指能够结合至Notch受体多肽的配体，所述Notch受体多肽存在于多种不同哺乳动物的细胞膜中，所述哺乳动物细胞包括造血干/祖细胞。在人细胞中已鉴定出的Notch受体，包括Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4。典型的Notch配体具有特征性DSL结构域(D-Delta、S-Serrate和L-Lag2)，所述结构域在氨基末端包含20-22个氨基酸并且在细胞外表面包含3-8个EGF重复序列。
术语Notch配体包括可以结合并参与Notch信号转导的抗-Notch抗体和适配体(例如DNA适配体)。
选出促进和维持T细胞谱系细胞分化和增殖的Notch配体。所述Notch配体任选地是源自人的，或可以是源自其他物种的，包括哺乳动物物种如啮齿动物、狗、猫、猪、绵羊、牛、山羊和灵长类。
Notch配体的具体实例包括Delta家族。所述Delta家族包括：Delta-1(Genbank登录号AF003522，智人(Homo sapiens))、Delta-3(Genbank登录号AF084576，褐家鼠(Rattusnorvegicus))、Delta-样1(DL1；Genbank登录号NM_005618和NP_005609，智人；Genbank登录号X80903、148324，小家鼠(M.musculus))、Delta-样3(Genbank登录号NM_053666、N_446118，褐家鼠)、Delta-4(Genbank登录号AF273454、BAB18580，小家鼠；Genbank登录号AF279305、AAF81912，智人)，和Delta-样4(DL4；Genbank登录号Q9NR61、AAF76427、AF253468、NM_019074，智人；Genbank登录号NM 019454，小家鼠)。所述Notch配体为市售的，或者可通过重组DNA技术生产并纯化至不同程度。
术语“Notch配体”包括已知可通过标准技术鉴定的Notch配体同源物。“同源物”是指展现出与任何已知的Notch配体的序列同源性(氨基酸或核酸序列同源性)的基因产物。Notch配体在氨基酸水平上与相应Notch配体可具有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，优选90％，更优选95％，最优选98-99％的同一性。
在一个实施方案中，Notch配体的同源物在N-末端包含DSL结构域，并且在细胞外表面具有3-8个EGF样重复序列。合适的同源物也将能够结合Notch受体。可以通过本领域已知的多种方法(包括体外结合测定法)来确定与Notch受体的结合。
术语“Notch配体”还包括已知Notch配体的突变体或变体。术语“突变体”是指所具有的一级氨基酸序列与野生型序列的区别在于一个或多个氨基酸添加、取代或缺失的多肽。优选地，所述突变体与所述野生型序列具有至少90％的序列同一性。优选地，所述突变体在整个野生型序列上具有20个或更少的突变。更优选地，所述突变体在整个野生型序列上具有10个或更少的突变，最优选地具有5个或更少的突变。
任选地，所述Notch配体包含至少一种蛋白标签。蛋白标签是附加于目的蛋白(如Notch配体)的肽序列。所述蛋白标签可以直接或间接连接至目的蛋白。各种蛋白标签是本领域已知的，且可用于多种目的。在一个实施方案中，所述Notch配体包含Fc标签(也称为Fc融合蛋白)。如本文所用，术语“Fc”是指IgG的Fc结构域。在一个具体实施方案中，Notch配体DL4与Fc融合(DL4-Fc)。在另一个实施方案中，所述标签是His标签。在又一个实施方案中，所述标签是促进Notch配体寡聚化的分子。例如，可以将COMP(软骨寡聚基质蛋白)的小结构域与Notch配体(例如DL4)融合以形成DL4五聚体。铁蛋白可以类似的方式用于形成DL4多聚体。
根据本文所述的方法，通过培养包含干细胞或祖细胞的样本产生T细胞谱系细胞。干细胞或祖细胞可以从任何合适的来源获得，包括但不限于：脐带血、胚胎、胚胎组织、胎儿组织、骨髓和血液。在一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是造血干细胞或祖细胞(HSPC)。在另一个实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在又一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是诱导性多能干细胞。在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是CD34+造血前体细胞，任选地是从ESC或iPSC分化而来的CD34+造血内皮前体细胞，或者是从ESC或多能干细胞(PSC)分化而来的CD34+前体造血细胞。用于获取CD34+细胞的各种分化方案是本领域已知的。对于治疗应用，所述用于产生T细胞谱系细胞的干细胞或祖细胞可获取自待治疗的患者。
如本文所用，术语“造血干/祖细胞”、“造血干或祖细胞”或“HSPC”是指能够分化为其他细胞类型(包括T细胞谱系细胞)的未分化造血细胞。HSPC可从获取自多种来源，包括但不限于：骨髓、脐带血和动员外周血(mPB)。HSPC也可以获自多个胎儿和胚胎部位，如肝脏、卵黄囊或背主动脉。HSPC还可通过在培养中诱导ESC或iPSC的分化来获得。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”或“ESC”是指未分化的胚胎干细胞，其具有整合至发育胚胎并成为发育胚胎生殖细胞系一部分的能力。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指源自经过重编程回到胚胎样多能状态的体细胞(如皮肤或血细胞)的细胞。在一个实施方案中，iPSC为T细胞来源，所述T细胞具有已知或未知的TCR特异性(例如，携带对癌症具有特异性的TCR的T细胞)。
通常，含有干细胞或祖细胞的样本首先要去除非干细胞或成熟细胞。本领域已知的阴性和阳性选择方法可用于富集干细胞或祖细胞。例如，可以使用荧光激活的细胞分选仪或与特定细胞表面抗原结合的磁性珠子，基于细胞表面抗原来分选细胞。阴性选择柱可用于去除表达谱系特异性表面抗原的细胞。
在一个实施方案中，将含有干细胞或祖细胞的样本分成谱系阴性(Lin-)和谱系阳性(Lin+)部分。Lin-部分可用于CD34+细胞分选。
在如本文所述的合适条件下培养祖细胞或干细胞，以产生T细胞谱系细胞。优选地，在有一种或多种与悬浮支持物缀合的Notch配体存在的情况下，培养所述细胞足够长的时间以形成T细胞谱系细胞。
本文所述方法的一个优点是，它们容许将T细胞谱系细胞悬浮培养。在一个实施方案中，将所述祖细胞或干细胞培养悬浮培养，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物如微珠的Notch配体。在悬浮培养中，细胞在培养基中自由漂浮生长。相反，在贴壁培养中，细胞在人工基质上以单层生长。
