KR102382905B1

KR102382905B1 - 노치 1 및/또는 노치 2 작용제를 사용한 줄기 세포의 확장 및 생착

Info

Publication number: KR102382905B1
Application number: KR1020167036821A
Authority: KR
Inventors: 어윈 디. 번스타인
Original assignee: 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2022-04-04
Also published as: US10208286B2; BR112016028537A2; CN106459919B; IL249376B; JP6641299B2; CA2949981A1; JP2017516486A; AU2015271689C1; IL249376A0; US20190127698A1; AU2018271280B2; US20170107493A1; EP3152301B1; EP3152301A1; AU2015271689A1; AU2018271280A1; WO2015187815A1; KR20170013940A; US11359179B2; CA2949981C

Abstract

본 개시내용은 줄기 세포와 같은 비-말기 분화된 세포인 전구체 세포를 무한증식시키는 방법을 제공하며, 당해 방법은 비-말기 분화된 세포의 증식은 지지하나 이의 분화는 지지하지 않는 하는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제(및, 특수한 구현예에서, 하나 이상 성장 인자)의 존재하에서 전구체 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 상기 세포의 보다 구체적인 세포 유형으로의 분화를 지지하는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 적어도 하나의 성장 인자의 존재하에서 상기 세포를 성장시킴을 포함하여, 무한증식된 세포의 분화를 유도시키는 방법을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 무한증식되고/되거나 분화된 세포는 예를 들면, 감염 또는 특정 약물에 대한 노출의 결과로서 소멸된 세포 집단을 증식시키는데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법으로 무한증식된 미-말기 분화된 세포의 집단을 포함하는 세포 배양물 및 전구체 세포의 무한증식을 촉진하는 시약을 포함하는 키트를 제공한다.

Description

노치 1 및/또는 노치 2 작용제를 사용한 줄기 세포의 확장 및 생착{EXPANSION AND ENGRAFTMENT OF STEM CELLS USING NOTCH 1 AND／OR NOTCH 2 AGONISTS}

본 출원은 2014년 6월 4일 출원된 미국 가특허원 제62/007,848호의 이익을 청구하며, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다.

정부 지원의 설명

본 발명은 국립 보건원에 의해 지급된 HL 100395하의 정부 지원으로 이루어졌다.

1. 개시내용의 분야

본 개시내용은 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제 및 하나 이상의 증식-촉진 성장 인자의 존재하에서 전구체 세포형의 세포가 증식하여 분화하거나 사멸하는 기간 이상 동안 비-무한증식 전구체 세포(non-immortalized precursor cell)를 배양함을 포함하여, 무한증식 전구체 세포 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 전구체 세포를 무한증식 전 또는 후에 이들의 분화를 촉진하는 조건에 노출시킴을 포함하여, 무한증식하여 분화된 세포형을 생산하는 방법을 제공한다. 이로부터 유도된 무한증식 세포는 세포 치료요법에 사용될 수 있다.

2. 개시내용의 배경

2.1 노치 신호전달 경로(Signaling Pathway)

노치 계열의 구성원은 다수의 무척추 시스템에서 조기 발달 동안 세포-세포 상호작용 및 세포-운명 결정(cell-fate decision)에 있어 중추적인 역할을 하는 거대한 전이막 단백질(transmembrane protein)을 암호화(encoding)한다. 노치 수용체는 즉시 근접하는 세포(immediately neighboring cell)에 의해 취해진 것들을 기준으로 대안적인 분화 경로들 사이에서 다양한 세포형을 선택할 수 있도록 하는 고도로 보존된 경로의 일부이다. 이러한 수용체는 2개의 대안적인 운명중의 하나를 채택하는 이들의 권한을 억제함으로써, 세포가 분화를 지연하거나, 적절한 발달 신호의 존재하에서 비-억제된 경로를 따라 분화에 전념하도록 함으로써 중립된 세포(uncommitted cell)의 진행을 조절하는 일반적인 단계를 통해 작용하는 것으로 여겨진다.

유전 및 분자 연구는 노치 신호전달 경로의 명확한 성분을 정의하는 유전자 그룹을 확인하여 왔다. 이들 다양한 성분의 초기 확인이 초기 안내자로서 유전 도구를 사용하여 초파리(Drosophila)로부터 집중적으로 이루어져 왔지만, 후속적인 분석은 사람을 포함하는 척추동물 종에서 상동성 단백질의 확인을 이끌었다. 공지된 노치 경로 성분 뿐만 아니라 이들의 소세포 국재화(subcellular localization) 사이의 분자 관계는 문헌(Artavanis-Tsakonas 등, 1995, Science 268:225-232 및 Artvanis-Tsakonas 등, 1999, Science 284:770-776)에 묘사되어 있다.

2.1.1. 노치 신호전달 경로의 구성원

노치 신호전달 경로의 몇가지 구성원이 무척추동물 및 척추동물 유기체에서 클로닝되고 서열분석되었다. 비-포유동물 노치 유전자는 초파리(Wharton 등, 1985, Cell 43:567-581); 손톱개구리속(Xenopus)(Coffman 등, 1990, Science 249:1438-1441); 및 제브라피쉬(zebrafish)(Bierkamp 등, 1993, Mech. Dev. 43:87-100)에서 확인된 것들을 포함한다. 적어도 4개의 포유동물 노치 동족체가 확인되었다(노치-1, -2, -3, 및 -4; Weinmaster 등, 1991, Development 113:199-205; Ellisen 등, 1991, Cell 66:523-534; Weinmaster 등, 1992, Development 116:931-941; Franco del Amo 등, 1993, Genomics 15:259-264; Lardelli and Lendahl, 1993, Exp. Cell. Res. 204:364-372; Milner 등, 1994, Blood. 83:2057-62; Lardelli 등, 1994, Mech Dev. 46:123-136; Uyttendaele 등, 1996, Development 122:2251-9). 노치 경로의 다른 구성원은 리간드 델타 및 Serrate/Jagged, 세포질 단백질 Deltex, CBF1으로 또한 알려진 전사 활성화제 RBP-Jκ, bHLH 전사 인자의 스플릿 과(Split family)의 증진제(Enhancer), 및 노치의 상피 성장 인자(EGF) 모듈러스를 개질시켜 노치가 이의 리간드 Delta에 결합하는 능력을 변경시키는 글리코실트랜스퍼라제 효소로서 골지체내에서 작용하는, Fringe(Panin 등, 1997, Nature 387:908-912)를 포함한다. 논문의 다음과 같은 완전하지 않은 목록은 노치 신호전달 경로의 주요 구성원의 유전자 및 단백질 서열, 및 또한 작용 역할을 설명한다.

무척추동물 리간드: (i) Delta(Kopczynski 등, 1988, Genes Dev. 2:1723-1735; Henrique 등, 1995, Nature 375:787-790; Chitnis 등, 1995, Nature 375:761-766); 및 (ii) Serrate(Fleming 등, 1990, Genes Dev. 1 :2188-2201; Lindsell 등, 1995, Cell 80:909-917; Thomas 등, 1991, Development 111 :749-761; Tax 등, 1994, Nature 368:150-154).

척추동물 리간드: (i) Serrate(Thomas, 1991, Development 111 : 749-761; Lindsell 등, 1995, Cell 80:909-917); 및 (ii) Delta(Chitnis 등, 1995, Nature 375:761; Henrique 등, 1995, Nature 375:787-790; Bettenhausen 등, 1995, Development 121 :2407).

다른 무척추동물 노치 경로 구성원: (i) 세포질 단백질 Deltex(Busseau 등, 1994, Genetics 136:585-596); (ii) 핵 단백질 Mastermind, Hairless, 스플릿 복합체의 증진제(Enhancer of Split Complex)(Smoller 등, 1990, Genes Dev. 4:1688-1700; Bang and Posakony, 1992, Genes Dev. 6:1752-1769; Maier 등, 1992, Mech. Dev. 38:143-156; Delidakis 등, 1991, Genetics 129:803-823; Schrons 등, 1992, Genetics 132:481-503; 및 Fortini and Artavanis-Tsakonas, 1994, Cell 79:273-282); (iii) Hairless의 억제제(Suppressor)(Furukawa 등, 1991, J. Biol. Chem. 266:23334-23340; Furukawa 등, 1992, Cell 69:1191-1197; 및 Schweisguth and Posakony, 1992, Cell 69:1199-1212); 및 (iv) Fringe(Irvine and Wieschaus, 1994, Cell 79:595-606).

다른 척추동물 노치 경로 구성원: (i) RBP-Jκ(Matsunami 등, 1989, Nature 342:934-937; Kawaichi 등, 1992, J. Biol. Chem. 267:4016-4022); (ii) Deltex(Matsunami 등, 1998, Nat. Genet. 19:74-78); (iii) Lunatic, Manic 및 Radical Fringe를 포함하는 Fringe(Wu 등, 1996, Science 273:355-358; Moran 등, 1999, Mamm. Genome 10:535-541).

2.1.2. 세포질 도메인을 통해 억제 신호를 중재하는 표면 수용체를 암호화하는 노치 계열 구성원

초파리 및 씨. 엘레간스(C. elegans)에서 집중된 유전 및 분자 연구는 노치 동족체에 의해 암호화된 단백질이 억제 신호 형질도입 경로를 활성화시킬 수 있는 세포 표면 수용체로서 작용함을 입증하였다(Greenwald and Rubin, 1992, Cell. 68:271-281; Heitzler and Simpson, 1991, Cell 64:1083-1092; Yochem and Greenwald, 1989, Cell 58:553-63; Fehon 등, 1991, J. Cell Biol. 113:657-669; Rebay 등, 1993, Cell 74:319-329).

노치 신호전달은 노치 리간드들(델타-1, -2, -3, 또는 Jagged-1 또는 -2) 중의 하나와 상호작용함으로써 개시되는 것으로 생각된다(Shawber 등, 1996, Developmental Biology 180:370-76; Luo 등, 1997, Molecular and Cellular Biology 17:6057-6067; Henrique 등, 1997, Current Biology 7:661-70; Bettenhausen 등, 1995, Development 121 :2407-18; Dunwoodie 등, 1997, Development 124:3065-76). 공지된 리간드 각각은 드로소필라, 씨. 엘레간스, 및 척추동물에서 발견된 다수의 EGF 반복체를 함유하는 세포외 도메인 및 고도로 보존된 DSL 도메인에 의해 특성화된다(Tax 등, 1994, Nature 368:150-154). 노치 활성화를 유도하는 특수한 노치 리간드의 능력은 다른 유전자의 발현에 의해 변형될 수 있다는 증거가 있다. 예를 들면, Fringe의 발현은 Serrate(Jagged의 초파리 동족체)에 의해 노치의 활성화를 방지하지만 델타 활성을 향상시킨다(Fleming 등, 1997, Development 124:2973-81).

세포외 도메인에 의매 중재된 세포 상호작용은 세포내 도메인에 의해 신호 형질도입을 조절하여 분화의 조절을 생성한다는 상당한 증거가 존재한다(Yochem and Greenwald, 1989, Cell 58:553-563; Rebay 등, 1993, Cell 74:319-329). 데이타는, 이것이 세포외 도메인의 이의 리간드들 중 하나에 대한 결합에 이어, 궁극적으로 노치의 세포내 도메인의 방출을 가져오는 일련의 단백질분해적 절단의 결과로서 발생함을 나타낸다(Struhl and Adachi, 1998, Cell. 93:649-660; Schroeter 등, 1998, Nature 393:382-386). 노치 수용체의 트렁케이트된 형태의 발현을 포함하는 작용적 분석은 수용체 활성화가 세포내 도메인에서 6개의 cdc10/ankyrin 반복체에 의존함을 나타낸다. 또한, 노치 활성화는, cdc10/ankyrin이 가능하게는 단백질의 나머지로부터의 단백질분해적 절단 후 핵에 도달하여 전사 활성화에 관여하는 것을 필요로 한다(Struhl and Adachi, 1998, Cell 93:649-660). 이의 과-발현이 경로의 명확한 활성화를 생성하는 Deltex 및 Hairless의 억제제는 이들 반복체와 관련되어 있다. 최근의 증거는 핵 도입을 위해 cdc10/ankyrin 반복체를 방출하는 단백질분해적 절단 단계가 프레세닐린 활성(Presenilin activity)에 의존적임을 제안한다(De Strooper 등, 1999, Nature 398:518-522; Struhl and Greenwald, ibid.:522-525; Ye 등, ibid.:525-529).

노치 경로는 핵으로 노치의 안키린 반복체를 방출하는 단계에 추가로 단백질 프로세싱 처리에 의존적이다. 혈장 막에 존재하는 노치 수용체는 2개의 노치 단백질분해성 절단 생성물의 이종이량체를 포함하며, 하나는 세포외 도메인의 부위, 전이막 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 N-말단 단편을 포함하며, 다른 것은 대부분의 세포외 도메인을 포함한다(Blaumueller 등, 1997, Cell 0:281-291). 수용체를 활성화시키는 노치의 단백질분해적 절단 단계는 골지체에서 발생하며 퓨린-유사 컨버타제(furin-like convertase)에 의해 중재된다(Logeat 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8108-8112). 노치 리간드, 델타는 또한 활성화를 위한 절단을 필요로 한다. 델타는 세포 표면에서 ADAM 디스인테그린 메탈로프로테이나제 Kuzbanian에 의해 절단되어 델타의 가용성 및 활성형을 방출하는 것으로 고려된다(Qi 등, 1999, Science 283:91-94).

노치의 세포내 도메인은, 당해 도메인의 강제 발현이 C2 근아세포에서 근세포 융합을 방지하고(Kopan 등, 1994, Development 120:2385-2396), MyoD 및 Myf-5에 의한 3T3 세포의 근육 전환을 차단하며(Kopan 등, 1994, Development 120:2385-2396), DMSO-유도된 P19 배아 암종 세포의 근육 분화를 방지하며, P19 세포의 신경교 분화를 허용하면서 신경발생을 억제하므로(Nye 등, 1994, Development 120:2421-2430), 구성적으로 활성인 수용체로서 작용하는 것으로 밝혀졌다.

세포내 도메인은 핵으로 수송되는 것으로 고려되며, 여기서 이는 CBFI/PVBP-JKκ를 포함하는, 다수의 분자 표적과 상호작용함으로써 전사를 조절하는 것으로 여겨진다(Struhl and Adachi, 1998, Cell 93 :649-660; Schroeter 등, 1998, Nature 393 :382-386 Fortini 등, 1993, Nature 365 :555-7). 하부(downstream) 표적이 완전히 측정되지는 않았으나, RBP-JKκ는 전사 활성의 억제제로서 작용하는 Split의 모발 증진제(Hairy Enhancer of Split: HES)의 발현을 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Jarriault 등, 1998, Mol Cell Biol. 18:2230-9). RBP-Jκ(기술한 바와 같이, 또한 CBF1로 공지됨, Hairless의 초파리 유전자 억제제의 동족체)는 B 세포의 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)-유도된 무한증식에 관여하는 포유동물 DNA 결합 단백질이다. 적어도 배양된 세포 속에서 Hairless의 억제제는 세포질에서 cdc10/안키린 반복체와 연합하여 인접한 세포에서 노치 수용체와 이의 리간드 델타의 상호작용시 핵내로 전위되는 것으로 입증되었다(Fortini and Artavanis, 1994, 세포 79:273-282). 핵 단백질인, Hairless와 Hairless의 억제제의 연합은 효모의 2개의 하이브리드 시스템을 사용하여 문서화되었으므로, 전사시 Hairless의 억제제의 관여는 Hairless에 의해 조절되는 것으로 여겨진다(Brou 등, 1994, Genes Dev. 8:2491; Knust 등 1992, Genetics 129:803). 노치 신호전달은 스플릿 복합체의 증진제내에서 적어도 특정의 bHLH 유전자의 활성화를 생성하는 것으로 알려져 있다(Delidakis 등, 1991, Genetics 129:803). 마스터마인드(Mastermind)는 새로운 흔한 핵 단백질을 암호화하는데, 노치 신호전달에 대한 이의 관계는 명확하지 않지만 유전 분석에 의해 입증된 바와 같이 노치 경로에 관여한다(Smoller 등, 1990, Genes Dev. 4:1688).

노치 신호전달이 Deltex를 통한 신호전달에 관여하여 예를 들면, B-세포 시스템에서 E 단백질 활성의 억제를 생성하는, 대안적인 HES 독립 경로에 의해 중재된다는 증거가 존재하며, RBP-Jκ를 제외하고 Deltex는 E47 작용을 억제하는데 관여함이 또한 밝혀졌다(Ordentlich 등, 1998, Mol Cell Biol 18:2230-9). Deltex는 링 징크 핑거(ring zinc finger)를 함유하며 노치의 안키린 반복체와 상호작용하는 세포질 단백질이다(Matsuno 등, 1995, Development 121 :2633-2644).

2.1.3. 노치 과 구성원의 역활

미국 특허 제5,780,300호는 분화 과정에서 노치 단백질의 역할을 설명한다. 요약하면, 노치는 많은 상이한 세포형의 권한을 조절하여 각각의 세포형의 발달 역사에 따라 선택된 특수한 세포 운명 및 이것 안에서 작동하는 특이적인 신호전달 경로와 함께, 분화/증식/세포자멸사 신호에 반응하도록 한다. 초파리 및 씨. 엘레간스에서, 노치llin-12 계열의 구성원은 특이적인 세포 운명이 결정되는 경우 다양한 조직의 분화 동안 다수의 단계에서 요구된다. 씨. 엘레간스에서, 노치-관련된 유전자 lin-12 및 glp-1은 하나 이상의 잠재적인 세포 운명의 억제 또는 발현을 생성하는 광범위한 세포-세포 상호작용에서 작용한다(Greenwald and Rubin, 1992, Cell 68:271-81; Greenwald 등, 1983, Cell 34:435-444; Austin and Kimble, 1987, Cell 51 :589-99; Yochem and Greenwald, 1989, Cell 58:553-563; Wilkinson 등, 1994, Cell 79:1187-1198). 하나의 특히 명확한 예는 발달하는 음문에서 세포 운명을 규정하는데 관여하는 상호작용에 있으며, 여기서 2개의 동등한 다분화능 전구체는 항상 하나의 앵커 세포(anchor Cell: AC) 및 하나의 배 자궁(ventral uterine: VU) 전구체 세포를 형성한다(Greenwald and Rubin, 1992, Cell 68:271-81; Greenwald 등, 1983, Cell 34:435-44; Austin and Kimble, 1987, Cell 51 :589-99; Yochem and Greenwald, 1989, Cell 58:553-63; Wilkinson 등, 1994, Cell 79:1187-98). 줄기 세포 중 하나가 제거되는 경우, 나머지 세포는 항상 AC가 되며; lin-12 활성이 결여되는 경우 둘 다는 AC가 되고; lin-12 활성이 상승되는 경우, 세포 둘 다는 VU 운명을 발현한다. 추가의 증거는, AC 분화에 전념하는 세포에서 lin-12, lag-2에 대한 리간드의 발현시 상대적인 증가는 직접적인 세포-세포 상호작용을 통해, AC 분화에 대해 억제성이지만 VU 분화에 대해 허용성인, lin-12 활성에 있어서의 증가를 유도함을 나타낸다.

초파리에서, 노치는 신경계, 눈, 중배엽, 난소 및 다분화능 전구세포(progenitor)가 세포-운명 결정을 이루는 다른 부위를 포함하는 다수의 조직에서 적절한 세포-운명 결정에 요구되는 것으로 밝혀졌다(Artavanis-Tsakonas 등, 1999, Science 284:770-776; Go 등, 1998, Development 125:2031-2040; Doherty 등, 1996, Genes Dev. 10:421-434; Artavanis-Tsakonis 등, 1995, Science 268:225-232; Greenwald and Rubin, 1992, Cell 68:271-81; Heitzler and Simpson, 1991, Cell 64:1083-1092; Artavanis-Tsakonas and Simpson, 1991, Trends Genet. 7:403-408; Cagan and Ready, 1989, Genes Dev. 3:1099-1112). 신경 영역에서, 예를 들면, 노치의 분화적 발현은 동등한 세포의 집단내의 단일 세포가 신경의 운명(neural fate)을 채택하는 반면 인접한 세포는 상피의 운명을 채택하는 측면 억제(lateral inhibition)를 중재하는 것으로 여겨진다. 유사하게, 노치 유전자의 동형 널(null) 돌연변이를 지닌 배아에서, 신경 영역내 모든 세포는 신경아세포가 되며 상피 전구체가 되지 않는다.

손톱개구리 속에서, 발달하는 배아 속에서 노치의 돌연변이 형태의 발현은 정상 발달을 깊이 방해한다(Coffman 등, 1993, 세포 73:659).

제브라피쉬 및 손톱개구리에서 노치의 3개의 공지된 척추동물 동족체 중의 하나인, 노치-1의 발현의 연구는, 일반적인 양식이 비-말단적으로 분화된, 증식 세포 집단과 일반적으로 관련된 노치 발현과 유사함이 밝혀졌다. 발현 수준이 높은 조직은 발달하는 뇌, 눈 및 신경관을 포함한다(Coffman 등, 1990, Science 249:1438-1441; Bierkamp 등, 1993, Mech. Dev. 43:87-100). 포유동물에서의 연구가 상응하는 노치 동족체의 발현이 발달 말기에 시작함을 나타낸다고 해도, 단백질은 세포 운명 결정 또는 신속한 증식을 겪는 조직에서 역동적 양식으로 발현된다(Weinmaster 등, 1991, Development 113:199-205; Reaume 등, 1992, Dev. Biol. 154:377-387; Stifani 등, 1992, Nature Genet. 2:119-127; Weinmaster 등, 1992, Development 116:931-941; Kopan 등, 1993, J. Cell Biol. 121: 631-641; Lardelli 등, 1993, Exp. Cell Res. 204: 364-372; Lardelli 등, 1994, Mech. Dev. 46:123-136; Henrique 등, 1995, Nature 375:787-790; Horvitz 등, 1991, Nature 351: 535-541; Franco del Amo 등, 1992, Development 115:737-744). 포유동물 노치 동족체가 먼저 발현되는 조직 중에는 체절발생전 중배엽 및 배아의 발달하는 신경상피가 있다. 체절발생전 중배엽에서, 노치-1의 발현은 이주된 중배엽 모두에서 관찰되며, 특히 농밀한 밴드가 체절발생전 중배엽의 앞쪽 가장자리에서 관찰된다. 이러한 발현은, 일단 체세포가 형성되면 감소하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 체세포 전구체 세포의 분화시 노치에 대한 역할을 나타낸다(Reaume 등, 1992, Dev. Biol. 154:377-387; Horvitz 등, 1991, Nature 351 :535-541). 유사한 발현 양식이 마우스 델타에서 발견된다(Simske 등, 1995, Nature 375:142-145).

발달하는 포유동물 신경계내에서, 노치 동족체의 발현 양식은 특히 척추의 뇌실대의 영역에서 및 말초 신경계의 성분에서 오버랩핑 양식(overlapping pattern)으로 그러나 동일하지 않은 양식으로 우세함이 밝혀졌다. 신경계에서 노치 발현은 세포 증식의 영역에 한정되는 것으로 여겨지며, 최근 분화된 세포의 근접한 집단에 부재하는 것으로 여겨진다(Weinmster 등, 1991, Development 113:199-205; Reaume 등, 1992, Dev. Biol. 154:377-387; Weinmaster 등, 1992, Development 116:931-941; Kopan 등, 1993, J. Cell Biol. 121:631-641; Lardelli 등, 1993, Exp. Cell Res. 204:364-372; Lardelli 등, 1994, Mech. Dev. 46:123-136; Henrique 등, 1995, Nature 375:787-790; Horvitz 등, 1991, Nature 351 :535-541). 랫트 노치 리간드는 또한 발달하는 척추내, 노치 유전자의 발현 도메인과 오버랩된 뇌실대의 명백한 밴드 속에서 발현된다. 이러한 리간드의 시공적인 발현 양식은 척추 신경 운명에 전념하는 세포의 양식과 관련되어 있으며, 이는 신경 운명을 위한 세포 집단의 마커로서 노치의 유용성을 입증한다(Henrique 등, 1995, Nature 375:787-790). 이는 또한 척추동물 델타 동족체에 대해서도 제안되었는데, 이의 발현 도메인은 또한 노치-1의 도메인과 오버랩된다(Larsson 등, 1994, Genomics 24:253-258; Fortini 등, 1993, Nature 365:555-557; Simske 등, 1995, Nature 375:142-145). 손톱개구리 속 및 닭 동족체의 경우에, 델타는 측면 명세 모델(lateral specification model)로부터 예측되는 바와 같이, 노치-1 발현 도메인내에서 산란된 세포에서만 실제로 발현되며, 이들 패턴은 신경 분화의 미래의 양식의 "전조(foreshadow)"가 된다(Larsson 등, 1994, Genomics 24:253-258; Fortini 등, 1993, Nature 365:555-557).

특별한 관심이 있는 다른 척추동물 연구는 망막, 모낭 및 치배(tooth bud)를 포함하는 발달하는 감각 구조에서 North 동족체의 발현에 촛점을 맞추어 왔다. 손톱개구리 속 망막의 경우에, 노치-1은 중심의 가장자리 영역(central marginal zone) 및 중심 망막의 분화되지 않은 세포내에서 발현된다(Coffman 등, 1990, Science 249:1439-1441; Mango 등, 1991, Nature 352:811-815). 랫트에서의 연구는 또한 발달하는 망막에서 분화하는 세포와 노치-1의 연합을 입증하며 노치-1이 당해 조직에서 성공적인 세포 운명 선택에 관여하는 것으로 해석되어 왔다(Lyman 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10395-10399).

