CN109312307A - 用于从干细胞和/或祖细胞生成祖t细胞的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了一种用于从干细胞和/或祖细胞生成祖T细胞的方法，所述方法包括在适合于生成祖T细胞的条件下将干细胞和/或祖细胞暴露于Notch配体δ样4(DL4)和血管粘附分子1(VCAM‑1)。所提供的方法适用于体外和体内pro‑T细胞生成。在体外，pro‑T细胞在无血清条件下生成。提供了使用该方法产生的细胞以及使用该细胞的方法。

Description

用于从干细胞和/或祖细胞生成祖T细胞的方法及其用途
在先申请的交叉引用
本申请根据巴黎公约要求于2016年4月8日提交的美国临时专利申请序列号62/320,005的优先权，该临时专利申请通过引用并入本文如同其全文在本文阐述一样。
本公开内容的领域
本说明书一般性地涉及用于生成祖T细胞(progenitor T cell)的体外方法。更特别地，本说明书涉及用于从干细胞和/或祖细胞体外生成人类祖T细胞的方法及其用途。
本公开内容的背景
T细胞是一种类型的淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中起重要作用。例如，T细胞在身体内参与调节免疫应答并且维持反复出现的病原体的免疫记忆。T细胞缺乏可能是致命的，特别是在化学疗法后的患者中，所述患者处于机会性感染的增加的风险中。
从造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell；HSPC)的常规体外T细胞发育在包含血清的培养基中和被工程化以表达Notch活化DL4蛋白的鼠(murine)OP9饲养细胞(OP9feeder)上进行1,2。该系统的不确定性和异种性使得难以研究内源性分泌因子或基质组分的作用，并且限制临床转化。已经报道了通过将Notch配体非特异性吸附至组织培养板上，可避免使用OP9饲养层3。然而，这种无OP9系统需要在培养基中使用大量的动物血清。也已经报道了将DL4固定至磁性微珠作为人工Notch信号传导系统。然而，这种方法遭受了向非T(B谱系)细胞的偏移4。在一项研究中，Notch配体Jagged1-Fc被机器人点制在微制造的柱上、压印在薄的硫醇化PEG水凝胶膜上、并经由马来酰亚胺修饰的蛋白A拴系，以研究其对单神经干细胞自我更新的影响5。然而，不存在证据表明这种小规模、单细胞方法将适用于转化为用于临床应用的T细胞发育。目前不存在用于T细胞发育的限定系统的报道。
本公开内容的概述
在一个方面，提供了一种从干细胞和/或祖细胞生成祖T细胞的方法。该方法包括在无血清条件下，在Notch配体δ样4(DL4)的至少部分和血管粘附分子1(VCAM-1)的至少部分的存在下培养干细胞和/或祖细胞以生成祖T细胞。
在一个实施方案中，培养步骤还包括生成所生成的祖T细胞的衍生物。
在一个实施方案中，DL4的部分包含DL4的细胞外结构域。在一个实施方案中，DL4被吸附或固定至基底上。
在一个实施方案中，VCAM-1的部分包含SEQ ID NO:4的Phe25-Glu698，所述Phe25-Glu698与人类IgG1的Fc区融合。
在一个实施方案中，DL4的部分以在7.5μg/mL至20μg/mL的范围内的浓度提供。在一个实施方案中，DL4的部分以约15-20μg/mL的浓度提供。
在一个实施方案中，VCAM-1的部分以在0.15μg/mL至5.3μg/mL的范围内的浓度提供。在一个实施方案中，VCAM-1的部分以约2.5-5.3μg/mL的浓度提供。
在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞的培养包括将所述干细胞和/或祖细胞暴露于包含SCF、FLT3L和IL-7的造血分化培养基。
在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是人类细胞。在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是多能干细胞或造血干祖细胞。
在一个方面，提供了通过本文公开的方法生成的祖T细胞的分离的群体。
在一个实施方案中，分离的群体包含祖T细胞的衍生物。
在一个实施方案中，群体包含至少20％的CD7+祖T细胞。在一个实施方案中，群体包含至少60％的CD7+祖T细胞。
在一个实施方案中，祖T细胞是表达CD7的人类细胞。在一个实施方案中，人类祖T细胞表达CD34、CD45RA和CD5中的一种或更多种。
在一个方面，提供了一种用于增加有相应需要的受试者中的T细胞数目的方法。该方法包括将有效数目的如本文提供的祖T细胞施用至受试者。
在一个实施方案中，受试者是人类。
在一个实施方案中，所施用的祖T细胞是自体的。
在一个实施方案中，所施用的祖T细胞是同种异体的。
在一个实施方案中，需要增加T细胞数目的受试者具有引起或导致淋巴细胞减少的医学状况。在一个实施方案中，医学状况是癌症、HIV感染、部分胸腺切除、自身免疫性疾病和/或器官移植。
附图描述
在以下参考附图的详细描述中，本公开内容的这些和其他特征将变得更加明显，在附图中：
图1a-图1c说明DL4-Fc配体可在HEK293T细胞中产生，并且其结合能力可使用双阴性(DN)T细胞来证实。
图1a：描绘了未转染的HEK293T(对照)细胞和转染的细胞(DL4-Fc)的10μg裂解物的免疫印迹，所述细胞针对人类IgG(抗-hIgG)进行免疫印迹以确定DL4-Fc的表达。
图1b：描绘了来自稳定表达DL4-Fc的培养的HEK293T细胞的上清液的考马斯蓝染色，所述上清液通过亲和纯化蛋白G柱并进行评价。
图1c：DL4-Fc配体结合双阴性(DN；CD4-CD8-)而非双阳性(DP，CD4+CD8+)胸腺细胞的描绘。
图2a-图2o描绘了用于有效T细胞分化的限定无血清培养基的鉴定。
图2a：2D包被的DL4测定的方案，其中将分选的E13.5sca1+ckit+胎肝HSPC以1000个细胞/孔的密度接种于标准96孔平底板中的200μl测试培养基中的包被的DL4配体上，所述测试培养基包含细胞因子25ng/mLSCF、5ng/mL Flt3L和1ng/mL IL7；将细胞在第4天用包含细胞因子的新鲜培养基再补料；在第7天，使用流式细胞术测定细胞的表面标志物表达。
图2b：描绘了在2D包被的DL4的存在或不存下在第7天的CD45+7AAD-活细胞相对于在第0天的输入物分选的HSPC的总倍数扩增的图。
图2c：描绘了在OP9血清培养基(αMEM+16％FBS)与无血清培养基组合物(αMEM+BIT和IMDM+BIT)中在10μg/mL吸附的DL4的存在或不存下在第7天的CD45+7AAD-活细胞相对于在第0天的输入物分选的HSPC的总倍数扩增的图(n＝3)；所有培养基组合物包含相同量的细胞因子(25ng/mL SCF、5ng/mL Flt3L和1ng/mL IL-7，以200μL培养基/孔)，具有在第4天50％培养基的更换步骤。
图2d：描绘了在DL4的存在或不存在下在不同培养基组合物中在第7天的CD25+CD90+祖T(proT)细胞相对于在第0天的输入物分选的HSPC的扩增的图(n＝3)(图2c和图2d中的数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图2e：针对CD45+7AAD-表达门控的血清(OP9培养基；αMEM+16％FBS)培养基与无血清(IMDM+BIT)培养基的代表性流式图；顶行显示CD25与CD44表达，而底行显示CD25与CD90表面标志物表达；误差条(errorbar)，标准偏差(n＝3)。
图2f：在OP9血清培养基中定量基线阳性对照分化的代表性流式细胞术图(n＝3)。
图2g：在IMDM+BIT无血清培养基中定量10μg/mL吸附的DL4配体上分化第7天的代表性流式细胞术图；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±标准偏差。
图2h：描绘了与血清培养基对照相比，在不同无血清培养基组合物中CD11b+髓样细胞产量与CD19+祖B细胞产量的图(标志物形状对应于来自子图(i)的培养基条件)；被填充的标志物指示2D包被的DL4条件，且空心的标志物指示无DL4条件。αMEM+BIT无血清培养基产生与血清培养基对照相当的最佳髓样细胞和B细胞产量。
图2i：描绘了与血清培养基对照相比，在不同无血清培养基组合物中在第7天的总CD45+7AAD-活细胞产量与DN1(CD25-CD44+CD45+)祖T细胞频率的定量的图。
图2j：描绘了在不同无血清培养基组合物中在分化第7天的CD25+CD90+产量与CD25+CD90+祖T细胞频率的定量的图；IMDM+BIT显示与血清OP9培养基对照相当的产量与频率。
图2k：描绘了在第7天的CD25+CD90+祖T细胞产量与DN2(CD25+CD44+CD45+)祖T细胞频率的定量的图；或者
图2l：与血清培养基对照相比，在不同的无血清培养基组合物中DN3(CD25+CD44-CD45+)定向(committed)祖T细胞的频率。
图2m：描绘了在OP9血清培养基(αMEM+16％FBS)与无血清培养基组合物(αMEM+BIT和IMDM+BIT)中在第7天的总CD45+7AAD-活细胞产量与DN1(CD25-CD44+CD45+)祖T细胞频率的定量的图。
图2n：描绘了与OP9血清培养基对照相比，在不同无血清培养基组合物中在第7天的CD25+CD90+proT细胞产量与DN2(CD25+CD44+CD45+)细胞频率的定量的图。
图2o：描绘了与OP9血清培养基对照相比，在不同无血清培养基组合物中在第7天的CD25+CD90+proT细胞产量与DN3(CD25+CD44-CD45+)细胞频率的定量的图(图2m-图2o中的阴影区域使用双变量核密度估计函数绘制；所有数据点描绘了n＝3个生物学重复)。
图3a-图3d描绘了与血清OP9培养基对照相比，不同无血清培养基组合物中髓样细胞和B细胞扩增的定量。
图3a：描绘了在2D包被的DL4的存在或不存在下在第7天的CD19+B细胞相对于第0天的输入物HSPC的倍数扩增的图；αMEM+BIT无血清培养基产生与血清培养基对照相当的最佳髓样细胞和B细胞产量。
图3b：描绘了在DL4的存在或不存在下在不同培养基组合物中在第7天的CD19+B细胞相对于在第0天的输入物分选的HSPC的扩增的图(n＝3)；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图3c：描绘了在2D包被的DL4的存在或不存在下在第7天的CD11b+髓样细胞相对于在第0天的输入物HSPC的倍数扩增的图。
图3d：描绘了在DL4的存在或不存在下在不同培养基组合物中在第7天的CD19+B细胞相对于在第0天的输入物分选的HSPC的扩增的图(n＝3)；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图4a-图4g描绘了工程化胸腺小生境(niche)的关键测定设计标准的优化。
图4a：描绘了针对增加的输入物第0天分选的HSPC接种密度/cm2被归一化的在第7天的总CD45+7AAD-活细胞扩增的定量的图(n＝3)(数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；而在具有高于3.1×103个HSPC/cm2的接种密度的培养物中，总细胞扩增显著更低，在具有低于3.1×103个HSPC/cm2的接种密度的培养物中观察到总细胞扩增的更高可变性。
图4b：描绘了分选的HSPC被接种在无血清IMDM+BIT培养基中增加的量的吸附的DL4上，并在第7天分析多种proT、B和髓样细胞群体的频率的图(n＝3)；在培养7天之后，7.5μg/mL的DL4是在IMDM+BIT无血清培养基中以等同于OP9血清培养基对照的水平支持DN3pro-T细胞生成的最低浓度。
图4c：描绘了分选的HSPC被接种在无血清IMDM+BIT培养基中的可溶性10μg/mLDL4配体中、吸附的10μg/mL或20μg/mL DL4配体上或者吸附和可溶性配体的混合物中，并在第7天定量细胞频率的图(n＝3)；在可溶性DL4中分化的HSPC产生显著更少的DN3细胞并保留DN1表型，而DN3细胞是吸附的DL4上的主要输出群体；在组合吸附的和可溶性DL4的条件下，可溶性DL4的存在阻碍了吸附的DL4对DN3细胞产生的诱导作用。
图4d：消除第4天培养基更换同时减少培养基消耗的方案；基线“再补料”分化策略包括将细胞接种在200μl培养基/孔中，在第4天50％培养基被更换并且使在第0天的细胞因子浓度加倍，以维持相同浓度；优化的“无补料”分化策略包括将细胞接种在50μl培养基/孔中，具有更高的细胞因子浓度并且在第4天无培养基更换。