在另一个实施方案中，所述祖细胞或干细胞在生物反应器(任选地封闭的或封闭的、自动生物反应器)中悬浮培养，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体。在一个实施方案中，所述悬浮支持物是微珠，其直径与生物反应器兼容。各种生物反应器是本领域已知的，并且可包括分批、补料分批或连续培养的生物反应器。连续培养生物反应器的一个实例是连续搅拌釜式反应器模型。
本发明考虑了培养物中祖细胞或干细胞的各种浓度。例如，培养物中祖细胞或干细胞的浓度可为每ml培养基1个到数百万个细胞。
在一个实施方案中，所述与微珠缀合的Notch配体和祖细胞或干细胞之间的比例为1：1至27：1，任选地为5：1至15：1、8：1至10：1，或9：1。所述比率在本文中也称为“微珠与细胞比”。
本发明人还证明了，Notch配体取向对悬浮支持物的朝向可以增强Notch信号转导。因此，在一个实施方案中，所述Notch配体的C末端缀合至所述悬浮支持物。这可以，例如，通过在Notch配体的C末端添加一个序列来进行工程化，所述序列可以通过酶催化缀合至生物素分子。在另一个实施方案中，所述融合蛋白(Notch配体-Fc)的Fc片段存在于C-末端区域，可直接与缀合至悬浮支持物的蛋白A或蛋白G结合。
还可将一种或多种促进T细胞谱系细胞的定向和分化的阳性细胞因子加入培养物中。所述细胞因子可以是源自人的，或者可以是其他物种来源的。培养物中细胞因子的浓度通常为约1-10ng/ml。以下是可以在本申请中使用的细胞因子的代表性实例：Flt-3-配体的所有成员，以及白介素7(IL-7)和干细胞因子。在一个实施方案中，本文使用的细胞因子是Flt-3-配体、IL-7和干细胞因子。所述细胞因子可以与等摩尔或更多量的糖胺聚糖(如硫酸肝素)组合使用。所述细胞因子为市售的，或可通过重组DNA技术生产并纯化至不同程度。某些细胞因子可通过标准生化技术从细胞系培养基中纯化。
各自缀合至悬浮支持物的一种或多种其他分子，也可以加入培养物中。在一个实施方案中，所述其他分子是促进T细胞发育(例如，促进T细胞谱系细胞定向和分化)的分子，在本文中也称为“T细胞共刺激分子”。在一个实例中，本发明人证明了，缀合至微珠的DL4和VCAM1与HSPC一起培养加速了向T细胞谱系的分化。因此，在一个实施方案中，所述T细胞共刺激分子是VCAM1。如本文所用，术语“VCAM1”是指血管细胞粘附蛋白1，也称为血管细胞粘附分子1(VCAM1)或分化簇106(CD106)，该蛋白在人体内由VCAM1基因编码。术语“VCAM1”还包括VCAM1的突变体或变体。在另一个实施方案中，所述T细胞共刺激分子是细胞因子或趋化因子(干细胞因子、IL-7、CCL25或CXCR4)，I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)，或共刺激(CD80、CD86)分子。任选地，所述T细胞共刺激分子包含至少一种蛋白标签。各种蛋白标签是本领域已知的，并且可用于多种目的。在一个实施方案中，所述T细胞共刺激分子包含Fc标签(也称为Fc融合蛋白)。
所述祖细胞和干细胞可培养于包含条件培养基、非条件培养基或胚胎干细胞培养基的培养基中。适宜的经调整的(conditioned)培养基实例包括用胚成纤维细胞(如人胚成纤维细胞或小鼠胚成纤维细胞)调整的IMDM、DMEM或αMEM，或等效培养基。适宜的不经调整的培养基的示例包括Iscove改良的杜氏培养基(IMDM)、DMEM或αMEM，或等效培养基。所述培养基可包含血清(如牛血清、胎牛血清、小牛血清、马血清、人血清或人工血清替代物)，或者也可以是无血清的。在本方法中可用的其他培养基实例包括StemCell Technologies培养基(StemSpanTMSFEM II)，或任何其他市售等效培养基。
在一个实施方案中，所述培养条件需要将祖细胞或干细胞培养足够长的时间，以使制备中的细胞形成proT细胞。在另一个实施方案中，所述培养条件需要将祖细胞或干细胞培养足够的时间，以使制备中的细胞形成成熟的T细胞，例如成熟的SP T细胞。应当理解，可以将所述细胞维持适当长的时间，所述适当长的时间为获取预期细胞组合物所需要的时间。任选地，将所述祖细胞或干细胞培养至少6、8、10、12、14、21、28、35或42天。在一个实例中，所述祖细胞或干细胞与本文所述的Notch配体一起培养4-21天、6-18天或7-14天以产生proT细胞。在另一个实例中，所述祖细胞或干细胞与本文所述的Notch配体一起培养至少21、28、35或42天，以产产生熟的T细胞。
本申请所述方法容许产生大量T细胞谱系细胞。具体地，在一个实施方案中，在培养14天或更多天后，获得了多于干细胞或祖细胞初始数量50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍的细胞扩增量。
如本文所用，术语“分离的”是指已从其原生环境中与所述细胞共同存在的细胞性或生物性材料中分离或纯化得到所述祖细胞。因此其可将所述细胞从其自然存在的环境中区分出来。
术语“细胞”或“所述细胞”包括多个细胞。
II.悬浮Notch配体
本发明人还开发了新颖的悬浮Notch配体。如本文所用，术语“悬浮Notch配体”是指用于悬浮细胞培养物中的Notch配体。
因此，本公开还提供了如本文所述的悬浮Notch配体。所述悬浮Notch配体包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物。
具体地，本发明人证明了当直接缀合至直径25μm的微珠时，DL4传递强而持续的信号以诱导HSPC发展为T细胞谱系细胞。因此，在一个实施方案中，所述悬浮支持物是直径为10-100μm，任选地20-30μm，24-26μm，或25μm的微珠。
本发明人进一步证明，Notch配体取向对悬浮支持物的朝向可以增强Notch信号转导。因此，在另一个实施方案中，所述Notch配体的C-末端缀合至所述悬浮支持物。如上所述，这可以，例如，通过在Notch配体的C末端添加一个序列来进行工程化，所述序列可以通过酶催化缀合至生物素分子。
所述Notch配体任选地为DL4，并且可以与标签如Fc标签融合。
本文还提供了悬浮T细胞共刺激分子。如本文所用，术语“悬浮T细胞共刺激分子”是指用于悬浮细胞培养物中的T细胞共刺激分子。所述悬浮T细胞共刺激分子包含(a)T细胞共刺激分子和(b)悬浮支持物，其中所述T细胞共刺激分子缀合至所述悬浮支持物。
所述T细胞共刺激分子任选地为VCAM1，并且可以与标签如Fc标签融合。
III.试剂盒
悬浮Notch配体可制备并包装于试剂盒中，用于产生T细胞谱系细胞。
因此，本文还提供了用于产生T细胞谱系细胞的试剂盒，所述试剂盒包含悬浮Notch配体，其中所述悬浮Notch配体包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物。任选地，所述悬浮Notch配体包含于防腐剂和/或缓冲溶液中，并且所述试剂盒还包含用于分配所述悬浮Notch配体的装置，如小瓶或注射器。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含培养基，用于与悬浮Notch配体共同培养包含干细胞或祖细胞的样本。所述培养基的实例包括条件培养基、非条件培养基或胚胎干细胞培养基。所述培养基可包含血清(如牛血清、胎牛血清、小牛血清、马血清、人血清或人工血清替代物)，或者其可以是无血清的。其他可用培养基的实例包括StemCell培养基或任何其他市售的等效培养基。