모근의 재생하는 매트릭스 세포에서 마우스 노치-1 발현의 상세한 분석은 상피/간엽 유도성 상호작용에서 노치 단백질의 잠재적인 참여를 시험하기 위해 수행되었다(Franco del Amo 등, 1992, Development 115:737-744). 이러한 역활은 원래 랫트 구렛나루 및 치배에서 이의 발현을 기준으로 노치-1에 대해 제안되었다(Weinmaster 등, 1991, Development 113:199-205). 노치-1 발현은 대신 상피/간엽 상호작용을 하지 않는 비-유사분열성의, 분화 세포의 소세트에 한정되는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 발견은 다른 곳에서 노치 발현과 일치한다.

노치-1의 사람 동족체(TAN-1)는 초기에 당해 유전자를 포함하는 전좌를 지닌 T-세포 백혈병으로부터 클로닝되었으며 후속적으로 다양한 성체 조직에서, 그러나 흉선 및 림프절에서 최대량으로 발견되었다(Ellisen 등, 1991, Cell 66:649-661; Zhong 등, 1997, Development 124:1887-1897; Vargesson 등, 1998, Mech Dev. 77:197-9; Lewis 등, 1998, Mech Dev. 78:159-163; Lindsell 등, 1996, Mol. Cell. Neurosci. 8:14-27; Hasserjian 등, 1996, Blood. 88:970-976). 노치/TAN-1의 동족체는 사람 CD34+ 조혈 전구체(Milner 등, 1994, Blood 83:2057-2062) 및 또한 CD34-골수 세포(Milner 등, 1994, Blood 83:2057-2062; Varnum-Finney 등, 1998, Blood 91:4084-4091)에서 발현된다. 후속적인 연구는, 조혈 발달 동안 노치-1 및 노치-2 단백질, 및 또한 조혈 기질에서 노치 리간드인, Jagged-1의 광범위한 발현을 입증하였다(Varnum-Finney 등, 1998, Blood 91 :4084-4091; Li 등, 1998, Immunity 8:43-55). 세포 증식 및 분화를 겪는 조직에서 척추동물 노치 동족체의 우선적인 발현은, 이들 분자가 이들이 무척추동물에서 하는 바와 같이 척추동물에서 세포-운명 결정을 매개하는데 관여함을 제안한다. 유사분열적으로 활성인 조직내에서 이러한 지속성은 또한 노치가 세포 증식을 조절하는데 관여될 수 있음을 제안한다. 노치-1의 세포질 도메인 및, 마우스에서, 바이러스-유도된 종양에서 마우스 유방 종양 바이러스에 대한 일반적인 통합 부위인 노치-관련된 int-3 유전자자리의 세포질 도메인의 하향조절된 발현과 관련된 종양원성 표현형은 이러한 인식과 일치한다(Jhappan 등, 1992, Genes Dev. 6:345-355; Robbins 등, 1992, J. Virol. 66:2594-2599).

사람 노치-1 및 노치-2 발현의 추가의 연구가 정상 및 신생물 경부 및 결장 조직을 포함하는 성체 조직 단면에서 수행되어 왔다. 노치-1 및 노치-2는 일부 전구체 세포를 제외하고는, 시험되었고 정상의 원주 상피에서 명확하게 발현되지 않는 정상 조직의 편평 상피내 세포의 분화하는 집단내에서 오버랩핑 양식으로 발현되는 것으로 여겨진다. 단백질 둘 다는 비교적 양성인 편평 이형성으로부터 원주 상피가 이들 종양에 의해 대체된 암성의 침입성 선암종에 이르는 범위의 경우에, 신생물속에서 발현된다(Gray 등, 1999, Am. J. Pathol. 154:785-794; Zagouras 등, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6414-6418).

2.1.4. 조혈에 있어서 노치 작용

사람 CD34+ 전구체에서 노치-1 mRNA 발현의 증거는 조혈시 노치 신호전달을 위한 역활에 대한 추측을 가져왔다(Milner 등, 1994, Blood 3:2057-62). 이는 또한 노치-1 및 -2 단백질이 조혈 전구체내에 및, T 세포, B 세포, 및 단핵세포내에서 보다 많은 양으로 존재한다는 증거에 의해서, 및 조혈 기질내 Jagged-1 단백질의 증거에 의해 뒷받침된다(Ohishi 등, 2000, Blood 95:2847-2854; Varnum-Finney 등, 1998, Blood 91 :4084-91; Li 등, 1998, Immunity 8:43-55).

노치 신호전달의 생리학적 역활에 대한 가장 명확한 증거는 활성화된 노치-1이 B 세포 성숙을 억제하지만 T 세포 성숙은 허용함을 입증했던 T 세포 발달의 연구로부터 왔다(Pui 등, 1999, Immunity 11 :299-308). 대조적으로, 노치-1의 불활성화 또는 HES-1의 녹 아웃(knock out)함에 의한 노치-중재된 신호전달의 억제는 T 세포 발달을 억제하였지만 B 세포 성숙은 허용하였다(Radtke 등, 1999, Immunity 10: 47-58; Tomita 등, 1999, Genes Dev. 13:1203-10). B 및 T 세포 발달에 있어서 노치-1의 이러한 반대 효과는 노치-1이 일반적인 림프구 전구세포에 의한 운명 결정을 조절하는 가능성을 상승시킨다.

형질도입 마우스에서 다른 연구는, 활성화된 노치-1이 CD4 대 CD8 표현형 및 또한 αβ 대 γ△ 세포-운명을 추정하는 세포의 비율에 영향을 미침을 입증하였다(Robey 등, 1996, Cell 87:483-92; Washburn 등, 1997, Cell 88:833-43). 이것이 일반적인 전구체에 의한 운명 결정에 있어서의 영향을 반영할 수 있다고 해도, 보다 최근의 연구는, 이들 효과가 또한 사멸할 수 있는 분화하는 T 세포의 생존을 가능하도록 하는 노치-1의 항-세포자멸사 효과로부터 생성될 수 있음을 제안하였다(Deftos 등, 1998, Immunity 9:777-86; Jehn 등, 1999, J. Immunol. 162:635-8).

골수형성시 노치 신호전달에 대한 주요 역할을 뒷받침하는 증거는 거의 명확하지 않다. 노치-1의 과발현 또는 불활성화를 포함하는 생체내 연구는 T 및 B 세포 발달에 있어서 심오한 효과에도 불구하고, 성숙한 골수 성분의 발달에 있어서 노치-1 신호전달의 유의적인 효과를 확인하지 않았다(Pui 등, 1999, Immunity 11 :299-308; Radtke 등, 1999, Immunity 10:547-58). 그러나, 시험관내 연구는 구성적으로 활성인 노치-1이 골수조혈시 구성적으로 활성인 노치-1 형태의 효과를 입증하였다. 노치-1의 활성화된 형태의 구성적 과발현은 쥐 32D 세포의 G-CSF-유도된 과립구 분화를 억제하였다(Milner 등, 1996, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 93:13014-9). 보다 최근의 연구는, 노치-1의 구성적으로 활성인 세포내 도메인의 과발현이 분리된 쥐 조혈 전구체의 분화를 억제하며 생체내 재생 세포를 포함하는, 조기 전구체 세포의 생성을 향상시킴을 제안한다(Milner 등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:13014-13019; Bigas 등, 1998, J. Mol. Cell. Biol. 18:2324-2333). 따라서, 성숙한 골수 성분의 생체내 생성시 노치-1의 확인가능한 효과의 결여는 거의 성숙하지 않은 전구체내에서 노치 활성화의 효과를 차폐할 수 있는 사이토킨과 같은 다른 인자에 기인한 보충적인 효과로부터 생성될 수 있다.

연구는 또한, 분리된 조혈 전구체 세포의 분화가 리간드-유도된 노치 신호전달에 의해 억제될 수 있음을 입증하였다. 쥐 골수 전구체 세포(lin-Sca-1+ c-kit+)와 사람 Jagged-1을 발현하는 3T3 세포의 동시배양은 원시 전구체 세포 집단의 형성에 있어 2 내지 3배 증가를 가져왔다(Varnum-Finney 등, 1998, Blood 91 :4084-4991; Jones 등, 1998, Blood 92:1505-11). 분류된 전구체와 사람 Jagged-1의 정제된 세포외 도메인으로 피복된 비드(bead)의 항온처리는 또한 전구체 세포의 향상된 생성을 가져왔다(Varnum-Finney 등, 1998, Blood 91 :4084-91).

사람 CD34+ 세포의 연구에서, 노치-1의 세포내 도메인의 발현 또는 Jagged-2를 과발현한 세포에 대한 노출은 또한 전구체 세포의 향상된 생성 및 CD34 발현의 연장된 유지를 가져왔다(Carlesso 등, 1999, Blood 93:838-48). 다른 연구에서, CD34+ 세포에서 Jagged-1을 발현하는 세포의 효과는 배양물 속에 존재하는 사이토킨에 의해 영향을 받았으며; 첨가된 성장 인자의 부재하에서, 세포-결합된 Jagged-1과의 상호작용은 CD34+ 세포의 증식되지 않고, 분화되지 않은 상태로의 유지를 가져온 반면, c-kit 리간드의 첨가는 적혈구 콜로니-형성 세포에 있어서 2배 증가를 가져왔다(Walker 등, 1999, Stem Cells 17:162-71).

보다 성숙한 골수 성분의 연구는 또한 이들의 세포-운명 결정을 조절하는데 있어서 노치 신호전달에 대한 잠재적인 역할을 나타내었다. 이들 연구에서, 무한증식하는, 트렁케이트된(truncated) 델타-1은 CD14+ 단핵구의 대식구로의 분화를 억제하였으며 특이적인 사이토킨의 존재하에서 세포자멸사를 유도하였다(Ohishi 등, 2000, Blood 95:2847-2854). 또한, 리간드-유도된 노치 신호전달은 적절한 사이토킨 자극과 관련하여 단핵세포의 수지 세포로의 분화를 허용한다. 따라서, 다른 발달하는 시스템에서 관찰되는 바와 같이, 노치 신호전달은 특수한 경로에 따른 분화를 억제하여, 세포가 분화되지 않는 상태로 남거나 억제되지 않은 디폴트 경로(default pathway)를 따라 분화하도록 하는 것으로 여겨진다.

노치 신호전달은 다수의 발달 시스템에서 세포 운명 결정시 중추적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 진화론적으로 보존된 노치 전이막 수용체는 분화, 증식, 및 세포자멸사 현상에서 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 노치 신호전달은 특수한 경로를 따라 분화를 억제하여, 세포가 분화되지 않거나 특수한 환경 신호에 대한 반응시 대체 경로를 따라 분화하도록 한다. 노치 신호전달은 다음의 수용체 리간드 상호작용을 유도하여, 단백질분해적 절단 및 핵으로 수송되어 전사 조절인자, RBP-Jκ를 포함하는, 다수의 하부 표적과 상호작용하는 활성 세포내 도메인의 방출을 유발한다. 현재, 노치 유전자 중 4개의 파라로그(paralog)가 척추동물에서 확인되었다(노치-1-4). 노치에 대한 리간드는 또한 전이막 단백질이며 Jagged-1 및 -2, 및 델타- 1, -2, 및 -3을 포함한다. 사람 CD34+ 전구체에서 노치-1 mRNA의 발현의 증거는 조혈에서 노치 신호전달에 대한 역활에 대한 추측을 가져온다. 추가의 연구는 조혈 전구체내 및 보다 많은 양으로 T 세포, B 세포에서 노치-1 및 -2 단백질을 입증하였으며, 또한 Jagged-1이 조혈 기질에서 발현됨을 나타낸다. 노치 신호전달의 생리적 역활에 대한 가장 명확한 증거는 T 세포 발달의 연구로부터 왔으며, 상기 노치-1은 T 세포 발달에 요구되고 CD4/CD8 및 αβ/γ△ 세포 운명 결정에 영향을 미치며 노치-1의 구성적으로 활성인 형태는 T 세포 림프구를 유도한다. 또한, 구성적으로 활성인 노치-1 형태의 과발현은 B 세포 성숙을 억제하며, 이는 노치-1이 일반적인 림프구 전구세포에 의한 운명 결정을 조절할 수 있음을 제안한다. 골수조혈에서 노치 신호전달에 대한 중요한 역할을 뒷받침하는 증거는 거의 명확하지 않다. 활성화된 노치-1 형태의 구성적 과발현은 32D 세포의 G-CSF-유도된 과립구 분화, 및 분리된 조혈 전구체의 분화를 억제한다. 전구체 세포의 분화는 또한 리간드-유도된 노치 신호전달에 의해 억제된다. 쥐 골수 전구체 세포(sca-1+ lin- c-kit+)와 사람 Jagged-1을 발현하는 3T3 세포 층의 동시배양 또는 분류된 전구체와 사람 Jagged-1의 정제된 세포외 도메인으로 피복된 비드의 항온처리는 원시 전구체 세포 집단의 형성시 2 내지 3배 증가를 가져온다. 노치 리간드의 무한증식된, 트렁케이트된 형태, 델타-1은 분리된 전구체의 분화를 억제하여, sca-1+lin- 세포의 수에 있어서 실질적인 증가를 허용하는 것으로 밝혀졌다.

2.2 발달 동안 세포 분화

사람을 포함하는 다세포 유기체의 개체발생을 지배하는 발달 과정은 신호전달 경로 사이의 상호작용에 의존하며, 이는 원래의 분화전능성 줄기 세포로부터 말기 분화된 성숙한 세포까지의 세포의 발달 잠재능을 점진적으로 축소시키며, 이는 심장 세포 또는 신경 세포와 같은 전문화된 작용을 수행한다.

수정란은 모든 다른 세포혈통이 기원하는 세포, 즉, 궁극적인 줄기 세포이다. 발달이 진행되면서, 조기 배아 세포는 세포가 발달 성숙도에 도달할 때까지, 즉 말기 분화될 때까지, 세포의 발달 잠재능을 점진적으로 축소시키는 성장 및 분화 신호에 반응한다. 이들 말기 분화된 세포는 작용 및 특성이 분화되어 있고, 특수한 세포로 전구체 세포 분화의 다-단계 공정에서 마지막 단계를 나타낸다.

세포 분화시 1 단계로부터 다음 단계로의 이전은 성숙도에 이를 때까지 진행을 점진적으로 조절하는 특이적인 생화학적 기전에 의해 지배된다. 조직 및 세포의 분화는 말기 분화된 상태가 도달할 때까지 구체적인 단계를 따라가는 점진적인 공정이다.

조기 배아 세포괴의 형태형성 운동인, 낭배형성은 3개의 명백한 배 세포 층, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽의 형성을 생성한다. 각각의 배 세포 층에서 세포는 다양한 발달 신호에 반응하므로, 특수 분화된 세포로 구성된 구체적인 기관이 생성된다. 예를 들면, 표피 및 다양한 신경계는 외배엽-기원한 세포로부터 발달하며, 호흡계 및 소화관은 내배엽-기원한 세포로부터 발달되며, 중배엽-기원한 세포는 연결 조직, 조혈 시스템, 비뇨생식계, 근육, 및 대부분의 내부 기관의 부분으로 발달한다.

신경 신경능은 외배엽으로부터 기원하며 말초 신경계, 색소 세포, 부신 수질 및 두부 연골의 특정 부위를 포함하는 비범하게 크고 복합한 수의 분화된 세포형이 생산되는 세포괴이다.

신경 신경능 세포의 다능성은 잘 확립되어 있다(LeDouarin 등, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:728-732). 단일의 신경 신경능 세포는 수개의 상이한 세포형으로 분화할 수 있다.

표피는 분화되지 않은, 유사분열적으로 활성인 기저 세포로부터 출발하여 말기 분화된 비-분열하는 각질형성세포까지 분화 계통을 정의하는 수개의 세포 층으로 이루어진다.

내배엽은 성체내에서 2개의 관을 연결하는 조직의 공급원이다. 소화관은 신체의 길이 전체로 연장된다. 소화관은 소화관 뿐만 아니라, 예를 들면, 간, 방광 및 췌장까지 생기도록 한다. 제2의 관, 호흡관은 폐 및 인두의 부분을 형성한다. 인두는 편도선, 갑상선, 흉선 및 부갑상선이 생기도록 한다.

메센게닉 공정(mesengenic process)으로 또한 언급되어 온 중배엽의 생성은 외배엽 벽 및 소화관과 호흡관 사이의 모든 기관을 포함하는 매우 큰 수의 내부 조직이 생기도록 한다.

배아 발달은 완전히 형성된 기관을 생산한다. 각각의 기관의 세포 경계를 규정하는 형태학적 공정은 증식 및 분화뿐만 아니라 세포자멸사(프로그램화된 세포 사멸)도 포함한다. 예를 들면, 신경계에서, 신경의 대략 50%는 배아발생 동안 프로그램화된 세포 사멸을 겪는다.

청소년 또는 성인에서, 조직의 유지는, 정상의 삶 동안 또는 손상 및 질환에 대한 반응 동안에 상관없이 특이적인 발달 신호에 반응할 수 있는 전구체 세포로부터 기관의 보충에 의존한다.

미성숙 세포의 분화를 통한 성체 세포 회복의 가장 잘 공지된 예는 조혈 시스템이다. 여기서, 발달적으로 미성숙 전구체(조혈 줄기 및 전구세포)는 분자 신호에 반응하여 변화된 혈액 및 림프구 세포형을 점진적으로 형성한다.

조혈 발달 동안에, 다능성 줄기 세포의 후대(progeny)는 이들의 증식 잠재능 및 자가-회복을 위한 능력을 상실하며, 제공된 분화 경로로의 보다 큰 책무를 나타낸다. 다양한 조혈 계통에 대한 이러한 책무를 조절하는 인자는 이해되어 있지 않지만, 확률적 공정 및 가용성 및 세포-결합된 사이토킨과의 상호작용을 포함하는 것으로 고려된다(Fairbairn 등, 1993, Cell 4:823-32; Ogawa, 1993, Blood 81 :2844-53; Metcalf, 1989, Nature 339:27-30; Metcalf, 1993, Blood. 82:3515-23; Goldsmith 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:7006-11; Socolovsky 등, 1997, J. Biol. Chem. 272:14009-12).

조혈 시스템이 성체 세포 시스템을 재생하는 가장 잘 이해된 자체이지만, 대부분, 아마도 모든 성체 기관은 바른 상황 하에서, 성체 조직을 보충하도록 유발(trigger)할 수 있는 전구체 세포를 지닌다. 예를 들면, 신경능 세포의 다능성은 상기 기술되어 있다. 성체 위(gut)는 분화된 조직을 보충하는 미성숙 전구체를 함유한다. 간은 간 미성숙 전구체; 피부 재생물 자체 등을 함유하므로 재생하는 능력을 갖는다. 메센제닉 공정을 통해, 대부분의 중배엽 유도체는 전구체의 분화에 의해 지속적으로 보충된다. 이러한 복구는 배아 계통을 개괄하며 다능성 전구세포를 포함하는 분화 경로를 수반한다.

간엽성 전구 세포(progenitor cell)는 특이적인 신호에 반응하여 특이적인 계통을 취하는 다능성 세포이다. 예를 들면, 골 형태학적 인자에 대한 반응시, 간엽성 전구세포는 골 형성 계통을 취한다. 예를 들면, 손상에 대한 반응시, 중배엽 전구세포는 적절한 부위로 이주하여, 증식하고 국소 분화 인자와 반응하여, 결과적으로 명백한 분화 경로를 취한다.

단지 제한된 조직 복구가 성체에서 발견되는 이유는 특이적인 분화 계통을 취할 수 있는 후대 세포가 너무 적기 때문이라는 것이 제안되어 왔다. 이들 세포가 배양물에서 이들을 무한증식시킴으로써 확장될 수 있는 경우, 조직 복구는 배양된 세포의 이식에 의해 촉진될 수 있음이 명백하다. 그러나, 이배체 세포는 일반적으로 시험관내에서 제한된 증식능을 갖는다. 초기 배양 후, 세포는 일련의 신속한 사이클링을 겪으며, 이는 상기 집단이 유사분열의 G1/S 또는 G2/M 상에서 차단의 결과인, 성장 정지를 겪을때까지 둔화된다(Derventz 등, 1996, Anticancer Res. 16:2901-2910). 예를 들면, 제한된 수의 분열 후, 사람 섬유모세포는 세포 노쇠의 결과로서 비증식성 상태로 도입된다. 특정의 바이러스 종양유전자가 섬유모세포에서 발현되면, 복제 가능 수명(replicative life span)이 연장되나, 세포는 여전히 "위기(crisis)" 상태로 명명되는 비복제성 상태로 도입된다(Wei and Sedivy, 1999, Exp Cell Res 253:519-522). 성장 정지 상에 이르기 전에 세포가 겪는 세포 주기의 수는 세포형에 의존하며; 사람 세포의 경우, 상기 수는 일반적으로 30 내지 60회이다(Derventz 등, 1996, Anticancer Res. 16:2901-2910 및 이에 인용된 참고문헌). 따라서, 바람직한 유형의 줄기 또는 전구세포와 같은 다능성(pluripotent) 또는 다분화능(multipotent) 세포를 생체외(ex vivo)에서 무한증식시키는 공정은 바람직한 세포형의 보다 신속한 증식을 유발하여 손상 또는 외상의 보다 신속한 치료를 허용한다. 또한, 상기 능력은 많은 사람 질환을 치료하기 위한 잠재능을 유발하며 면역억제제를 필요로 하지 않으면서 조직 거부를 피할 수 있다.

3. 개시내용의 요약

(a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써, 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체, 또는 이의 고정화된 항원 결합 단편이고; 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체, 또는 이의 고정화된 항원 결합 단편이다. 특정한 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 조혈 전구체 세포에서 노치 신호전달 경로 활성화 수준을 최대 수준 이하로 유지하는 양으로 존재한다.

(a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 전에 조혈 전구체 세포에 의해 노치 1 발현 및/또는 노치 2 발현을 검출하거나 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배양 단계에서 사용된 하나 이상의 작용제는 상기 제1 단계에서 검출되거나 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그(paralog)의 작용제가다.

(a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 동안에 상기 조혈 전구체 세포에 의해서 노치 1 및 노치 2 발현을 반복적으로 검출하거나 측정하고, 검출 또는 측정 단계를 즉시 진행함으로써 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상의 작용제를 상기 배양 단계에서 사용함을 추가로 포함한다.

구체적인 구현예에서, 상기 배양은 조절 전구체 세포가 (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제, 및 (b) 성장 인자의 존재하에서 배양되지 않은 조혈 전구체 세포가 증식 및 분화를 중지하거나 사멸하는 기간을 초과하는 동안 수행된다.

구체적인 구현예에서, 상기 배양은 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재하에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 상기 배양은 노치 1 작용제의 존재하에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 상기 배양은 노치 2 작용제의 존재하에서 수행된다.

특정의 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 골수, 제대혈(umbilical 제대 혈액), 태반 혈액, 또는 와튼 젤리(Wharton's jelly)로부터 수득된다. 특정의 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 태아 또는 신생아 혈액으로부터 수득된다.

특정의 구현예에서, 배양 동안, 노치 2 작용제 대 노치 1 작용제의 중량비는 150:1; 140:1; 130:1; 120:1; 110:1; 100:1; 90:1; 80:1; 70:1; 60:1; 50:1; 40:1; 30:1; 25:1; 24:1; 23:1; 22:1; 21:1; 20:1; 19:1; 18:1; 17:1 16:1; 15:1; 14:1; 13:1; 12:1; 11 :1; 10:1; 9:1; 8:1; 7:1; 6:1; 5:1; 4:1; 3:1; 2:1; 1.5:1; 또는 1.25:1이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 2 작용제는 0.1㎍/ml 내지 50㎍/ml의 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 1 작용제는 0.005㎍/ml 내지 30㎍/ml의 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 2 작용제는 20㎍/ml의 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 1 작용제는 2.5㎍/ml, 10㎍/ml 또는 0.15㎍/ml의 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 2 작용제는 10㎍/ml의 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 1 작용제는 0.02㎍/ml의 농도이다.

특정의 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 트롬보포이에틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF), 및 Flt-3 리간드이다. 구체적인 구현예에서, IL-3은 10ng/ml의 농도에 있다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 IL-3, IL-6, TPO, SCF, 및 Flt-3 리간드는 50ng/ml의 농도에 있다.

특정의 구현예에서, 상기 배양은 7 내지 8일 이상 걸린다. 특정의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 5주 이상 소요된다. 특정의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 6주 이상 소요된다.

특정의 구현예에서, 조혈 전구체 세포를 (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포에 의한 노치 1 및 노치 2 발현을 반복적으로 측정하고, 상기 배양 단계에서 처음 24 내지 72시간의 배양 기간에 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상의 작용제를 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포를 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 여기서, 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포에 의한 노치 1 및 노치 2 발현을 반복적으로 측정하고, 중간 24 내지 72시간의 배양 기간에 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상의 작용제를 상기 배양 단계에서 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, 조혈 전구체 세포를 (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포에 의한 노치 1 및 노치 2 발현을 반복적으로 측정하고, 최종 24 내지 72시간의 배양기간 중 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상의 작용제를 상기 배양 단계에서 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 노치 1 및 노치 2 발현을 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포로 반복적으로 측정하고, 상기 배양 기간의 1/3 중에 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상 작용제를 상기 배양 단계 중에 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 노치 1 및 노치 2 발현을 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포로 반복적으로 측정하고, 상기 배양 기간의 2/3 중에 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상 작용제를 상기 배양 단계 중에 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 노치 1 및 노치 2 발현을 상기 배양 단계 동안 상기 조혈 전구체 세포로 반복적으로 측정하고, 상기 배양 기간의 최종 3번째에 상기 조혈 전구체 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진 노치 파라로그의 작용제인 하나 이상 작용제를 상기 배양 단계 중에 사용함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 Hes1 발현을 평가함으로서 조혈 전구체 세포내에서 노치 신호전달 경로를 측정함을 추가로 포함한다.