图4e：实施以优化“无补料”分化策略的SCF、FLT3L和IL7的浓度的实验设计(DOE)表面响应方法的结果；设计立方体描绘了来自DOE模型的使用的细胞因子浓度的最佳浓度预测。
图4f和4g：描绘了对于阳性对照(25-5-1再补料条件)与使用无血清IMDM+BIT培养基优化的无补料过程，在第7天的DN2(k)或DN3(l)频率的图；通过简单地将IL-7浓度从2ng/mL增加至10ng/mL(50-10-10无补料条件)，细胞产生比对照显著更高的DN2产量和更高的T谱系定向DN3细胞频率和产量(阴影区域使用双变量核密度估计函数绘制；所有数据点描绘了n＝3个生物学重复)。
图5a-5g描绘了HSPC接种密度、配体选择和孔形状的设计参数的优化。
图5a：描绘了用增加的输入物第0天分选的HSPC的接种密度/cm2的在第7天的DN1、DN2、DN3、CD19+B细胞、CD11b+髓样细胞以及CD25+CD90+proT细胞亚组频率的定量的图(n＝3)；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图5b：描绘了用增加的DL1配体的包被浓度在第7天获得的DN1、DN2、DN3、CD19+B细胞、CD11b+髓样细胞以及CD25+CD90+proT细胞亚组频率的定量的图(n＝3)(数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；与先前的观察结果一致6，发现Notch配体DL1由于较弱的Notch途径活化对T细胞诱导的效率比DL4更低。
图5c：描绘了在具有在第0天未包被(-DL4)或10μg/ml DL4(+DL4)的U-底(U bot)与平底板(平bot)中在第7天的DN1、DN2、DN3、CD19+B细胞、CD11b+髓样细胞以及CD25+CD90+proT细胞亚组频率的定量的图(n＝3)(数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；尽管如先前报道的，孔的形状(U-底对平底)显著影响髓样细胞和B细胞的命运7，它确实不影响T细胞定向。
图5d：描绘了在0μg/mL DL4-Fc(无配体；阴性对照)和10μg/mLDL4-Fc(阳性对照)上在24小时之后针对组成型活性Renilla质粒被归一化以测试在10μg/mL和20μg/mL的DL1-Fc的活性的notch途径CBF-1Firefly活化的图(n＝3)；吸附的DL1配体以与DL4配体相似的包被浓度不能够维持祖T细胞产生或者活化Notch途径(数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图5e：描绘了在无配体、可溶性DL4、吸附的DL4或可溶性和吸附的DL4的混合物中使用核内CBF1-Firefly活化来测量的针对组成型活性Renilla质粒被归一化的Notch信号传导途径活化的图(n＝3)。
图5f：描绘了在最佳恒定IL7浓度同时改变SCF和FLT3L测试浓度以最大化定向DN3T祖细胞频率的合意性的实验设计(DOE)3D表面响应曲线。
图5g：描绘了在最佳恒定FLT3L浓度改变SCF和IL7测试浓度以最大化定向DN3T祖细胞频率的合意性的DOE 2D表面响应曲线。
图6a-6n说明了细胞基质VCAM-1增强工程化胸腺小生境中的DN3产量。
图6a：胎肝HSPC中α4β1、α4β7和α5β1整联蛋白(integrin)的表达的流式细胞术分析。Sca-1+c-kit+7AAD–细胞(HSPC区室)选自未分选的Ter119–细胞群体；HSPC表达α4β1和α5β1，且少数表达α4β7整联蛋白。
图6b：第0天的TER-119-消耗的细胞的流式细胞术分析首先针对Sca-1+cKit+细胞(HSPC区室)门控，并且随后定量α4β1和α4β7整联蛋白的表达(n＝3)。
图6c：描绘了在单独的10μg/mL DL4-Fc或者10μg/mL DL4-Fc与增加浓度的VCAM-1(0.24μg/mL、0.47μg/mL和2.32μg/mL)上培养的分选的Sca-1+cKit+HSPC的图；在第7天将DN1、DN2、DN3、CD19+B细胞、CD11b+髓样细胞和CD25+CD90+proT细胞频率定量(n＝3)。
图6d：描绘了在单独的10μg/mL DL4-Fc或者10μg/mL DL4-Fc与增加浓度的VCAM-1(0.24μg/mL、0.47μg/mL和2.32μg/mL)上在第7天的总DN3祖T细胞产量的定量的图；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图6e：描绘了进行以评价不同浓度的几种细胞因子(IL-6、可溶性IL-6R(sIL6R)、IL-11、IL-7、白血病抑制因子(LIF))、趋化因子(CCL25、SDF1α)和基质蛋白(VCAM-1)对在培养第7天的T-谱系定向DN3细胞频率的作用的筛选研究的图；数据表示n＝3个生物学重复的平均值±95％CI。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图6f：描绘了来自培养第5-7天的在单独的10μg/mL DL4-Fc或者DL4+纤连蛋白和DL4+VCAM-1上的DN1、DN2和DN3细胞的细胞速度(μm/min)的定量的图。
图6g：描绘了来自培养第6至7天的在单独的10μg/mL DL4-Fc或者DL4+VCAM-1上的DN1和DN3细胞的平均细胞速度(μm/min)的定量的图。
图6h：描绘了分选的HSPC在无包被、纤连蛋白(FN)、VCAM-1、DL4、DL4+FN和DL4+VCAM-1上的培养开始之后24小时和48小时的DN2(CD25+CD44+)生成频率的评价的图；与所有其他包被条件相比，DL4+VCAM-1显示最快的DN2细胞生成。
图6i：描绘了在无包被、2.32μg/mL VCAM-1、10μg/mL DL4、或DL4+VCAM-1上接种的分选的Sca-1+cKit+HSPC的图；在培养0小时、24小时和48小时定量DN2频率(n＝4)。
图6j：描绘了分选的HSPC在无包被、FN、VCAM-1、DL4、DL4+FN和DL4+VCAM-1上的培养开始之后24小时和48小时的DN3(CD25+CD44-)生成频率的评价的图。与所有其他包被条件相比，DL4+VCAM-1显示最快的DN3细胞生成。
图6k：描绘了在无包被、2.32μg/mL VCAM-1、10μg/mL DL4、或DL4+VCAM-1上接种的分选的Sca-1+cKit+HSPC的图。在培养0小时、24小时和48小时定量DN3频率(n＝4)。
图6l：在DL4与DL4+VCAM-1上培养之后24小时和48小时的HSPC的代表性流式图(n＝4)。
图6m：Notch1受体细胞内结构域(NICD)易位至细胞核以及包含几个反馈网络基序的T细胞发育基因网络的活化的说明。
图6n：描绘了在与分选的HSPC一起培养24小时和48小时之后在无包被、2.32μg/mLVCAM-1、10μg/mL DL4、或DL4+VCAM-1上的下游Notch途径基因(Hes1、Deltex、Notch1、Bcl11b、Gata3、Tcf7)、HSPC基因(E2a)和髓样谱系基因(PU.1)的qRT-PCR基因表达的图(n＝3)；数据表示n≥3个生物学重复的平均值±95％CI，除了qRT-PCR数据，该qRT-PCR数据表示n＝3个生物学重复的平均值±标准误差(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图7描绘了在DL4与细胞外基质诱因组合上的活细胞扩增；在分化的第7天，使用流式细胞术经由CD45+7AAD-门控定量活细胞；细胞在单独的DL4或DL4与增加剂量的VCAM-1上分化。
图8a-8h说明人类CD34+HSPC可在工程化胸腺小生境中生成祖T细胞。
图8a：在每种培养开始之前，输入物脐带血来源的HSPC的纯度被证实大于95％CD34+；在7AAD-活细胞群体上评价CD34+频率(n＝3)。
图8b：分析第0天脐带血来源的CD34+细胞(HSPC区室)的α4β1和α4β7整联蛋白的表达(n＝3)。
图8c和8d：描绘了在单独的吸附的10μg/mL DL4或DL4与纤连蛋白(FN)、纤维连接蛋白(RN)或VCAM-1上持续9天(图8c)或14天(图8d)培养的并且通过流式细胞术分析CD7、CD34、CD45RA和CD5的表达的人类脐带血来源的CD34+细胞的图。到第9天，DL4+VCAM-1培养物生成CD7+CD34-、CD7+CD45RA+和CD7+CD5+祖T细胞表型(n＝3)。
图8e：在工程化胸腺小生境上生长9天或14天的人类CD34+HSPC的代表性FACS图。早在培养的第9天就观察到共表达CD5和CD45RA的CD7+细胞的生成。
图8f：描绘了在单独的吸附的10μg/mL DL4或DL4与纤连蛋白(FN)、纤维连接蛋白(RN)或VCAM-1上的针对输入物第0天CD34+HSPC归一化的在第14天的CD7+CD34-细胞倍数扩增的图(n＝3)。
图8g：在单独的DL4或DL4+VCAM-1上生长14天的人类CD34+HSPC的代表性流式细胞术图(n＝3)。
图8h：描绘了在与人类CD34+HSPC一起培养24小时之后在无包被、2.32μg/mLVCAM-1、10μg/mL DL4、或DL4+VCAM-1上的下游Notch途径基因(Hes1、Deltex、Notch1、Bcl11b、Gata3、Tcf7)、HSPC基因(E2a)和髓样谱系基因(PU.1)的qRT-PCR基因表达的图(n＝5)；数据表示n＝5个生物学重复的平均值±标准误差(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图9a-9c描绘了在工程化胸腺小生境和对照OP9DL4系统上人类祖T细胞的生成。
图9a：描绘了在DL4+VCAM-1工程化胸腺小生境或对照OP9-DL4共培养物上的针对输入物第0天CD34+HSPC归一化的在第14天的总细胞扩增的图(n＝6)。
图9b：描绘了在DL4+VCAM-1工程化胸腺小生境或对照OP9-DL4共培养物上在第14天的CD7+表达的图(n＝6)；在OP9-DL4与工程化胸腺小生境之间未发现显著差异。
图9c：描绘了在OP9-DL4共培养物或在工程化胸腺小生境上14天之后CD7+CD34+、CD7+CD34-和CD7+CD5+群体的定量的图；数据表示n＝6个生物学重复的平均值±95％CI，除了流式图，该流式图表示n＝3只小鼠/组的平均值±标准偏差(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；n.s.指示不显著)。
图10a-10g描绘了在工程化胸腺小生境上生成的人类祖T细胞的体内成熟。
图10a：使用来源于工程化胸腺小生境或对照OP9-DL4系统的分选的CD7+细胞进行的体内研究的方案；将细胞通过肝内注射到SRG新生小鼠中，并且每4天用人类IL-7和IL-7抗体(M25)输注；在4周之后从胸腺中收获细胞，并且在10-12周之后从外周血和脾中收获细胞；将细胞针对人类CD45+表达进行电子门控以分析成熟T细胞表面标志物的表达。
图10b：描绘了如通过在鼠(murine)胸腺中定量的人类CD45+表达评价的在4周之后体内归巢至并且植入SRG新生小鼠胸腺的来源于工程化胸腺小生境或对照OP9DL4系统的分选的CD7+细胞的图。
图10c：来源于体内SRG胸腺的针对人类CD45+表达门控的并且发育为共表达CD3、CD4和CD8的双阳性T细胞的细胞的代表性流式图。
图10d：在输注来自OP9-DL4共培养物或来自工程化胸腺小生境的CD7+细胞之后4周从SRG胸腺收获的成熟T细胞上的CD7、CD5、CD1a、CD4和CD8共表达的代表性流式图(n＝3只小鼠/组)。
图10e：在输注来自OP9-DL4共培养物或来自工程化胸腺小生境的CD7+细胞之后10-12周从外周血收获的循环成熟细胞毒性T细胞上的CD8和CD3表达的代表性流式图(n＝3只小鼠/组)。
图10f：在用PMA和离子霉素体外刺激6小时后来自成熟CD3+T细胞的细胞内IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子分泌的代表性流式图(n＝3只小鼠/组)(细胞在输注来自OP9-DL4共培养物或来自工程化胸腺小生境的CD7+细胞之后10-12周从脾收获)；(对于图10d-10f，表示n＝3只小鼠/组的平均值±标准偏差的流式图。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；n.s.指示不显著；在OP9-DL4与工程化胸腺小生境之间未发现显著差异)。