在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含一个或多个其他分子，各分子缀合至悬浮支持物。在一个实施方案中，所述其他分子是促进T细胞发育(例如，促进T细胞谱系细胞的定向和分化)的分子，在本文中也称为“T细胞共刺激分子”。在另一个实施方案中，所述T细胞共刺激分子是VCAM1。
所述培养基任选地包括一种或多种促进T细胞谱系细胞定向和分化的细胞因子。所述细胞因子可以源自人，或者可以源自其他物种。培养物中细胞因子的浓度通常为约1-10ng/ml。以下是可以在本申请中使用的细胞因子的代表性实例：Flt-3-配体的所有成员，以及白介素7(IL-7)和干细胞因子。在一实施方案中，本文使用的细胞因子是Flt-3-配体、IL-7和干细胞因子。所述细胞因子可以与等摩尔或更多量的糖胺聚糖(如硫酸肝素)结合使用。所述细胞因子是市售的，或者可以通过重组DNA技术生产并纯化至不同程度。某些细胞因子可以通过标准生化技术从细胞系的培养基中纯化。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个用于所述试剂的容器。
在各种实施方案中，所述试剂盒中也可以包含对试剂使用提供指导的印刷说明书。术语“说明书”或“使用说明书”通常包括有形表达形式，所述有形表达形式描述所述悬浮Notch配体的试剂浓度或用量，和/或至少一种测定方法的参数，诸如待混合的悬浮Notch配体与细胞的相对量、培养时间段、温度、培养基条件等。例如，在一个实施方案中，所述说明书描述了一种方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。
IV.T细胞谱系细胞
本公开进一步提供了通过本文所述的方法、系统和试剂盒产生的T细胞谱系细胞，或作为所述细胞后代的有丝分裂或分化的细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了通过本文述方法产生的“T细胞祖细胞”或“proT细胞”。在另一个实施方案中，所述T细胞祖细胞是人T细胞祖细胞，例如，表征为CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-的人T细胞祖细胞。
在另一个实施方案中，所述T细胞祖细胞是小鼠T细胞祖细胞，例如，表征为CD25+的小鼠T细胞祖细胞。
本公开还提供了表征为CD4+CD8+或CD4+CD8+CD3+的双阳性(DP)T细胞。本公开进一步提供了T细胞谱系细胞，其是表征为CD4-CD8+、CD4+CD8-或CD8+CD3+、CD4+CD3+的单阳性(SP)细胞。
在一个实施方案中，将通过本文描述的方法产生的T细胞谱系细胞(例如，T细胞祖细胞或成熟T细胞)用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造，以赋予其对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性。如此工程化改造的细胞可用于治疗诸如癌症的病况。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含通过本文所述的方法产生的分离的T细胞谱系细胞，以及药学上可接受的稀释剂或载体。
合适的稀释剂和载体，描述于例如《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》中。在此基础上，所述组合物包括但不限于proT细胞溶液，所述细胞与一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂相结合，并包含于具有合适pH且与生理液等渗的缓冲溶液中。
药物组合物包括但不限于冻干粉末、水性或非水性无菌注射溶液或悬液，其可进一步包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，所述溶质使所述组合物与预期接受者的组织或血液基本相容。其他可存在于此类组合物中的组分包括，例如，水、表面活性剂(如TweenTM)、醇、多元醇、甘油和植物油。即时注射溶液和悬液可由无菌粉末、颗粒、片剂或浓缩溶液或悬液制备。所述组合物可以，例如但不限于以冻干粉末的形式供应，所述冻干粉末在施用于患者之前用无菌水或盐水复溶。
所述药物组合物还包括冷冻贮藏溶液。在一个实施方案中，将通过本文描述的方法产生的T细胞谱系细胞冷冻贮藏于合适的媒介中，例如药学上可接受的或GMP级的媒介，并且任选地配制为施用于对其有需求的受试者。
合适的药学上可接受的载体包括基本为化学惰性且无毒的组合物，其不干扰所述药物组合物的生物学活性效力。合适的药物载体的实例，包括但不限于：水、盐溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2,3-二油烯基氧基(dioleyloxy))丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和脂质体。这样的组合物应包含治疗有效量的化合物以及适当量的载体，以提供直接施用于患者的形式。
所述组合物可以例如通过肠胃外、静脉内、皮下、肌内、颅内、眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、雾化或口服施用。对于肠胃外施用，本文所述的pro-T细胞的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。分散剂也可以在甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其含有或不含有醇的混合物，以及在油类中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。本领域技术人员应当知晓如何制备合适的配方。
优选地，所述T细胞谱系细胞以有效治疗对其有需求的受试者的疾病状态的量存在。在一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞以有效提升在有需求的受试者中定植造血祖细胞的量存在。任选地，所述组合物还包含T细胞谱系细胞或用于移植的组织。在一个实施方案中，所述组织包含胸腺。在另一个实施方案中，所述组织包含器官。
V.治疗应用
产生体外来源的人T细胞祖细胞并在人/小鼠免疫定植模型中测试其安全性的能力，为基于细胞治疗T谱系的免疫相关病症的方法开辟了道路(Legrand等，2006；van denBrink等，2004)。T细胞是识别和消除病毒和细菌病原体的适应性免疫系统的主要效应器装备。在某些罕见的血液癌症如T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中，T细胞增殖、排挤健康的免疫细胞并扰乱正常的免疫功能(Ferrando等，2002；Weng等，2004)。尽管化学疗法通常可以给癌症患者带来治疗益处，但它通常可以导致免疫缺陷和对机会性感染的易感性。机会性感染在艾滋病患者中也造成了严重问题，这些患者在感染HIV后，其CD4+T细胞已经耗尽。尽管免疫缺陷仍然是HIV/AIDS和癌症的严重问题，但过度免疫活性在自身免疫疾病中同样存在问题，其中缺乏适当调节控制的T细胞会产生对自身组织的免疫反应。