특정의 구현예에서, 상기 하나 이상 작용제는 각각 모노클로날 항체이다. 특정의 구현예에서, 상기 하나 이상 작용제는 각각 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, Fc, 또는 일본쇄 Fv 단편(scFv)이다. 구체적인 구현예에서, 노치 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 노치 1의 세포외 EGF 반복체 도메인에 결합한다. 보다 구체적인 구현예에서, 노치 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 노치 1의 EGF-유사 반복체 1 내지 6에 결합한다. 구체적인 구현예에서, 노치 2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편은 노치 2 세포외 EGF 반복체 도메인에 결합한다. 특정의 구현예에서, 하나 이상 작용제는 각각 사람, 사람화된, 합성, 또는 키메라 항체이다.

특정의 구현예에서, 배양은 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재하에서 수행되고, 노치 1 작용제는 제1의 고체 상에 고정된다. 구체적인 구현예에서, 배양은 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재하에 수행되고, 노치 1 작용제는 제1의 고체 상에 고정되며, 노치 2 작용제는 제1의 고체 상이 아닌 제2의 고체 상에 고정된다. 구체적인 구현예에서, 배양은 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재하에 수행되고, 노치 1 작용제는 제1의 고체 상에 고정되고, 노치 2 작용제는 제1의 고체 상에 고정된다. 구체적인 구현예에서, 제1의 고체 상은 조직 배양 디쉬(dish) 또는 플라스크의 표면이다. 보다 구체적인 구현에에서, 제1의 고체 상은 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면이고, 제2의 고체 상은 비드이다. 보다 구체적인 구현예에서, 제1의 고체 상은 비드이고, 제2의 고체 상은 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면이다.

특정의 구현예에서, 노치 1 작용제는 노치 1 및 델타를 발현하는 세포주 속에서 노치 1의 시스(cis) 억제를 극복할 수 있다. 특정의 구현예에서, 노치 1 작용제는 노치 2에 결합하는 것보다 더 높은 친화성으로 노치 1에 결합한다. 특정의 구현예에서, 노치 1 작용제는 실질적으로 노치 2에 대한 결합을 나타내지 않는다. 특정의 구현예에서, 노치 2 작용제는 노치 1에 대해 결합하는 것보다 더 높은 친화성으로 노치 2에 결합한다. 특정의 구현예에서, 노치 2 작용제는 실질적으로 노치 1에 대한 결합을 나타내지 않는다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에 조혈 줄기 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 줄기 세포 집단을 생성함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 전에 노치 1 발현 및/또는 노치 2 발현을 조혈 전구체 세포로 검출하거나 측정하는 제1 단계를 추가로 포함하며, 상기 노치 1 작용제는 노치 1이 발현되는 경우 상기 배양 단계에서 사용된다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생성함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 전에 노치 1 발현 및/또는 노치 2 발현을 조혈 전구체 세포로 검출하거나 측정하는 제1 단계를 추가로 포함하며, 상기 노치 2 작용제는 노치 2가 발현되는 경우 상기 배양 단계에서 사용된다.

특정의 구현예에서, (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생성시킴을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 전에 노치 1 발현 및/또는 노치 2 발현을 조혈 전구체 세포에 의해 검출하거나 측정하는 제1 단계를 추가로 포함하며, 상기 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제는 노치 1 및 노치 2 둘 다가 발현되는 경우에 상기 배양 단계에서 사용된다.

(a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상 성장 인자의 존재하에 조혈 전구체 세포를 배양함으로써 확장된 조혈 전구체 세포 집단을 생성함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 본원에 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 노치 2 작용제는 노치 2에 결합하는 고정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 상기 방법은 상기 배양 단계 동안에 노치 1 및 노치 2 발현을 상기 조혈 전구체 세포로 반복적으로 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배양 단계 동안 검출하거나 측정하는 단계의 예는 조혈 전구체 세포가 실질적으로 노치 2를 발현하지 않음을 나타내며, 이러한 예 후에, 노치 1 작용제는 상기 배양에 사용되지만, 노치 2 작용제는 상기 배양에 사용되지 않는다.

구체적인 구현예에서, 상기 배양은 노치 1 작용제의 존재하에 수행되며, 상기 노치 2 작용제는 상기 배양이 노치 1 작용제의 존재하에 수행되는 경우 존재하지 않는다. 구체적인 구현예에서, 상기 배양은 노치 2 작용제의 존재하에 수행되며, 상기 노치 1 작용제는 상기 배양이 노치 2 작용제의 존재하에 수행되는 경우 존재하지 않는다.

구체적인 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 사람이다. 구체적인 구현예에서, 상기 노치 1 및 노치 2는 사람 노치 1 및 노치 2이다. 구체적인 구현예에서, 상기 성장 인자는 사람 성장 인자이다.

구체적인 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 조혈 줄기 세포이다. 구체적인 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포이다. 구체적인 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 조혈 전구 세포이다. 구체적인 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 단-기간 골수 이식 세포이다. 구체적인 구현예에서, 본원에 기술된 상기 방법은 흉선에 이주할 수 있는 조기 T 세포 전구체를 추가로 생산하며 성숙한 T 세포를 생성한다.

플라스틱 표면에 델타1의 세포외 도메인(Delta1^ext-IgG)의 고정화에 의해 유도된 노치 신호전달은 단기간 증식하는 세포를 포함하는, 쥐 골수 또는 사람 제대혈액으로부터의 정제된 조혈 전구세포의 생체외 배양 후 증가된 수의 조혈 전구세포를 생성한다. 이러한 배양 시스템이 임상 셋팅에서 제대 혈액 이식을 증진시키는 생성물을 생성시키는데 사용되어 왔다고 해도, 고정화된 Delta1^ext-IgG는 배양된 HSC에 의해 발현된 노치 1 및 노치 2 수용체 둘 다를 고 수준으로 활성화시킬 수 있음으로써, 줄기 세포 자기-재생에 대해 억제 경향성인 분화 프로그램을 유도한다.

본 개시내용은 낮은 노치 신호 강도의 유지가 줄기 세포의 증진된 확장 및 생착을 가져온다는 것을 제공한다. 노치 신호전달에 있어서 정성적 차이보다는 정량적인 차이가 나타나 있으므로, 노치 1 및/또는 노치 2의 활성화를 사용하여 바람직한 수준의 노치 신호전달을 생성할 수 있다. 또한, 노치 1 및 노치 2 수용체 발현은 배양 동안 서로 독립적으로 발생하므로, 상이한 노치 작용제를 시간에 따라 변화하는 발현 수준을 기준으로 선택할 수 있다. 이들 구현예에서, 노치 신호전달은 노치 1 작용제; 노치 2 작용제; 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제가 존재에 기인할 수 있다. 따라서, 및 본원에 기술된 바와 같이, 낮은 수준의 노치 신호 강도는, 노치 1, 노치 2 또는 노치 1 및 노치 2의 활성화를 통해 유지되어야 한다.

현재의 개시내용은 또한, 노치 1(이의 발현은 노치 활성화 후 배양 동안 증가한다)의 낮은 활성화와 함께 낮은 노치 신호 강도(이는 줄기 세포에서 노치 2에 의해 중재될 수 있다)의 유지가 줄기 세포의 개선된 확장 및 생착을 가져옴을 제공한다. 상기 결과는 선택적인 파라로그 활성화에 의해 줄기 세포내에서 노치 신호의 조심스러운 적정이 유리함을 제안한다. 현재의 개시내용은 비교적 많은 양의 노치 2 작용제와 조합된 적은 양의 노치 1 작용제가 들어있는 웰(well) 속에서 쥐 골수가 고도로 농축된 줄기(SK-SLAM) 세포의 배양이, Delta1^ext-IgG, 노치 2 작용제 단독, 또는 노치 1 또는 노치 2 수용체에 대해 특이적인 모노클로날 항체가 플라스틱 표면에 고정화되어 있는 경우 대조군 리간드가 들어있는 배양물 속에서 1배 미만의 증가와 비교하여, 7 내지 8일의 배양 후 SK-SLAM 세포(Sca-1⁺-c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD1lb^-)의 2배 증가된 생성을 가져옴을 나타낸다. 따라서, 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 사용에 의한 노치 파라로그 특이적인 활성화는 조혈 줄기 세포를 포함하는, 줄기 세포를 확장시키는 신규 방법을 제공한다.

하나의 특수한 구현예는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제, 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제(및, 특수한 구현예에서, 하나 이상 성장 인자)의 존재하에서 비-무한증식된 전구체 세포를 상기 노치 1 작용제, 노치 2 작용제, 또는 노치 1 및 노치 2 작용제(및, 특수한 구현예에서, 성장 인자)의 부재하에서 상기 전구체 세포형의 세포가 증식 및/또는 분화를 중지하거나 사멸하는 기간 동안 배양하여, 상기 전구체 세포가 증식하지만 상기 기간 동안 말기 분화하지 않도록 함으로써 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산하는 방법을 포함한다.

다른 구현예에서, 배양 동안 노치 2 작용제는 노치 1 작용제보다 더 높은 농도로 제공된다.

다른 구현예에서, 노치 2 작용제 대 노치 1 작용제의 비는 150:1; 140:1; 130:1; 120:1; 110:1; 100:1; 90:1; 80:1; 70:1; 60:1; 50:1; 40:1; 30:1; 25:1; 24:1; 23:1; 22:1; 21 :1; 20:1; 19:1; 18:1; 17:1 16:1; 15:1; 14:1; 13:1; 12:1; 11 :1; 10:1; 9:1; 8:1; 7:1; 6:1; 5:1; 4:1; 3:1; 2:1; 1.5:1; 또는 1.25:1이다. 바람직한 구현예에서, 상기 비는 중량비이다.

다른 구현예에서, 배양 동안 상기 노치 2 작용제는 0.1㎍/ml; 1㎍/ml; 5㎍/ml; 10㎍/ml; 15㎍/ml; 20㎍/ml; 25㎍/ml; 30㎍/ml; 35㎍/ml; 40㎍/ml; 45㎍/ml; 50㎍/ml; 55㎍/ml; 60㎍/ml; 65㎍/ml; 70㎍/ml; 75㎍/ml; 80㎍/ml; 85㎍/ml; 90㎍/ml; 95㎍/ml; 또는 100㎍/ml의 농도이다.

다른 구현예에서, 배양 동안 상기 노치 1 작용제는 0.005㎍/ml; 0.05㎍/ml; 0.5㎍/ml; 1㎍/ml; 5㎍/ml; 10㎍/ml; 15㎍/ml; 20㎍/ml; 25㎍/ml; 30㎍/ml; 35㎍/ml; 40㎍/ml; 45㎍/ml; 50㎍/ml; 55㎍/ml; 또는 60㎍/ml의 농도이다.

다른 구현예에서, 배양 동안 상기 노치 2 작용제는 20㎍/ml의 농도이고 상기 노치 1 작용제는 2.5㎍/ml, 10㎍/ml 또는 0.15㎍/ml의 농도이다.

다른 구현예에서, 배양 동안 상기 노치 2 작용제는 10㎍/ml의 농도이고 상기 노치 1 작용제는 0.02㎍/ml의 농도이다.

다른 구현예에서, 상기 하나 이상 성장 인자는 IL-3; IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3이다.

다른 구현예에서, 배양 동안 IL-3는 10 ng/ml의 농도이다. 다른 구현예에서, 배양 동안, IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3 중의 하나 이상은 50 ng/ml의 농도이다.

다른 구현예에서, 전구체 세포 집단은 실질적으로 상기 기간 동안 분화하지 않는다.

다른 구현예에서, 상기 전구체 세포는 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 전구체 세포는 전구 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 다른 구현예에서, 상기 전구 세포는 조혈 전구 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 조혈 줄기 또는 전구 세포는 골수로부터 수득된다. 다른 구현예에서, 상기 조혈 줄기 또는 전구 세포는 태아 또는 신생아 혈액으로부터 수득된다.

다른 구현예에서, 상기 기간은 7 내지 8일이다. 다른 구현예에서, 상기 기간은 적어도 5주이다. 다른 구현예에서, 상기 기간은 적어도 6주이다.

4. 도면의 간단한 설명

도 1. 특이적인 노치 항체와의 배양은 SK-SLAM(Sca-1⁺c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD11b^-) 세포의 증가된 생성을 가져온다. 각각의 바아는 (i) 5㎍/ml에서 고정화된 Delta1^ext-IgG(델타), (ii) 5㎍/ml에서 고정화된 사람 대조군 IgG(HuIgG) 및 (iii) 노치 2 항체[HMN2-35 (MN2)] 또는 (iv) 노치 2 및 노치 1 항체 [HMN1-12(MN1)] (캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 Biolegend에서 상업적으로 이용가능함)에 대한 나타낸 투여량의 고정화된 모노클로날 항체가 들어있는 배양물 속에서 SK-SLAM 세포의 평균 배 증가된 수를 나타낸다. x-축에서 괄호안의 수는 ㎍/ml로 제공된다. 바아는 2개의 별도의 실험 +/- 범위의 배양 웰 속에 둔 SK-SLAM의 초기 수와 비교한 평균 배 증가이다.

도 2a 내지 2d. 2개의 별개의 단위체로부터의 제대 혈액 CD34⁺　세포를 IL-3 (10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50ng/ml)이 들어있는 스템스판(Stemspan) 속에서 14일 동안 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 델타 1(델타, 2.5㎍/ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 2(α노치2, 클론 MHN2-25, 0.5㎍/ml(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)), (iii) 고정화된 항-사람 노치 1(노치l, 클론 MHN1-519(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)과 합해진 고정화된 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml, 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG(IgG)의 존재하에서 성장시켰다. CD34⁺ 전구 세포의 (A) 퍼센트 및 (B) 수, 및 또한 추가의 원시 CD34⁺/90 low 세포의 (C) 비 및 (D) 수를 측정하였다. x-축에서의 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 3. 도 2에서와 같이 14일 동안 배양한 후, 10,000개의 제대 혈액 CD34⁺　세포의 확장된 전구를 그룹당 6마리의 NSG 마우스 각각에 이식시켰다. 마우스로부터 골수 흡입물을 이식 후 2주째에 유동 세포분석기로 생착에 대해 분석하였다. 노치 1 항체(αN1, 클론 MHN1-519(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 및 노치 2 항체 (aN2, 클론 MHN2-25, 0.5㎍/ml (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함))는 2주째에 골수 흡입물 속에서 CD45⁺　세포(y-축)에 나타낸 바와 같이, 델타, IgG, 또는 노치 2 항체 단독(2개의 제대 혈액 단위체에 대해 각각 p=0.0024 및 p=0.0225)보다 유의적으로 더 높은 수준의 사람 생착을 가능하도록 하였다. x-축의 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 4a 내지 4d. 특이적인 노치 항체에서 AGM-기원한 CD45⁺/VE-Cadherin⁺　세포의 배양은 LSK-SLAM 세포 및 다중계통 생착의 생성에 영향을 미친다. (A) 유동세포 분석에 의한 LSK-SLAM(Scal+c-kit+CD150+CD48-Gr1-F480-) 세포의 수는 2.5㎍/ml에서 Delta1^ext ^- ^IgG(델타), 2.5㎍/ml에서 HulgG 및 나타낸 투여량의 노치 1 항체에 대한 고정화된 모노클로낭 항체(MN1 또는 항N1, 클론 HMN1-12(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 또는 노치 2 항체에 대한 고정화된 모노클로낭 항체(MN2 또는 항N2, 클론 HMN2-35(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함))에서 5일 배양 후 생성하였다. 세포 수는 도입된 출발하는 CD45+/VE-Cadherin+ 세포의 AGM 1 당량당 나타내며 오차 바아(error bar)는 분석된 3개의 웰의 표준 편차를 나타낸다. 패널 A에서 배양되고, 3X10⁴　구조 CD45.1 골수 세포로 마우스 당 출발하는 세포(CD45.2)의 0.5 AGM 당량으로 이식된 세포의 (B) 2주 및 (C-D) 6주째의 말초 혈액 생착. 분석된 각각의 마우스에 대한 말초 혈액 속에서 총 CD45⁺ 세포의 퍼센트로서 공여체 생착(CD45.2) %, 공여체 골수 생착(Gr1 및/또는 F480), 및 공여체 B 골수(CD19)/T 림프구(CD3) 생착이 나타나 있다. x-축에서 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 5a 내지 도 5d. 2개의 별개의 단위체로부터의 제대 혈액 CD34⁺　세포를 14일 동안 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50ng/ml)이 들어있는 스템스판 속에서 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 델타 1(델타, 2.5㎍/ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 2(α노치2, 클론 MHN2-25(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml, (iii) 고정화된 항-사람 노치 1과 합해진 고정화된 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml(α노치 1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)), 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG의 존재하에서 성장시켰다. CD14⁺　세포의 (A) 퍼센트 및 (B) 총 수를 측정하고, CD15⁺　세포의 (C) 퍼센트 및 (D) 총 수를 측정하였다. x-축에서 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 6a 내지 6b. 2개의 별개의 단위체로부터 제대 혈액 CD34⁺　세포를 14일 동안 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50ng/ml)이 들어있는 스템스판 속에서 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 델타 1(델타, 2.5㎍/ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 2(α노치2, 클론 MHN2-25 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml, (iii) 고정화된 항-사람 노치 1와 합해진 고정화된 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml(α노치 1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)), 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG (IgG)의 존재하에서 성장시켰다. CD7⁺　세포의 (A) 퍼센트 및 (B) 총 수를 측정하였다. x-축에서 수는 ㎍/ml로 나타낸다.

도 7a 내지 7b. 2개의 단위체의 혼주물(pool)로부터의 제대 혈액 CD34⁺ 세포를 14일동안 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)가 들어있는 스템스판 속에서 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 델타 1(델타, 2.5㎍/ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 1(αN1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.02㎍/ml, (iii) 고정화된 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml와 합해진 고정화된 항-사람 노치 2(αN2, 클론 MFIN2-25 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml, 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG의 존재하에서 성장시켰다. 10,000개 세포의 확장된 전구를 그룹당 5마리의 NSG 마우스 각각에게 이식하였다. 골수 흡입물을 세포 유동분석기에 의해 총 사람(CD45), 림프구(CD 19) 및 골수에 대해 이식 2주째에 및 이식 후 8 또는 10주째에 분석하였다. 비교용의, (A) 도 3에 또한 나타낸 바와 같은 2주째에 실험 409로부터의 CD45⁺ 세포의 퍼센트에 대한 결과, 및 (B) 2주째에 실험 414로부터의 CD45⁺ 세포의 퍼센트에 대한 결과. x-축에서 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 8a 내지 8b. 2개의 실험((A) 실험 409 및 (B) 실험 414)에서 2개의 단위체의 혼주물로부터의 CD34⁺　세포를 14일 동안 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)가 들어있는 스텝스판 속에서 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/1ml 및 (i) 고정화된 Delta1(델타, 2.5㎍/1ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 1(αN1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)), 0.02㎍/1ml, (iii) 고정화된 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml와 합해진 고정화된 항-사람 노치 2(αN2, 클론 MHN2-25 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml, 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG (IgG)의 존재하에서 성장시켰다. 골수 흡입물을 유동 세포분석기에 의해 총 사람(CD45), 림프구(CD 19) 및 골수에 대해 이식 후 2주 및 이식 후 8 또는 10주째에 분석하였다. (A) 10주째에 실험 409로부터의 CD45⁺　세포의 퍼센트의 결과, 및 (b) 8주째에 실험 414로부터의 CD45⁺　세포의 퍼센트의 결과를 나타낸다. x-축에서 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 9a 내지 9c. 2개의 단위체로부터의 제대 혈액 CD34⁺　세포를 14일 동안 IL-3(10ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50ng/ml)가 들어있는 스템스판 속에서 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 Delta1(델타, 2.5㎍/ml), (ii) 고정화된 항-사람 노치 1(αN1 또는 αN1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.02㎍/ml, (iii) 고정화된 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml와 합해진 고정화된 항-사람 노치 2(αN2 또는 αN2, 클론 MHN2-25 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml, 또는 (iv) 고정화된 대조군 IgG(IgG)의 존재하에서 성장시켰다. 골수 흡입물을 유동 세포분석기에 의해 총 사람(CD45), 림프구(CD 19) 및 골수에 대해 이식 후 2주째에 및 이식 후 8 또는 10주째에 분석하였다. (A) 실험 409에 대한 10주 후 골수내 CD33⁺세포의 퍼센트에 대한 결과, (B) 실험 414에 대해 8주 후에 골수속의 CD33⁺　세포에 대한 퍼센트의 결과, 및 (C) 실험 414에 대해 8주후 골수내 CD33⁺ 및/또는 CD14⁺/CD15⁺ 세포의 퍼센트의 결과를 나타낸다. x-축의 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 1Oa 내지 10c. 전체의 노치 2 세포내 도메인(ICD)에 대한 게놈성 암호화 영역을 노치 1 유전자자리(노치l　^12/12)내로 교환하고 노치1 ICD를 노치 2 유전자자리(노치 2^21/21) 내로 교환한 정상의 쥐 말초 혈액(PB) 조혈 계통의 표면 마커 발현. 점 플롯(dot plot)은 분석된 계통 항체 CD3, CD4, CD8(T 세포), CD 19(B 세포), 및 F4/80, GR1 (골수) 및 FACS로 염색된 지정된 마우스로부터의 PB를 나타낸다. 나타낸 결과는 (A) CD3 및 CD 19 발현, (B) CD4 및 CD8 발현, 및 (C) F4/80 및 GR1 발현에 대한 것이다. 구석의 수는 이러한 사분면내의 현상의 퍼센트를 나타낸다.

도 11. 새로이 분리된 제대 혈액(CB) 총 CD34⁺　또는 CD34+CD90¹⁰　원시 소세트를 노치 1(N1) 및 노치 2(N2)의 세포 표면 발현에 대해 분석하였다. 막대그래프는 동형 대조군(모든 그래프에서 가장-좌측 피크)과 비교하여 노치 1 또는 노치 2 항체 염색(모든 그래프에서 가장-우측 피크)의 상대적인 양을 나타낸다.

도 12a 내지 12b. 제대 혈액 CD34⁺　세포를 14일 동안 고정화된 Delta1 (델타, 2.5㎍/ml) 및 (A) 고정화된 노치 1 항체(노치 1, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.02㎍/ml, 또는 (B) 고정화된 노치 2 항체 (노치 2, 클론 MHN2-25 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml의 존재하에서 배양하였다. 10,000개의 확장된 전구 세포를 각각의 NSG 마우스내로 이식하였다. 골수(BM) 흡입물(2 내지 3주)를 이식 후 총 사람 세포에 대해 분석하였다. y-축은 사람 세포의 퍼센트를 나타내는, CD45 양성 세포의 퍼센트를 나타낸다.

도 13. 사람 노치 1의 개략도. EGF-N1로 표지된 선은 노치 1 항체 클론 MHN1-519(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)을 생성하는데 사용된 펩타이드의 상대적인 위치를 나타낸다. NRR-N1로 표지된 선은 NRR-N1 항체를 생성하는데 사용된 펩타이드의 상대적인 위치를 나타낸다.

도 14. CB-기원한 CD34⁺　세포는 레트로넥틴 및 (i) 대조군(IgG), (ii) 델타 1(델타), (iii) 노치 1 항체 클론 MHN1-519(EGF-N1), (iv) NRR-N1, (v) 노치 2 항체 클론 MHN2-25(EGF-N2), 또는 (vi) NRR-N2로 0.1㎍/ml 또는 2.5㎍/ml로 피복된 비-조직 배양 웰에서 4시간 동안 배양하였다. cDNA를 수거된 세포로부터 분리된 RNA를 사용하여 생성하였다. Hes1(y-축, 2^△△Ct)의 상대적인 발현을 대조군 IgG와 비교하여 각각의 배양 조건에 대해 보고한다. x-축에서 수는 ㎍/ml으로 제공된다.

도 15a 내지 15b. (A) 제대 혈액 CD34⁺　세포를 분류하여 CD34⁺CD90^l0　및 CD34⁺CD90^-　소세트를 분리하였다. 동일한 수의 세포를 레트로넥틴 및 (i) 사람 IgG 2.5㎍/ml, (ii) Delta1 10㎍/ml, (iii) 노치 1 항체 클론 MHN1-519 (EGF-N1) 0.02㎍/ml 또는 (iv) 노치 1 항체 클론 MHN1-519, 5㎍/ml로 피복된 웰로 이전시키고 4시간 동안 5GF(IL-3 10ng/ml, IL-6, SCF, Flt-3L, TPO 모두 50 ng/ml)이 들어있는 스템스판 속에서 배양하였다. 세포를 Hes1 RT-PCR을 위해 수거하였다. Hes1의 상대적인 발현(y-축, 2^△△Ct)의 상대적인 발현을 대조군 IgG와 비교하여 각각의 배양 조건에 대해 보고한다. x-축의 수는 ㎍/ml로 제공한다. (B) 분류되지 않은 제대 혈액 CD34⁺　세포의 일부를 5GF가 들어있는 스텝스판 속에서 15일 동안 고정화된 사람 IgG 2.5㎍/ml 및 레트로넥틴 5㎍/ml와 함께 배양하였다. 세포를 레트로넥틴 및 (i) 사람 IgG l0㎍/ml, (ii) 델타 10 ㎍/ml, 또는 (iii) 노치 1 항체 클론 MHN1-519 (EGF-N1) 5㎍/ml으로 피복된 새로운 웰로 이전시키고 4시간 동안 항온처리하였다. 세포를 Hes1 RT-PCR을 위해 수거하였다. Hes1의 상대적인 발현(y-축, 2^△△Ct)을 대조군 IgG와 비교하여 각각의 배양 조건에 대해 보고한다.