图10g：提出的机制的示意图。
图11a-11o描绘了来自补料分批式(fed-batch)扩增的CD34+脐带血细胞的祖T细胞的生成。
图11a：来源于脐带血的经由补料分批式和补料分批式+UM729小分子生物反应器技术的第0天CD34+HSPC的扩增的方案；在第12天从两种培养方法收获细胞并且分选CD34+和CD34-群体；将来自两种培养方法的分选的CD34+和CD34-细胞连同解冻的未扩增的第0天CD34+HSPC以4000个细胞/96-孔(用20μg/mL DL4和2.3μg/mL VCAM-1包被过夜)接种在包含100ng/mL SCF、Tpo、Flt3L和IL-7的无血清IMDM+BIT培养基中；将培养物在7天后再补料，并且在14天后收获，用于淋巴样和髓样谱系细胞表面标志物的FACS分析。
图11b：描绘了从100,000个第0天未扩增的CD34+MACS-富集的细胞、第12天补料分批式(FB)和第12天补料分批式+UM729(FB+UM)培养物获得的CD34+细胞的总产量的图。
图11c：描绘了从第12天FB和第12天FB+UM培养物获得的CD34-细胞的总产量的图。
图11d：描绘了在总培养的第26天或在DL4+VCAM-1测定的第14天从来源于第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM培养物的CD34+细胞获得的淋巴样和髓样群体的频率的图；被评价的群体包括NK(CD7+CD56+)、proB(CD34+CD19+)、preB/B(CD34-CD19+)、B(CD5+CD19+)、髓样细胞(CD34-CD14/33+)、嗜中性粒细胞(CD14/33+CD16+)和proT(CD7+)；不具有UM的第12天FB来源的CD34+细胞显示最高频率的CD7+proT细胞和向髓样谱系的最小偏移。
图11e：描绘了在总培养的第26天或在DL4+VCAM-1测定的第14天从来源于第12天FB和第12天FB+UM培养物的CD34-细胞获得的淋巴样和髓样群体的频率的图；两种培养物产生最高频率的髓样细胞。
图11f：描绘了对由来源于第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM培养物的CD34+细胞产生的CD7+细胞评价祖T细胞标志物的共表达的图；第12天FB来源的CD34+产生最高频率的CD7+CD5+和CD7+CD45RA+proT细胞，而第0天CD34+产生最高频率的CD7+CD34+原始祖细胞。
图11g：描绘了当对由来源于第0天或第12天FB培养物的CD34-细胞产生的表达CD7的细胞进行评价时，未观察到祖T细胞标志物的共表达的图。
图11h：描绘了在proT细胞测定中的CD7+细胞/输入物CD34+(来自第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM)的产量的图；第12天FB显示proT测定中的CD7+细胞/输入物CD34+的最高产量(n＝3)。
图11i：描绘了来自从第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM培养物获得的CD34+细胞总数的CD7+细胞的产量的图；同样，第12天FB显示来自从每个培养方法获得的CD34+细胞总数的CD7+细胞的最高产量(n＝3)。
图11j：描绘了来自从第0天脐带血或第12天补料分批式扩增培养物(第12天FB)收获的总CD34+细胞的在2D DL4+VCAM-1包被的板上在14天之后的CD7+proT-细胞产量的图(n＝3)。
图11k：描绘了从第0天脐带血或第12天补料分批式扩增培养物(第12天FB)收获的每个输入物CD34+细胞的在2D DL4+VCAM-1包被的板上在14天之后的CD7+proT-细胞产量的图(n＝3)。
图11l：描绘了在proT细胞测定中的CD7+CD56+NK细胞/输入物CD34+(来自第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM)的产量的图；第12天FB趋向具有proT测定中的NK细胞/输入物CD34+的最高产量(n＝2)。
图11m：描绘了来自从第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM培养物获得的CD34+细胞总数的NK细胞的产量的图；第12天FB趋向具有来自从每个培养方法获得的CD34+细胞总数的NK细胞的最高产量(n＝2)。
图11n：描绘了在proT细胞测定中的CD33+/CD14+髓样细胞/输入物CD34+(来自第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM)的产量的图；第12天FB+UM在proT测定中趋向具有与第0天脐带血等同的髓样细胞潜能/输入物CD34+，而第12天FB显示受抑制的髓样细胞偏移(n＝2)。
图11o：描绘了来自从第0天脐带血、第12天FB和第12天FB+UM培养物获得的CD34+细胞总数的髓样细胞的产量的图；第12天FB+UM趋向具有来自从每个培养方法获得的CD34+细胞总数的髓样细胞的最高产量(n＝2)。
图12a-12d描绘了来自人类多能干细胞(hPSC)来源的生血内皮(hemogenicendothelium；HE)细胞的祖T(CD7+CD56-)细胞的生成。
图12a：在培养的第6天产生的hPSC来源的HE细胞的表型；描绘了表达CD34+的共表达CD43和CD73的细胞的流式图。
图12b：第6天hPSC来源的CD34+HE细胞的磁性富集和富集后CD34+表达的评价。
图12c：将第6天富集的CD34+细胞接种于OP9DL4或DL4+VCAM-1无血清培养物上并且在两周后经由流式细胞术测定祖T细胞标志物的代表性流式图；从接种于DL4+VCAM-1板上的PSC来源的CD34+细胞中观察到表达低水平CD5的CD7+CD34-细胞的生成。
图12d：使用来源于脐带血(umbilical cord blood)的第0天CD34+HSPC将阳性对照培养物并行接种于DL4+VCAM-1板上的代表性流式图；将来自第6天PSC来源的HE的CD34-级分也接种于DL4+VCAM-1上，并且测定祖T细胞产生。
图13a-13c描绘了以较大规模培养格式的人类祖T细胞的生成。
图13a：描绘了并行地在OP9-DL4基质共培养物(n＝6)上或者在用DL4+VCAM-1包被的96孔板(n＝6)、6孔板(n＝3)或贴壁培养生物反应器袋(n＝1)上的无血清条件中分化14天的UCB来源的CD34+细胞的总细胞扩增的图。
图13b：描绘了CD7+、CD7+CD34+、CD7+CD34-、和CD7+CD5+祖T细胞的频率的图。
图13c：代表性流式图显示第14天在OP9DL4、DL4+VCAM-1包被的6孔板及DL4+VCAM-1包被的贴壁培养生物反应器袋上产生的CD7+、CD7+CD34+、CD7+CD34-、和CD7+CD5+祖T细胞。
本公开内容详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
如本文使用的，术语“干细胞”指可分化为更为特化的细胞并具有自我更新能力的细胞。干细胞包括多能干细胞(pluripotent stem cell)(PSC)，诸如胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)，以及多潜能干细胞(multipotent stem cell)，诸如脐带血干细胞和成体干细胞，它们见于多种组织中。
如本文使用的，术语“祖细胞”指可分化为一种或更多种类型的细胞但通常不具有自我更新能力的细胞。祖细胞是干细胞的衍生物，并且相对于其对应的来源干细胞具有更有限的潜能。例如，在成人骨髓、外周血(以较少的数量)和脐带血中发现的造血干细胞(HSC)具有产生所有其他血细胞的能力。造血祖细胞是来源于HSC的多潜能或谱系定向细胞，其具有产生更有限或特定类型的血细胞的能力。造血干祖细胞(HSPC)通常作为体内异质群体存在，并且具有作为如本文描述的异质群体的作用。
如本文使用的，术语“祖T细胞”和“pro-T细胞”指来源于多能干细胞或CD34+造血干细胞和/或祖细胞并表达CD7+(人类系统)或CD25+CD90+(小鼠系统)并且具有分化为一种或更多种类型的成熟T细胞的能力的细胞。成熟T细胞包括表达CD4、CD8和CD3细胞表面标志物的组合的细胞。
如本文使用的，“限定培养基”指仅包含化学上限定的成分的化学上限定的制剂。限定培养基可包括具有已知化学组成的成分。培养基成分可以是合成的和/或来源于已知的非合成来源。例如，限定培养基可包括从已知组织或细胞分泌的一种或更多种生长因子。然而，限定培养基将不包括来自此类细胞的培养物的条件培养基。限定培养基可包含从动物分离的特定的已知血清组分，包括人类血清组分，但限定培养基将不包含血清。在限定培养基中提供的任何血清组分，诸如，例如牛血清白蛋白(BSA)，优选地基本上是同质的。
如本文使用的，“无血清培养基”指缺乏动物血清的细胞培养基。无血清培养基可包含从动物(包括人类动物)分离的特定的已知血清成分，诸如，例如BSA。
如本文使用的，“δ样4”、“DL4”和“Notch配体DL4”指人类中由DLL4基因编码的蛋白。DL4是Notch信号传导途径的成员，并且在本领域中也被称为“δ样配体4”和“DLL4”。在本文中，提及DL4不限于完整DL4蛋白，而是至少包括DL4的信号传导肽部分。例如，包含在C-末端与人类IgG1的Fc区融合的人类DLL4(全长DLL4登录号NP_061947.1；SEQ ID NO:1)的细胞外结构域(Met 1-Pro 524)的商购可得的产品(Sino Biologicals)是适用于本文的DL4蛋白。
如本文使用的，“血管细胞粘附分子1”和“VCAM-1”指人类中由VCAM1基因编码的蛋白。VCAM-1是细胞表面唾液酸糖蛋白，一种为Ig超家族的成员的I型膜蛋白。VCAM-1在本领域中也被称为血管细胞粘附蛋白1和分化簇106(CD106)。在本文中，提及VCAM-1不限于完整VCAM-1蛋白，而是至少包括VCAM-1的信号传导肽部分(QIDSPL(SEQ ID NO:2)或TQIDSPLN(SEQ ID NO:3))。例如，包含与人类IgG1的Fc区融合的小鼠VCAM-1(全长鼠VCAM-1登录号CAA47989；SEQ ID NO:4)的(Phe25-Glu698)区的商购可得的小鼠VCAM-1Fc嵌合蛋白(R&D)是适用于本文的VCAM-1蛋白。使用人类VCAM-1(全长人类VCAM-1登录号P19320、NP001069、EAW72950；SEQ ID NO:5)的至少部分也可适于在本文提供的方法中使用。
本公开内容的一般描述
如本文描述的，本发明人已经确定了一种用于在无血清系统中生成祖T细胞(pro-T细胞)的体外方法。该方法包括在无血清培养基中在Notch配体δ样4(DL4)和VCAM-1的存在下培养干细胞和/或祖细胞以生成pro-T细胞。在一个实施方案中，本发明人发现DL4和VCAM-1协同增强Notch信号传导并且促进pro-T细胞分化和迁移。
提供了使用本文提供的方法生成的pro-T细胞。本文提供的细胞可用于例如治疗需要pro-T细胞和/或更为成熟的T细胞的受试者，如下文进一步描述的。例如，需要另外的pro-T细胞和/或成熟T细胞的宿主可经历细胞移植，所述细胞移植包括有效量的本文提供的pro-T细胞或有效量的本文提供的pro-T细胞与干细胞(例如，HSPC)的组合。
体外生成祖T细胞的方法
通常，生成pro-T细胞的体外方法包括在适于分化为pro-T细胞的条件下并且持续适于分化为pro-T细胞的时间，在无血清培养基中在DL4和VCAM-1的存在下培养干细胞和/或祖细胞。为了确认pro-T细胞的生成，可分析细胞的指示pro-T细胞的一种或更多种特征，诸如，例如一种或更多种细胞表面标志物。
在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是多能干细胞，诸如ESC或iPSC。在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是HSPC。例如，HSPC可从脐带血、外周血或骨髓中获得，或者它们可在体外来源于ESC、iPSC或其他中间干细胞。在一个优选的实施方案中，干细胞和/或祖细胞是人类细胞。