因此，本申请包括治疗患有需要增加T细胞数量的病况的受试者的方法，其包括：
(i)产生T细胞谱系细胞，包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，所述悬浮支持物任选地为颗粒或微珠，和(b)分离T细胞谱系细胞；以及
(ii)将有效量的T细胞谱系细胞施用于有需求的受试者。
在一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞。
在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是成熟的T细胞。
本公开还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞谱系细胞，任选地为T细胞祖细胞或成熟T细胞，在治疗患有需要增加T细胞数量的病况的受试者中的用途。
本公开还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞谱系细胞，任选地为T细胞祖细胞或成熟T细胞，在再生医学中的用途，例如用于替换和/或再生受疾病或创伤影响的组织。
如本文所用，短语“有效量”或“治疗有效量”是指在达到期望结果所需的剂量和时间段时有效的量。有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别、受试者的体重等因素而变化。与该量相对应的给定细胞制备物的量将根据各种因素而变化。诸如药物配方、给药途径、疾病或病症的类型、接受治疗的受试者或接受者的特性等，但是仍然可以由本领域技术人员按常规确定。“有效量”优选将是对于T细胞谱系细胞定植入被治疗的受试者有效的量。
如本文所用并且如本领域中所周知的，术语“治疗(treating/treatment)”是指获得有益或预期结果的方法，所述结果包括临床结果。有益或预期的临床结果可包括但不限于：减轻或改善一种或多种症状或病况、缩小疾病范围、稳定疾病状态(即不恶化)、预防疾病扩散、延迟或减缓疾病进程、改善或减轻疾病状态、减少疾病复发，及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”也可意指延长生存期。如本文所用，“治疗”还包括预防性治疗。
如本文所用，术语“受试者”是指动物界的任何成员，并且优选为人类。
“需要增加T细胞数量的病况”包括与健康动物相比T细胞水平降低的任何病况，包括但不限于：免疫缺陷、癌症、遗传疾病(例如原发性免疫缺陷疾病(PID))、传染性疾病、免疫失调和自体免疫病。
如上所述，可以将本文所述的T细胞谱系细胞工程化改造以表达特异性识别肿瘤相关抗原的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
因此，本申请还包括治疗受试者癌症的方法，其包括：
(i)产生T细胞谱系细胞，包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，所述悬浮支持物任选地为颗粒或微珠，和(b)分离T细胞谱系细胞；以及
(ii)将有效量的T细胞谱系细胞施用于有需求的受试者，
其中所述T细胞谱系细胞用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造，以赋予其对肿瘤相关抗原的特异性。
本公开还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞谱系细胞(任选地T细胞祖细胞或成熟T细胞)在治疗癌症受试者中的用途，其中所述T细胞谱系细胞用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造，以赋予其对肿瘤相关抗原的特异性。任选地，所述iPSC可源自具有已知或未知的TCR特异性的T细胞(例如，带有对癌症具有特异性的TCR的T细胞)，并且这些T-iPSC然后可以通过本文所述的方法用于产生T细胞。
以下非限制性实施例是对本申请的阐释：
实施例
实施例1：
材料和方法：
造血干细胞来源
根据“新宁保健科学中心研究伦理委员会(Research Ethics Board ofSunnybrook Health Sciences Centre)”确立的已核准指南，从知情同意的分娩后母亲处获取人脐带血(UCB)样本，其通过注射器抽取并收集于含有柠檬酸磷酸葡萄糖抗凝剂(Baxter Healthcare,Deerfield,Illinois)的血袋装置中。在收集的24小时内，使用Ficoll密度离心分离UCB单核细胞，并根据制造商的说明书使用EasySep人CD34阳性选择试剂盒(Stemcell Technologies,Vancouver,BC)预富集了谱系阴性的(Lin-)CD34+细胞。Lin-细胞用抗人CD38-APC和抗人CD34-PE mAb染色，并使用BD Biosciences FACSAria分选仪(BD,San Jose,CA)分选CD34+CD38-/lo细胞，以分离人HSPC。经分选后的分析确定，分选的人HSPC纯度大于99％。一些脐带血来源的CD34+细胞和所有动员外周血(mPB)来源的CD34+细胞均购自Stemcell Technologies。对于mPB，志愿者接受G-CSF(收集前，G-CSF的最大量为10μg/kg/天，持续3-5天)和普乐沙福(Plerixafor)(收集前1天，最大量为0.24mg/kg)的组合处理。
DL4-Fc的设计与生产
Delta-样-4经基因工程改造为pDL4-Fc-His-B质粒构建体，所述工程化改造将人DLL4胞外结构域(氨基酸残基[aa]1-529)的编码序列融合至组氨酸(His)标签，其后为人IgG3的Fc部分(包括铰链区)以及在C末端的Bir1A识别序列(AvitagTM)，其间间隔有接头序列。可在这些方法中使用的其他构建体包括：i)与IgG1 Fc部分融合的人DLL4(aa 1-524)，ii)融合至IgG1的Fc部分的碱性磷酸酶(aa 1-17)人DLL4(aa 27-524)信号序列，iii)在C末端与StreptagII和6xHis融合的人DLL4(aa 1-524)，iv)在C末端与10xHis融合的碱性磷酸酶(aa 1-17)人DLL4(aa 27-524)信号序列，及其任何组合。将本构建体插入pIRESpuro2哺乳动物表达质粒(Clontech,Mountainview,CA)。使用标准的CaPO4转染方法将所得质粒转染到HEK-293T细胞中，基于细胞对添加至标准DMEM[补充有10％(v/v)FBS、2mM Glutamax、青霉素(100U/ml)/链霉素(100mg/ml)(所有产品均来自Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)、2mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MI)]的2mg/mL的嘌呤霉素的抗性对稳定整合有质粒的细胞进行筛选。扩增细胞，并转移至表达Freestyle 293的培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养。分泌至培养基中的DL4-Fc融合蛋白，使用连接至