도 16a 내지 16b. 저켓 세포(Jurkat cell)를 (A) Delta1-myc (25ug/ml) 또는 (B) 노치 1 항체 클론 MHN1-519 (EGF-N1)(5㎍/ml)과 접합된 PE와 함께 사람 IgGl의 Fc 부위(Delta1, 작은 파선처리된 곡선, 패널 A 및 B; 차단제 없음, 큰 파선처리된 곡선, 패널 A 및 B)에 융합된 델타 1을 첨가하거나 첨가하지 않으면서 항온처리하였다. Delta1-myc을 항-myc 항체 9E10을 사용하여 검출하였다. 델타 1-myc에 대한 대조군(실선 곡선, 패널 A)은 결합 완충액만이었다. MHN1-519에 대한 대조군(실선 곡선, 패널 B)은 비-결합 마우스 IgGl였다.

도 17a 내지 17f. CHO K1-DLL1 세포를 독시사이클린(1㎍/ml)의 존재(파선 곡선) 또는 부재(실선 곡선) 하에 밤새 항온처리하여 DLL1을 유도시키고 (A) 피복시키지 않거나, (B) 고정화된 사람 IgG(2.5㎍/ml), (C) 고정화된 Delta1 2.5㎍/ml (D) 고정화된 Delta1 l0㎍/ml, (E) 고정화된 노치 1 항체 클론 MHN1-519(EGF-N1) 0.02㎍/ml, 또는 (F) 고정화된 노치 1 항체 클론 MHN1-519 5㎍/ml 및 모두 레트로넥틴5㎍/ml과 함께 피복시킨 웰에 이전시켰다. 2일 후, 세포를 수거하고 YFP 발현을 유동 세포분석기로 평가하였다.

도 18. PE에 접합된 사람 항-노치 1 항체 및 APC에 접합된 사람 항-노치 2 항체를 사용하여 새로이 분리된 제대 혈액 CD34+ 세포 및 고정화된 Delta1에서 배양된 것들에서 노치 발현을 검출하였다. 평균 형광성 강도(MFI)를 0 내지 14일의 배양 간격으로 (i) PE에 접합된 항-노치 1 항체(N1, 사각형), (ii) APC에 접합된 항-노치 2 항체(N2, 십자형), (iii) 대조군 IgGl (Gl, 다이아몬드형), 또는 (iv) 대조군 IgG2a (2A, 삼각형)에 접합시킨 항-노치 2 항체에 대해 측정하였다.

도 19. 2개의 별개의 단위체로부터의 제대 혈액 CD34⁺　세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 대조군 IgG (ii) 고정화된 Delta1 (0.5, 2.5 또는 10㎍/ml), 또는 (iii) 고정화된 항-사람 노치 1 (노치 1 (0.02, 0.1, 0.5 또는 2.5㎍/ml), 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함))의 존재하에서 성장시켰다. 일반적인 림프구전구 세포(CLP), CD34⁺/CD387CD7⁺　집단을 유동 세포분석기로 평가하였다. y-축은 7일째에 CD34⁺/CD387CD7⁺　세포의 총 수를 나타낸다. x-축의 수는 ㎍/ml로 제공된다.

도 20a 내지 20b. 2개의 단위체의 혼주물로부터의 제대 혈액 CD34⁺　세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 델타 1 2.5㎍/ml, (ii) 고정화된 대조군 IgG, (iii) 고정화된 항- 사람 노치 1 (aNl, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.02㎍/ml, 또는 (iv) 항-사람 노치 2 (aN2, 클론 MHN2-25, (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)) 0.5㎍/ml와 합해진 고정화된 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml의 존재하에 성장시켰다. 배양 14일째에, 10,000개의 확장된 전구 세포를 그룹당 5마리의 NSG 마우스 각각에 이식하였다. 18주 후, 골수를 수거하고 (A) 총 사람 생착(CD45 퍼센트, y-축) 및 (b) 사람 T 세포 생착(CD3 퍼센트, y-축)을 유동 세포분석기로 평가하였다. x-축에서의 수는 ㎍/ml로 제공한다.

5. 약어 및 정의

본원에 사용된 것으로서, 다음의 약어 및 정의는 나타낸 의미를 가질 것이다:

ATRA: 모든 트랜스 레티노산

BDNF: 뇌-기원한 신경영양 인자

BFU-E: 파열(burst)-형성 단위-적혈구. 반-고체 배지 속에서 적혈구 전구 세포의 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구세포.

CFU 또는 CFU-C: 콜로니-형성 단위 또는 콜로니-형성 단위 세포. 반-고체 배지 속에서 전구 세포의 콜로니를 생성할 수 있는 세포.

CFU-E/Mega: 콜로니-형성 단위-적혈구, 거핵 세포. 반-고체 배지 속에서 적혈구 및 거핵 세포 전구세포로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포.

CFU-Eo: 콜로니-형성 단위-호산구. 반-고체 배지 속에서 호산구 전구세포로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포.

CFU-G: 콜로니-형성 단위-과립구. 반-고체 배지 속에서 과립구(또는 다형핵 백혈구)로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포.

CFU-GM: 콜로니-형성 단위-과립구, 대식구. 반-고체 배지 속에서 과립구 및 대식구 전구로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포.

CFU-M: 콜로니-형성 단위-대식구. 반-고체 배지 속에서 대식구 전구세포로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포.

CFU-Mega: 콜로니-형성 단위-거핵구. 반-고체 배지 속에서 거핵구 전구세포로 구성된 콜로니를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포. 거핵구는 혈소판의 전구체이다.

CFU-S: 콜로니 형성 단위-비장. 치사적으로 조사된 마우스내로 접종시 거핵구, 과립구 및 적혈구 전구체를 함유하는 비장(들)에서 콜로니(소절(nodule))을 생산할 수 있는 자가-재생능을 지닌 다능성 줄기 세포.

CNTF: 섬모 향신경성 인자

EGF: 상피 성장 인자

EPO: 에리쓰로포이에틴

FGF-1 : 섬유아세포 성장 인자- 1/산성 FGF

FGF-2: 섬유아세포 성장 인자-2/염기성 FGF

FGF-7: 섬유아세포 성장 인자-7

Flt-3L: flt-3 리간드

GDNF: 아교 세포주-기원한 향신경성 인자

GM-CSF: 과립구-대식구 콜로니 자극 인자

HGF: 간세포 성장 인자

HSC: 조혈 줄기 세포. HSC의 정의는 작용성이며 골수형성 치료를 받은 수용체의 조혈 시스템을 재생시키는 이식된 세포의 능력을 기준으로 한다. HSC는 대략 0.01%의 골수 세포이다. 이들은 자가-재생할 수 있우며 골수를 재생시키고 장기간 림프- 및 골수조혈을 하는 이들의 능력으로 평가할 수 있다(Dexter and Allen, 1992, Nature 360:709-710).

HSPC: 조혈 줄기 및 전구 세포

HPP-CFC 또는 HPP-mix: 미성숙 골수 줄기 세포인, 고 증식성의 잠재 콜로니 형성 세포.

ICD: 세포내 도메인

IGF-1: 인슐린-유사 성장 인자-1

IL-3: 인터루킨-3

IL-6: 인터루킨-6

IL-7: 인터루킨-7

IL-11: 인터루킨-11

IRES: 내부 리보소옴 도입 부위

림프구 줄기 세포: 림프구 줄기 세포는 자기 재생능으로 제한되며 전체 림프구 계통을 재생시킬 수 있고 반-고체 배지 속에서 모든 림프구 세포형으로 구성된 콜로니를 생산할 수 있다. 쥐 림프구 줄기 세포는 이들의 CD25 발현에 의해 표지된다.

골수 줄기 세포: 골수 줄기 세포는 제한된 자기 재생능을 가지며 전체 골수 계통을 재생시킬 수 있고 반-고체 배지 속에서 모든 골수 세포형으로 구성된 콜로니를 생산할 수 있다. 쥐 골수 줄기 세포는 Gr-1 및 F4/80의 발현으로 정의된다.

NGF: 신경 성장 인자

NSG 마우스: NOD-scid IL2R감마 널(null) 마우스

PDGF: 혈소판-기원 성장 인자

RAM: 노치의 RBPJκ 결합 도메인

RAR: 레티노산 수용체

SCF: c-kit 리간드로 또한 공지된 줄기 세포 인자 또는 유방 세포 성장 인자

TGF-β: 형질전환 성장 인자-β

TPO: 트롬보포이에틴

6. 상세한 설명

본 개시내용은 (a)(i) 노치 1 작용제, (ii) 노치 2 작용제, 또는 (iii) 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제인 하나 이상의 작용제, 및 (b) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 조혈 전구체 세포를 배양함으로써, 확장된 조혈 전구 세포 집단을 생산함을 포함하여, 조혈 전구체 세포를 확장시키는 방법이 기술되어 있으며; 상기 노치 1 작용제는 노치 1에 결합하는 고정화된 항체, 또는 이의 고정화된 항원 결합 단편이고; 상기 노치 2 작용제는 노치 에 결합하는 고정화된 항체, 또는 이의 고정화된 항원 결합 단편이다. 전구체 세포를 확장시키기 위한 본 발명의 방법은 생체외에서 수행된다.

본 개시내용은 또한 비-말기 분화된 세포의 무한증식 세포 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법에 의해 무한증식된 세포는 이후에 무한증식 세포로 언급된다. 특히, 본 개시내용은 세포가 또한 노쇠 및/또는 세포 사멸을 가져오는 위기를 겪음으로 인해, 증식, 분화를 중지하고/하거나 사멸할 수 있는 기간 이상 동안 배양물 속에서 전구체 세포(비-말기 분화된 세포)를 성장시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제, 및/또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 노출시킴을 포함한다. 특수한 구현예에서, 세포는 또한 전구체 세포의 증식을 촉진하지만 이의 분화는 촉진하지 않는 하나 이상 성장 인자에 노출된다.

본 개시내용은 또한 노치 신호전달에 있어서 정량적 차이가 골수 분화의 지연을 설명한다는 것을 제공한다. 노치 신호전달에 있어서 정성적 차이가 아닌 정량적 차이를 나타내므로, 노치 1 및/또는 노치 2의 활성화를 사용하여 노치 신호전달의 바람직한 수준을 생성할 수 있다. 노치 1 및 노치 2 수용체 발현은 배양 동안 서로 독립적으로 발생하므로, 상이한 노치 작용제를 시간에 따라 발현 수준의 변화를 기준으로 선택할 수 있다. 또한, 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제의 양은 노치 1 수용체 발현 및 노치 2 수용체 발현을 기준으로 계산할 수 있다. 따라서, 이들 구현예에서, 노치 신호전달은 노치 1 작용제, 노치 2 작용제, 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재에 기인할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 조혈 줄기 세포 집단의 적어도 일부의 개개 세포에서 낮은 수준의 노치 신호 강도(예를 들면, 개개 세포 수준에서 준최대 Hes1 발현에 의해 측정됨)은 노치 1, 노치 2 또는 노치 1 및 노치 2의 활성화를 통해 유지되어야 한다. 개개 조혈 줄기 세포에서 낮은 노치 신호 강도의 유지는 본원에 기술된 바와 같이 조혈 줄기 세포를 확장시키는 방법을 뒷받침하는 반면 보다 높은 노치 신호 강도의 유도는 림프구 계통, 예를 들면, Thy1+ 및 CD25+ T 세포 전구체로의 세포 분화를 유도한다(참고: 예를 들면, Dallas 등, J. Exp. Med., Vol. 201, May, 2005, pp. 1361-1366). 조혈 줄기 세포 집단를 따라, 상이한 조혈 줄기 세포에서 낮은 및 높은 노치 신호 강도 둘 다를 유도하는 것이 조혈 줄기 세포 및 이러한 림프구 전구체 둘 다를 상기 집단으로부터 생산하는데 유리할 수 있다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법에 따른 전구체 세포를 무한증식시킨 후 상기 무한증식된 세포 및/또는 이의 전구 세포를 상기 전구체 세포의 바람직한 세포형으로의 분화를 촉진하는 조건에 노출시킴을 포함하여, 거의 분화되지 않은 유형으로부터 바람직하게 분화된 세포 유형을 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법에 의해 분화된 세포는 이후 분화된 세포로 언급된다.

이러한 방법은 고갈된 세포 집단의 재생 또는 보충, 예를 들면, 화학치료요법 후 조혈 세포 또는 사람 면역결핍성 바이러스에 의한 감염 후 T-세포의 재구성을 위한 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법으로 무한증식되거나 분화된 세포는 또한 예를 들면, 바람직한 유전자 생성물을 전달하기 위해 재조합체로 제조될 수 있다.

본 개시내용의 특정의 구현예에서, 무한증식된 세포는 대상체의 신체의 적절한 영역내로 다시 이식되는데, 예를 들면, 무한증식된 HSC는 대상체의 골수내로 이식된다. 다른 구현예에서, 무한증식된 세포는 노치 경로를 활성화시키고/시키거나 세포를 본 개시내용의 방법에 따라서 또는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해 성장시키는 성장 인자의 조합을 변경시킴으로써 분화된다. 여전히 다른 구현예에서, 전구체 줄기 세포는 동시에 무한증식되며 노치 1, 노치 2 또는 노치 1 및 노치 2 활성화 및 적절한 성장 인자의 조합에 의해 분화된 후 대상체내로 다시 이식된다. 바람직하게는 노치 1 및/또는 노치 2 작용제는 대상체내로 이식되기 전에 불활성화된다.

본 개시내용은 본원에 기술된 방법으로 생산된 배양물 및 HSC를 또한 제공한다.

본 개시내용은 함께 이들에 노출된 전구체 세포를 무한증식시킬 수 있는 노치 1, 노치 2 작용제 및 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 세포를 무한증식시키거나 무한즉식 및 분화시키기 위한 시약을 포함하는 키트를 또한 제공한다.

6.1 노치 1 및 노치 2 작용제

본 개시내용의 방법은 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제(및, 특수한 구현예에서, 하나 이상 성장 인자)의 존재하에서 제공된 기간 동안 전구체 세포(미-말기 분화된 세포)를 무한증식시킴을 포함한다. 노치 1 및/또는 노치 2 작용제는 적절하게는 노치 1 또는 노치 2에 대해 특이적인, 노치 경로 작용의 활성화를 촉진시키는, 즉, 유발하거나 증가시키는 제제이다. 본원에 사용된 것으로서, "노치 경로 작용"은 RBP-Jκ 또는 Hairless의 이의 초파리 동족에 억제제의 핵 전좌; 분할 복합체(split complex), 예를 들면, 마스터마인드(Mastermind)의 인핸서의 bHLH 유전자의 활성화; 초파리 신경모세포 분리의 억제; 및 노치의 델타, Jagged/Serrate, Fringe, Deltex 또는 RBP-Jκ/Hairless 억제제, 또는 이의 동족체 또는 유사체에 대한 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

노치 활성화는 전구체 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 노출시킴으로써 수행된다. 노치 1의 작용제 및 노치 2의 작용제는 전구체 세포가 노출된 세포 단층 상의 세포-표면 분자, 또는 고체 상에 고정화된 분자로서 재조합적으로 발현된 가용성 분자일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 노치 1 및/또는 노치 2 항체에 고정화된다. 다른 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 전구체 세포내로 도입된 핵산으로부터 재조합적으로 발현될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 제1의 고체 상에 고정화된 노치 1 작용제 및 제2의 고체 상에 고정화된 노치 2 작용제를 배양함으로써 확장되며, 상기 제1 및 제2의 고체 상은 동일하다.

일부 구현예에서, 세포는 당해 세포를 제1의 고체 상에 고정화된 노치 1 작용제 및 제2의 고체 상에 고정화된 노치 2 작용제와 함께 배양함으로써 확장되며, 상기 제2의 고체 상은 제1의 고체 상이 아니다. 구체적인 구현예에서 상기 제1 및 제2의 고체 상은 배양 디쉬, 배양 플라스크, 배양 플레이트, 비드, 입자 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 어느 것으로부터 선택된 상이한 유형의 고체 상이다. 구체적인 구현예에서, 제1의 고체 상은 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면이고, 제2의 고체 상은 비드, 예를 들면, 자기 마이크로비드이다. 다른 특정한 구현예에서, 제1 고체 상은 비드, 예를 들면, 자기 마이크로비드이고, 상기 제2의 고체 상은 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면이다. 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제가 상이한 고체 상에 고정화된 구현예에서, 전구체 세포는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 동시에 또는 순차적으로 배양될 수 있다.

본 개시내용의 노치 1 및 노치 2 작용제는 노치 단백질 및 이의 유사체 및 유도체(단편 포함), 노치 경로의 다른 성분인 단백질 및 이의 유사체 및 유도체(단편 포함), 이에 대한 항체 및 이의 결합 영역을 함유하는 이러한 항체의 단편 또는 다른 유도체, 상기 단백질 및 유도체 또는 유사체를 암호화하는 핵산; 및 노치 경로에서 노치 단백질 또는 다른 단백질에 결합하거나 또는 달리는 상호작용함으로써 본원에 기술된 바와 같이 노치 1 또는 노치 2 활성이 촉진되는 토포리쓰믹 단백질(toporythmic protein)단백질 및 이의 유도체 및 동족체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 작용제는 노치 단백질 및 세포내 도메인을 포함하는 이의 유도체, 이를 암호화하는 노치 핵산, 및 노치 1 또는 노치 2 수용체 리간드(예를 들면, 델타, Jagged, Serrate의 세포내 도메인)의 노치-상호작용 도메인을 포함하는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 작용제는 RBPJκ/hairless 억제제 또는 Deltex를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Fringe를 사용하여 예를 들면, 델타 단백질과 함께, 노치 활성을 향상시킬 수 있다. 이들 단백질, 이의 단편 및 유도체는 재조합적으로 발현시키고 발현시키고 분리하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제가 전구체 세포 자체, 예를 들면, 노치의 우성 활성형(dominant active form)에서 재조합체 핵산을 통해 발현되는 경우, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제를 발현하는 세포의 확인은 내부 리보소옴 도입 부위(IRES)의 도입 후 재조합체 핵산 작제물 속에서 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제의 개방 판독 프레임에 마커 단백질 3'를 암호화하는 개방 판독프레임을 도입하여 촉진시킬 수 있다. 바람직하게는, 마커 단백질은 녹색 형광성 단백질(GFP; 참고: 예를 들면, 미국 특허 제5,491,084호 및 제5,777,079호)와 같은 형광성 단백질; 상이한 강도 및/또는 파장에서 형광성으로 변형된 GFP(예를 들면, Heim and Tsien, 1996, Curr. Biol. 6:178-82에 의해 기술된 바와 같은 청색 GFP) 또는 초산호에서 최근에 발견된 황색 또는 적-오렌지생 방사체(Matz 등, 1999, Nature Biotechnol. 17:969-973)이다.

다른 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 노치 1 및/또는 노치 2를 효능화시키는, 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체를 발현하는 세포이다. 당해 세포는 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제를 이것이 전구체 세포에 대해 이용가능하도록 하는, 예를 들면, 세포 표면에 분비되어, 발현되는 방식으로 발현한다. 여전히 다른 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 노치 1 또는 노치 2를 효능화시키는 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체를 암호화하는 핵산이며; 이러한 작용제는 예를 들면, 상기 단락 4.3에 기술된 방법에 따라 사용되거나 전달될 수 있다.

여전히 다른 구체적인 구현예에서, 노치의 작용제는 노치 신호전달 경로의 구성원에 결합하는 펩티도미메틱(peptidomimetic) 또는 펩타이드 유사체 또는 유기 분자이다. 이러한 작용제는 당해 분야에 공지된 것들로부터 선택된 결합 검정에 의해 확인될 수 이다.

바람직한 구현예에서, 상기 작용제는 적어도 노치 단백질 또는 이의 부착성 단편에 대한 결합을 중재하는 노치-상호작용 유전자에 의해 암호화된 단백질의 단편으로 적어도 이루어진 단백질이다. 본원에 사용된 것으로서 노치 상호작용 유전자는 유전자 노치, 델타, Jagged, Serrate, RBPJκ, Hairless 억제제 및 Deltex, 및 또한 서열 동족체 또는 유전적 상호작용으로 인해 확인될 수 있는 Delta/Serrate/Jagged 계열 또는 Deltex 계열의 다른 구성원 및 보다 일반적으로 분자 상호작용(예를 들면, 시험관내에서 결합, 또는 유전적 상호작용(예를 들면, 초파리에서 표현형적으로 묘사된 바와 같음)에 의해 확인된, "노치 캐스캐이드)" 또는 "노치 그룹"의 구성원을 의미한다. 상기 인용된 노치-결합 단백질의 부착 단편은 미국 특허 제5,648,464호; 제5,849,869호; 및 제5,856,441호에 기술되어 있다.

일 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 재조합체 핵산으로부터 발현된다. 예를 들면, 세포외, 리간드 결합 도메인을 결여하는 노치 수용체의 트렁케이트되고, "활성화된" 형태의 발현은 작용 돌연변이체 표현형을 획득한다. 바람직하게는, 노치 우성의 활성 돌연변이체는 유도성 프로모터로부터 전구체 세포에 의해 발현됨으로써, 발현이 이로부터 세포가 기원함으로써 이식된 세포가 환경 신호에 반응할 수 있는 유기체내에서 생체내 결여된 유도인자를 사용하여 확장 및/또는 분화를 위해 유도될 수 있도록 한다. 다른 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제를 암호화하는 핵산은 Cre 부위에 의해 플랭킹(flanking)된다. 전구체 세포의 확장 및/또는 분화에 이어서 그러나 대상체로의 이식 전에, 핵산을 포함하는 전구 세포는 하기 단락 4.8에 기술된 바와 같이, Lox 단백질에 노출된다. 또한, FLP/FRT 재조합 시스템을 사용하여 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제의 존재 및 발현을 조절할 수 있다(Brand and Perrimon, 1993, Development 118:401-415).

또한, 다른 구현예에서 노치의 작용제는 재조합체 우성의 노치 활성 돌연변이체가 아니다. 또한, 다른 구현예에서, 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제에 대한 전구체 세포의 노출은 세포 표면에서 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제를 재조합적으로 발현하는 다른 세포와의 항온처리에 의해 수행되지 않는다(비록 다른 구현예에서, 당해 방법이 사용될 수 있지만).

다른 구현예에서, 재조합적으로 발현된 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 노치의 세포내 도메인 및 다른 리간드-결합 표면 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 노치 단백질이다. 예를 들면, EGF 수용체 세포외 도메인 및노치 세포내 도메인을 포함하는 키메라 노치 단백질은 전구체 세포내에서 발현된다. 그러나, 노치 경로는 키메라를 발현하는 전구체 세포가 EGF 수용체의 리간드, 즉, EGF에 노출되지 않는 한 활성이 되지 않을 것이다. 노치의 트렁케이트된 형태의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 사용함으로써, 키메라 노치 단백질의 활성은 가역성이 되며; EGF가 세포로부터 제거되면, 노치 활성은 중지될 것이다. 노치 활성은 다시 리간드의 첨가로 되돌려질 수 있다. 바람직하게는, 키메라 수용체는 예를 들면, 무한증식된 세포의 이식 전에, 유도인자를 제거함으로써 중단된 유도성 프로모터의 대조군 하에 발현됨으로써 이식된 세포는 노치 경로의 활성화에 의해 생체내에서 EGF에 반응하지 않는다.

여전히 다른 구현예에서, 노치 1 및 노치 2 활성은 노치 1 또는 노치 2 수용체의 세포외 부위에 대한 노치 1 작용제 또는 노치 2 작용제의 결합에 의해 조작될 수 있다. 노치 신호전달은 인접한 세포에 막-결합되거나 고체 표면에 고정화된 노치의 세포외 도메인와 이의 리간드 사이의 물리적 상호작용에 의해 개시되는 것으로 여겨진다. 완전한 길이의 리간드는 하나의 세포에서 이들의 발현이 노치 수용체를 발현하는 이웃하는 세포내에서 경로의 활성화를 개시하므로, 노치의 작용제가다. 조직 배양 플레이트와 같은, 고체 표면 상에 고정화된, 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 노치-결합 부위를 포함하는 가용성의 트렁케이트된 델타 또는 Serrate 분자를 노치 경로 작용제로서 사용할 수 있다. 이러한 가용성 단백질은 항체 또는 상호작용 단백질, 예를 들면 델타 또는 Serrate가 이와 함께 융합 단백질로서 발현되는 에피토프 태그(epitope tag)(예를 들면, 항체 9E10에 의해 인식된, myc 에피토프 태그)에 대해 지시된 항체 또는 델타 또는 Serrate가 이와 함께 융합 단백질로서 발현되는 에피토프 태그(예를 들면, 단백질 A에 의해 결합된, 면역글로불린 에피토프 태그)와 상호작용하는 단백질에 의해 고체 표면에서 고정화될 수 있다. 세포내 도메인을 결여하는 가용성의 트렁케이트된 델타 또는 Serrate 분자는, 이들의 발현이 이웃하는 노치-발현 세포내에서 비-자가성의, 우성인 음성 표현형을 생성하므로, 상기 경로의 작용제로서 작용한다.