在一个实施方案中，方法在二维(2D)培养系统中进行。例如，将标准组织培养板的一个或更多个孔用DL4和VCAM-1包被。在一个实施方案中，DL4和VCAM-1作为吸附的蛋白提供。然后将干细胞和/或祖细胞接种到2D DL4和VCAM-1包被的孔中的无血清造血分化培养基中，并且在适于生成pro-T细胞的条件下并且持续适于生成pro-T细胞的时间进行培养。通常适于造血分化的培养基是本领域技术人员已知的并且商购可得。在一个实施方案中，本文描述了适用于在本文提供的方法中使用的用于造血分化的优选的培养基。
在一个实施方案中，将标准96孔组织培养板的孔用约50μL/孔的浓度范围为7.5-20μg/mL(优选地约15-20μg/mL)的DL4-Fc和浓度范围为0.15-5.3μg/mL(优选地约2.3-5.3μg/mL)的VCAM-1-Fc包被过夜。然后洗涤包被的孔以去除未结合的配体，并用无血清造血分化培养基中的干细胞以例如约1000-4000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在一个优选的实施方案中，无血清造血分化培养基是限定培养基，诸如，例如，具有20％牛血清白蛋白、胰岛素和运铁蛋白血清替代物的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM+BIT)。在一个优选的实施方案中，将接种的细胞在促进pro-T细胞分化的生长因子，诸如，例如，干细胞因子(SCF)、FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、血小板生成素(thrombopoietin)(TPO)和白细胞介素7(IL7)的存在下培养。将接种的细胞在适当的温度(例如37℃)培养并且持续足以生成pro-T细胞的时间，诸如，例如9-21天(人类)或7-14天(小鼠)。为了确认pro-T细胞的生成，可分析在2D系统中培养的细胞的指示pro-T细胞的一种或更多种特征，诸如，例如特定的分子标志物。
通常，胸腺中的pro-T细胞发育的特征在于通常被称为DN1、DN2、DN3和DP的四个连续阶段(DN＝CD4和CD8表达双阴性且DP＝CD4和CD8表达双阳性)。鼠pro-T细胞可经由细胞表面上的CD25和CD44的表达被追踪，其进展经由连续的双阴性(DN；CD4-CD8-)阶段：DN1(CD25-CD44+CD90-)、DN2(CD25+CD44+CD90+)、DN3(CD25+CD44-CD90+/-)，并且最终成熟为双阳性(DP；CD4+CD8+)和单阳性(SP；CD4+CD3+或CD8+CD3+)T细胞。人类pro-T细胞可经由细胞表面上的CD4和CD8的表达被追踪，其进展经由连续的双阴性(DN；CD4-CD8-)阶段：CD7+CD34+原始祖T细胞、随后是CD7+和/或CD34-和/或CD5+和/或CD45RA+pro-T细胞，并且最终成熟为双阳性(DP；CD4+CD8+)和单阳性(SP；CD4+CD3+或CD8+CD3+)T细胞。在一个实施方案中，本文提供的方法可用于生成CD25+CD90+鼠pro-T细胞。在一个实施方案中，本文提供的方法可用于生成CD7+人类pro-T细胞。
使用本文提供的体外方法生成的祖T细胞
提供了使用本文提供的方法生成的pro-T细胞。优选地，pro-T细胞是人类pro-T细胞。在一个实施方案中，人类pro-T细胞可经由细胞表面上的CD4和CD8的表达在表型上被表征，其进展经由连续的双阴性(DN；CD4-CD8-)阶段：CD7+CD34+原始祖T细胞、随后是CD7+和/或CD34-和/或CD5+和/或CD45RA+pro-T细胞，并且最终成熟为双阳性(DP；CD4+CD8+)和单阳性(SP；CD4+CD3+或CD8+CD3+)T细胞。在一个实施方案中，本文提供的人类pro-T细胞可通过CD7表达被表征。通常，淋巴样细胞可通过其小且圆的形态以及通过吉姆萨染色中的蓝色颜色来鉴定。在一个实施方案中，本文提供的pro-T细胞可在功能上被表征。例如，CD7+pro-T细胞的体内移植应导致移植的细胞归巢至胸腺，植入胸腺中，并且然后快速分裂以生成DP和SP T细胞。
在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是多能干细胞，诸如ESC或iPSC。在一个实施方案中，干细胞和/或祖细胞是HSPC。例如，HSPC可从脐带血、外周血或骨髓中获得，或者它们可在体外来源于ESC、iPSC或其他中间干细胞。在一个优选的实施方案中，干细胞和/或祖细胞是人类细胞。
在一个实施方案中，使用本文提供的方法生成的pro-T细胞是自体的。
在一个实施方案中，使用本文提供的方法生成的pro-T细胞是同种异体的。
预期本文提供的同种异体pro-T细胞可被转移至需要pro-T细胞的受辐照的受试者，而无论主要组织相容性复合物(MHC)差异如何。不受理论束缚，认为pro-T细胞与成熟T细胞不同，不会引起移植物抗宿主病(GVHD)，这至少因为pro-T细胞前体在胸腺中完成其分化，在胸腺中它们受限于宿主MHC并产生宿主耐受的T淋巴细胞。因此，在本文提供的pro-T细胞的治疗用途中不要求严格的组织相容性。
本文提供的细胞可用于例如治疗需要pro-T细胞和/或更为成熟的T细胞的受试者。“治疗”我们意指在适于增加受试者中T细胞数目的条件下将有效量的如本文提供的细胞施用至受试者，这可导致预防、抑制和/或治疗处理与T细胞不足相关的医学状况。“有效量”我们意指治疗有效量，诸如，例如，在施用至受试者后足以实现预期目的(例如治疗)的细胞的量。该量可以在受试者之间变化，并且可取决于一个或更多个因素，诸如，例如，受试者的性别、年龄、体重、受试者的健康史和/或待预防、抑制和/或治疗的状况的根本原因。
例如，罹患引起或导致淋巴细胞减少的医学状况的受试者可受益于如本文描述的pro-T移植物的施用。例如，化学疗法后和/或辐照后的受试者，诸如接受癌症治疗的那些受试者，患有HIV感染、部分胸腺切除、自身免疫性疾病诸如狼疮或类风湿性关节炎、或糖尿病的受试者可受益于本文提供的pro-T细胞的施用。在一个实施方案中，所施用的细胞可以是自体的。在一个实施方案中，所施用的细胞可以是同种异体的。在一个实施方案中，本文提供的细胞可用于在器官移植后诱导宿主耐受性。
用于生成祖T细胞的试剂盒
本公开内容构思了用于实施本文提供的方法的试剂盒。此类试剂盒通常包含生成pro-T细胞所需的两种或更多种组分。试剂盒的组分包括但不限于化合物、试剂、容器、设备和用于使用该试剂盒的说明书中的一种或更多种。因此，本文描述的方法可通过利用本文提供的预先包装的试剂盒来进行。
在一个实施方案中，提供了一种用于在体外从PSC或HSPC生成pro-T细胞的试剂盒。该试剂盒包含DL4和VCAM-1。在一个实施方案中，DL4被吸附或固定至基底上。在一个实施方案中，VCAM-1被吸附或固定至基底上。在一个实施方案中，试剂盒还包含造血分化培养基，所述造血分化培养基优选地包含以造血量的生长因子，诸如SCF、Flt3L、IL7和/或TPO。例如，生长因子的量可以如下：10-50ng/mL(小鼠培养物)和约100ng/mL(人类培养物)。在一些实施方案中，提供了用于使用该试剂盒在体外从干细胞和/或祖细胞(诸如PSC或HSPC)生成pro-T细胞的说明书。该说明书可包括关于以下的一个或更多个方案：准备DL4，并且任选地，准备VCAM-1组分；向培养系统提供DL4和/或VCAM-1组分；培养条件，诸如时间、温度和/或气体孵育浓度；收获方案；和用于鉴定pro-T细胞和任选地更为成熟的T细胞的方案。
试剂盒还可包括可用于进行本发明方法的材料，诸如，例如培养板、孔板、培养皿等。
通过参考以下实施例描述非限制性实施方案，所述实施例不应被解释为限制性的。
实施例1：方法
在实施例1中，描述了随后实施例中使用的方法。
胎肝分离和HSPC分选。
未定时的妊娠(E13-14)雌性CD-1小鼠从Charles River实验室(Wilmington,MA)购买。动物使用和实验方案根据加拿大动物照护协会(the Canadian Council on AnimalCare)的指南由多伦多大学动物照护委员会(the University of Toronto Animal CareCommittee)批准。使用外科手术镊从去头的小鼠胚胎(E14-15)中分离胎肝。将胎肝置于包含2％胎牛血清(FBS；Invitrogen)(或HF)的Hank平衡盐溶液(HBSS；Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并且使用16号钝端针(Stemcell Technologies)破碎。为了获得单细胞悬液，将细胞轻轻地通过21号针三次。将细胞以1500rpm在4℃离心(spin down)5min并且用HF洗涤两次。随后，根据制造商的说明，通过EasySepTM磁性分选(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)使细胞经历两轮Ter119消耗。将Ter119-胎肝细胞以1×107个细胞/mL在冰冷的HF中染色以用于HSPC分选。将细胞用1％抗Fc受体抗体(Fc-阻断,BD Biosciences,SanJose,CA)阻断非特异性结合，并且用抗Sca-1-PE和抗cKit-APC(BD Biosciences,SanJose,CA)在冰上染色20分钟。使用7-氨基放线菌素D(7-AAD；Invitrogen)从活细胞分选中排除死细胞。将细胞使用FACSAriaTMII(Becton Dickinson)、AstriosTM(BeckmanCoulter)或MoFloTM XDP流式细胞仪(Beckman Coulter)以1×106个细胞/mL进行分选。同型对照和单染色的补偿对照被用于设定用于分选的阈值门，使得阴性对照包含99.5％的阴性细胞。
DL4-Fc产生和包被的DL4-Fc板制备。
商购可得的DL4-Fc从Sino Biologicals(Cedarlane Labs,Burlington,Ontario,Canada)购买或者如下文描述在内部(in-house)制造并用于实验。将DL4-Fc以10μg/mL稀释于冷却的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，或者以20μL/孔和50μL/孔在标准组织培养96孔板中在4℃包被过夜。在接种细胞之前将孔用PBS洗涤一次以从孔中去除任何未结合的配体。对于某些实验，还将孔用50μL/孔的包含以本文描述浓度的DL4-Fc和VCAM-1-Fc(R&D)或纤连蛋白(Sigma)的PBS包被过夜。
基因工程化的DL4-Fc通过将鼠Dll4的细胞外结构域的编码序列(SEQID NO:1的氨基酸残基1-529)与人类IgG1的Fc部分(包括铰链区)融合并且将其插入到pIRESpuro2哺乳动物表达质粒(Clontech,Mountainview,CA)中来生成。将HEK-293T细胞使用标准CaPO4转染方法转染，并且基于细胞对添加至培养基DMEM[补充有10％(v/v)FBS、2mM Glutamax、青霉素(100U/ml)/链霉素(100mg/ml)(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL的所有产品)、2mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MI)]中的2μg/mL嘌呤霉素的耐受性来筛选具有稳定整合的质粒的细胞。将细胞扩增并且转移以在FreeStyleTM 293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。将分泌到培养基中的DL4-Fc融合蛋白使用附接至plusTM(GE Health.)自动色谱系统的HiTrapTM蛋白G亲和柱(GE HealthcareLife Sciences,Marlborough,MA)纯化。对于某些实验，如先前描述8产生DL1-Fc。
分选的HSPC接种和体外培养。