plus(GE Healthcare)的自动色谱系统的HiTrap蛋白G亲和柱(GEHealthcare Life Sciences,Marlborough,MA)进行纯化。
VCAM1-Fc的设计与生产
对重组VCAM1-Fc进行基因工程改造，使其包含VCAM-1细胞外结构域、IgG3 Fc结构域和AvitagTM生物素化位点，类似于DL4-Fc。用于VCAM1-Fc融合蛋白的制造和纯化的材料和方法与上述DL4-Fc融合蛋白的材料和方法相同。
DL4-Fc和VCAM1-Fc的生物素化
将NHS活化的生物素以最佳摩尔比添加至纯化的DL4-Fc中，以使每个DL4-Fc分子获取两个生物素分子。通过在PBS中透析或缓冲液交换去除混合物中未反应的NHS-生物素，并且使用HABA(4′-羟基偶氮苯-2-羧酸)方法(Pierce Biotin Quantitation Kit，产品编号28005)估算生物素的掺入量。生物素化的DL4-Fc随后储存于4℃下。
根据生产商的说明书，使用BirA-500试剂盒(Avidity)将单个生物素分子经酶促缀合至DL4-Fc的Fc区的AviTagTM序列上，以将DL4-Fc定向至链霉亲和素(SA)包被的表面。简而言之，在500μL PBS的反应体积中，将2.5μg BirA添加至500μg DL4-Fc中，并在室温下孵育1小时。根据制造商的说明书，使用40K的MWCO ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo-Fisher)对350μL纯化的DL4-Fc蛋白脱盐，以除去任何残留的生物素。随后将生物素化的DL4-Fc储存在4℃下。使用与上述相同的方法和材料，将含有AvitagTM的VCAM1-Fc蛋白在其C末端进行生物素化。
生物素化的DL4-Fc缀合至链霉亲和素包被的微珠
将1μg生物素化的DL4-Fc与各种大小的链霉亲和素(SA)包被的聚苯乙烯μbead(Spherotech,Lake Forest,IL)(直径范围从1μm至100μm)共同孵育。D4-Fc也缀合至SA包被的Dynabead(Thermo-Fisher)和50nm的纳米金颗粒，各自在2mL PBS中于室温孵育30分钟，并每10分钟通过涡旋混合一次。在所有情况下，颗粒的表面积均相当于2x105个25μm的SA-μbead。用4mL PBS清洗缀合有DL4-Fc的珠子，并以3000xg离心10分钟。小心收集上清，以从混合物中除去任何未结合的配体，并测定DL4-Fc含量以评估与其与微珠的结合。两次清洗后，将DL4-μbead重悬于多种体积的PBS中以获取如文中所述的指定浓度。平行制备未缀合的μbead作为阴性对照。
对于DL4-Fc和VCAM1-Fc与SA-μbead的化合物缀合，所述DL4-Fc的量保持恒定为1μg对应2x105个SA-μbead，而VCAM-Fc的加入量为0.01μg(对于100：1)、0.1μg(对于10：1)、1μg(对于1：1)和10μg(对于1:10)。
NOTCH激活报告细胞系3T3-N1Cluc的开发
将Notch应答元件(8x RBPJ共有结合位点)插入无启动子的pGL4.17[luc2/Neo]质粒(Promega)。至此，创建了单个质粒(命名为pGL4.17-N1Rep)，该质粒通过表达荧光素酶报告Notch的激活，同时赋予其对新霉素的抗性。然后，用pMIGR-NOTCH1(由UPenn的WarrenPear博士惠赠)和pGL4.17N1Rep质粒转染NIH3T3细胞。首先选出对新霉素处理(1μg/mL)具有抗性的细胞，然后通过流式细胞仪分选表达GFP的细胞。接着，通过单细胞沉积(singlecell deposition)将NIH3T3细胞克隆分离至96孔板中。然后测量各个克隆对与板结合的DL4-Fc(以20μg/mL放置过夜)激活的应答。将具有最低背景量和最高Notch激活应答的克隆(命名为3T3N1CLuc)扩增并用于实验，以测量Notch受体的激活。
3T3-N1CLuc荧光素酶测定用于测量Notch激活
将DL4-μbead添加到标准组织培养(TC)处理的平底96孔板的3x104个3T3-N1CLuc细胞中，并于补充了5％FBS的αMEM中孵育过夜。裂解细胞，并根据制造商的说明，使用萤火虫荧光素酶测定试剂盒2.0(Biotium,Fremont,CA)测定荧光素酶的活性。简而言之，去除生长培养基，并用PBS清洗细胞，然后添加裂解缓冲液。通过在-80℃冷冻10分钟然后融化来裂解细胞，再将裂解液转移至96孔平底不透明聚苯乙烯板(Corning)中。制备D-荧光素，并通过自动分配器添加到每个孔中，使用Synergy H1读板仪(BioTek Instruments Inc.,Winooski,VT)进行分析。在前一天通过将50μL/孔的蛋白(5-20μg/mL)吸附至平底96孔板并于4℃过夜来制备与板结合的人IgG和DL4-Fc对照，然后在第二天清洗并接种3T3-N1CLuc细胞。
包被的DL4-Fc板及具有HSPC的DL4-μbead培养物
将不同数量的DL4-μbead添加至3x103个小鼠Lin-Sca-1+cKit+HSC(通过流式细胞仪从C57BL6小鼠的骨髓中分选)，以获取1：1、1：3、1：9和1:27的细胞与珠子的比例。对于各种条件，将所述细胞-珠子组合物孵育于圆底96孔板的单个孔中的200μL IMDM[补充有20％BIT(STEMCELL Technologies)、1％Glutamax(Thermo)、50ng/mL SCF、10ng/mL Flt3L和10ng/mL IL-7(R&D Systems,Minneapolis,MN)]。在前一天通过将50μL/孔的蛋白(20μg/mL)吸附至平底96孔板中并于4℃过夜来制备与板结合的人IgG和DL4-Fc对照，然后在第二天对细胞进行清洗和铺板。在共培养的第7天收获细胞，并用抗小鼠CD45、CD25、CD44、CD90、CD11b和CD19的抗体进行染色，然后在LSR II细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。
对于人HSPC，通过流式细胞仪从UCB中分选Lin-CD34+CD38-/lo细胞，将4x103个细胞与36,000个DL4-μbead培养于圆底96孔板中每孔的200μL补充有StemSpanTM T细胞祖细胞扩增补充剂(Stemcell Technologies)的StemSpanTMSFEM II(Stemcell Technologies)，培养14天，在第7天更换50％的培养基。培养14天后收获细胞，计数并与新鲜的DL4-μbead一起接种。在共培养的第14天，对细胞计数以确定细胞扩增量，并用使用抗CD34、CD5、CD1a和CD7的抗体进行染色以测定谱系进程。为了测定在proT细胞阶段之后的发育，还在随后的时间点用抗CD4、CD8和CD3的抗体对细胞进行染色。