다른 구체적인 구현예에서, 및 미국 특허 제5,780,300호(Artavanis-Tsakonas 등에게 허여)에 기술된 바와 같이, 노치 작용제는 노치 프로세싱에 요구되는 푸린-유사 컨버타제, 쿠즈바니안(Kuzbanian), 노치에 대해 상부 또는 평행한 노치 경로의 활성화에 요구되는 것으로 고려되는 상부 메탈로프로테아제-디스인테그린(ADAM)(Schlondorff and Blobel, 1999, J. Cell Sci. 112:3603-3617), 또는 보다 일반적으로, 세포 구획 사이의 이동을 위해 요구된 GTPase의 rab 계열과 같은 세포 트래트래피킹(trafficking) 및 프로세싱 단백질(Rab GTPases의 참조를 위해, Olkkonen and Stenmark, 1997, Int. Rev. Cytol. 176:1-85 참고)와 같은 노치 또는 노치 신호전달 경로의 구성원의 활성화에 요구되는 성숙 또는 프로세싱 단계를 중재하는 세포 공정을 촉진하거나 활성화하는 시약을 포함한다. 상기 작용제는 푸린, 쿠즈바니안 또는 rab 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체 또는 이의 우성의 활성인 돌연변이체, 또는 상기 단백질에 결합하여 이의 작용을 활성화시키는 펩타이드 유사체 또는 유기 분자를 암호화하는 핵산과 같은, 상기 공정 중 하나의 활성을 증가시는 어떠한 분자일 수 있다. 펩티도미메틱 또는 펩타이드 유사체 또는 유기 분자는 상기 기술된 검정에 의해 확인할 수 있다.

노치 1 작용제 및 노치 2 작용제는 적절하게는 노치 1 또는 노치 2, 및 이의 항원 결합 단편에 대한 항체를 포함한다. "항체"는 예를 들면, 전체 항체 또는 일본쇄 Fv 단편(scFv)을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, Fc, 또는 노치 1 또는 노치 2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 어떠한 생물학적으로 효과적인 단편을 포함한다. 항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 이특이적인 항체, 미니 바디(mini body), 및 선형 항체의 모두 또는 일부를 포함한다. 특정의 구현예에서, 노치 1 작용제는 노치 1의 세포외 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편이다. 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제는 노치 1의 세포외 EGF 반복체 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편이다. 보다 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제는 노치 1의 EGF 반복체 1-6에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정의 구현예에서, 노치 2 작용제는 노치 2의 세포외 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편이다. 구체적인 구현예에서, 노치 2 작용제는 노치 2의 세포외 EGF 반복체 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편이다. 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제는 항-노치-1 MFIN1-519 항체(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)이다. 구체적인 구현예에서, 노치 2 작용제는 항-노치-2 MHN2-25 항체 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)이다.

이후에, 실시예에 나타낸 바와 같이, 노치 1에 대한 항체는 노치 시스 억제를 극복하여 노치 신호전달 경로 활성화(실시예 4)를 제공할 수 있고, 노치 1에 대한 항체 및 노치 2에 대한 항체는 노치 리간드 Delta로 달성한 것보다 조혈 줄기 세포의 보다 큰 확장을 제공한다(실시예 3).

어떠한 기전에 결합시킬 의도는 아니지만, 노치 1 또는 노치 2는 조혈 줄기 세포 집단내에서, 일부 개개의 조혈 줄기 세포가 시스-억제될 것이고, 일부는 시스-억제되지 않을 것이므로, 광범위한 농도에 걸쳐 조혈 줄기 세포 집단에서 조혈 줄기 세포를 확장시키는 것으로 여겨진다. 비교적 높은 수준의 항-노치 1 또는 항-노치 2 항체 농도에서, 또한 시스-억제될 수 있는 조혈 줄기 세포는 활성화되어 이러한 세포내에서 낮은 내지 중간 수준의 노치 신호전달 경로 활성화를 달성함으로써 확장하여 보다 많은 조혈 줄기 세포를 생산하는 반면, 비-시스-억제된 조혈 줄기 세포는 활성화되어 이러한 세포에서 높은 수준의 노치 신호전달 경로를 달성하여, 흉선으로 이주할 수 있는 조기 T 세포 전구체를 생산하고 성숙한 T 세포를 생성한다. 비교적 낮은 수준의 항-노치 1 또는 항-노치 2 항체 농도에서, 시스-억제되지 않은 조혈 줄기 세포는 활성화되어 이러한 세포내에서 낮은 내지 중간 수준의 노치 신호전달 경로를 달성하므로 확장하여 보다 많은 조혈 줄기 세포를 생산한다. 일부 예에서, 조혈 줄기 세포의 확장(즉, 보다 많은 조혈 줄기 세포의 조혈 줄기 세포의 집단으로부터의 생산), 및 또한 흉선으로 이주하여 성숙한 T 세포를 생성할 수 있는 조기 T 세포 전구체의 생산이 바람직하고 본 발명에 의해 제공된다.

노치 1 또는 노치 2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 수득하는 방법, 파아지 디스플레이(phage display)의 방법, 사람 또는 사람화된 항체를 생성하는 방법, 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이(예를 들면, 미국 특허 제6,291,161호 및 제6,291,158호) 항체를 생산하기 위해 가공된 형질도입 동물 또는 식물을 사용하는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 부분적으로 또는 완전한 합성 항체의 파아지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하며 노치 1 또는 노치 2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 결합 도메인은 노치 1 또는 노치 2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대한 Fab 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다(참고: Hoet 등, Nat. Biotechnol. 23:344, 2005). 사람 항체의 파아지 디스플레이 라이브러리가 또한 이용가능하다. 또한, 편리한 시스템(예를 들면, 마우스, HuMAb mouse^®, TC mouse^TM, KM-mouse^®, 라마, 닭, 랫트, 햄스터, 토끼 등)에서 면역원으로서 목적한 표적을 사용하는 하이브리도마 발달을 위한 전통적인 전략을 사용하여 결합 도메인을 발달시킬 수 있다. 특수한 구현예에서, 항체는 노치 1 또는 노치 2 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며 비특이적인 성분 또는 관련되지 않은 표적과 교차 반응하지 않는다. 일단 확인되면, 상기 항체를 암호화하는 아미노산 서열 또는 폴리펩타이드 서열을 분리하고/하거나 측정할 수 있다.

최종적으로, 미국 특허 제5,780,300호는 본 개시내용의 실시에 노치 경로를 활성화시키는데 사용될 수 있는 노치 작용제 분자의 부류(및 이들의 확인 방법), 예를 들면, RBP-Jκ를 지닌 노치 안키린 반복체의 해리를 개시함으로써 세포질로부터 핵으로 RBP-Jκ의 전좌를 촉진하는 분자를 추가로 개시하고 있다.

특정의 구현예에서, 노치 결합 단백질, 예를 들면, 노치 1 또는 노치 2에 결합하는 항체가 노치 작용제인지를 측정하기 위해서, 전구체 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 노치 결합 단백질의 존재하에서 배양한 후 예를 들면, q-PCR에 의해 증가된 Hes1 발현 수준(노치 작용제 활성을 가지지 않은 대조군 분자의 존재하에서 배양된 전구체 세포와 관련하여)에 대해 시험하며, 상기 노치 결합 단백질의 존재하에서 배양된 세포내에서 증가된 Hes1 발현 수준은 상기 노치 결합 단백질이 노치 작용제임을 나타낸다. 다른 구현예에서, 노치 결합 단백질, 예를 들어, 노치 1 또는 노치 2에 결합하는 항체는 노치 작용제인지를 측정하기 위해서는, 전구체 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 노치 결합 단백질의 존재하에서 배양한 후 NSG 마우스내로 주사하며, 여기서, NSG 마우스내 노치 결합 단백질의 존재하에서 배양된 세포의 증가된 생착(노치 작용제 활성을 가지지 않은 대조군 분자의 존재하에서 배양된 전구체 세포와 비교하여)은 노치 결합 단백질이 노치 작용제임을 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 항-노치 1 항체는 사람 노치 1에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 항-노치 2 항체는 사람 노치 2에 결합한다. 사람 노치 1의 아미노산 서열은 예를 들면, GenBank 수탁 번호 제P46531호 또는 GenBank 수탁 번호 제NP_060087호로서 이용가능하다. 사람 노치 2의 아미노산 서열은 예를 들면, GenBank 수탁 번호 제Q04721호 또는 GenBank 수탁 번호 제NP_077719로서 이용가능하다.

6.2 성장 인자

본 개시내용은 선택된 성장 인자의 존재하에서 노치 경로를 활성화시킴으로써 전구체 세포를 무한증식시키고 임의로 분화시킴을 포함하는 방법을 제공한다. 여기서 분화가 아닌 무한증식이 달성되어야 하며, 본 개시내용의 전구체 세포는 성장을 뒷받침하지만 분화는 뒷받침하지 않는 성장 인자의 존재하에서 배양된다. 성장 인자는 실질적으로 분화를 유발하지 않고 세포 증식 및/또는 생존을 촉진하는 단백질 또는 화학적 화합물과 같은 어떠한 유형의 분자일 수 있다.

일반적으로, 본 개시내용은 전구체 세포의 증식을 촉진하지만 분화는 촉진하지 않는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제(및, 특수한 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자)에 세포를 노출시킴에 의해 상기 세포가 달리 증식을 중지하고/하거나, 분화하고/하거나 사멸하는 기간 동안 배양물 속에서 전구체 세포(비-말기 분화된 세포)를 성장시키는 방법을 제공한다. 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것은 초기에 상기 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 노출시키기 전, 이와 동시에 또는 이후에 수행할 수 있다. 전구체 세포는 성장 인자(들) 및 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 최소의 배양 시간, 가장 바람직하게는 대부분의 당해 시간 동안 동시 노출된다. 최소 배양 시간은 세포가 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 선택된 성장 인자(들)의 부재하에서 사멸하거나 증식을 중지할 수 있는 시간의 양이다. 일 구현예에서, 상기 기간은 적어도 20회의 세포 분열 주기를 위한 기간이고, 다른 구현예에서, 상기 기간은 적어도 100회의 세포 분열 주기를 위한 기간이다. 다른 구현예에서, 상기 기간은 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90회의 세포 분열 주기를 위한 기간이다. 여전히 다른 구현예에서, 상기 기간은 적어도 125, 150, 175 또는 200회의 세포 분열 주기의 기간이다. 시간의 양은 세포 유형에 따라 변할 것이며 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 조혈 세포의 경우, 예를 들면, 최소의 배양 시간은 3 내지 4주일 수 있다. 다른 구현예에서, 조혈 세포에 대한 배양 시간은 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주이다. 여전히 다른 구현예에서, 조혈 세포에 대한 배양시간은 10주 이상, 예를 들면, 12, 15, 18, 20 또는 25주이다.

구체적인 예시적인 구현예에서, 전구체 세포는 HSC이다. c-kit 리간드로 또한 공지된 줄기 세포 인자(SCF) 또는 유방 세포 성장 인자는 단독으로 사용되어 HSC를 무한증식시키거나 예를 들면, 다음의 성장 인자: Flt-3L, IL-3, IL-6, IL-11, SCF, TPO, GM-CSF, 및/또는 G-CSF 중의 하나 이상과 함께 사용될 수 있다. SCF, Flt-3L, IL-6, 또는 TPO의 양은 5 내지 1000 ng/ml의 범위, 보다 바람직하게는 약 10 내지 500 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 10 내지 300 ng/ml의 범위일 수 있다. 특정의 구체적인 구현예에서, SCF, Flt-3L, IL-6, 또는 TPO의 양은 10, 20, 50, 75 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 또는 450 ng/ml이다. IL-3, IL-11 G-CSF, 또는 GM-CSF의 양은 1 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 양 5 내지 50 ng/ml. 보다 바람직하게는 약 7.5 내지 25 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 10 내지 15 ng/ml일 수 있다. 특정의 구체적인 구현예에서, IL-3, IL-11, G-CSF, 또는 GM-CSF의 양은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 또는 15 ng/ml이다. 바람직한 구현예에서, 앞서의 인자는 혈청 유리된 배지 속에서 HSC에 가해진다. 성장 인자는 또한 다음의 조합으로 제공될 수 있다: IL-3; IL-6; TPO; SCF and Flt-3. 성장 인자는 또한 다음의 조합 및 양으로 제공될 수 있다: IL-3 (10 ng/ml); IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3 (각각 50 ng/ml).

HSC를 무한증식시키기 위한 바람직한 구현예에서, 세포는 세포외 매트릭스 단백질이 결합된 조직 배양 디쉬 속에서 배양된다. 상기 구현예의 바람직한 방식에서, 세포외 매트릭스 단백질은 피브로넥틴(FN), 또는 이의 단편이다. 이러한 단편은 CH-296을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(Dao 등, 1998, Blood 92(12):4612-21).

HSC를 무한증식시키기 위한 구체적인 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양물 디쉬에서 IL-3; IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3의 존재하에서 배양된다. HSC를 무한증식시키기 위한 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양 디쉬 속에서 100 ng/ml의 각각의 SCF, Flt-3L, TPO 및 IL-6 및 10 ng/ml의 IL-3의 존재하에 배양된다. HSC를 무한증식시키기 위한 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양 디쉬 위에서 100 ng/ml의 각각의 SCF 및 Flt-3L 및 10 mg/ml의 G-CSF 및 GM-CSF의 존재하에 배양된다. HSC를 무한증식시키기 위한 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양 디쉬 위에서 100 ng/ml의 각각의 SCF, Flt-3L 및 TPO 및 10 mg/ml의 GM-CSF의 존재하에 배양된다. HSC를 무한증식시키기 위한 여전히 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양 디쉬 위에서 300 ng/ml의 각각의 SCF 및 Flt-3L, 100 ng/ml의 각각의 TPO 및 IL-6, 및 10 mg/ml의 IL-3의 존재하에서 배양된다. HSC를 무한증식시키기 위한 매우 바람직한 구현예에서, 세포는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제를 함유하는 플라스틱 조직 배양 디쉬 위에서 100 ng/ml의 각각의 SCF, Flt-3L, 및 TPO 및 10 mg/ml의 각각의 G-CSF 및 GM-CSF의 존재하에 배양된다. 앞서의 배양 조건에 대한 대안적인 구현예에서, 피브로넥틴 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질을 조직 배양 디쉬 속에 포함시킬 수 있다.

분화가 요구되는 경우, SCF를 GM-CSF 또는 인터루킨-7(IL-7)과 함께 사용하여 무한증식된 HSC를 골수 줄기 세포 또는 림프구 줄기 세포 각각으로 분화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 레티노산 수용체 (RAR) 작용제, 가장 바람직하게는 모든 트랜스 레티노산(ATRA)을 사용하여 무한증식된 HSC의 HPP-CFC내로의 분화를 촉진할 수 있다.

다른 구현예에서, EGF를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 상피 및 섬유모세포를 단독으로 또는 IGF-1 및 TGF-β와 함께 무한증식시킬 수 있다. 다른 구현예에서, FGF-1은 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용되어 상피 세포를 무한증식시킬 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, FGF-2를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 중배엽 및 신경외배엽 세포를 무한증식시키거나 지방세포 및 난소 과립층 세포를 무한증식시킬 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, FGF-7를 각질세포 무한증식 및/또는 분화, 또는 전립샘 상피 무한증식 및/또는 분화를 위해 노치 1 효능제, 노치 2 효능제 또는 노치 1 효능제 및 노치 2 효능제와 함께 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, HGF를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 간세포를 무한증식시킬 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, IL-6을 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 각질세포 또는 신경 줄기 및 전구세포를 분화시킬 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, PDGF를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 중배엽 및 신경외배엽 세포를 단독으로 또는 EGF 및/또는 IGF-1와 함께 무한증식시킬 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, NGF, CNTF, GDNF 또는 BDNF를 개별적으로 또는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제와 함께 사용하여 신경 세포를 무한증식시킬 수 있다.

본 개시내용의 방법으로 이용된 성장 인자는 상업적으로 수득되거나, 재조합체 발현에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, ATRA, BDNF (사람), CNTF (사람 및 랫트), EGF (사람), FGF-1 (사람 및 소), FGF-2 (사람 및 소), FGF-7 (사람), Flt-3L (사람), GDNF (사람 및 랫트), HGF (사람), IGF-1 (사람), IL-6 (사람 및 마우스), IL-11 (사람), NGF (쥐), PDGF (사람 AA, AB, 및 BB 동형), SCF (사람), TGF-β(사람), TPO (사람 및 쥐)는 Sigma(미주리주 세이트 루이스 소재)로부터 시판된다. EGF (사람 및 쥐), FGF-1 (사람), FGF-2 (사람), GM-CSF (사람 및 쥐), IGF-1 (사람), IL-6 (사람 및 쥐), IL-7 (사람 및 쥐), NGF (쥐), PDGF (사람 AA, AB, 및 BB 동형), SCF (사람) 및 TGF-β(사람)는 Life Technologies, Inc.(매릴랜드주 록크빌 소재)로부터 시판된다.

다른 구현예에서, 성장 인자는 재조합체 발현(예를 들면, 상기 단락 4.3에 기술된 바와 같음)에 의해, 또는 화학적 펩타이드 합성(예를 들면, 펩타이드 합성기에 의해)에 의해 생산된다. 성장 인자 핵산 및 펩타이드 서열은 일반적으로 GenBank로부터 이용가능하다. 성장 인자(이는 핵산 서열 및 암호화된 단백질의 서열 둘다를 제공한다)에 대한 예시적인 GenBank 수탁 번호는 다음에 제공된다:

바람직하게는, 그러나 필수적이지는 않게도, 본 개시내용의 방법에 의해 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재하에서 전구체 세포를 무한증식시키고 임의로 분화시키는데 사용된 성장 인자는 전구체 세포와 동일한 종으로부터 기원한다. 전구체 세포를 무한증식시키거나 분화시키는데 사용된 특수한 성장 인자(들)은 전구체 세포 형에 의존하며, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.

전구체 세포를 무한증식시키거나 무한증식된 전구체 세포를 분화시키는데 적합한 성장 인자의 양 또는 농도는 성장 인자 제제의 활성, 성장 인자와 전구체 세포 사이의 종 상응성 등에 의존할 것이다. 일반적으로, 성장 인자(들) 및 전구체 세포가 동일한 종인 경우, 배양 배지 속의 성장 인자의 총 양은 1 ng/ml 내지 5㎍/ml, 보다 바람직하게는 5 ng/ml 내지 1㎍/ml, 및 가장 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 200 ng/ml의 범위이다. 바람직한 구현예에서, 전구체 세포는 HSC이고 상기 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 100 ng/ml의 SCF에 노출시킴으로써 무한증식된다. 다른 바람직한 구현예에서, 전구체 세포는 HSC이고 상기 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 IL-3; IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3에 노출시킴에 의해 무한증식된다. 다른 바람직한 구현에에서. 무한증식된 HSC는 상기 세포를 100 ng/ml의 각각의 SCF 및 IL-7에 노출시킴에 의해 림프구 전구체 세포내로 분화된다. 여전히 다른 바람직한 구현예에서, HSC는 상기 세포를 100 ng/ml의 각각의 SCF 및 GM-CSF에 노출시킴에 의해 골수 전구체 세포내로 분화된다.

6.3 노치 1 및 노치 2 작용제 및 성장 인자의 재조합체 발현

본 개시내용은 전구체 세포를 무한증식시키고 임의로 분화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 전구체 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 선택된 성장 인자의 존재하에서 배양함을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및/또는 성장 인자는 재조합적으로 생산된다. 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 또는 성장 인자는 전구체 세포가 배양되고, 전구체 세포내에서 무한증식 및/또는 증식 기간 동안 재조합적으로 발현되거나 무한증식 및/또는 분화 기간 동안 전구체 세포와 함께 배양되는 세포 속에서 내인성으로 또는 재조합적으로 발현되는 세포 배양 배지에 첨가하기 위해 분리될 수 있다.

노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 성장 인자를 발현시키는 방법이 본원에 제공된다. 성장 인자 또는 성장 인자 경로 성분, 노치 또는 노치 경로 성분, 또는 작동적으로 활성인 이의 단편 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 본 단락에서 "목적한 핵산"으로 언급되고 이것이 암호화하는 단백질은 "목적한 단백질"로 언급된다. 목적한 핵산은 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입된 단백질을 암호화하는 서열의 전사 및 해독을 위해 필수적인 성분을 함유하는 벡터내로 삽입될 수 있다. 필수적인 전사 및 해독 신호는 천연의 유전자 및/또는 이의 플랭킹 영역에 의해 공급될 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템을 이용하여 단백질-암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 이들은 바이러스(예를 들면, 박시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)으로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물, 또는 박테리오파아지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드(cosmid) DNA로 형질감염된 세균을 발현시킬 수 있다. 벡터의 발현 성분은 이들의 길이 및 특이성에 있어 다양하다. 이용된 숙주-벡터 시스템에 따라서, 다수의 적합한 전사 및 해독 성분 중 어느 하나를 사용할 수 있다.

DNA 단편을 벡터내로 삽입하기 위해 앞서 설명된 방법들 중 어느 것도 사용하여 적절한 전사/해독 대조군 신호 및 단백질 암호화 서열로 이루어진 키메라 유전자를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합체 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전적 재조합)을 포함할 수 있다. 이의 목적한 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현은 제2의 핵산 서열에 의해 목적한 단백질이 재조합체 DNA 분자로 형질전환된 숙주내에서 발현되도록 조절될 수 있다. 예를 들면, 목적한 단백질의 발현은 당해 분야에 공지된 어떠한 프로모터/인핸서 성분에 의해 조절될 수 있다. 대조군 세포 운명 대조군 유전자 또는 세포 운명 유전자 경로 성분 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 조기 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 길 말단 반복체내에 함유된 프로모터(Yamamoto, 등, 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster 등, 1982, Nature 296:39-42); 열 쇼크 단백질 70 유전자(Bienz and Pelham, 1986, Cell 45:753-60) 진핵세포 발현 벡터, 예를 들면 β-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff, 등, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)의 조절 서열, 또는 tac 프로모터(DeBoer, 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)(또한 "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94 참고); 노팔린 신테타제 프로모터 영역을 포함하는 식물 발현 벡터(Herrera-Estrella 등, Nature 303:209-213) 또는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner, 등, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), 및 광합성 효소 리불로즈 비포스페이트 카복실라제의 프로모터 (Herrera-Estrella 등, 1984, Nature 310:115-120); 효모 또는 다른 진균으로부터의 프로모터 성분, 예를 들면 Gal 4 프로모터, ADH(알코올 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼린 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 형질도입 동물에서 사용된 다음의 동물 전사 조절 영역: 췌장 소엽 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 대조군 영역(Swift 등, 1984, 세포 38:639-646; Omitz 등, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 대조군 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프구세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 대조군 영역(Grosschedl 등, 1984, Cell 38:647-658; Adames 등, 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프구 및 유방 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 대조군 영역(Leder 등, 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 대조군 영역(Pinkert 등, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 대조군 영역(Krumlauf 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등, 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 대조군 영역(Kelsey 등, 1987, Genes and Devel. 1 :161-171), 골수 세포에서 활성인 β-글로불린 유전자 대조군 영역(Mogram 등, 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등, 1986, Cell 46:89-94; 뇌 속의 희돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 대조군 영역(Readhead 등, 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 대조군 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 고나도트로픽 방출 호르몬 유전자 대조군 영역(Mason 등, 1986, Science 234:1372-1378)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, "Tet 시스템"으로 언급된 이. 콜라이(E. coli)로부터의 테트라사이클린-조절된 유전자를 사용하는 방법(Gossen 등, 1995, Science 268:1766-1769; Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551)을 사용하여 유전자 발현을 지시한다. 이 경우에, 이식 유전자 세포주가 생성되며, 여기서 테트라사이클린-조절된 전사 활성인자(tTA)에 대한 암호화 영역은 구성적 또는 유도성 방식으로 tTA의 발현을 지시하는 프로모터/인핸서에 작동적으로 융합된다. 이식유전자 세포주가 생성되며, 여기서 잘못-발현될 목적한 핵산에 대한 암호화 영역은 tTA-반응성 조절 성분을 지닌 프로모터에 작동적으로 융합된다. 세포 배양 배지가 충분한 양의 테트라사이클린으로 보충되는 경우, 이는 생성되는 전구세포에서 목적한 유전자의 발현을 완전히 차단한다. 목적한 유전자의 발현은 식품 또는 세포 배양 배지로부터 테트라사이클린을 제거함으로써 마음대로 단순히 유도될 수 있다. 또한, 목적한 유전자의 발현 수준은 식품 속에서 테트라사이클린의 수준을 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 따라서, 잘못된-발현에 대한 이원의 조절 기전으로서 Tet 시스템의 사용은 목적한 핵산의 잘못된-발현의 진폭 및 시기를 조절하기 위한 수단을 제공하는 장점을 지닌다.

목적한 핵산을 함유하는 발현 벡터는 4개의 일반적인 시도: (a) 핵산 하이브리드화; (b) 분자 생물학, (c) 삽입된 서열의 발현; 및 (d) "마커" 유전자 작용의 존재 또는 부재에 의해 확인할 수 있다. 제1의 시도에서, 발현 벡터내에 삽입된 목적한 핵산의 존재는 목적한 삽입된 핵산에 대해 동종인 서열을 포함하는 프로브를 사용하는 핵산 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다. 제2의 시도에서, 핵산 생물학과 "마커" 유전자 작용의 조합을 사용하여 목적한 핵산을 함유하는 재조합체 발현 벡터를 확인한다. 예를 들면, 목적한 핵산이 항생제 내성 둘 다를 암호화하는 발현 벡터의 특수한 제한 부위내로 삽입되는 경우, 벡터를 취한 세균 세포는 상기 항생제에 대한 이들의 내성에 의해 확인되며, 목적한 핵산을 함유하는 이들 벡터는 증폭된 벡터 DNA를 특수한 제한 효소로 제한분해하여 확인할 수 있다. 제3의 시도에서, 재조합체 발현 벡터는 재조합체에 의해 발현된 목적한 단백질을 검정함으로써 확인할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면, 목적한 단백질의 물리적 또는 작용적 특성을 기반으로 할 수 있다. 제4의 시도에서, 벡터/숙주 시스템은 벡터내의 목적한 핵산의 삽입으로 유발된 특정의 "마커" 유전자 작용(예를 들면, 티미딘 키나제 활성, β-갈락토시다제, 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스에서 폐색체 형성 등)의 존재 또는 부재를 기반으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 목적한 핵산이 벡터의 마커 유전자 서열내에 삽입되는 경우, 목적한 핵산을 함유하는 재조합체는 마커 유전자 작용의 부재에 의해 확인될 수 있다.