将分选的sca1+ckit+HSPC在DL4-包被的96孔板中在具有20％牛血清白蛋白、胰岛素和运铁蛋白血清替代物(BIT；Stemcell Technologies)、1％GlutaMAXTM(Gibco)和1μg/mL低密度脂蛋白(Calbiochem,La Jolla,CA)的无血清Iscove改良的Dulbecco培养基(Gibco,Rockville,MD)[IMDM+BIT]中以1000个细胞/孔(对应于3.1×103个细胞/cm2)进行培养。对于阳性对照培养物，使用OP9血清培养基，其包含αMEM培养基(Gibco)和16％FBS(HycloneTM,GE Health.)。除了使用αMEM(Gibco)作为基础培养基外，无血清αMEM+BIT培养基完全按照IMDM+BIT培养基来制备。以200μL/孔添加补充有25ng/mL干细胞因子(SCF；R&D Systems,Minneapolis,MN)、5ng/mL FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3L；R&D Systems)和1ng/mL白细胞介素(IL-7；R&D Systems)的OP9血清培养基、αMEM+BIT或IMDM+BIT无血清培养基，具有在第4天包含2倍浓缩的细胞因子的50％培养基的更换步骤，如先前描述的9。使用响应面法使用Design-(v10)进行以计算机建模的实验设计(DOE)以研究不同浓度的SCF、Flt3L和IL-7用于最大化DN3T细胞产量并且最小化IMDM+BIT培养基的体积的组合合意性。在DOE优化之后，以50μL/孔添加补充有50ng/mL SCF(R&DSystems)、10ng/mL Flt3L(R&DSystems)和10ng/mL IL-7(R&D Systems)的IMDM+BIT无血清培养基，除非文中另有描述，持续测定长度不进行培养基更换。对于无血清IMDM+BIT培养基中的候选因子筛选，以列出的浓度使用以下蛋白或小分子：JAK抑制剂I(50nM；EMD Millipore)、IL-11(10ng/mL、50ng/mL、和100ng/mL；R&D Systems)、IL-6(10ng/mL、50ng/mL、和100ng/mL；R&D Systems)、IL-6R(100ng/mL；R&D Systems)、Ccl25(1.5μg/mL；R&D Systems)、IL-7(50ng/mL、100ng/mL、和200ng/mL；R&D Systems)、SDF1α(Cxcl12；200ng/mL；R&D Systems)、和白血病抑制因子(LIF；0.1ng/mL、1ng/mL、和10ng/mL；EMD Millipore)。
对于人类HSPC培养，根据西奈山医院(Mount Sinai Hospital)的伦理批准程序从自愿的捐赠者收集脐带血样品。根据制造商的说明，使用EasySepTM人类CD34阳性选择试剂盒(Stemcell Technologies)从红细胞(RBC)裂解的脐带血级分中分离CD34+细胞。在每次富集之后进行流式细胞术以确保CD34频率大于95％。将CD34+HSPC以12,500个HSPC/cm2(对应于4000个细胞/孔)的较高的接种密度在DL4和VCAM-1包被的96孔板上培养14天。在培养的第7天进行一次完全的培养基更换，并且将细胞返回至同一DL4和VCAM-1包被的板上。对于某些实验，如文中描述的，单独地或与(Takara Shuzo)或纤连蛋白(Sigma Aldrich)一起包被DL4-Fc。将CD34+细胞在具有20％牛血清白蛋白、胰岛素和运铁蛋白血清替代物(BIT；Stemcell Technologies)、1％GlutaMAXTM(Gibco)和1μg/mL低密度脂蛋(Calbiochem)的无血清Iscove改良的Dulbecco培养基(Gibco)中培养。以50μL/孔添加补充有100ng/mL SCF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、100ng/mL Flt3L(R&D Systems)、100ng/mL Tpo(R&DSystems)和100ng/mL IL-7(R&D Systems)的培养基。
流式细胞术。
表面标志物染色用缀合的大鼠抗小鼠抗体(BD Biosciences,San Jose,CA,表1)进行。将所有样品在FACSCantoTM或FACS LSRFortessaTM流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。在培养的第7天，通过多于一次(multiple)HF冲洗使得细胞离开板，用针对CD45、CD25、CD44、CD90、CD11b和CD19的抗体以1:400稀释在冰上染色20分钟。将人类祖T细胞用针对CD34、CD7、CD5和CD45RA的抗体以1:100稀释进行染色。使用针对α4、β1、和β7整联蛋白亚基的抗体分析Sca-1+cKit+小鼠HSPC和CD34+人类脐带血细胞上的整联蛋白表达。对于细胞内细胞因子染色，将脾细胞收集、洗涤并且用荧光染料缀合的针对CD45和CD3的抗人类抗体染色，并且随后用IL-2、IFN-γ和TNF-α-s特异性抗体使用Cytofix/CytopermTM试剂盒(BDBiosciences)固定和透性化。如表1中描述购买所有小鼠抗人类抗体。将细胞用HF洗涤两次，并且将死细胞使用以1:1000稀释的7-AAD(Life Technologies)排除。使用软件分析流式数据并进行批次处理，并且在Python(版本2.7.10)中进一步分析。
用于测量Notch活化的NIH3T3萤光素酶测定。
在前一天将NIH3T3细胞以125,000个细胞/孔接种于6孔板中，并且按照制造商的说明，使用HD转染试剂(Promega Corporation,Madison WI USA)用Notch1、CBF1-Firefly和组成型活性Renilla质粒瞬时转染过夜。将转染的NIH3T3细胞接种于DL4包被的板上或于DL4-缀合的MC中持续24小时，然后根据制造商的说明使用双萤光素酶报告物测定系统(Promega Corporation,Madison WI USA)测量针对Renilla表达被归一化的Firefly活化。
活性成像
将分选的Sca-1+cKit+HSPC以低密度(200个细胞/孔)接种到包被有不同底物的96孔板的一式三个孔中。在培养6天之后，将细胞用针对CD25-APC和CD44-PE的缀合抗体(1:500稀释)在37℃染色1小时。然后在5％CO2和37℃受控条件下在AxioObserver Z1(Zeiss)平台上进行活细胞成像而不进行洗涤。使用10×0.3NA air物镜在24小时内以5分钟(或10分钟)的间隔捕获明视野图像。为了最小化光毒性和光漂白，荧光APC和PE通道中的图像以较长的30分钟(或60分钟)的间隔采集。图像采集和处理使用ZEN 2012蓝色版软件(Zeiss)进行。手动追踪使用Image-J软件进行。在3个独特的仅DL4孔和3个独特的DL4+VCAM-1孔中追踪细胞。对仅在DL4条件下的43个细胞(15个、10个和18个细胞/孔)和DL4+VCAM-1条件下的69个细胞(30个、14个和25个细胞/孔)进行手动追踪。
定量实时PCR
将分选的Sca-1+cKit+鼠HSPC以20,000个细胞/孔接种于96孔板中的无包被、10μg/mL DL4、2.32μg/mL VCAM-1、和DL4+VCAM-1上，并且在培养的24小时和48小时使用多于一次PBS冲洗来收集。将CD34+人类脐带血细胞在相同条件下接种，并且在培养的24小时、48小时和96小时之后收集。根据制造商的方案使用PureLinkTM RNA微型试剂盒(Invitrogen)将细胞裂解并且分离RNA。根据制造商的方案使用SuperScriptTM III逆转录酶(Invitrogen)将RNA转化为cDNA，并且在FastStart SYBR Green Master Mix(Roche)中用各自的引物扩增。热循环和定量使用QuantStudioTM 6Flex(Applied Biosystems)进行。个体基因的相对表达通过Δ循环阈值(ΔCt)方法计算，其中β肌动蛋白的表达作为内部参考。PCR引物序列在表2中可得。
小鼠。
hSIRPαtg RAG2-/-γc-/-(SRG)小鼠从Jackson实验室(Bar Harbor,ME)购买并且于无病原体的设施中安置并喂养。所有动物程序均经桑尼布鲁克健康科学中心动物照护委员会批准(the Sunnybrook Health Sciences Centre Animal Care Committee)。
人类CD34+HSPC的补料分批式生物反应器扩增培养
根据西奈山医院(Mt.Sinai Hospital)(Toronto,ON,Canada)的伦理批准程序从自愿的捐赠者收集脐带血样品。细胞如先前描述10的使用HetaSep(StemCellTechnologies)被消耗红细胞(RBC)。根据制造商的方案，使用人类CD34+富集试剂盒(StemCell Technologies)，使用EasySep系统选择CD34+祖细胞。将新鲜分离的CD34+细胞以1×105个总细胞/mL的密度接种。将细胞接种于补充有100ng/mL干细胞因子(SCF,R&DSystems或CellGenix)、100ng/mL FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3L,R&D Systems或CellGenix)、50ng/mL Thrombopoietin(TPO,R&D Systems或CellGenix)、2mM GlutaMAX(GIBCO)和/或500nM UM729小分子的StemSpan-ACF培养基(StemCell Technologies)中。如先前描述11的将细胞在培养期间以最低限度的手动操作培养12天。
在第12天从补料分批式或补料分批式+UM729收获细胞，并且分选CD34+和CD34-群体。将来自两种培养方法的分选的CD34+和CD34-细胞连同解冻的未扩增的第0天CD34+HSPC以4000个细胞/96-孔(用20μg/mL DL4和2.3μg/mL VCAM-1包被过夜)接种在包含100ng/mLSCF、Tpo、Flt3L和IL-7的无血清IMDM+BIT培养基中。将培养物在7天后再补料，并且在14天后收获，用于淋巴样和髓样谱系细胞表面标志物的FACS分析。
将人类祖T细胞植入免疫缺陷小鼠中。
将人类CD34+HSPC在工程化胸腺小生境中培养14天。分选CD7+祖T细胞，重悬于包含重组人类白细胞介素7(rhIL-7；0.5μg)与IL-7抗体M25(2.5μg)的PBS混合物中，并且肝内注射到2-5天龄的SRG新生小鼠中。每只小鼠接受以30μl总体积的4×105个CD7+祖T细胞。作为对照，将小鼠用来自第14天HSPC/OP9DL4共培养物的CD7+细胞注射，如先前描述的2。将小鼠每4天用IL-7/M25混合物腹腔内加强。在肝内移植之后4-12周收获胸腺、脾和外周血，并且用CD3、CD1a、CD7、CD5、CD4、CD8和CD45抗人类抗体分析细胞。对于细胞内细胞因子染色，在肝内注射OP9-DL4或DL4-VCAM来源的CD7+细胞之后10-12周从SRG小鼠收获脾细胞。将细胞以1×105个细胞/孔的密度接种于OP9培养基中，并且与50ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA；Sigma Aldrich)、500ng/mL离子霉素(Sigma Aldrich)和3μg/mL布雷菲德菌素A(eBioscience)孵育6小时。如以上描述，将细胞在刺激后用PBS洗涤并且染色以用于细胞内细胞因子染色。
人类多能干细胞(hPSC)来源的生血内皮细胞的生成。
AggrewellsTM(24孔,StemCell Technologies)使用由硅胶母模(silicone mastermold)铸造的400μm聚二甲基硅氧烷插入物在内部制造并且如先前描述的(Ungrin等,2008)进行灭菌。对于生血内皮细胞分化，将MEF上的hPSC用5分钟的TrypLETM Express处理解离，并且以1:3的分流比涂布于(1:50稀释的)或(1:30稀释的)包被的6孔板上，进行48小时的MEF消耗。将MEF消耗的hPSC用TrypLETM Express处理，随后进行刮擦并进行机械解离。将单细胞悬液转移至AggrewellTM板的补充有ROCK抑制剂Y-27632(RI)(1:1000,Sigma Aldrich)的生血内皮细胞诱导培养基中，并且然后将板以1500rpm离心5分钟以在个体微孔中形成细胞聚集物。生血内皮细胞诱导培养基包含BMP4(40ng/ml,R&D)、VEGF(50ng/ml,R&D)、SCF(40ng/ml,R&D)、和bFGF(5ng/ml,Peprotech)。基础培养基包含-34(Invitrogen)、抗坏血酸(50μg/ml；Sigma)、L-谷氨酰胺(1％v/v,Invitrogen)、青霉素/链霉素(1％v/v)、1-单硫代甘油(4×10-4M；Sigma)、和运铁蛋白(150μg/ml；Roche)。