人诱导性多能干细胞(iPSC)向CD34+造血前体细胞或造血内皮细胞向T细胞的分
化
重编程的hiPSC细胞系源自成纤维细胞(AlStemBio，目录号iPSC11)和T细胞(Harvard Stem Cell Science，目录号STiPS A3)。将它们培养于基质胶(Matrigel)上的mTeSR培养基(StemCellTech)。为了产生自聚集的EB，将iPSC用胶原酶B处理20分钟，然后进行短暂的胰蛋白酶-EDTA步骤。用细胞刮刀轻刮细胞以形成小的聚集体。通过前24小时在StemPro-34(Invitrogen)中于BMP-4存在下培养，然后在随后的24小时于BMP-4和bFGF存在下培养，之后在BMP-4、bFGF和SB存在下培养接下来的48小时(第2-4天)以产生EB。在第4天，移除BMP-4和SB，并替换为VEGF、IL-6、IL-11、IGF-1、SCF、EPO、TPO、Flt-3、IL-3和DKK1(所有细胞因子均来自Miltenyi Biotec,Auburn,CA或R&D Systems)。将培养物在低氧环境中于5％CO2/5％O2/90％N2维持8天。在第8天，如所述(Kennedy等，2012)用MACS富集CD34+细胞，并与DL4-μbead加StemSpanTMSFEM II II(Stemcell Technologies)按如上所述共同培养以产生T细胞，其中所述StemSpanTMSFEM II补充有StemSpanTM T细胞祖细胞扩增补充剂(Stemcell Technologies)。
T细胞祖细胞过继转移至免疫缺陷小鼠
建立大规模的人HPSC/DL4-μbead培养物，以备过继转移至免疫缺陷小鼠。将2x105个CD34+的HSPC与1.8x106个DL4-μbead在T25烧瓶(Thermo Scientific)中孵育7-10天，此时，使用FACSAria细胞分选仪(BD Biosciences,San Jose,CA)分选被鉴定为CD34+CD7+细胞的T细胞祖细胞(proT)。或者，当将HSPC与氧化铁包被的DL4-μbead共培养时，使用autoMACS-pro细胞分选仪(Miltenyi Biotec)从细胞组分中对DL4-μbead进行磁性分离。将proT细胞经肝内注射到3-6天的免疫缺陷NOD-Scid/IL2rγnull(NSG)新生小鼠。各小鼠接受3-5x105个proT细胞以及hIL-7(0.5μg/小鼠)和抗IL-7单克隆抗体(mAb)、克隆M25(2.5μg/小鼠)，于α-MEM中总体积为50μl。每3-4天以IL-7/M25混合物对小鼠加强注射。移植后3或12周，收集淋巴器官胸腺、脾脏和骨髓。从每个器官制备单细胞悬液，染色并使用LSR-II细胞仪(BD Biosciences)进行分析。通过针对排除了细胞死亡标志物4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的活细胞和表达人CD45的细胞进行电子设门来评估定植。
结果：
DL4-μbead诱导强Notch信号转导
本发明人实验室先前的工作显示，当将DL4融合蛋白DL4-Fc固定在标准TC处理的孔/板表面时，其可以在小鼠和人HSPC中诱导足以诱导T谱系细胞发育的Notch信号转导(Shukla等，2017)。但是，这种2D形式限制了规模化和传递强且持久的Notch信号以促进T细胞发育的能力。
Taqvi等的团队(2006)尝试用DL4来功能化2.8μm的磁性珠子，并将其与小鼠HSC共培养。将所述混合物置于OP9细胞之上，它们之间有可渗透的插入物。这阻止了干细胞和基质细胞之间的物理接触，但允许必需的可溶性因子通过以促进分化。虽然具有DL4功能化的μbead的培养物中确实出现了一些CD90+(Thy1)细胞，但Thy1的表达并非明确的T谱系标记。重要的是，CD19+B细胞也出现了。促进T细胞发育和抑制B细胞发育所需的持续Notch激活有一个阈值。B细胞仍然存在的事实表明，该系统不具有激活和维持Notch信号转导的能力。实际上，将珠子与细胞的比例从1：1增加至5：1促进了B细胞分化并阻止了Thy1表达。结合已知的诱导强Notch信号转导对基于细胞的或与板结合的Notch配体的需要，以μbead形式存在的可溶性Notch配体无法诱导所需水平的Notch信号转导的观点表明这种方法不太可能用于从HSPC产生T细胞。此外，未曾有人使用人CD34+细胞进行这些类研究。因此，仍有待确定的是，用DL4功能化的μbead是否可以提供从HSPC诱导T细胞发育所需的水平足够高且恒定的Notch信号转导，然后轻松规模化并可做临床应用转化。
因此，本发明人研究了将DL4-Fc缀合至μbead是否会创造一个高阶的DL4多聚体平台，其可以高效结合Notch受体并在具有HSPC的悬浮液中发挥功效，由此适用于规模化。
为促进DL4-Fc与μbead的连接，对DL4-Fc进行了化学生物素化处理，以备与SA包被的聚苯乙烯珠子结合(图1A)。通过Western Blot(图1B)确认生物素结合至DL4-Fc的情况，并通过对缀合前、后收获的上清液进行蛋白定量来测定其随后与珠子的缀合情况。为评估珠子大小对Notch信号传递的影响，将非生物素化的DL4-Fc共价缀合至50nm NHS活化的金纳米颗粒，并将生物素化的DL4-Fc共价缀合至1μm SA包被的DynabeadTM以及25μm和100μm的聚苯乙烯珠子(图2)。将功能化的珠子与3T3-N1Cluc共同孵育，其使用荧光素酶基因作为报告子报告Notch激活。各条件下合计的珠子数量代表相同的总表面积，因此DL4-Fc的分子总数也相同。这表明珠子的大小影响了DL4-Fc珠子激活Notch信号转导的能力，如萤光素酶活性水平所示(图2B)。值得注意的是，当与相同材料的其他尺寸的珠子或与1μm的Dynabead和50nm的纳米颗粒相比，直径为25μm的DL4-μbead对Notch受体激活作用的增强最大。
用25μm的DL4-μbead获取的Notch信号转导水平高于已知诱导T谱系分化所需的水平，其相当于20μg/mL与板结合(PB)的DL4-Fc。然后，通过将其与小鼠HSC孵育7天来确定添加IL-7、Flt3L和SCF后的DL4-μbead是否具有诱导T细胞发育的能力。结果显示，当与DL4-μbead孵育时，小鼠HSC容易产生proT细胞，以41％的细胞中表达CD25为标志(图3)。相反，PB-DL4-Fc仅在4％的细胞中诱导了CD25的表达。DL4-μbead还抑制了替代性的B细胞(CD19+)和髓样(CD11b+)谱系结局，而已知Notch信号转导可以阻止该结局。
DL4-Fc定向缀合至μbeads增强对Notch信号转导的诱导