일단 특수한 재조합체 DNA 분자가 확인되어 분리되면, 당해 분야에 공지된 수개의 방법을 사용하여 이를 증식시킬 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합체 발현 벡터를 증식시켜 양을 제조할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 다음의 벡터 또는 이들의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 몇가지 말하자면, 박시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 바큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파아지 벡터(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 유전자 생성물을 목적한 특수한 양식으로 변형시키고 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 특정의 프로모터로부터의 발현은 특정한 유도인자의 존재하에서 상승될 수 있으므로; 유전적으로 가공된 목적한 단백질(예를 들면, 노치 1 및 노치 2 작용제)의 발현이 조절될 수 있다. 또한, 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 공정 및 변형(예를 들면, 글리코실화, [신호 서열의] 절단)을 위해 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외부 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 보증할 수 있다. 예를 들면, 해독후 변형은 이들의 작용에 거의 요구되지 않으므로, 세균 시스템에서의 발현을 사용하여 노치 1 및 노치 2 작용제를 다량 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 생산할 것이며, 이는 TPO와 같은 일부 단백질에 필수적이다. 후생동물 세포에서의 발현을 사용하여 신호전달 분자의 신호 서열의 "천연" 프로세싱을 보증할 수 있다.

다른 구체적인 구현예에서, 목적한 단백질이 융합체, 또는 키메라 단백질 생성물((상이한 단백질의) 이종 단백질 서열에 결합된 펩타이드를 통해 결합된 펩타이드, 단편, 유사체, 또는 유도체 포함)로서 발현될 수 있다. 이러한 키메라 생성물은 목적한 아미노산 서열을 암호화하는 적절한 핵산 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 적절한 암호화 프레임으로 서로 연결하고, 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법으로 키메라 생성물을 발현시켜 제조할 수 있다. 달리는, 이러한 키메라 생성물은 단백질 합성 기술, 예를 들면, 펩타이드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. cDNA 및 게놈 서열 둘 다는 클로닝되어 발현될 수 있다.

당해 단락에 기술된 방법은 또한 노치 경로의 성분이 아닌 유전자 및 단백질에 적용가능하지만, 노치 경로의 유전자 또는 단백질의 기능을 간접적으로 변경시키는데 사용될 수 있는 유전자 및 단백질에 적용가능하다.

6.4 전구체 세포

본 개시내용은 전구체 세포가 세포 주기 정지로 또는 비복제 상으로 도입하는 것을 피하거나 지연시킴으로서 전구체 세포를 무한증식시키고 임의로 분화시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용에 따라 무한증식하기 위한 전구체 세포는 비-말기-분화된 세포이며 사람, 동물, 식물, 포유동물, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말, 소, 가금류, 곤충, 초파리, 및 씨. 엘레간스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 종으로부터 기원할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전구체 세포는 척추동물이고, 보다 바람직하게는 포유동물이며, 가장 바람직하게는 사람이다. 바람직한 구현예에서, 전구체 세포는 "위기" 또는 "노쇠" 상을 통과하지 않아 세포주 특성(예를 들면, 안정한 표현형적 변화를 생성하는 형질전환(참고: Freshney, 1994, In "Culture of Animal Cells--A manual of Basic Technique," 3rd Edition at p. 12, John Wiley & Sons, Inc.))을 생성한다. 바람직한 구현예에서, 전구체 세포는 영장류 세포이다. 용어 "원시 세포"는, 세포가 포유동물 대상체와 같이, 조직 공급원으로부터 이들의 설명에 따라 아배양(subculture)을 수행하지 않는 것을 나타낸다.

일반적으로, 필수적이지는 않지만, 전구체 세포는 다능성 줄기 세포 또는 다분화능 전구 세포이다. 일 구현예에서, 전구체 세포는 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 전구체 세포는 전구 세포이다. 전구체 세포는 경우에 따라, 무한증식 전 또는 후에 세포 집단으로부터 분리될 수 있다. 노치 경로의 활성화는 바람직하게는 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 노출시킴으로써 달성되는데, 예를 들면, 고체 표면에서 고정시키거나 세포 표면에서 재조합적으로 발현시키거나, 우성의 활성인 노치 돌연변이체를 발현시키는 재조합체 핵산, 또는 노치 1 및/또는 노치 2를 활성화시키는 다른 분자를 세포내로 도입시킴으로써 달성한다.

가장 바람직하게는, 전구체 세포의 무한증식되고/되거나 분화된 전구 세포가 재증식 또는 유전자 치료요법에 사용되어야 하는 경우, 전구체 세포는 이들이 무한증식 및, 임의로 증식된 후 투여되는 대상체의 조직으로부터 직접 수득된다. 예를 들면, 전구체 세포가 HSC인 경우, 이는 세포를 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 IL-3, IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3L의 조합물의 존재하에서 배양함으로써 대상체로부터 이의 분리 후 무한증식될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 기술된 바와 같이 배양된 후 SCF와 GM-CSF 또는 IL-7에 노출되어 골수 또는 림프구 계통 각각으로의 분화를 자극하며, 이후 생성되는 골수 또는 림프구 세포 집단은 대상체로 다시 이식된다. 이식은 바람직하게는 자가유래이지만, 또한 비-자가유래일 수 있다. 비-자가유래 이식의 경우, 수용체는 바람직하게는 면역억제 약물을 제공 받아서 이식된 세포의 거부 위험성을 감소한다.

다음의 예시적인 구현예는 전구체 세포 및 전구체 세포-함유 조직의 분리를 허용하는 시도를 기술하며, 이는 본 개시내용에 따라 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 성장 인자로 치료되어야 한다. 이미 암시한 바와 같이, 세포 집단의 분리된 세포 유형 또는 심지어 혼합물은 본 개시내용의 방법에 따라서 치료될 수 있다. 생성되는 세포 집단이 이식을 위해 사용되어야 하는 경우, 재조합체 유전자가 세포내로 도입되어 이것 또는 이의 전구세포가 이식 전 바람직한 유전자 생성물을 발현하도록 할 수 있다. 재조합체 유전자의 도입은 전구체 세포 확장 및/또는 분화 전 또는 후에 달성될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 전구체 세포 집단은 정제되거나 적어도 고도로 농축된다. 그러나, 본 개시내용의 방법에 의해서 전구체 세포를 무한증식시키고/시키거나 분화시키기 위하여, 전구체 세포가 순수한 집단일 필요는 없다. 일단 혼합물이 처리되면, 바람직한 집단을 선택하여 정제할 수 있다. 또한, 정제는 생체내에서 치료학적 투여 전에 필수적이거나 바람직한 것은 아니다.

본 개시내용에서 사용하기 위한 전구체 세포의 분리는 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 다수의 방법 중 어느 것에 의해서도 수행될 수 있다. 예를 들면, 전구체 세포를 분리하는 일반적인 방법은 대상체로부터 및 상이한 항체 결합을 사용하여 세포의 집단을 수집하는 것이며, 여기서, 하나 이상의 특정의 분화 단계의 세포가 항체에 의해 분화 항원에 결합되며, 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 분리된 세포의 집단으로부터 선택된 분화 항원을 발현하는 바람직한 전구체 세포를 분리한다. FACS는 입자들의 형광성 특성을 기준으로 하여, 세포를 포함하는 입자를 분리하는 잘-공지된 방법이다(Kamarch, 1987, Methods Enzymol. 151 :150-165). 개개 입자에서 형광성 잔기의 레이저 여기는 혼합물로부터 작은 전기적 전하를 생성하여 양성 및 음성 입자가 전자기적으로 분리되도록 한다.

다른 구현예에서, 자기 비드를 사용하여 세포 집단으로부터 전구체 세포를 분리할 수 있다. 구체적으로, 자기 활성화된 세포 분류(MACS) 기술을 사용할 수 있다. MACS는 자기 비드(0.5 내지 100μm의 직경)에 결합하는 이의 능력을 기준으로 입자를 분리하는 방법이다. 자기 비드는 Dynal(Oslo, Norway; http://www.dynal.no)로부터 수득할 수 있다. 세포-고체상 표면 분자 또는 합텐을 특이적으로 인식하는 항체의 공유결합성 첨가를 포함하는 많은 유용한 변형을 자기 미세구 상에서 수행할 수 있다. 이후에 자기장을 적용하여 선택된 비드를 물리적으로 조작한다. 이후에 비드를 세포, 예를 들면, 전구체 세포를 포함하는 세포 집단과 혼합하여 결합하도록 한다. 이후에 세포를 자기장에 통과시켜 바람직한 세포 표면 마커를 갖는 세포를 분리한다.

다른 구현예에서, 배양 디쉬의 표면은 항체로 피복하여, 패닝(panning)으로 불리는 방법에 의해 세포를 분리하는데 사용할 수 있다. 세포는 이들 각각이 바람직한 세포 유형의 마커에 대한 항체로 피복된 별도의 디쉬 속에서 연속적으로 항온처리된 후, 각각의 항온처리에 이어서 완전히 세정된다. 이용된 항체의 특수한 조합은 바람직한 세포 유형에 대해 특이적인 마커의 상응하는 조합을 인식하지만 혼합된 세포 집단 속에서 존재하는 경향이 있는 다른 세포 유형에 대해 특이적인 마커의 상응하는 조합은 인식하지 않는다. 최종의 세정 단계에 이어서, 플레이트에 결합되어 남아있는 세포는 바람직한 세포 유형의 세포일 것이다.

무한증식되거나 분화된 세포는 클로날 분리를 위해, 미세역가 디쉬와 같은 별도의 디쉬로 희석될 수 있다. 바람직하게는, 희석 전에, 바람직한 세포 유형의 세포를 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 정제할 수 있다. 예를 들면, 무한증식되거나 분화된 세포는 FACS 또는 MACS로 정제할 수 있다. 전구체 또는 분화된 세포 유형의 내인성 마커 이외에, 무한증식되거나 분화된 세포는 전구체 세포를 바람직한 세포 유형 속에서 활성화되는 계통-특이적인 프로모터의 조절하에서 리포터 유전자를 암호화하는 작제물로 형질감염시켜 정제할 수 있다(참고: 예를 들면, 미국 특허 제5,639,618호).

다음의 단락은 세포의 특수한 유형의 추출 또는 분리를 위한 예시적인 방법을 설명한다. 또한, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

6.4.1. 조혈 세포

바람직하게는, 본원에 기술된 방법에 따라 확장된 전구체 세포는 조혈 전구체 세포이다. 본 개시내용의 방법은 HSC, 림프구 줄기 세포 및 골수 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 어떠한 비-말기 분화된 조혈 세포의 무한증식 및 임의로 분화를 포함한다. 조혈 세포의 분리를 제공하는 어떠한 기술도 본 개시내용의 당해 구현예에서 사용할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 조혈 세포는 HSC이다. 조혈 줄기 세포는 또한 장기간 골수 이식 세포(long-term marrow engrafting cell)로 언급된다. 바람직한 구현예에서, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포는 사람 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포이다.

HSC의 분리를 달성할 수 있는 기술은 공여체로부터 분리된 골수 세포, 또는 HSC의 전구세포가 이식을 위해 사용되어야 하는 경우, 미래의 숙주로부터의 HSC의 분리를 포함한다. 비-자가 조직의 HSC는 바람직하게는 미래의 숙주/대상체의 이식 면역 반응을 억제하는 방법과 함께 사용된다. 본 개시내용의 특수한 구현예에서, 사람 골수 세포는 침 흡입(needle aspiration)에 의해 후방 엉덩뼈 능선으로부터 수득될 수 있다(참고: 예를 들면, Kodo 등, 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). 본 개시내용의 바람직한 구현예에서, HSC 또는 이의 후대는 고도로 농축되거나 실질적으로 순수한 형태로 제조될 수 있다. 당해 농축은 본 개시내용의 방법에 따라서 무한증식 및/또는 분화 전, 동안, 또는 후에 달성될 수 있다.

HSC의 분리를 위한 다른 기술은 Milner 등, 1994, Blood 83:2057-2062에 기술되어 있다. 골수 샘플을 수득하고 피콜-하이파크 밀도 구배 원심분리(Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation)에 의해 분리하고, 세척하며, 2색 간접 면역형광성 항체 결합을 사용하여 염색한 후 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 분리한다. 세포를 IgG 항체로 동시에 표지함으로써 개개의 계통 연합된 항원, CD34+lin-의 발현을 결여하는 미성숙 소세트를 포함하는 CD34+ HSCs를 골수로부터 수집된 세포로부터 분리한다.

골수 전구 세포가 요구되는 경우, 조혈 전구 세포 및/또는 이들의 전구세포의 존재는 일반적으로 공지된 시험관내 콜로니 형성 검정(예를 들면, CFU-GM, BFU-E를 검출하는 것들)에 의해 검출할 수 있다. 다른 예로서, HSC에 대한 검정은 또한 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 비장 포커스 형성 검정, 재플레이팅 후 전구세포를 형성하는 능력을 검출하는 검정).

구체적인 구현예에서, 전구체 세포는 조혈 줄기 세포이다. 구체적인 구현예에서, 전구체 세포는 조혈 전구 세포이다. 구체적인 구현예에서, 전구체 세포는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포이다.

일 구현예에서, 조혈 전구체 세포는 단-기간 골수 이식 세포(신속하게 재생하는 세포)인 다분화능 전구 세포를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 전구체 세포는 조혈 줄기 세포가 농축된 세포의 집단이다. 다른 구현예에서, 전구체 세포는 조혈 줄기 및 전구 세포가 농축된 세포의 집단이다.

조혈 세포 마커

조혈 세포 유형의 다음의 마커를 사용하여 조혈 세포를 확인하고 바람직한 조혈 세포 유형(전구체 세포 집단 속에서 또는 무한증식되거나 분화된 세포 집단 속에서)을 선택하거나 농축시킬 수 있다.

항체의 그룹을 사용하여 상이한 조혈 세포 유형의 다양한 세포 표면 항원의 차등적인 발현을 주로 기본으로 하여, 조혈 시스템의 상이한 세포를 구별하여 왔다. 모노클로날 항체를 세포 분류와 함께 사용하여 선택한 조혈 세포를 농축시킬 수 있다. 예를 들면, 사람 HSC를 초기에 CD34 발현 및 CD38 발현의 결여를 기준으로 하여 정제하였다. 항-CD34 항체를 사용하여, HSC를 정상의 골수 세포 집단의 1 내지 2%로부터(Civin 등, 1989, Report on the CD34 cluster workshop, In: Leucocyte typing IV, White Cell Differentiation Antigens. Knapp 등, Eds., Oxford University Press. Oxford, p. 818) 집단의 대략 50 내지 80%로 농축시킬 수 있다(Ishizawa 등, In: HSCs: The Mulhouse Manual, Wunder 등, eds. AlphaMed Press, Ohio pp 171-182; Shpall 등, 1994, J. Clinical Oncology 12:28-36; Winslow 등, 1994, Bone Marrow Transplantation 14:265-271; Thomas, 1994, Cancer Research, Therapy and Control 4(2):119-128). 당해 분야에 공지된 항체의 어떠한 조합도 사용하여 목적한 세포상에 존재하는 항원을 발현하는 세포를 선택하거나 원치않는 항원을 발현하는 세포를 고갈시킴으로써 바람직한 조혈 세포 유형에 대해 확인하거나 선택할 수 있다.

CD34+ 외에도, HSC는 바람직하게는 CD33-, CD38-, HLA DR- 및 Thy-1-lo이다(Craig 등, 1993, J. Exp. Med. 177:1331; Civin 등, 1994, J. Immunol. 133:157; Civin 등, 1987, Exp. Hematol. 15:10; Terstappen 등, 1991, Blood 77:1218). 또한, 사람 HSC는 바람직하게는 CD45Ra-, CD19- 및 c-kit+이다(Scadden에게 허여된 미국 특허 제5,965,437호).

HSC를 선택하고/하거나 농축시키는데 사용될 수 있는 다른 HSC 마커는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(또한 KDR로서 공지된, VEGFR2; Ziegler 등, 1999, Science 285:1553-1558)이다.

사람 조혈 전구 세포 및 사람 HSC는 또한 글리코포린 A, CD3, CD24, CD16, 및 CD 14를 인식하는 항체와 함께 골수 추출물과 같은 샘플을 항온처리하고 비-항체 결합된 세포로부터 항체-결합된 세포를 분리함으로써 농축시킨다. CD45RA, CD36, CD56, CD2, CD19, CD66a 및 CD66b에 대한 항체를 또한 사용하여 당해 공정을 정제할 수 있다. 비-항체 결합된 세포 집단은 조혈 줄기 및 전구 세포에 대해 농축시킨다(참고: Thomas 및 Lansdorp에게 허여된 미국 특허 제5,877,299호). 다른 연구에서, My 10 및 HLA-DR 항체를 2개의 색상 분류와 함께 사용하여 사람 골수로부터 매우 농축된 전구 세포 집단을 수득하였다(Lu 등, 1987, J. Immunol. 139(6):1823- 1829). T 림프구 고갈을 또한 사용하여 조혈 줄기 또는 전구 세포를 농축시킬 수 있다. 당해 과정에서, T 림프구는 세포를 T 세포 항원일 인식하는 모노클로날 항체(들) 및 상보체로 처리함으로써 세포 집단으로부터 제거한다. 이러한 과정은 앞서 기술되어 있다(Broxmeyer 등, 1984, J. Clin. Invest. 73:939-953).

글리코포린 A 항체를 사용하여 적혈구를 위해 또는 이에 대해 선택할 수 있다. CD14, CD16, CD66a 및 CD66b에 대한 항체를 사용하여 단핵구를 위해 또는 이에 대해 선택할 수 있다. CD24, CD3, CD19, CD20, CD56, CD2에 대한 항체를 사용하여 B 및 T 림프구 및 NK 세포에 대해 선택할 수 있다. CD45RA 및 CD36에 대한 항체를 사용하여 T-세포, B-세포, 과립구, 혈소판, 단핵구, 차등화된 적혈구 전구체, 및 일부 결정된 성숙한 전구세포(progenitor)를 위해 또는 이에 대해 선택할 수 있다(참고: 미국 특허 제5,877,299호). 다른 T-세포 마커는 CD7, CD5, TCD-2, 및 CD4 또는 CD8을 포함한다. CD7 및 말기 데옥시리보뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(Tdt)는 프레-T 전구세포의 마커이다. 프레-B 전구세포의 추가의 마커는 MHC 제II 부류 항원이다. 성숙한 B 세포는 CD21의 발현을 추가의 특징으로 한다. 예를 들면, Raska and Ponzio, 1994, In "Immunology and Inflammation: Basic Mechanisms and Clinical Consequences," Sigal and Ron, Eds., McGraw-Hill, Inc.를 참고한다.

구체적인 구현예에서, 현재 이용가능하고 농축 프로토콜에서 사용될 수 있는 항체는 My-10 및 3C5(이는 CD34를 인식한다), 또는 RFB-1(이는 CD99를 인식한다(Petty and Tippett, 1995, Vox Sang 69(3):231-5)를 포함하고 BFU-E 세포의 집단을 확인한다(Kannourakis and Johnson, 1988, Blood 71(3):758-65)). 상술한 조혈 항원에 대한 다른 현재 이용가능한 항체는 미국 특허 제5,877,299호에 개시되어 있다. 이들 항체는 단독으로 또는 "패닝"(Broxmeyer 등, 1983, J. Clin. Invest. 73:939-953) 또는 형광성 활성화된 세포-분류(FACS)(Williams 등, 1985, J. Immunol. 135:1004; Lu 등, 1986, Blood 68(1):126-133)와 함께 사용되어 모노클로날 항체에 의해 인식된 표면 결정인자를 함유하는 세포를 분리할 수 있다.

사용될 수 있는 다른 방법은 대두와 같은 렉틴을 사용하는 선택적인 응집반응을 이용하여 줄기 및 전구세포를 분리하는 것이다(Reisner 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:1164). 상기 과정은 가능하게 필수적인 보조 세포를 제거하지 않고 줄기 및 전구세포의 분리 및 농축을 위한 실행가능한 대안일 수 있다(Reisner 등, 1983, Blood 61(2):341-348; Reisner 등/, 1982, Blood 59(2):360-363).

이론적으로, 하나의 조기 줄기 세포만이 전체 조혈 시스템의 재증식에 요구된다. 이상적인 조건 하에서 및 수용체 동물에서 줄기 및 전구세포에 영양을 주는 미세환경이 영향을 받지 않는 경우, 단일 줄기 세포가 마우스의 결함이 있는 조혈 시스템을 전체적으로 재증식시켜 빈혈의 치사적인 합병증으로부터 이를 구제할 수 있다는 실험실적 증거가 존재한다(Boggs 등, 1982, J. Clin. Invest. 70:242-253). 확실하게, 남성의 임상 조건 하에서 조혈 시스템을 구조하기 위한 하나 이상의 줄기 세포가 일반적으로 요구될 수 있다. 더욱이, 특히 숙주의 미세환경이 조사 또는 화학요법과 같은 처리에 의해 손상된 경우, 줄기 및 전구 세포외에, 보조 또는 헬퍼 세포(줄기/전구세포의 성장에 영향을 미치는 비-줄기/전구 세포)의 존재가 요구될 수 있다(Spooncer 등, 1985, Nature (London) 316:62-64). 따라서, 다른 제대혈액 세포로부터 조혈 줄기 및 전구세포를 분리하는 방법이 존재하고(Leary 등, 1984, J. Clin. Invest. 74:2193-2197) 이들 및 다른 방법을 사용하여 무한증식 및 궁극적으로 이식을 위해 이들 세포의 순수하거나 매우 농축된 제제를 저장하는 방법이 존재한다고 해도, 줄기 및 전구세포의 정제된 제제를 환자에게 이식하는 시도에 있어서 주의하여야 한다.

6.4.2. 간엽성 줄기 세포

치료학적 적용을 위한 전구체 세포의 가장 중요한 유형 중의 하나는 간엽으로부터 기원한 것들이다. 간엽 줄기 세포는 시험관내 또는 생체내 미세환경에 따라 다양한 계통(예를 들면, 골생성(steogenic), 연골생성, 건생성(tendonogenic), 지방생성, 근원성(myogenic) 계통 등)의 세포로 분화할 수 있는 골수, 혈액, 진피, 및 골막에서 발견된 다능성 세포이다(Caplan, 1991, J. Orth. Res. 641-650). 지금까지 최상의 작업은 연골세포 및 조골세포로 분화할 수 있는 세포의 분리 및 배양을 포함한다. 관련된 전구 세포 집단을 분리하기 위해 개발된 시스템을 우선 닭 배아에서 작업하였다(Caplan, 1970, Exp. Cell. Res. 62:341-355; Caplan, 1981, 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, pp. 37-68; Caplan 등, 1980, Dilatation of the Uterine Cervix 79-98; DeLuca 등, 1977, J. Biol. Chem. 252:6600-6608; Osdoby 등, 1979, Dev. Biol. 73:84-102; Syftestad 등, 1985, Dev. Biol. 110:275-283).

문헌(Caplan 등, 1993, 및 Caplan 등, 1996, 미국 특허 제5,226,914호 및 제5,486,359호 각각)은 골수로부터 간엽 줄기 세포를 분리하기 위한 예시적인 방법을 기술하고 있다. 이들 분리된 골수 줄기 세포는 증식을 촉진하지만 분화는 촉진하지 않는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 성장 인자를 사용하여 무한증식시킬 수 있다. 이들 전구체 세포는 이후에 예를 들면, 분화를 촉진하는 성장 인자의 존재하에서 성장시켜 추가로 분화시킬 수 있다. 세포는 바람직하게는 골세포, 연골, 연골세포, 지방세포 등으로 분화된다.

수개의 골수 분리 프로토콜이 보고되어 왔으며 전구체 세포를 수득하는데 사용될 수 있다. 랫트 골수로부터의 단일 세포 현탁액은 문헌(Goshima 등, 1991, Clin. Orth. and Rel. Res. 262:298-311)에 따라 제조할 수 있다. 골수로부터의 사람 줄기 세포 배양물은 다음과 같이 문헌(Bab 등, 1988, Bone Mineral 4:373-386)에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 전체 골수 세포를 대상체로부터 수득한다. 골수 샘플을 장골능 또는 대퇴부 미드샤프트(femoral midshaft)로부터 분리한다. 골수 샘플 3ml 용적을 50 U/ml 페니실린 및 0.05 mg/ml 스트렙토마이신-설페이트를 함유하는 혈청-유리된 최소 필수 배지(MEM) 6ml에 이전시킨다. 주로 단일 세포의 현탁액을, 상기 제제를 주사기내로 끌어당기고 이를 19, 21, 23 및 25 게이지 침을 통해 연속적으로 수회 배출함으로써 앞서 기술한 바와 같이 제조한다(Bab 등, 1984, Calcif. Tissue Int. 36:77-82; Ashton 등, 1984, Calcif. Tissue Int. 36:83-86). 세포를 고정된 용적의 혈구계산기를 사용하여 계수하고 농도를 현탁액 ml당 1-5X10⁸개의 총 골수 세포로 조절한다. 양성 및 음성 대조군 세포 현탁액을 토끼 전체 골수 및 비장 세포 각각을 사용하여 앞서 기술한 바와 같이(Shteyer 등, 1986, Calcif. Tissue Int. 39:49-54) 설정할 수 있다.

6.4.3. 섬유모세포

연결 조직은 섬유모세포, 연골, 골, 지방 및 평활근 세포를 포함한다. 섬유모세포는 최소한의 차별화된 연결 조직 세포이며 신체 전체의 연결 조직 속에 분산되어 있다. 이들은 이들의 제I 형 및/또는 제III 형 콜라겐의 특징적인 분비에 의해 확인될 수 있다. 섬유모세포는 조직 상처내로 이주하여 상처를 치유하고 분리하는 콜라겐성 매트릭스를 분비한다. 또한, 이들은 이들의 국소 신호에 따라 연결 조직 계열의 다른 구성원으로 분화될 수 있다. 섬유모세포는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 골수 기질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 상이한 조직으로부터 분리될 수 있다.