在培养的第6天，收获细胞并且使用TrypLETM Express解离。使用EasySepTM人类CD34阳性选择试剂盒(Stem Cell Technologies)富集CD34+细胞。在选择后表征细胞的CD34+表达，并且接种于DL4-Fc和VCAM-Fc包被的板上的包含BIT 9500血清替代物(20％v/v,Stem Cell Technologies)、青霉素/链霉素(1％v/v)、GlutaMAXTM(1％v/v,Gibco)、低密度脂蛋白(1μg/mL,Calbiochem,La Jolla,Ca)和100ng/mL各SCF、Flt3L、Tpo和IL-7(R&D)的无血清IMDM基础培养基(Gibco,Rockville,MD)中持续两周。将细胞在培养的第7天再补料，并且在14天结束时收获细胞用于经由流式细胞术的分析以确定祖T细胞表面标志物。
扩展的祖T细胞分化
将脐带血来源的CD34+细胞在OP9DL4基质共培养物中分化，并且与用DL4+VCAM-1包被的96孔板或6孔板中的限定无血清分化培养物进行比较。将96孔板的一半(15.4cm2)与6孔板中的两个孔(19.0cm2)或贴壁培养生物反应器袋(24cm2)中的12cm×2cm修剪的表面区域进行比较。在14天之后分析CD7+、CD7+CD34+、CD7+CD34-和CD7+CD5+祖T细胞的频率。
实施例2：用于有效T细胞分化的限定无血清培养基的鉴定。
胸腺中的祖T细胞发育的特征在于通常被称为DN1、DN2、DN3和DP的四个连续阶段(DN＝CD4和CD8表达双阴性，且DP＝CD4和CD8表达双阳性)。理想的限定祖T细胞分化测定应旨在支持专门定向为T淋巴样谱系的DN3T细胞的扩增。另外，DN2和DN3T细胞上的CD90必须被上调并且与CD25共表达以确认它们的祖T细胞身份。常规的体外T细胞分化在含血清培养基中的OP9基质饲养层上进行。开发用于T细胞分化的限定测定中明显的第一步是建立消除对血清和饲养细胞(feeder)两者的需求的条件。为了替换OP9饲养层，生成DL4-Fc蛋白，并且证实该配体的纯度和结合DN T细胞而不是DP T细胞的功能，因为这些细胞类型差异表达Notch-1受体(图1a-1c)。接下来，使用接种于吸附的DL4-Fc配体上的E13.5小鼠胎肝来源的分选的sca1+ckit+HSPC测试三种不同的无血清培养基组合物的T细胞分化能力。用鼠HSPC进行测定开发，目的是随后将该系统转化为临床相关的人类祖T细胞生成。基于可扩展的人类脐带血来源的HSPC扩增和无血清多能干细胞来源的中胚层分化的先前经验12,13，选择IMDM+BIT和D2SFD培养基类型。将培养物在4天之后再补料，并且在7天之后分析祖T细胞表面标志物(图2a)。对未处理的表面(阴性对照)和OP9-DL4基质共培养物(基于其SCF、Flt3L和IL-7补充浓度被测定的阳性对照9)进行并行培养。在Notch配体DL4-Fc不存在下，所有三种无血清培养基都产生等同的活血细胞(CD45+7AAD-)扩增水平，出乎意料地该水平显著高于含血清培养基阳性对照(OP9基质培养基；αMEM+16％FBS)(图2b、2c)。在DL4-Fc处理的表面上，IMDM+BIT无血清培养物生成与OP9培养基阳性对照培养物等同水平的CD45+血细胞，并且CD45+细胞水平显著高于测试的其他无血清培养基(图2b、2c)。仔细观察在胸腺中顺序分化的DN祖T细胞亚组，IMDM+BIT培养基产生DN1、DN2和DN3T细胞亚组以及显著更高的CD25+CD90+共表达，指示祖T细胞(图2d-2g)。在Notch配体不存在下还定量偏移至非T细胞命运的谱系水平，以评价由所有培养基类型支持的默认(default)细胞分化。在DL4不存在下，αMEM+BIT无血清培养基生成最大产量的CD11b+髓样细胞和CD19+B细胞，其显著更高(图2h；图3a、图3b)。在DL4配体不存在下，D2SFD和IMDM+BIT培养基显示出最小量的髓样和B谱系偏移，使得它们成为进行下一步的更好的祖T细胞培养基候选物。甚至在DL4配体存在下，αMEM+BIT也显示出与OP9培养基相当的髓样细胞扩增(图3c、图3d)。
接下来，通过定量每个DN亚组的频率及其对活细胞产量的贡献来评价每种培养基的祖T细胞分化潜能。在无血清培养基候选物中，IMDM+BIT培养基在分化7天之后保留了最低频率的DN1细胞，这与OP9基质培养基对照相当(图2i)。另外，IMDM+BIT还产生与OP9基质培养基对照相似频率和产量的CD25+CD90+细胞，并且该频率和产量显著高于其他无血清培养基类型(图2j)。然后，进一步检查DN2和DN3细胞对CD25+CD90+区室的个体贡献。IMDM+BIT培养基具有对CD25+CD90+区室的比OP9基质培养基对照更低频率的DN2贡献，尽管对总CD25+CD90+产量的贡献与OP9相当且显著高于其他培养基类型(图2k)。T谱系定向DN3频率和产量在IMDM+BIT和OP9基质培养基之间是相当的，并且显著高于所有其他无血清培养基类型(图21)。与IMDM+BIT无血清培养基相比，对用OP9血清培养基的DL4处理的表面还观察到共表达CD90的定向DN3细胞中的更高可变性(图2m-2o)。这表明，IMDM+BIT培养基以与OP9培养基相似的水平促进原始DN1T细胞区室的增殖并且减少DN2阶段中细胞的频率以促进DN3T细胞的扩增。因此，关键测定设计标准的随后优化用IMDM+BIT无血清培养基进行。
实施例3：工程化胸腺小生境的关键测定设计标准的优化
测定开发中的下一步是评价不同关键培养参数对体外T细胞发育的影响。接种密度、DL4配体浓度和存在以及培养基利用被优化，以建立增加系统中T细胞产生的稳健性、再现性和产量的策略。
首先，将分选的sca1+ckit+HSPC的细胞接种密度在无血清IMDM+BIT培养基中在10μg/mL吸附的DL4配体上进行调节。在细胞密度低于1000个细胞/孔(3125个细胞/cm2)时，观察到总细胞扩增的高可变性(图4a)。总细胞扩增在细胞密度高于3.1×103个细胞/cm2时也显著降低(图4a)。这可能是由于HSPC区室中的固有可变性，并且进一步纯化输入物细胞来源可以消除这种可变性。然而，在1000个细胞/孔和更高的接种密度，总倍数扩增的可变性被最小化。在测试的输入物细胞密度之间未观察到DN亚组频率中的显著差异(图5a)。替代的髓样细胞和B细胞命运偏移在1000个细胞/孔(3125细胞/cm2)输入物密度的情况下也是最小的(图5a)。还观察到，将接种密度增加高于1000个细胞/孔导致细胞扩增降低。因此，对于随后的测定优化，选择1000个HSPC/孔(或3125个细胞/cm2)作为输入物细胞接种密度。
接下来，改变测定中吸附的DL4配体的浓度以确定稳健的T细胞分化所需的Notch配体的最小浓度。7.5μg/mL DL4是在培养7天之后以等同于标准10μg/mL DL4条件的水平支持T谱系定向DN3细胞的生成的最小浓度(图4b)。另外，DN1细胞的频率随着吸附的DL4配体的较高浓度而降低，而DN2、DN3和CD25+CD90+共表达随着吸附的DL4配体的较高浓度而增加，进一步证实了Notch活化在促进T细胞发育中的作用。基于这些结果，10μg/mL浓度的吸附的DL4被设定用于随后的实验。还研究了使用δ样1(DL1)作为替代的Notch-1配体，如已经在OP9基质共培养系统中使用的那样6。在相同包被浓度范围内的DL1配体不能够生成DN2或DN3祖T细胞，并且细胞保留DN1表型(图5b)。有趣的是，由于较弱的Notch途径活化，发现Notch配体DL1对于T细胞诱导的效率比DL4低(图5d)。这些结果通过先前公布的DL4是用于Notch-1受体相互作用的比DL1亲和力更高的配体的结果14,15得到证实。此外，先前的研究已经表明，由于增加的同型祖B细胞相互作用，孔的形状可决定B淋巴样谱系发育7。虽然观察到在DL4不存在下在U-底孔形状中CD19+B细胞发育增加的趋势，包被的DL4孔的形状未介导对T细胞发育的作用(图5c)。
先前已经表明，可溶性形式的DL1对C2C12成肌细胞中的Notch功能是抑制性的8。因此，研究了可溶性DL4对T细胞发育的可能的抑制作用。因此，在吸附的DL4上、可溶性DL4中或吸附和可溶性DL4的混合物中在培养7天之后测量每个DN亚组以及髓样细胞和B淋巴样细胞的频率。不仅可溶性DL4配体不足以支持向DN2和DN3亚组的T细胞发育，而且事实上可溶性DL4配体的存在完全抑制了吸附的DL4配体的诱导作用(图4c)。与10μg/mL吸附的DL4配体相比，当HSPC在10μg/mL可溶性DL4配体中分化时未生成DN3细胞，并且细胞保留DN1表型(图4c)。因此，需要将DL4配体固定至表面上以维持用于T细胞发育的Notch信号传导。当评价将吸附和可溶性DL4配体组合的作用时，发现可溶性DL4的存在完全阻碍了吸附的DL4对DN3细胞产生的诱导作用。然而，在相同总浓度的固定的DL4配体(20μg/mL)中，在可溶性配体不存在下，HSPC以与10μg/mL包被的DL4对照等同的频率生成DN3细胞(图4c)。这确认了在包含可溶性和固定的DL4两者的培养物中观察到的DN3发育的抑制是由于可溶性DL4的存在并且与DL4浓度的增加无关。为了确定可溶性DL4对T细胞分化的抑制作用的机制，替代物NIH3T3细胞系测定被工程化以通过核内CBF1-萤光素酶表达定量Notch途径活化。该测定揭示，甚至当细胞处于固定的DL4上时，可溶性DL4的添加也积极地抑制Notch1受体的细胞内结构域的易位(图5e)。从这些结果得出的结论是，在我们的工程化胸腺小生境中必须确保不存在可溶性未结合的DL4，因为即使痕量水平也可能抑制T细胞产生。
接下来，研究了消除第4天培养基更换以通过减少用户操作和培养基成本来改进再现性、同时维持或增强祖T细胞产量的可能性(图4d)。使用实验设计(DOE)建模方法(图4e)，通过改变添加至系统中的外源细胞因子的浓度来检查减少培养基消耗的能力。基于先前公布的OP9基质共培养系统9，基线对照使用200μL培养基/孔中的25ng/mL SCF、5ng/mLFlt3L和1ng/mL IL-7(25-5-1再补料条件；图4f-g)。当培养基体积被减少到可能的最小量(50μL/96-孔)同时保持细胞因子浓度恒定时，与基线对照相比，总细胞倍数扩增降低了近三分之一(25-5-1无补料条件；图4f-4g)。然而，当细胞因子浓度被加倍至50ng/mL SCF、10ng/mL Flt3L和2ng/mL IL-7时，细胞增殖能力恢复，与对照相当，但细胞未显著分化为DN2或DN3T细胞(50-10-2无补料条件；图4f-4g)。通过简单地将IL-7浓度从2ng/mL增加至10ng/mL(50-10-10无补料条件；图4f-4g)，细胞产生比对照显著更高产量的T谱系定向DN3细胞。使用DOE，通过建模和测试SCF、Flt3L和IL-7的非线性组合，使能够以高频率和产量产生DN3细胞的合意性指数的优化(图5f、5g)。因此，通过调节外源细胞因子浓度同时降低培养基消耗，增加了T细胞分化的效率，同时减少了需要添加至系统中的细胞因子的总量，并且消除了在测定过程中用户操作的需要。
实施例4：细胞基质VCAM-1增强了限定T细胞分化测定中的DN3产量
作为工程化我们的胸腺小生境的下一步，检查了细胞外基质蛋白纤连蛋白或胸腺上皮细胞呈递的基质蛋白VCAM-1的掺入，以确定限定T细胞分化测定中的DN3产量是否可以被改进。已经显示两种蛋白在祖T细胞增殖、存活、归巢和特化中发挥多效作用16,17。由于纤连蛋白和VCAM-1是当与β1或β7整联蛋白配对时α4和α5整联蛋白的配体17，首先确认分选的sca1+ckit+HSPC区室上这些整联蛋白受体的表达。事实上，α4β1和α5β1以非常高的水平表达，而α4β7在HSPC中以低水平表达(图6a、6b)。
接下来，研究了在限定T细胞分化测定中增加固定的VCAM-1浓度的作用。VCAM-1显著降低DN1频率，同时以剂量依赖性方式增加CD25+CD90+频率(图6c-6d)。具体地，增加剂量的VCAM-1提高了DN3细胞的频率，而DN2、髓样和B细胞区室保持不变(图6c)。由于VCAM-1的包含不影响CD45+7AAD-细胞的总产量(图7)，VCAM-1提高了限定T细胞分化测定中的DN3细胞的纯度和总产量。在已知对体内胸腺细胞发育是重要的候选细胞因子、趋化因子和基质蛋白的筛选中18,19,20,21，VCAM-1对促进T谱系定向DN3细胞具有最显著的作用(图6e)。