为了改进朝向随机的第一代DL4-μbead，本发明人研究了控制DL4-Fc相对于珠子表面的朝向是否会增强Notch信号传递。为此，所述DL4-Fc经设计在其C末端具有BirA识别序列(AviTagTM)，单个生物素分子可以经酶促缀合至该序列(图4)。如通过3T3N1CLuc细胞荧光素酶活性进行评估所示，孵育这些第二代DL4-μbead显著提高了Notch信号转导(图5)。使用定向的缀合方法，重新评估了珠子大小对Notch传递的影响。结果表明，直径100μm、25μm、10μm和6.5μm的珠子均具有激活Notch的能力，但直径25μm的珠子具有最强效力(图6)。珠子与细胞的最佳比例也经过了评估，经确定当珠子与细胞的比例为3：1时，和与板结合的对照相比，Notch激活增加了10倍(图6)。
接下来研究了SA μbead是否为生物素化的DL4-Fc所饱和，以确定每个珠子中用以激活Notch信号转导的最佳DL4-Fc量。将不同量的DL4-Fc(0.01、0.1、1和10μg)孵育至相同数量的25μm的SA-珠子。然后将珠子与3T3-N1Cluc细胞孵育过夜。结果显示，1μg DL4-Fc对应2.25x105个SA-μbead给予了最强应答，表明DL4-μbead的活性已饱和(图7A)。还证明了，磁化的25μm聚苯乙烯珠子(包被有氧化铁)与其未磁化的对应物在激活Notch方面等效(图7A)。此外，用蛋白G-μbead替换相同直径的SA-μbead对DL4-Fc激活Notch的能力没有显著影响(图7B)。
因此，所述结果确立了以下参数：i)珠子的大小，ii)DL4分子的朝向，和iii)珠子与细胞的比例。优化这些参数对刺激Notch活性和确定T细胞发育的最佳条件有影响。另外，相对于珠子上DL4-Fc的负载量，确定了用以使活性最大化的DL4-Fc与珠子的比例，并且磁化珠子对Notch活性没有影响。进一步，与DL4-Fc的Fc区域结合的蛋白G-μbead很可能朝向DL4-Fc，与SA-μbead类似。
可使发育自HSPC的T细胞量最大化的DL4-μbead的条件
基于以上结果，本发明人接下来着手确定相同因素是否会影响T细胞的发育。首先使用小鼠HSPC对它进行测试。如图8所示，DL4-μbead在诱导小鼠T细胞发育方面比PB-DL4更有效。
为了确定HSPC与DL4-μbead的最佳比例以使proT细胞的产生量最大化，以3倍的数量递增DL4-μbead并在各条件下孵育3x103个HSPC(图9)。孵育7天后，针对不同的HSPC：DL4-μbead的比率，分析HSPC向proT细胞(CD25+)的分化。最佳HSPC：DL4-μbead比例约为1：9，因为这产生了最高百分比的CD25+细胞。将HSPC：珠子的数量比增加至1:27没有提升T谱系的分化。
使用DL4-μbead的人T细胞发育动力学和扩增
接下来验证了使用DL4-μbead来诱导CD34+UCB来源的HSPC向人T细胞发育。为此，使用了上文确立的最佳HSPC：DL4-μbead比例(1：9)。每2天对细胞计数，并进行流式细胞仪分析。结果显示，在培养的第4天时出现了共表达CD34、CD7和CD5的人proT细胞(图10A)。这些结果表明，人HSPC与DL4-μbead共同孵育达到了显著的proT细胞表型(CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-)，而与未缀合的μbead或与PB-DL4-Fc共同孵育则不能，证实了相比与板结合的DL4-Fc，DL4-μbead激活Notch的能力更强。
获得临床相关的proT细胞产量的挑战之一是难以获得足够的细胞数量。为解决这个问题，还对发育过程中的细胞扩增进行评估表明，截至第14天可以达到比初始起始数大150倍的总细胞扩增量(图10B)。
DL4-μbead促进成熟人T细胞发育
接下来研究了激活Notch能力增强的DL4-μbead是否可以诱导发育中的细胞分化进入T细胞发育的后期阶段，从而在之后的培养时间点表达更成熟的表型(图11)。对第28天和第47天的培养物进行分析显示，CD4+CD8+双阳性(DP)细胞构成细胞的约25％。值得注意的是，第47天的培养物显示出现了CD4+CD8+CD3+DP细胞和CD8+CD3+单阳性(SP)细胞。这些结果显示，由DL4-μbead诱导的强Notch信号转导可克服先前使用PB-DL4-Fc的尝试中所见的T细胞成熟的发育障碍。
动员的外周血(mPB)来源的HSPC与DL4-μbead共同培养时分化为T谱系细胞
成人mPB可能是比UCB更易于获得的HSPC来源，因为从单个个体获得的HSPC数量约为UCB的100倍。为比较T谱系发育的个体发生，将来自3个不同个体的mPB来源的CD34+HSPC与DL4-μbead培养，并与UBC来源的HSPC培养物进行比较(图12A)。经观察，在D14时T细胞的发育进程与CB来源的HSPC的进程非常相似，具有相似的proT细胞群体(CD34+CD7+)百分比。但是，对于14天后的扩增率，mPB来源的HSPC为110x，而CB来源的细胞则接近190x(图12B)。
使用DL4-μbead诱导iPSC中T细胞发育
根据本文所述的方法，诱导成纤维细胞来源的人iPSC分化为CD34+前造血细胞前体细胞。将CD34+细胞与DL4-μbead共同孵育，以确定其在发育的早期(图13A)和晚期(图13B)驱动多能细胞向T谱系发育的能力。发育的早期显示CD7细胞表面标志物正常增长，随后是CD5。T细胞发育的晚期阶段以第28天时CD4+非成熟单阳性(iSP)标志物的增长以及第35天时单阳性标志物CD8细胞为标志。值得注意的是T细胞受体(TCR)组分CD3(一种细胞表面标志)的存在，表明该培养物中成熟T细胞的存在。
当iPSC来源于T细胞(T-iPSC)时，表示TCRα和TCRβ基因座已经经过了基因重排，且当重新分化至T谱系命运时，这些细胞将表达已经重排的TCRαβ。将CD34+前造血祖细胞与DL4-μbead共同孵育，以确定在什么发育阶段TCR可由T-iPSC来源的细胞表达。在第12天检查的培养物显示，当成熟的T细胞标志物CD4和CD8尚未表达时，40％的细胞显示了TCRαβ和CD34的细胞表面表达，但80％的细胞确实表达了早期T细胞标志物CD7(图14，左图)。当针对CD7+细胞设门时，它们显示出超过70％的TCRαβ和CD3表达。在第24天时，超过80％的细胞表达TCRαβ和CD3，并且这些细胞中的许多已经获得了CD4和CD8的表达(图14，右图)。
VCAM-1加速了HSPC向T细胞的分化
为确定SA-μbead是否可作为添加其他生物素化分子的模块基础发挥作用，检测了VCAM-1的功能性作用。先前已经显示，将VCAM-1添加到与板结合的DLL4中加速了HSPC向T细胞的分化(Shukla等，2017)。在此，经基因设计、表达、和生物素化形成一种新的融合蛋白VCAM1-Fc。使用免疫印迹分析，确定了所产生VCAM1-Fc的大小与市售VCAM1产品的大小相似(图15，左图)。此外，含有用于BirA酶生物素化的目的序列的VCAM1-Fc，经证明是生物素化的(图15，右图)。然后使用生物素化的VCAM1-Fc以及不变量的DL4-Fc包被SA-μbead的表面，并与UBC来源的HSPC共同培养。对第7天的培养物分析表明，通常较高的VCAM1-Fc/DL4-Fc比例导致分化速率加快(图16)。这表明VCAM-1的活性以及μbead作为可控地添加共刺激分子的平台的灵活性与T细胞发育有关。
T细胞祖细胞定植到免疫缺陷小鼠及其随后向外周的迁移