6.4.4. 신경 줄기 세포

일반적으로 중추 신경계에서 신경발생은 출생 전 또는 직 후에 소멸하는 것으로 추정된다. 최근에, 수개의 연구는 적어도 일부 정도의 새로운 신경 세포는 성체 척추동물의 뇌에 지속적으로 첨가되는 것을 나타낸다(Alvarez-Buylla and Lois, 1995, Stem Cells (Dayt) 13:263-272). 전구체는 일반적으로 뇌실의 벽에 위치한다. 이들 증식 영역으로부터 신경 전구체가 표적 위치를 향해 이주할 것으로 고려되며 상기 위치에서 미세환경은 이들이 분화하도록 유도한다. 문헌[참조: Alvarez-Buylla and Lois, 1995, Stem Cells (Dayt) 13:263-272]에서 검토된 바와 같이, 심실 하부 영역으로부터의 세포가 생체내 뿐만 아니라 시험관내에서도 둘다 신경세포를 생성시킬 수 있다는 연구가 보고되었다.

성인의 뇌로부터의 신경세포 전구체는 신경세포 이식을 위한 세포의 공급원으로서 사용할 수 있다(Alvarez-Buylla, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2074-2077). 신경관 세포는 또한 문헌[참조: LeDouarin and Ziller, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5: 1036-1043]에서 발견되는 미세환경으로부터 접수되는 지시사항에 따라 상이한 세포 신경 세포 유형 내로 이주하고 분화할 수 있는 다능성 신경 세포인 것으로 오랫동안 인식되어 왔다.

6.4.5. 태아 세포

본 개시내용의 특정 구현예에서, 전구체 세포는, 예를 들면, 인생의 나중 시점에서 필요할 때까지 배양하기 위한 태아 세포 일 수 있다. 태아 혈액은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 태아 혈액은 초음파[Daffos 등, 1985, Am. J. Obstet. Gynecol. 153:655-660; Daffos 등, 1983, Am. J. Obstet. Gynecol. 146:985)], 플라센토센티시스(placentocentisis)[참조: Valenti, 1973, Am. J. Obstet. Gynecol. 115:851; Cao 등, 1982, J. Med. Genet. 19:81], 태아경검사[참조: Rodeck, 1984, in Prenatal Diagnosis, Rodeck, C. H. and Nicolaides, K. H., eds., Royal College of Obstetricians and Gynecologists, London] 등에 의해 유도된 바늘을 사용하여 태반 뿌리(root)에 있는 태아 순환에서 취할 수 있다. 특정 구현예에서, 태아 세포는 제대 혈액, 태반 혈액 또는 왓튼의 젤리(Wharton's jelly)에서 수득할 수 있다. 왓튼의 젤리는 일반적 느슨한 점액 결합 조직으로 간주되는 탯줄에서 발견된 젤라틴 물질이며, 종종 섬유 아세포, 콜라겐 섬유 및 주로 히알루론산으로 이루어지는 무정형 기저 물질로 이루어지는 것으로 설명하고 있다[참조: Takechi 등, 1993, Placenta 14:235-45].

또한, 본 개시내용의 전구체 세포는 신생아 혈액으로부터 수득할 수 있다. 신생아 혈액은 바람직하게는 탯줄로부터 직접 배수시킴으로써 및/또는 rot에서 및 팽창된 정맥에서 전달된 태반으로부터의 바늘 흡인에 의해 수득할 수 있다.

수집은 무균 상태에서 수행해야 한다. 수령하는 즉시, 신생아 또는 태아의 혈액은 항응고제와 혼합하여야 한다. 이러한 항응고제는 CPD(시트레이트-포스페이트-덱스트로즈), ACD (시트르산-덱스트로즈) Alsever의 용액(Alsever and Ainslie, 1941, N.Y. St. J. Med. 41 :126), DeGowin의 용액(DeGowin 등, 1940, J. Am. Med. As. 114:850), Edglugate-Mg (Smith 등, 1959, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 38:573), Rous-Turner 용액 (Rous and Turner, 1916, J. Exp. Med. 23:219), 다른 글루코즈 혼합물, 헤파린, 에틸 비스쿰아세테이트 등(참조: Hum, 1968, Storage of Blood, Academic Press, New York, pp. 26-160)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분야에 공지된 어떠한 것일 수 있다.

인간 태아의 뇌 세포의 1차 배양물은 임신 5 내지 12주 후에 합법적 낙태로부터 얻은 인간 태아로부터 분리될 수 있다. 압박방출은 초음파 검사 통제하에 주사기 중심의 부드러운 흡입에 의해 수행할 수 있다.

6.4.6. 상피 줄기 세포와 각질 형성 세포

상피 줄기 세포(ESC) 및 각질 세포는 피부 및 공지된 과정(Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229)에 의한 소화관의 내벽과 같은 조직으로부터 수득할 수 있다. 피부와 같은 계층화된 상피 조직에서, 갱신은 기저 라미나(basal lamina)에 가장 가까운 층인 배아 층 내의 전구체 세포의 유사분열에 의해 발생한다. 소화관의 내벽 내의 전구체 세포는 당해 조직의 신속한 갱신 속도를 제공한다. 대상체 또는 기증자의 창자의 피부 또는 내벽에서 수득한 ESC (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229; Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61 :771)는 본 개시내용의 방법에 따라 무한증식될 수 있다.

6.4.7. 간 줄기 세포

간 줄기 세포는 1994년 4월 28일자로 공개된 PCT 공보 제94/08598호에 기재된 방법에 의해 분리될 수 있다.

6.4.8. 신장 줄기 세포

포유동물 신장은, 궁극적으로 성숙한 소변 수집 시스템(Nigam and Brenner, 1992, Curr. Opin. Nephrol. Huper 1 : 187-191)을 형성하는 일련의 형태형성 운동을 수행하는 우테릭 버드(uteric bud)를 유도하는 metanephric 중간엽에서 나온다. Wolfian 덕트의 상피 증식인 우테릭 버드는 조기 배아 일생에서 상피 발산의 분화 경로를 따라 인접한 중간엽을 수축시키고 응축을 유도한다. 이러한 시험관내 과정을 연구하기 위한 시도가 보고되어 왔으며; 기관 배양물에서의 메탄프로스(metanephros)는 유도인자로서 배아 척수를 사용하는 세관을 형성하도록 유도될 수 있다. 시험관내에서 우테릭 버드에 의해 또는 시험관내 척수에 의해 메탄프릭(metanephric) 중간엽을 유도시키는 특정한 형질도입제는 공지되어 있지 않지만, 세포 특이적 마커는 분화 프로그램이 전구 세포에서 유도되는 것을 나타낸다(Karp 등, 1994, Dev. Biol. 91 :5286-5290).

6.5 전구체 세포의 분화

본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따른 이들의 무한증식 전, 후 또는 이와 동시에 전구체 세포의 분화 방법을 제공한다. 전구체 세포의 분화는 세포를 분화를 촉진하는 하나 이상의 성장 인자에 노출시키고, 분화가 일어나도록 하는 조건하에서 세포를 성장시킴으로써 달성된다. 전구체 세포 또는 이들의 무한증식된 후대를 분화시키기 위한 성장 인자는 상기 단락 4.2에 기술된 것들을 포함한다. 전구체 세포의 분화를 촉진하는 성장 인자의 선택은 전구체 세포 유형에 의존하며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 단락 4.2에 기술된 바와 같이, 무한증식된 HSC는 세포를 100ng/ml의 각각의 SCF 및 IL-7에 노출시켜 림프구 줄기 세포로 분화시키고, 세포를 100ng/ml의 각각의 SCF 및 GM-CSF에 노출시킴으로써 골수 줄기 세포로 분화시킨다. 특정의 예에서, 성장 인자는 이를 상이한 성장 인자와 합함으로써 분화 및 증식 둘 다에 사용할 수 있는데; 예를 들면, SCF를 단독으로 또는 IL-6, IL-11, 및 Flt-3L과 함께 사용하여 HSC(HSC를 SCF(및 임의로 IL-6, IL-11, 및 Flt-3L) 및 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제에 상기 HSC가 일반적으로 증식을 중지하고/하거나 사멸하는 기간 동안 노출시킴으로써)를 무한증식시킬 수 있고, IL-7 또는 GM-CSF와 함께 사용하여 무한증식된 HSC의 림프구줄기 세포 또는 골수 줄기 세포 각각으로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

6.6 개시내용의 배양된 세포의 치료학적 용도

본 개시내용은 전구체 세포의 무한증식 및, 임의로 분화를 허용하는 방법을 제공한다. 특정의 구현예에서, 수득되는 세포는 세포 치료요법에 사용된다. 예로서 및 제한하지 않고, 다음의 단락은 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 세포를 사용하여 조혈 장애 및 신경 조직에 대한 손상을 치료하기 위한 예시적인 구현예를 기술한다. 그러나, 무한증식되거나 분화된 세포는 어떠한 결핍된 세포 집단을 보충하거나 전구체 세포 유형의 치료학적 세포 집단을 공급하거나 유전자 치료요법 벡터로서 사용할 수 있다(참고: 상기 단락 4.8). 또한, 전구체 세포는 예를 들면, 무한증식 전 또는 후에, 동결건조에 의해 보존될 수 있다(참고: 상기 단락 4.7).

6.6.1. 조혈 장애

무한증식된 HSC 또는 분화된 조혈 세포의 이식은 조혈 장애 및 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 사용하여 정상의 혈액 세포 생산 및 성숙화 세포의 실패 또는 기능장애에 의해 특징화된 조혈 장애 또는 질환을 치료하거나 예방한다. 다른 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 사용하여 조혈 악성 종양으로부터 생성된 조혈 장애 또는 질환을 치료하거나 예방한다. 여전히 다른 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 사용하여 면역억제, 특히 악성의, 고형 종양을 지닌 대상체에서의 면역억제로부터 생성되는 조혈 장애 또는 질환을 치료하거나 예방한다. 여전히 다른 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 사용하여 조혈 시스템에 영향을 미치는 자가면역 질환을 치료하거나 예방한다. 여전히 다른 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 사용하여 유전성 또는 선천성 조혈 장애 또는 질환을 치료하거나 예방한다. 대상체에서 조혈 질환 또는 장애의 치료에 사용된 분화된 세포의 유형은 대상체의 상태를 완화시키기 위해 선택되는데, 예를 들면, 적혈구 경로를 따라 분화된 세포는 빈혈을 치료하기 위해 선택된다.

본 개시내용의 무한증식된 및/또는 분화된 세포에 의해 치료될 수 있지는 특별한 조혈 질환 및 장애의 예는 표 2에 나열된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다:

I. 정상 혈액 세포의 생산과 성숙의 실패 또는 기능장애에 따른 질환

줄기 세포 과증식 질환

재생 불량성 빈혈

범 혈구 감소증

무과립구증

혈소판 감소증

적혈구 무형성증

약물, 방사선, 또는 감염 특발성으로 인한 Blackfan-Diamond 증후군

II. 조혈 악성 종양

급성 림프모구(림프구성) 백혈병

만성 림프구성 백혈병

급성 골수성 백혈병

만성 골수성 백혈병

급성 악성 골수경화증

다발성 골수종

진성 다혈구증

원인불명의 골수화생증

발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)

호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma)

비-호지킨 림프종

III. 악성 고형 종양 환자에서 면역 억제

악성 흑색종

위의 암종

난소암

유방암

소세포 폐암

망막 모세포종

고환 암

아교 모세포종

횡문근 육종

신경 모세포종

유잉 육종(Ewing's sarcoma)

림프종

IV. 자가 면역 질환

류마티스 관절염

제I형 당뇨병

만성 간염

다발성 경화증

전신 홍반성 루푸스

V. 유전적(선천적) 장애

빈혈

가족 재생 불량성

판 코니 증후군(Fanconi's syndrome)

블룸 증후군(Bloom's syndrome)

순수 적혈구 무형성증(PRCA)

선천성 이상각화증(dyskeratosis congenita)

Blackfan-다이아몬드 증후군

선천성 적혈구형성이상 증후군 I-IV

Chwachmann-다이아몬드 증후군

디하이드로폴레이트 환원효소 결함

포르마미노 전이효소 결핍

Lesch-Nyhan 증후군

선천성 구상적혈구증

선천성 타원적혈구증

선천성 구상적혈구증

선천성 Rh 널(null) 질환

발작성 야간 혈색소뇨

G6PD (글루코스-6-인산 탈수소효소) 변종 1, 2, 3 피루베이트 키나아제 결핍

선천성 에리스로포이에틴 민감성 부족

겸상 적혈구 질환 및 특성

지중해 빈혈 알파, 베타, 감마

met-혈색소혈증

선천성 면역 질환

심한 결합 면역결핍 질환(SCID)

베어 림프구 증후군(bare lymphocyte syndrome)

캡핑 이상(capping abnormality)과 이온 운반체-응답 결합된 면역 결핍 결합된 면역결핍

뉴클레오사이드 포스포릴라제 결핍

과립구 액틴 결핍

유아 무과립구증

고셔병(Gaucher's disease)

아데노신 데아미나제 결핍

코스트만 증후군

망상 부전

선천성 백혈구 기능장애 증후군

VI. 기타

골 화석증

골수경화증

후천성 용혈성 빈혈

후천성 면역결핍

1차 또는 2차 면역결핍으로 인한 감염성 질환

면역결핍

세균 감염 (예를 들어, 브루셀라증, Listerosis, 결핵, 나병)

기생충 감염 (예를 들어, 말라리아, 리슈만 편모충증)

진균 감염

림프 세포 세트에서 불균형하게 관련된 질환 및 노화로 인해 손상된 면역기능

식세포 장애

코스트만의 무과립구증

만성 육아종성 질환

Chediak-Higachi 증후군

호중구 액틴 결핍

호중구 막 GP-180 결핍

대사 저장 질환

뮤코다당질축적증(mucopolysaccharidoses)

점액지질증(Mucolipidoses)

면역 메커니즘과 관련된 기타 장애

Wiskott-Aldrich 증후군

α1-항트립신 결핍증

일 구현예에서, 무한증식되거나 분화된 세포를 조혈 결핍증을 지닌 대상체에게 투여된다. 구현예의 일 방식에서, 무한증식되거나 분화된 세포는 조혈 결핍증으로 진단된 태아에게 출생 전에 투여된다.

본 개시내용의 무한증식되거나 분화된 세포를 사용한 이의 치료가 본 개시내용의 방법을 포함하는 조혈 결핍증은 표 2에 나열된 것들을 포함하는 조혈 시스템 또는 이의 조합의 골수, 적혈구, 림프구, 또는 거핵세포 중 어느 것의 증가된 수준을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 조혈 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용된 분화된 세포의 유형을 선택함으로써 이는 대상체의 조혈 결핍증을 보충하는데, 예를 들면, 림프구 경로를 따라 분화된 무한증식된 HSC를 사용하여 AIDS에 걸린 개인을 치료한다.

본 개시내용의 세포주를 사용한 치료에 민감한 상태 중에는 말초 혈액 속에서 순환하는 백혈구(백색 세포)의 수가 감소하는 백혈병이다. 백혈병은 특정 바이러스 또는 조사에 대한 노출에 의해 유도될 수 있다. 이는 흔히 암 치료요법의 다양한 형태, 예를 들면, 화학치료학적 약물, 방사선에 대한 노출 및 감염 또는 출혈의 부작용이다.

무한증식된 HSC 또는 분화된 조혈 세포는 또한 호중구감소증의 치료 또는 예방 및, 예를 들면, 재생불량성 빈혈, 주기성 호중구감소증, 특발성 호중구감소증, 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수섬유증, 혈소판감소증의 치료에 유용할 수 있다. 심각한 혈소판감소증은 판코니 빈혈(Fanconi's Anemia), 위스코트-알드리치(Wiscott-Aldrich), 또는 메이-헤글린이상 증후군(May-Hegglin syndrome)과 같은 유전적 결함으로부터 및 화학치료요법 및/또는 방사선 치료요법 또는 암으로부터 생성될 수있다. 후천성 혈소판감소증은 면역성 혈소판 감소증, 전신 홍반 루푸스, 용혈성 빈혈, 또는 태아와 모의 불화합성(fetal maternal incompatibility)에서와 같은 자가- 또는 동종 항체로부터 생성될 수 있다. 또한, 비장비대증, 산재성 혈관내 응고, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 감염 또는 보철 심장 판막은 혈소판감소증을 생성할 수 있다. 혈소판감소증은 또한 암종, 림프종, 백혈병 또는 섬유증에 의한 골수 침입으로부터 생성될 수 있다.

많은 약물이 골수 억제 또는 조혈 결핍증을 유발할 수 있다. 이러한 약물의 예는 AZT, DDI, 화학치료요법에 사용된 알킬화제 및 항-대사물질, 클로람페니콜, 페니실린, 강사이클로비르, 다우노마이신 및 설파 약물과 같은 항생제, 페노티아존, 메프로바메이트와 같은 정신안정제, 아미노피린 및 디피론과 같은 진통제, 페닐로인 또는 카바마제핀과 같은 항경련제, 프로필티오우라실 및 메티마졸과 같은 항갑상선제 및 이뇨제이다. 무한증식된 HSC의 이식은 이들 약물로 치료된 대상체에서 흔히 발생하는 골수 억제 또는 조혈 결핍증을 예방하거나 치료하는데 유용할 수 있다.

조혈 결핍증은 또한 바이러스, 미생물 또는 기생충 감염의 결과로서 및 신장 질환 또는 신부전에 대한 치료, 예를 들면, 투석의 결과로서 발생할 수 있다. 무한증식된 HSC의 이식은 그러한 조혈 결핍증을 치료하는 데 유용할 수 있다.

예를 들면, T 및/또는 B 림프구에서 다양한 면역결핍증, 또는 면역 장애, 예를 들면, 류마티스 관절염이 또한 무한증식된 HSC를 사용한 치료에 의해 유리하게 영향받을 수 있다. 면역결핍증은 바이러스 감염(HIV, HTLVI, HTLVII, HTLVIII를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 방사선에 대한 심각한 노출, 암 치료요법 또는 다른 의학적 치료의 결과일 수 있다.

6.6.2. 신경계 장애 및 손상의 치료

보충 또는 대체를 필요로 하고 무한증식되거나 분화된 세포의 이식에 의해 보충될 수 있는 신경계 장애는 본 개시내용의 방법으로 치료할 수 있다. 이들은 신경계 손상, 및 액손의 단절, 신경세포의 축소 또는 퇴행을 생성하는 질환 또는 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용에 따라 대상체(사람 및 비-사람 포유동물 대상체 포함)에서 치료될 수 있는 신경계 병변은 중추(척추, 뇌 포함) 또는 말초 신경계의 다음의 병변을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: (i) 육체적 손상에 의해 유발되거나 수술과 관련된 병변, 예를 들면, 신경계의 부위를 절단하는 병변, 또는 압착 손상; (ii) 신경계의 부위내 산소의 결여가 뇌 경색 또는 허혈, 또는 척추 경색 또는 허혈을 포함하는, 신경세포성 손상 또는 사멸을 생성하는 허혈성 병변; (iii) 신경계의 부위가 파괴되거나 신경계 관련된 악성 종양 또는 비-신경계 조직으로부터 기원한 악성 종양인 악성 조직에 의해 파괴되거나 손상된 악성 병변; (iv) 신경계의 부위가 예를 들면, 종기에 의해 또는 사람 면역결핍성 바이러스, 헤르페스 조스터(herpes zoster), 또는 헤르페스 단성 바이러스(herpes simplex virus) 또는 라임병(Lyme disease), 결핵, 매독과 관련된 감염과 관련된 감염의 결과로서 파괴되거나 손상된 감염성 병변; (v) 신경계의 부위가 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 또는 근육위축가쪽경화증과 관련된 퇴행 공정의 결과로서 파괴되거나 손상된 퇴행성 병변; (vi) 신경계의 일부가 비타민 B12 결핍증, 엽산 결핍증, 버니크 질환(Wernicke disease), 담배-알코올 약시, 마르키아파비-비냐미병(Marchiafava-Bignami disease)(뇌량의 원시 퇴행), 및 알콜성 뇌세포 퇴행을 포함하는 영양 장애 또는 물질대사의 장애에 의해 파괴되거나 손상된 영양 질환 또는 장애와 관련된 병변; (vii) 당뇨병(당뇨병성 신경병증, 안면 신경마비), 전신 홍반 루푸스, 암종, 또는 유육종증을 포함하나 이에 한정되지 않는 전신 질환과 관련된 신경학적 병변; (viii) 알코올, 납, 또는 특수한 신경독소를 포함하는 독성 물질에 의해 유발된 병변; 및 (ix) 신경계의 일부가 다발 경화증, 사람 면역결핍성 바이러스-관련된 골수증, 횡단척수증 또는 다양한 병인학, 진행성다병소성백질뇌증, 및 중심다리뇌말이집용해(central pontine myelino lysis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 탈수 질환에 의해 파괴되거나 손상된 탈수 병변(demyelinated lesion)을 포함한다.

구체적인 구현예에서, 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 모 신경세포 장애는 경색, 감염, 독소에 대한 노출, 외상, 수술적 손상, 변성 질환 또는 운동 신경세포에 영향을 미칠 수 있는 악성 종양 및 또한 신경계의 다른 성분, 및 또한 근육위축가쪽경화증과 같은 신경세포에 선택적으로 영향을 미치는 장애와 같은 장애, 및 진행성 척수성 근육 위축증, 진행성 연수마비, 일차성 측색 경화증, 유아 및 청소년 근위축증, 어린이의 진행성 연수마비(파지오-론데 증후군(Fazio-Londe syndrome)), 소아마비 및 폴리오 후 증후군(post polio syndrome), 및 유전 운동감각신경병증(샤르코마리투쓰병(Charcot-Marie-Tooth Disease))을 포함하나, 이에 한정되지 않는 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 구현예는 단지 예이며, 상기 기재내용의 무한증식되고/되거나 분화된 세포 또는 이의 후대는 세포 또는 조직 보충을 필요로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다.

6.7 전구체 세포의 보존

특정 구현예에서, 본 발명의 전구 세포는 (i) 무한증식 및 임의로 분화 전에, 또는 (ii) 세포 및 이의 게놈의 무결성을 유지하면서 무한증식 및 임의로 분화 후에 보존된다.

바람직한 구현예에서, 전구체 세포는 동결 보존에 의해 보존된다. 동결은 대부분의 살아있는 세포에게 파괴적이다. 냉각하면, 외부 매체가 동결함에 따라, 세포는 물을 잃어서 평형상태가 되며, 이에 따라 세포 내 용질 농도가 상승한다. 약 10 ℃ -15 ℃ 이하에서는 세포내 동결이 일어날 것이다. 세포내 동결 및 용액 효과가 모두 세포 손상의 원인이다(Mazur, 1970, Science 168 : 939-949). 따라서, 전구체 세포는 생존 세포의 동결시 세포 손상, 예를 들어 동결 보호제의 사용 및 최적의 냉각 속도를 피하기 위해 확립된 방법(Meryman 등, 1977, Cryobiology 14 : 287-302)을 이용하여 바람직하게 동결 보존된다.

전구체 무한증식된 및 분화된 세포는 또한 동결 건조하여 보존할 수 있다 (Simione 1992, J. Parenter.Sci.Technol.46 (6): 226-32에서 검토됨).

동결 건조는 동결-건조를 해치는 일이 거의 없기 때문에, 원액 스톡(master stock)은 일반적으로 액체 질소 또는 비교할만한 온도로 유지되는 반면, 작업 스톡은 동결 또는 동결-건조될 수 있다.

6.8 세포의 유전 공학

무한증식된 세포 집단은 유전자 조작된 세포의 대상체로의 이식에 유익한 유전자 생성물을 생산하도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 유전자 생성물에는 항-TNF, 항 IL-1 항 IL-2 등의 항-염증 인자가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 또한, 간엽 줄기 세포 및 전구 세포는 유전적으로 조작되어 MHC의 발현을 "녹 아웃"시켜서 거부 반응의 위험을 감소시킨다. 또한, 세포 집단은 유전자 치료요법에 사용하기 위해 유전적으로 조작되어 대상체의 유전자 활성 수준을 조절하여 이식의 결과를 돕거나 개선할 수 있거나, 또는 예를 들어, 재조합체 유전자에서의 결핍에 의해 유발된 질병을 치료한다. 세포 집단은 재조합체 핵산을 전구체 세포 또는 무한증식된 또는 분화된 세포 집단에 도입하여 재조합체를 만든다.

본 발명의 최광의의 측면에서, 유전자 치료요법은 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행된 치료요법을 말한다. 핵산은 직접적으로나 간접적으로 이의 암호화된 단백질을 통해, 대상체에서 치료학적 효과를 매개한다. 본 개시내용은 유전자 치료요법의 방법을 제공하며, 여기서 치료학적 가치(바람직하게는 사람에 대한)의 단백질을 암호화하는 핵산은 조작 전후 및 무한증식 전후에 본 개시내용의 방법에 따라 조작된 전구체 세포 내로 도입되어 핵산이 전구체 세포 및/또는 이의 후대에 의해 발현가능하게 되고, 이후에 재조합체 세포를 대상체에 투여한다.

본 개시내용의 재조합체 세포는 당해 분야에서 이용가능한 유전자 치료요법을 위한 방법들 중의 어느 하나에서 사용될 수 있다. 따라서, 세포 내로 도입된 핵산은 어떠한 바람직한 단백질, 예를 들면, 질병 또는 장애에서 손실되거나 역기능하는 단백질을 암호화할 수 있다. 하기 설명은 이러한 방법의 예증이 되는 것을 의미한다. 당해 분야의 숙련가들은 예증된 방법이 유전자 치료요법의 모든 이용가능한 방법의 단지 한 가지 샘플을 나타낸다는 것을 용이하게 이해할 것이다.