接下来，使用活细胞成像研究了VCAM-1对DN T细胞运动性的影响，因为它牵涉到作为一种用于体内胸腺迁移的基质的(stromal)基质(matrix)22。在限定T细胞分化测定中手动追踪从第5天至第7天的单细胞的随机迁移模式，并且使用用于CD25和CD44的表面标志物染色区分DN1、DN2和DN3表型(数据未示出)。发现与在单独的DL4上培养的这些亚型的速度相比，VCAM-1显著增加所有三种DN1-3亚型的速度(图6f、6g)。为了研究VCAM-1如何增强DN3产生的机制，检查了在与DL4和VCAM-1相互作用之后24小时和48小时在分选的HSPC中被上调的表面标志物表达和关键Notch途径基因。与任何其他包被条件相比，发现在DL4和VCAM-1上在24小时的DN2细胞和在48小时的DN3细胞加速产生(图6h-6l)。在与DL4和VCAM-1相互作用的最初48小时内，在分选的HSPC中检查了T细胞发育基因调节网络中的关键节点(图6m)。还发现，与单独的DL4相比，在DL4和VCAM-1存在下，下游Notch途径基因诸如Hes1、Gata3、Tcf7和Deltex的显著增加(图6n)。另外，与单独的DL4相比，在DL4和VCAM-1存在下，髓样基因PU.1在48小时更快速地被下调(图6n)。最后，Notch1受体基因表达和干细胞因子E2a在所有包被条件下保持不变(图6n)。因此，通过增强Notch途径基因活化和细胞运动性，VCAM-1与DL4协同相互作用以增加测定中的DN3T细胞产量。由此增加了对Notch配体的接近，使能够更强地活化下游Notch途径基因，其快速活化T细胞发育GRN并抑制替代的谱系途径。
实施例5：人类CD34+HSPC可在工程化胸腺小生境中生成祖T细胞
至此时所描述的限定T细胞分化测定的开发表示已经被优化以将小鼠HSPC分化为DN3定向T细胞的工程化“胸腺小生境”。通过将人类脐带血来源的CD34+HSPC分化为祖T细胞确认了工程化胸腺小生境向人类系统的转化。所期望的T谱系定向鼠DN3T细胞的人类等同物是CD7+CD5+CD45RA+共表达祖T细胞，其已经被证明比CD34+HSPC更快速地植入免疫缺陷小鼠的胸腺1。迄今，仅基质共培养系统或基于血清的非限定培养基已经用于从CD34+细胞产生祖T细胞23,24。在开始每种培养之前，我们证实了输入物HSPC的纯度大于95％CD34+(图8a)。α4β1在CD34+HSPC中以非常高的水平表达(96.9％±1.1％)，而α4β7在CD34+HSPC中以低水平(5.5％±1.0％)表达(图8b)。尽管单独的DL4可在无血清IMDM+BIT培养基中生成让人联想到(reminiscent)最早的胸腺内祖细胞表型的CD7+CD34+细胞，发现DL4本身不足以驱使这些祖细胞进入T细胞发育的后期阶段(图8c、8d)。因此，测试了细胞外基质蛋白纤维连接蛋白、纤连蛋白和VCAM-1与DL4组合的掺入，以确定这些蛋白是否可以诱导祖T细胞。发现纤维连接蛋白或纤连蛋白联合DL4不能够沿着T细胞谱系进一步分化CD7+CD34+祖细胞(图8d)。事实上，与小鼠系统中的观察结果相似，仅DL4+VCAM-1能够生成失去CD34表达并且共表达CD5和CD45RA的后期CD7+祖T细胞群体(图8d)。早在培养的第9天，祖CD7+T细胞开始上调CD45RA+和CD5+的表达，并且表达水平增加多达至第14天(图8d)。此外，与单独的DL4或DL4与纤连蛋白或纤维连接蛋白相比，DL4+VCAM-1使能够增加CD7+CD34-成熟的人类祖T细胞的扩增(图8f)。流式细胞术揭示，与单独的DL4相比，在DL4+VCAM-1存在下，限定测定中T细胞发育的后期更明显(图8g)。
与单独的DL4相比，DL4和VCAM-1协同增强Notch靶基因表达(图8i-8j)。在人类细胞中观察到的上调动力学与在小鼠细胞中观察到的不同。Deltex和Gata3在24小时内快速地被上调，并且显示持续增加多达至96小时。相比之下，观察到相对于单独的DL4，Bcl11b在显著增强之前需要96小时的刺激(图8h)。
接下来，进行了我们的工程化胸腺小生境与金标准OP9DL4基质共培养测定的比较。发现OP9DL4使得能够发生与工程化胸腺小生境相似的总活细胞扩增(图9a)。两种系统均产生了共表达CD5的相当的CD7+祖T细胞群体(图9b-9c)。然而，在两个系统之间的CD7+CD34+原始祖T区室频率中观察到差异(图9b、9c)。在培养的第14天从两个系统分选CD7+祖T细胞，并且肝内注射到SRG新生小鼠中以评价体内植入潜能(图10a)。在四周之后，收获来自这些小鼠的胸腺，并且发现高水平的人类CD45+细胞植入物(图10b)。两个系统生成了共表达CD3的类似的高DP T细胞频率(图10c、10d)。在植入后10-12周之后，在外周血中检测到成熟的循环CD3+CD8+T细胞，表明DL4+VCAM-1来源的祖T细胞能够重建免疫缺陷SRG小鼠的外周(图10e)。为了确认功能成熟，在体内10-12周之后从免疫缺陷SRG小鼠收获的CD3+T细胞在体外用PMA和离子霉素刺激。观察到高水平的人类IL-2、IFN-γ和TNF-α免疫调节细胞因子分泌(图10f)。因此，得出的结论是，在工程化胸腺小生境中产生的人类CD7+祖T细胞是功能性的并且能够在体内归巢和植入胸腺。不受理论束缚，我们预测DL4活化HSPC上的Notch-1受体，其导致NICD易位至细胞核，在细胞核中它活化Notch基因调节网络(顶图；图10g)。当DL4与VCAM-1共同存在时(底图；图10g)，在HSPC上表达的α4整联蛋白受体与VCAM-1接合，这导致下游Notch靶基因的更高活化、增加的运动性和对T细胞命运的加速定向。
实施例6：培养的CD34+细胞可在工程化胸腺小生境中生成祖T细胞
在建立人类脐带血来源的CD34+细胞(或第0天CD34+细胞)可以在工程化胸腺小生境中生成功能性祖T细胞后，测试CD34+细胞的培养物以确定这些细胞是否具有等同于它们的第0天CD34+细胞对应物的T淋巴样潜能。在补料分批式生物反应器中生长CD34+细胞是培养CD34+细胞的一种方式。具体地，先前已经证明，补料分批式生物反应器技术可用于产生具有自我更新、多谱系再生(repopulating)能力的CD34+HSPC的快速(12天)11倍增加。测试了从来源于补料分批式(FB)或补料分批式与UM-729小分子补充(FB+UM)的分选的第12天CD34+细胞与其第0天CD34+细胞的起始输入物群体相比的祖T细胞的生成(图11a)。与对照FB培养物相比，补料分批式生物反应器系统中的UM-729小分子补充在扩增12天之后增强了总CD34+产量并且最小化CD34-产量(图11b、11c)。
与第0天CD34+细胞和第12天FB+UM来源的CD34+细胞相比，来自FB培养物的分选的CD34+细胞在14天之后在工程化胸腺小生境中生成最大频率的CD7+proT细胞和CD7+CD56+NK细胞(图11d)。FB来源的CD34+细胞也显示出最小的髓样(CD34-CD14/CD33+)细胞偏移，而第0天CD34+和第12天FB+UM CD34+显示等同的髓样细胞频率(图11d)。所有条件均未生成proB细胞(CD34+CD19+)、preB/B细胞(CD34-CD19+)、B细胞(CD5+CD19+)或嗜中性粒细胞(CD14/CD33+CD16+)(图11d)。来自FB和FB+UM培养物两者的分选的CD34-细胞主要生成高频率的髓样细胞，因此显示T淋巴样潜能受限于CD34+细胞(图11e)。研究了CD7+细胞上共表达的proT谱系表面标志物，并且发现尽管CD7+CD34+原始祖细胞在第0天CD34+细胞中最高，第12天FB来源的CD34+细胞生成最高CD5+和CD45RA+共表达的CD7+proT细胞(图11f)。尽管小的CD7+细胞群体从FB来源的CD34-细胞生成(图11e)，但这些细胞不共表达CD34、CD5或CD45RA(图11g)。
接下来，对从CD34+细胞生成的CD7+proT细胞的产量进行定量。第12天FB在工程化胸腺小生境中生成最高产量的CD7+细胞/输入物CD34+细胞，而第0天CD34+和第12天FB+UM在proT测定中生成等同的CD7+产量/输入物CD34+(图11h、11k)。如果在补料分批式培养物中生成的所有CD34+细胞(图11b)在工程化胸腺小生境中分化，与第12天FB+UM来源的CD34+或第0天CD34+细胞相比，第12天FB将生成最大数目的总CD7+proT细胞(图11I、11j)。类似地，第12天FB来源的CD34+细胞在工程化胸腺小生境中生成最大数目的NK细胞/输入物CD34+细胞以及来自在FB培养系统中生成的总CD34+细胞的总NK细胞产量(图11l、11m)。相比之下，第12天FB来源的CD34+在工程化胸腺小生境中生成最少数目的髓样细胞/输入物CD34+细胞(图11n)。与第0天CD34+和第12天FB来源的CD34+细胞相比，第12天FB+UM来源的CD34+生成来自总CD34+细胞的最高产量的髓样细胞(图11o)。因此，与输入物第0天CD34+细胞相比，补料分批式生物反应器技术生成了展示出淋巴样谱系偏倚的CD34+细胞，具有最小的髓样谱系偏移，生成更高产量的CD7+proT细胞和NK细胞。向补料分批式生物反应器系统中添加UM-729增强了总的CD34+细胞生成，其维持与输入物第0天CD34+细胞相似的淋巴-髓样分化潜能。
实施例7：多能干细胞(PSC)来源的CD34+细胞在工程化胸腺小生境中生成CD7+细 胞
将PSC在无血清、基于限定聚集物尺寸的中胚层分化方案中分化6天，以生成共表达CD43和CD73的CD34+生血内皮细胞(图12a)。使用基于磁性的细胞富集，选择CD34+群体并且使用流式细胞术评价富集的细胞群体的纯度(图12b)。将PSC来源的CD34+细胞接种于金标准OP9DL4培养系统或DL4+VCAM-1工程化胸腺小生境中两周。OP9DL4系统生成来自T细胞发育的所有阶段的细胞，包括CD7+CD34+、CD7+CD34-和CD7+CD5+(图12c)。工程化胸腺小生境产生CD7+CD34+、CD7+CD34-，一小部分CD7+CD5+细胞并且未显示髓样(CD33/CD14)谱系偏移(图12c)。然而，CD7+群体也共表达高水平的CD56，表明NK谱系偏倚(图12c)。在该研究中使用的阳性对照是来自脐带血的第0天CD34+细胞，且阴性对照是PSC来源的CD34-细胞，其也产生高频率的共表达CD56的CD7+CD34+(图12d)。因此，当前的工作似乎表明，PSC来源的CD34+和CD34-细胞生成CD7+细胞，其包含高NK谱系潜能，具有最小的髓样谱系偏倚。
实施例9：可扩展的祖T细胞分化
将脐带血来源的CD34+细胞并行地在OP9DL4基质共培养物中分化，将其与用DL4+VCAM-1包被的96孔板、6孔板或贴壁培养生物反应器袋中的无血清分化培养物进行比较。被比较的DL4+VCAM-1包被的表面区域保持大致等同；将96孔板的一半(15.4cm2)与6孔板中的两个孔(19cm2)和12cm×2cm生物反应器袋(24cm2)进行比较。发现14天之后的总细胞扩增对于所有测试条件是相似的，并且从96孔、6孔或生物反应器DL4+VCAM-1包被的格式观察到～25倍的扩增(图15a)。在14天之后分析CD7+、CD7+CD34+、CD7+CD34-和CD7+CD5+祖T细胞的频率，并且除了最原始的CD7+CD34+区室以外，OP9DL4、96孔和6孔包被的板的所有条件之间是相似的(图15b、15c)。因此，DL4+VCAM-1限定培养物可以成功扩展规模至6孔格式。然而，DL4+VCAM-1包被的贴壁生物反应器袋产生较少的CD34-CD7+CD5+祖T细胞(图15b、15c)，最有可能是由于在第7天用含细胞因子的培养基灌注而不是以96孔和6孔板格式进行的100％培养基更换。
尽管已经参考某些特定实施方案描述了本公开内容，对于本领域技术人员来说，其各种修改将是明显的。本文提供的任何实例被包括仅用于说明本公开内容的目的，并不意图在以任何方式限制本公开内容。本文提供的任何附图仅用于说明本公开内容的各个方面的目的，并不意图在按比例绘制或以任何方式限制本公开内容。在此所附的权利要求的范围不应受到以上描述中阐述的优选的实施方案的限制，而应给出与本说明书作为整体一致的最广泛的解释。本文引用的所有现有技术的公开内容均通过引用以其整体并入本文。
引用的文献
1.Awong G，Herer E，Surh CD，Dick JE，La Motte-Mohs RN，JC.Characterization in vitro and engraftment potential in vivo of humanprogenitor T cells generated from hematopoietic stem cells.Blood.2009；114(5)：972-982.doi：10.1182/blood-2008-10-187013.