选择免疫缺陷的NSG小鼠模型，以评估来源于HSPC/DL4-μbead的培养物的CD34+CD7+祖细胞T细胞(proT)定植入胸腺的能力。proT细胞的产量线性增加，从96孔培养板转换至T25烧瓶。从第7天的培养物中分选出ProT细胞，并经肝内注射至NSG新生小鼠。在第3周检查了早期定植，显示人CD45+细胞的存在，其中在胸腺中大多数处于双阳性CD4+CD8+(DP)成熟T细胞阶段(图17)。胸腺中不存在B细胞(CD19)和髓样细胞(CD33)的发育。
移植后第12周的分析显示，在胸腺中无proT细胞的更新发生，人CD45+细胞几乎全部分化并成熟为CD4和CD8 SP(图18)。其显示成熟的CD4和CD8SP已从胸腺迁移至脾脏以及骨髓中。这表明proT细胞具有在胸腺内成熟并正常迁移至次级淋巴器官的能力。
从培养物的细胞组分中分离μbead
评估AutoMACS(Miltenyi)从共培养细胞中分离氧化铁包被的DL4-μbead的能力(图19A)，以备为临床目的从HSPC/DL4-μbead共培养物中规模化生产proT细胞。AutoMACS的功能与临床上批准的CliniMACS(Miltenyi)相似，其从细胞组分中完全分离出了μbead(图19B)，因为在细胞部分无法检测出所述μbead。相反，一些细胞被捕获或保持附着于所述珠子部分中分离的μbead。
总结
在此，描述了对无细胞的基于珠子的系统的开发，所述系统用于从小鼠和人HSPC以及iPSC中产生T细胞。非与板结合的或悬浮的Notch配体(如DL4-μbead)代表了一种独特的容许高效地产生T谱系细胞的策略，其可以在大规模的基于生物反应器的悬浮培养物中轻松实现，并且有可能克服和与板结合的方法相关的细胞发育障碍以及效率低下和规模化能力的缺陷。
先前的研究未曾表明在无细胞支持的系统中，在未成熟的proT细胞阶段后产生人T谱系细胞。此外，本文的结果首次显示使用无细胞支持的培养系统从iPSC产生了T谱系细胞，包括proT以及成熟的SP CD4和CD8细胞。在此显示了本文所述的悬浮Notch配体培养系统容许成熟SP T细胞的出现，这表明使用本文所述的DL4-μbead获取的Notch信号转导可以克服使用与板结合的方法时所见到的T细胞成熟发育障碍。
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Claims (27)
1.产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮支持物是颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述悬浮支持物是微珠。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述具有Notch配体的干细胞或祖细胞为悬浮培养。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自：造血干/祖细胞(HSPC)、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述干细胞是CD34+或CD34+CD38-/loHSPC。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述干细胞是CD34+造血前体细胞，任选地为从iPSC分化而来的CD34+造血前体细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述Notch配体是DL4。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞(proT)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞是人类细胞，并且所述proT细胞具有CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-表型。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞是小鼠细胞，任选地为谱系-CD117+Sca-1+小鼠细胞，并且所述proT细胞具有CD25+或CD25+CD90+表型。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞培养于无基质细胞的培养基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞与至少一种T细胞共刺激分子一起培养，所述T细胞共刺激分子结合至悬浮支持物，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子是VCAM1。
15.T细胞谱系细胞，其中所述细胞通过权利要求1-14中任一项所述的方法产生。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞是T细胞祖细胞、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
17.悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)微珠，其中所述Notch配体缀合至所述微珠。
18.根据权利要求17所述的悬浮Notch配体，其中(i)所述微珠直径为6.5-100μm，和/或(ii)所述Notch配体的C-末端区域缀合至所述微珠。
19.权利要求17或18所述的悬浮Notch配体用于产生T细胞谱系细胞的用途。
20.试剂盒，包含：(i)悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物；以及(ii)所述悬浮Notch配体用于产生T细胞谱系细胞的用途说明书。
21.试剂盒，包含：(i)悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物；以及(ii)培养基。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述悬浮Notch配体包含缀合至微珠的DL4。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的试剂盒，还包含(iii)结合至悬浮支持物的至少一种T细胞共刺激分子，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子为VCAM1。
24.治疗患有需要增加T细胞数量的病况的受试者的方法，其包括：
(i)产生T细胞谱系细胞，包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，和(b)分离T细胞谱系细胞；以及
(ii)对受试者施用有效量的T细胞谱系细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是成熟的T细胞。
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