2.La Motte-Mohs RN，Herer E，JC.Induction of T-celldevelopment from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 invitro.Blood.2005；105(4)：1431-1439.doi：10.1182/blood-2004-04-1293.
3.Ikawa T，Hirose S，Masuda K，et al.An essential developmentalcheckpoint for production of the T cell lineage.Science.2010；329(5987)：93-96.doi：10.1126/science.1188995.
4.Taqvi S，Dixit L，Roy K.Biomaterial-based notch signaling for thedifferentiation of hematopoietic stem cells into T cells.J Biomed Mater Res-Part A.2006；79(3)：689-697.doi：10.1002/jbm.a.30916.
5.Roccio M，Gobaa S，Lutolf MP.High-throughput clonal analysis ofneural stem cells in microarrayed artificial niches.Integr Biol.2012；4(4)：391.doi：10.1039/c2ib00070a.
6.Mohtashami M，Shah DK，Nakase H，Kianizad K，Petrie HT，JC.Direct comparison of Dll1-and DII4-mediated Notch activation levels showsdifferential lymphomyeloid lineage commitment outcomes.J Immunol.2010；185(2)：867-876.doi：10.4049/jimmunol.1000782.
7.Milne CD，Zhang Y，Paige CJ.Stromal Cells Attract B-Cell Progenitorsto Promote B-Ceil-B-Cell Contact and Maturation.Scand J Immunol.2005；62(sl)：67-72.doi：10.1111/j.1365-3083.2005.01612.x.
8.Varnum-Finney B，Wu L，Yu M，et al.Immobilization of Notch ligand，Delta-1，is required for induction of notch signaling.J Cell Sci.2000；113 Pt23：4313-4318.
9.Holmes R， JC.The OP9-DL1 system：Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.Cold SpringHarb Protoc.2009；4(2)：1-13.doi：10.1101/pdb.prot5156.
10.Kirouac DC，Madlambayan GJ，Yu M，Sykes EA，Ito C，Zandstra PW.Cell-cell interaction networks regulate blood stem and progenitor cellfate.MolSyst Biol.2009；5：293.doi：10.1038/msb.2009.49.
11.Csaszar E，Gavigan G，Ungrin M，et al.An automated system fordelivery of an unstable transcription factor to hematopoietic stem cellcultures.Biotechnol Bioeng.2009；103(2)：402-412.doi：10.1002/bit.22297.
12.Csaszar E，Kirouac DC，Yu M，et al.Rapid expansion of humanhematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedbacksignaling.Cell Stem Cell.2012；10(2)：218-229.doi：10.1016/j.stem.2012.01.003.
13.Purpura KA，Bratt-leal AM，Hammersmith KA，Mcdevitt TC，ZandstraPW.Biomaterials Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches toguide blood development.Biomaterials.2011：1-10.doi：10.1016/j.biomaterials.2011.10.051.
14.Besseyrias V，Fiorini E，Strobl LJ，et al.Hierarchy of Notch-Deltainteractions promoting T cell lineage commitment and maturation.J ExpMed.2007；204(2)：331-343.doi：10.1084/jem.20061442.
15.Andrawes MB，Xu X，Liu H，et al.Intrinsic Selectivity of Notch 1 forDelta-like 4 Over Delta-like 1.J Biol Chem.2013；288(35)：25477-25489.doi：10.1074/jbc.M113.454850.
16.Salomon D，Crisa L，Mojcik C，Ishii J，Klier G，Shevach E.Vascular celladhesion molecule-1 is expressed by cortical thymic epithelial cells andmediates thymocyte adhesion.Implications for the function of alpha4beta1(VLA4)integrin in T-cell development.Blood.1997；89(7)：2461-2471.
17.Prockop SE，Palencia S，Ryan CM，Gordon K，Gray D，Petrie HT.Stromalcells provide the matrix for migration of early lymphoid progenitors throughthe thymic cortex.J Immunol.2002；169∶4354-4361.doi：10.4049/jimmunol.169.8.4354.
18.Calderón L，Boehm T.Synergistic，context-dependent，and hierarchicalfunctions of epithelial components in thymic microenvironments.Cell.2012；149(1)：159-172.doi：10.1016/j.cell.2012.01.049.
19.Csaszar E，Wang W，Usenko T，et al.Blood stem cell fate regulation byDelta-1-mediated rewiring of IL-6 paracrine signaling.Blood.2014；123(5)：650-658.doi：10.1182/blood-2013-08-520445.
20.Hong C，Luckey MA，Park JH.Intrathymic IL-7：The where，when，and whyof IL-7signaling during T cell development.Semin Immunol.2012；24(3)：151-158.doi：10.1016/j.smim.2012.02.002.
21.Frasca D，Pioli C，Guidi F，et al.IL-11 synergizes with IL-3 inpromoting the recovery of the immune system after irradiation.IntImmunol.1996；8(11)：1651-1657.doi：10.1093/intimm/8.11.1651.
22.Petrie HT， JC.Zoned out：functional mapping of stromalsignaling microenvironments in the thymus.Annu Rev Immunol.2007；25：649-679.doi：10.1146/annurev.immunol.23.021704.115715.
23.Reimann C，Six E，Dal-Cortivo L，et al.Human T-lymphoid progenitorsgenerated in a feeder-cell-free Delta-like-4culture system promote T-cellreconstitution in NOD/SCID/Yc(-/-)mice.Stem Cells.2012；30(8)：1771-1780.doi：10.1002/stem.1145.
24.Awong G，Singh J，Mohtashami M，et al.Human proT-cells generated invitro facilitate hematopoietic stem cell-derived T-lymphopoiesis in vivo andrestore thymic architecture.Blood.2013；122(26)：4210-4219.doi：10.1182/blood-2012-12-472803.
序列表
<110> 多伦多大学管理委员会
<120> 用于从干细胞和/或祖细胞生成祖T细胞的方法及其用途
<130> 35941-2023
<140> PCT/CA2017/
<141> 2017-04-07
<150> US 62/320,005
<151> 2016-04-08
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<170> PatentIn version 3.5
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ccgactccta cagtgggcta 20
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tggtggattc ttggtgcttt tc 22

Claims (25)

1.一种从干细胞和/或祖细胞生成祖T细胞的方法，所述方法包括：
-在无血清条件下，在Notch配体δ样4(DL4)的至少部分和血管粘附分子1(VCAM-1)的至少部分的存在下培养干细胞和/或祖细胞以生成祖T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤还包括生成所生成的祖T细胞的衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中DL4的部分包含DL4的细胞外结构域。
4.根据权利要求3所述的方法，其中DL4的部分被吸附或固定至基底上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中VCAM-1的部分包含SEQ ID NO:4的Phe25-Glu698，所述Phe25-Glu698与人类IgG1的Fc区融合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中VCAM-1的部分被固定至基底上。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中DL4的部分以在7.5μg/mL至20μg/mL的范围内的浓度提供。
8.根据权利要求7所述的方法，其中DL4的部分以约15-20μg/mL的浓度提供。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中VCAM-1的部分以在0.15μg/mL至5.3μg/mL的范围内的浓度提供。
10.根据权利要求9所述的方法，其中VCAM-1的部分以约2.5-5.3μg/mL的浓度提供。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞的培养包括将所述干细胞和/或祖细胞暴露于包含SCF、FLT3L和IL-7的造血分化培养基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是人类细胞。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是多能干细胞或造血干祖细胞。
14.一种通过权利要求1至13中任一项所述的方法生成的祖T细胞的分离的群体。
15.根据权利要求14所述的分离的群体，其中所述分离的群体包含所述祖T细胞的衍生物。
16.根据权利要求14或15所述的分离的群体，其中所述群体包含至少20％的CD7+祖T细胞。
17.根据权利要求15所述的分离的群体，其中所述群体包含至少60％的CD7+祖T细胞。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的分离的群体，其中所述祖T细胞是表达CD7的人类细胞。
19.根据权利要求18所述的分离的群体，其中所述人类祖T细胞表达CD34、CD45RA和CD5中的一种或更多种。
20.一种用于增加有相应需要的受试者中的T细胞数目的方法，所述方法包括将有效数目的根据权利要求14至19中任一项所述的祖T细胞施用至所述受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者是人类。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所施用的祖T细胞是自体的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所施用的祖T细胞是同种异体的。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中需要增加T细胞数目的受试者具有引起或导致淋巴细胞减少的医学状况。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述医学状况是癌症、HIV感染、部分胸腺切除、自身免疫性疾病和/或器官移植。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112041431A (zh) * 2018-02-14 2020-12-04 桑尼布鲁克研究所 产生t细胞谱系细胞的方法
CN117567651A (zh) * 2024-01-15 2024-02-20 中国人民解放军东部战区总医院 协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3053294A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Method for generating t cells progenitors
CA3077344A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regents Of The University Of Minnesota Methods of making, expanding, and using a human progenitor t cell
CN117959334A (zh) * 2018-05-11 2024-05-03 加利福尼亚大学董事会 修饰免疫细胞以增加活性
AU2019329984A1 (en) * 2018-08-28 2021-03-11 Fred Hutchinson Cancer Center Methods and compositions for adoptive T cell therapy incorporating induced notch signaling
KR20210114422A (ko) * 2018-12-21 2021-09-23 스템셀 테크놀러지스 캐나다 인크. 자연살해세포의 분화를 위한 배지 및 방법
CA3142947A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 The Regents Of The University Of California Engineered off-the-shelf immune cells and methods of use thereof
CA3159629A1 (en) * 2019-11-14 2021-05-20 Peter William ZANDSTRA Media formulations and methods for producing progenitor t cells
WO2021133861A1 (en) * 2019-12-23 2021-07-01 Boston Medical Center Corporation Human ipsc-based derivation of nk and t-cells using early notch induction
EP4352208A1 (en) * 2021-05-18 2024-04-17 The University of British Columbia A method for producing blood progenitor and progenitor t cells, resulting cells and methods and uses thereof
WO2023001833A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Repairon Immuno Gmbh Method of producing a population of immune cells from pluripotent stem cells
CN114324126B (zh) * 2022-01-07 2024-03-19 南京鼓楼医院 一种改变早期b细胞分化的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140248248A1 (en) * 2008-11-07 2014-09-04 Sunnybrook Health Sciences Centre Human progenitor t-cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140248248A1 (en) * 2008-11-07 2014-09-04 Sunnybrook Health Sciences Centre Human progenitor t-cells

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN REIMANN等: "Human T-lymphoid progenitors generated in a feeder-cell-free Delta-like-4 culture system promote T-cell reconstitution in NOD/SCID/γc(-/-) mice", 《STEM CELLS》 *
D R SALOMON等: "Vascular cell adhesion molecule-1 is expressed by cortical thymic epithelial cells and mediates thymocyte adhesion. Implications for the function of alpha4beta1 (VLA4) integrin in T-cell development", 《BLOOD》 *
SHREYA SHUKLA等: "Progenitor T-cell differentiation from hematopoietic stem cells using Delta-like-4 and VCAM-1", 《NAT METHODS》 *
VALERIE BESSEYRIAS等: "Hierarchy of Notch-Delta interactions promoting T cell lineage commitment and maturation", 《J EXP MED》 *
袁茵等: "OP9-DL1细胞共培养系统在T细胞体外定向诱导分化中的应用", 《细胞与分子免疫学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112041431A (zh) * 2018-02-14 2020-12-04 桑尼布鲁克研究所 产生t细胞谱系细胞的方法
CN117567651A (zh) * 2024-01-15 2024-02-20 中国人民解放军东部战区总医院 协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用
CN117567651B (zh) * 2024-01-15 2024-03-26 中国人民解放军东部战区总医院 协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用

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