유전자 치료요법의 일반적인 개요는 문헌[참조: Lundstrom, 1999, J. Recept. Signal Transduct. Res. 19:673-686; Robbins and Ghivizzani, 1998, Pharmacol. Ther. 80:35-47; Pelegrin 등, 1998, Hum. Gene Ther. 9:2165-2175; Harvey and Caskey, 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518; Guntaka and Swamynathan, 1998, Indian J. Exp. Biol. 36:539-535; Desnick and Schuchman, 1998, Acta Paediatr. Jpn. 40: 191-203; Vos, 1998, Curr. Opin. Genet. Dev. 8:351-359; Tarahovsky and Ivanitsky, 1998, Biochemistry (Mosc) 63:607-618; Morishita 등, 1998, Circ. Res. 2: 1023-1028; Vile 등, 1998, Mol. Med. Today 4:84-92; Branch and Klotman, 1998, Exp. Nephrol. 6:78-83; Ascenzioni 등, 1997, Cancer Lett. 118: 135-142; Chan and Glazer, 1997, J. Mol. Med. 75:267-282]을 참조하라. 문헌[참조: Ausubel 등 (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; 및 Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기술될 수 있는 재조합체 DNA 기술의 분야에 일반적으로 공지된 방법들.

재조합체 전구체 세포가 유전자 치료요법에 사용되는 일 구현예에서, 발현이 대상체에서 바람직한 유전자는 전구체 세포 내로 도입되어 이것이 세포 및/또는 후대세포에 의해 발현될 수 있게 되고 재조합체 세포가 이후에 치료학적 효과를 위해 생체내에서 투여되도록 한다.

재조합체 세포 집단은 유전자 치료요법의 어느 적절한 방법에서 사용될 수 있는데, 이는 본 발명을 고려하는 경우 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식될 것이다. 대상체에게 투여된 재조합체 세포 집단의 수득되는 작용은, 예를 들면, 대상체에서 예비-선택된 유전자의 활성화 또는 억제를 이끌어서 대상체를 괴롭히는 질병이 있는 상태를 개선시킨다.

이러한 구현예에서, 목적하는 유전자는 수득되는 재조합체 세포의 생체내 투여 전에 전구체 세포 또는 이의 후대 내로 도입된다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공, 미세주사, 지질감염, 인산캄슘 매개된 형질감염, 유전자 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터에 의한 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 이동, 마이크로셀-매개된 유전자 이동, 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않은 당해 분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 외부 유전자를 세포 내로 도입시키기 위한 수많은 기술들이 당해 분야에 공지되어 있으며[참조: 예를 들면, . Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen 등, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92] 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 단 수용체 세포의 필요한 개발적 및 생리학적 작용은 방해되지 않는다. 이러한 기술은 유전자를 세포로 안정하게 이동시키기 위해 제공되어서 유전자가 세포에 의해 발현가능하게 되고 바람직하게는 이의 세포 후대에 의해 유전될 수 있고 발현될 수 있도록 한다. 대개, 이동 방법은 선택가능한 마커를 세포로 이동시키는 것을 포함한다. 세포는 이후에 선택하에 위치되어 취해진 세포를 분리시키며, 이동된 유전자를 발현한다. 이러한 세포는 이후에 대상체에게 전달된다.

유전자 치료요법을 실시하는 한 가지 일반적인 방법은 레트로바이러스 벡터을 사용하는 것이다[참조: Miller 등, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599]. 레트로바이러스 벡터는 예비선택된 유전자의 발현에 영향을 미치기 위해 예비선택된 유전자를 혼입하도록 변형된 레트로바이러스이다. 레트로바이러스의 천연적으로 발생하는 DNA 서열중 많은 것은 레트로바이러스 벡터에서 분배가능한 것으로 밝혀졌다. 레트로바이러스의 천연적으로 발생하는 DNA 서열 중의 단지 작은 소세트만이 필요하다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합을 위해 필요한 시스-작용 서열 모두를 포함해야만 한다. 이러한 시스-작용 서열은 (a) 벡터의 각각의 말단에서 긴 말단 반복체(LTR), 또는 이의 부분; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 게놈성 RNA를 비리온(virion) 내로 혼입시키기 위해 필요한 패지징 시그널이다.

유전자 치료요법에 사용되는 유전자는 벡터 내로 클로닝되는 데, 이는 벡터의 세포 내로의 감염 또는 전달에 의해 유전자의 전구체 세포 내로의 전달을 촉진시킨다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 사항은 문헌[참조: Boesen 등 1994, Biotherapy 6:291-302]에서 찾을 수 있는 데, 이는 화학치료요법에 보다 내성이 있는 줄기 세포를 제조하기 위하여 mdrl 유전자를 HSC로 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 용도를 기술하고 있다. 유전자 치료요법에서 레트로바이러스의 용도를 예증하는 다른 참고문헌은 다음과 같다: : Clowes 등, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem 등, 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; 및 Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114.

아데노바이러스는 또한 유전자 치료요법에서의 용도이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡 전구체 세포로 전달하기 위한 특히 매력적인 비히클(vehicle)이다. 아데노바이러스는 또한 간, 중추신경계, 내피 및 근육으로부터의 전구체 세포로 유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 갖는다. 문헌[참조: Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503]은 아데노 바이러스를 기본으로 한 유전자 치료요법에 대한 개관을 제공한다. 유전자 치료요법에서 아데노바이러스의 용도의 다른 예는 문헌[참조: Rosenfeld 등, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld 등, 1992, Cell 68: 143-155; 및 Mastrangeli 등, 1993, J. Clin. Invest. 91 :225-234]에서 찾을 수 있다.

아데노-관련된 바이러스(AAV)는 유전자 치료요법에서 사용되는 것이 제안되어 왔다[참조: Walsh 등, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300). 알파 바이러스는 또한 유전자 치료요법에서 사용되는 것으로 제안되어 왔다(Lundstrom, 1999, J. Recept. Signal Transduct. Res. 19:673-686].

유전자 치료요법에서 유전자 전달하는 다른 방법은 포유동물 인공 염색체를 포함한다[참조: Vos, 1998, Curr. Op. Genet. Dev. 8:351-359); liposomes (Tarahovsky and Ivanitsky, 1998, Biochemistry (Mosc) 63:607-618); ribozymes (Branch and Klotman, 1998, Exp. Nephrol. 6:78-83); 및 triplex DNA (Chan and Glazer, 1997, J. Mol. Med. 75:267-282].

목적하는 유전자는 동종 재조합에 의해, 발현을 위해 세포내로 도입될 수 있으며 숙주 전구체 세포 DNA 내로 혼입될 수 있다[참조: Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra 등, 1989, Nature 342:435-438].

특수한 구현예에서, 유전자 치료요법을 목적으로 도입되는 전구체 세포 또는 이의 후대에서 재조합체적으로 발현된 목적하는 유전자는 암호화 영역에 작동적으로 연결된 유도가능한 프로모터를 포함하여 재조합체 유전자의 발현이 전사의 적절한 유도자의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절가능하도록 한다.

바람직한 구현예에서, 전구체 세포 또는 이의 후대에서 재조합체적으로 목적하는 유전자는 Cre 부위에 의해 플랭킹된다. 유전자 기능이 더 이상 필요하지 않은 경우, 재조합체 유전자를 포함하는 세포는, 예를 들면, 유도가능한 또는 조직 특이적인 프로모터에 작용적으로 커플링된 Lox 암호화 서열을 포함하는 핵산을 공급하는 수단인, 또는 핵 내재화 시그널에 작용적으로 커플링된 Lox 단백질을 공급함으로써, Lox 단백질에 적용된다. Lox 재조합효소는, 공정에서 개재하는 서열을 절제하는, Cre 서열을 재조합하는 기능을 하며[참조: Hamilton 등, 1984, J. Mol. Biol. 178:481-486], 이는 본 구현예에 따라 목적하는 유전자의 핵산을 포함한다. 이 방법은 재조합체 유전자 발현을 조작하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Fukushige 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909]. 또한, FLP/FRT 재조합 시스템을 사용하여 부위-특이적 재조합을 통해 유전자의 존재 및 발현을 조절할 수 있다[참조: Brand and Perrimon, 1993, Development 118:401-415].

6.9 이식 방법

무한증식된 및/또는 분화된 세포 집단은, 목적하는 유전자를 재조합적으로 발현하든지 발현하지 않든지 간에, 질병 또는 부상의 치료를 위해 또는 이식되는 줄기세포 및 이식 부위의 유형에 적합한 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의한 유전자 치료요법을 위해 대상체 내로 이식할 수 있다. HSC 또는 더 분화된 유도체는, 간에 위치할 간 세포일 수 있는 바와 같이, 정맥내로 이식될 수 있다. 신경 줄기세포는 부상 또는 질병의 부위에서 뇌 속으로 직접 이식될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 이식을 위한 무한증식된 또는 분화된 세포를 포함하는 세포 집단은 정제되거나 적어도 고도로 풍부화된다. 상기한 단락 4.4에서 전구체 세포에 대해 기술된 세포 집단의 정제 및 풍부화를 설명하는 방법(예를 들면, FACS, MACS 등)는 이식을 위한 세포 집단의 정제 또는 풍부화에 적용가능하다.

일 구현예에서, 무한증식된 또는 분화된 세포의 이식은 자가 이식성이다. 자가 이식은, 예를 들면, 무한증식된 또는 분화된 세포가 유전적으로 조작되어 기타의 경우에는 대상체에서 결핍성인 유전자를 발현하는 경우 수행될 수 있다. 무한증식된 또는 분화된 세포의 자가 이식 대상체에서 화학치료요법에 의해 고갈된 조혈 세포 집단을 재구성하도록 수행될 수 있다. 바람직하게는, HSC는 대상체가 화학치료요법, 및 화학치료요법에 노출된 후 대상체에게 다시 이식된 무한증식된 또는 분화된 세포에 노출되기 전에 본 개시내용의 방법에 따라 무한증식시키기 위해 분리된다.

또 다른 구현예에서, 무한증식된 또는 분화된 세포의 이식은 비-자가 이식성이다. 이 구현예는, 예들 들면 대상체의 자신의 세포가 부재하거나 수가 너무 낮아서 배양물을 설정할 수 없는 경우 또는 대상체가 너무 아파서 이식 과정을 수행할 수 없는 경우에 실시한다. 비-자가 이식은 바람직하게는 거부반응을 억제하는 방법과 함께 사용한다.

도입 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내 및 경막외 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 세포 집단은, 예를 들면, 주입 또는 볼러스 주사(bolus injection), 상피 또는 점막 피부 라이닝(예 : 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)으로 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신계 또는 국소적일 수 있다. 또한, 본 개시내용의 약제학적 조성물을 뇌 실내 및 척수강내 주사를 포함하여 어떠한 적절한 경로에 의해 중추 신경계 내로 도입시키는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 Ommaya 저장소와 같은 저장소에 부착된, 예를 들면, 뇌실내 카테터(catheter)에 의해 용이하게 될 수 있다.

특정 구현예에서, 국소 치료가 필요한 영역에 본 개시내용의 세포 집단을 투여하는 것이 바람직 할 수 있으며; 이것은 예를 들면, 제한이 아닌, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 예를 들어 수술, 국소 도포 동안의 국소 주입에 의해, 카테터를 사용하여, 또는 이식물을 사용하여 달성할 수 있는데, 여기서 이식물은 시알라스틱 막(sialastic membrane), 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비 다공성 또는 젤라틴 물질이다.

예를 들면, 뇌에 세포를 이식하는 것은 다음과 같이 수행될 수 있다: 이식은 정위 기술(Lindvall 등, 1989, Arch. Neurol. 46:615)로 왼쪽 피질에서 3개 부위에서 이루어진다. 각각의 부위에 대해, 해리된 세포의 20㎕를 도구(외경 1.0 mm) 속으로 끌어당긴다. 세포를 15 내지 20 초마다 2.5㎕ 부분에, 각각 10, 12 및 14mm의 직선 관을 따라 주입시킨다. 각각의 주입 사이에 2분 지연시키고, 캐뉼러(cannula)는 1.5 내지 1.7 mm 후퇴시킨다. 최종 주사 후, 캐뉼라는 뇌로부터 서서히 회수되기 전에 8분 동안 제 위치에 남겨둔다. 수술 후에, 세포 생존율은 Brundin 등, 1985의 문헌(Brain. Res. 331 :251)의 과정에 따라 평가한다.

바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포 이식은 자가성이다. 다른 구현예에서, 이식은 비-자가성이다. 특정 구현예에서, 이식된 세포는 본 발명의 방법에 따라 생성된 기관 또는 조직의 형태일 수 있다.

특정한 장애 또는 상태의 치료에서 효과적이게 될 이식된 줄기 세포의 역가(titer)는 장애 또는 상태의 특성에 의존할 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 분석은 임의로 최적 투여량 범위를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 심각성에 좌우될 것이며, 의료인의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.

대상체는 바람직하게는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등의 동물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물이며, 바람직하게는 포유 동물, 및 가장 바람직하게는 사람이다.

6.10 약제학적 조성물

본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 방법에 따라 전구체 세포를 무한증식시키고 임의로 분화시킴으로써 생성된 재조합체 또는 비-재조합체 세포의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적(치료학적) 조성물을 투여함에 의한 치료방법을 제공한다. 바람직한 국면에서, 무한증식되거나 분화된 세포는 실질적으로 정제된다.

본 개시내용은 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 무한증식된 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 예를 들면, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 담체 및 조성물은 멸균시킬 수 있다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

조성물은, 또한 필요한 경우, 또한 습윤제 또는 유화제, 또는 pH를 완충제 소량 함유 할 수 있다. 조성물은 액상 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 사람에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에 고통을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다.

6.10.1. 약제학적 키트

본 개시내용은 또한 세포를 제조하기 위한 본 개시내용의 방법 및/또는 시약에 의해 제조된 하나 이상의 세포 집단, 또는 세포의 유전적 조작을 위한 시약으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩(pack) 또는 키트를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 하나 이상의 용기 속에 전구체 세포 및 정제된 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제의 분화가 아니라 증식을 촉진하는 하나 이상의 정제된 성장 인자를 포함하며, 여기서 성장 인자 및 노치 1 작용제 및/또는 노치 2 작용제는 함께 배양물 속에 이들을 노출시킨 전구체 세포를 무한증식시키기에 효과적이다. 임의로, 키트는 별도의 용기 속에 전구체 세포의 분화를 촉진시키는 하나 이상의 정제된 성장 인자를 추가로 포함한다. 임의로, 세포 배양 배지가 또한 제공된다. 임의로, 이러한 용기에는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 결합될 수 있으며, 이러한 통지서는 사람에게 투여하기 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.

예시적인 구현예

1. (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 (ii) 하나 이상 성장 인자의 부재하에서 전구체 세포 유형의 세포가 증식을 중지하고 분화하거나 사멸함으로써 전구체 세포가 증식하지만 상기 기간 동안 말기 분화하지 않은 기간 동안 (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 (ii) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 비-무한증식된 전구체 세포를 배양함으로써, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산하는, 방법.

2. (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 (ii) 하나 이상의 성장 인자의 부재하에서 전구체 세포 유형의 세포가 증식을 중지하고 분화하거나 사멸함으로써 전구체 세포가 증식하지만 말기 분화하지 않은 기간 이상 동안 (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 (ii) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 비-무한증식된 전구체 세포를 배양함으로써, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산함을 포함하여, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산하는, 방법.

3. 전구체 세포에 의해 노치 1 수용체 발현 및/또는 노치 2 수용체 발현을 평가(assessing)하는 단계; (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제 및 (ii) 성장 인자의 부재하에서 전구체 세포 유형의 세포가 증식을 중지하고 분화하거나 사멸함으로써 전구체 세포가 증식하지만 상기 기간 동안 말기 분화하지 않은 기간 이상 동안 낮은 노치 신호 강도를 유지하는 양의 (i) 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제(여기서, 상기 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제는 평가를 기준으로 선택된다) 및 (ii) 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 비-무한증식된 전구체 세포를 배양함으로써, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하여, 무한증식된 전구체 세포 집단을 생산하는, 방법.

4. 상기 노치 2 작용제가 노치 1 작용제보다 더 높은 농도로 제공되는, 본원에 개시된 구현예의 방법.

5. 배양 동안 노치 2 작용제 대 노치 1 작용제의 비가 150:1; 140:1; 130:1; 120:1; 110:1; 100:1; 90:1; 80:1; 70:1; 60:1; 50:1; 40:1; 30:1; 25:1; 24:1; 23:1; 22:1; 21 :1; 20:1; 19:1; 18:1; 17:1 16:1; 15:1; 14:1; 13:1; 12:1; 11 :1; 10:1; 9:1; 8:1; 7:1; 6:1; 5:1; 4:1; 3:1; 2:1; 1.5:1; 또는 1.25:1인, 본원에 개시된 구현예의 방법.

6. 배양 동안 노치 2 작용제가 0.1㎍/ml 내지 50㎍/ml의 농도로 존재하는, 본원에 개시된 구현예의 방법.

7. 배양 동안 노치 1 작용제가 0.005㎍/ml 내지 30㎍/ml의 농도로 존재하는, 본원에 개시된 구현예의 방법.

8. 배양 동안 노치 2 작용제가 20㎍/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

9. 배양 동안 노치 1 작용제가 2.5㎍/ml, 10㎍/ml 또는 0.15㎍/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

10. 배양 동안 노치 2 작용제가 10㎍/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

11. 배양 동안 노치 1 작용제가 0.02㎍/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

12. 상기 하나 이상의 성장 인자가 IL-3; IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3인 본원에 개시된 구현예의 방법.

13. 배양 동안 IL-3이 10 ng/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

14. 배양 동안 IL-6; TPO; SCF 및 Flt-3 중의 하나 이상이 50 ng/ml의 농도로 존재하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

15. 전구체 세포 집단이 상기 기간 동안 실질적으로 분화하지 않는 본원에 개시된 구현예의 방법.

16. 상기 전구체 세포가 줄기 세포인 본원에 개시된 구현예의 방법.

17. 상기 전구체 세포가 전구 세포인 본원에 개시된 구현예의 방법.

18. 상기 줄기 세포가 조혈 줄기 세포(HSC)인 본원에 개시된 구현예의 방법.

19. 상기 전구 세포가 조혈 전구 세포인 본원에 개시된 구현예의 방법.

20. 상기 조혈 줄기 또는 전구 세포가 골수로부터 수득되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

21. 상기 조혈 줄기 또는 전구 세포가 태아 또는 신생아 혈액으로부터 수득되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

22. 상기 기간이 7 내지 8일인 본원에 개시된 구현예의 방법.

23. 상기 기간이 적어도 5주인 본원에 개시된 구현예의 방법.

24. 상기 기간이 적어도 6주인 본원에 개시된 구현예의 방법.

25. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제가 상기 기간의 소세트 동안 전구체 세포에 의한 노치 1 수용체 발현 수준을 기준으로 선택되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

26. 상기 기간의 소세트가 배양 기간 중 처음 24시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

27. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 처음 48시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

28. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 처음 72시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

29. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 1/3을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

30. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 1/4를 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

31. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 마지막 24시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

32. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 마지막 48시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

33. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 마지막 72시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

34. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 마지막 3번째 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

35. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 마지막 4번째를 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

36. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 중간 24시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

37. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 중간 48시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

38. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 중간 72시간을 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

39. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 중간 3번째를 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

40. 상기 기간의 소세트가 상기 배양 기간의 중간 4번째를 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

41. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제를 선택하여 배양 기간 동안 전구체 세포에 의한 변화된 노치 1 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 배양을 지속하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

42. 낮은 노치 신호 강도가 Hes1 발현을 평가함으로써 측정되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

43. 상기 노치 신호 강도가 Thy1+ 및 CD25+ T 세포 전구체로의 전구체 세포 분화의 결여에 의해 확인되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

44. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제가 상기 기간 동안 전구체 세포에 의한 노치 1 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 선택되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

45. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제가 상기 기간 동안 전구체 세포에 의한 노치 2 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 선택되는 본원에 개시된 구현예의 방법.

46. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제를 선택하여 상기 기간 동안 전구체 세포에 의해 변화된 노치 2 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 배양을 지속하는 단계를 추가로 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

47. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제가 상기 기간 동안 전구체 세포에 의한 노치 1 수용체 발현 수준 및 노치 2 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 선택되는 본원에 개시된 구현에의 방법.

48. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제를 선택하여 상기 기간 동안 전구체 세포에 의해 변화된 노치 2 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 배양을 지속하는 단계를 추가로 포함하는 본원에 개시된 구현에의 방법.

49. 노치 1, 노치 2 작용제 또는 노치 1 및 노치 2 작용제를 선택하여 상기 기간 동안 전구체 세포에 의해 변화된 노치 1 수용체 발현 수준 및 노치 2 수용체 발현 수준을 기준으로 하여 배양을 지속하는 단계를 추가로 포함하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

50. 상기 평가 또는 추가의 평가가 노치 1 수용체 발현을 측정하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

51. 상기 평가 또는 추가의 평가가 노치 2 수용체 발현을 측정하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

52. 상기 평가 또는 추가의 평가가 노치 1 수용체 발현 및 노치 2 수용체 발현을 측정하는 본원에 개시된 구현예의 방법.

본 개시내용의 방법을 실시하고 세포 및 동물을 생산하기 위한 대안적인 구현예는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이며 첨부된 청구범위내에 포함되는 것으로 의도된다. 다음의 실험 실시예는 예증의 방식으로 제공되며 한정되는 방식으로는 제공되지 않는다.

7. 실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 특수한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자들은 본 개시내용의 측면에서 많은 변화가 본원에 개시된 구체적인 구현예에 대해 이루어질 수 있고 본 개시내용의 취지 및 영역으로부터 벗어나지 않고 동일하거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 인식하여야 한다.

기술된 실시예는 낮은 노치 신호 강도(이는 노치 1 및/또는 노치 2에 의해 중재될 수 있다)가 줄기 세포의 개선된 확장 및 생착을 가져옴을 나타낸다. 상기 결과는, 선택적인 파라로그 활성화에 의해 줄기 세포내에서 노치 신호의 조심스러운 적정이 유리할 수 있음을 제안한다. 현재의 개시내용은, 비교적 더 많은 양의 노치 2 작용제와 함께 적은 양의 노치 1 작용제가 함께 웰 속에서 줄기(SK-SLAM) 세포가 고도로 농축된 쥐 골수의 배양이 Delta1^ext ^- ^IgG, 노치 2 작용제 단독, 또는 노치 1 또는 노치 2 수용체에 대해 특이적인 모노클로날 항체가 플라스틱 표면에 고정화된 경우 대조군 리간드가 들어있는 배양물 속에서 1배 미만 증가한 것과 비교하여, 배양 7 내지 8일 후 SK-SLAM 세포(Sca-1⁺c-kit⁺CD150⁺CD48^-CD1lb^-)의 2배 증가된 생성을 가져온다는 것을 나타낸다. 따라서, 낮은 노치 신호 강도를 제공하는 노치 1 작용제, 노치 2 작용제 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 사용에 의한 노치 파라로그 특이적인 활성화는 조혈 줄기 세포를 포함하여, 줄기 세포를 확장시키는 신규 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 노치 신호전달에 있어서 정량적인 차이가 골수 분화의 지연을 설명함을 제공한다. 노치 신호전달에 있어서 정성적인 차이보다는 정량적인 차이가 나타나 있으므로, 노치 1 및/또는 노치 2의 활성화를 사용하여 노치 신호전달의 바람직한 수준을 생성할 수 있다. 또한, 노치 1 및 노치 2 수용체 발현은 배양 동안 서로 독립적으로 일어나므로, 상이한 노치 작용제를 시간에 따라 변화하는 발현 수준을 기준으로 선택할 수 있다. 이들 구현예에서, 노치 신호전달은 노치 1 작용제; 노치 2 작용제; 또는 노치 1 작용제 및 노치 2 작용제의 존재에 기인할 수 있다.

7.1 실시예 1

도 1. 특이적인 노치 항체와의 배양은 SK-SLAM 세포의 증가된 생성을 가져온다. 각각의 바아는 5㎍/ml에서의 Delta1^ext-IgG, 5㎍/ml에서의 HulgG 및 나타낸 투여량의 노치 1[HMN1-12 (MN1)] 또는 노치 2 항체[HMN2-35 (MN2)](Biolegend)에 대한 모노클로날 항체와의 배양물 속에서 SK-SLAM 세포의 평균 증가된 배수를 나타낸다. 바아는 2개의 별개의 실험 +/- 범위의 배양 웰 속에 있는 SK-SLAM의 초기 수와 비교하여 평균 배 증가이다.

도 2. 2개의 별개의 단위로부터의 제대 혈액 CD34+ 세포를 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)가 들어있는 스템스판 속에서 14일 동안 배양하였다. 세포를 항-사람 노치 1(클론 MHN1-519), 또는 대조군 IgG와 합해진 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 Delta1(2.5㎍/ml), 항-사람 노치 2(클론 MHN2-25, 0.5㎍/ml), 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml의 존재하에서 성장시켰다. 노치 항체는 델타 또는 대조군 IgG보다 더 높은 비율의 CD34+ 전구 세포 및 보다 원시의 CD34+ 90 low 세포를 유지하였다. 추가로, 노치 2 항체는 단독으로 및 노치 1 항체와 함께 CD34+ CD90 low 세포의 보다 큰 확장을 제공하였다.

도 3. 상기와 같이 14일 동안 배양한 후, 10,000개의 제대 혈액 CD34+ 세포의 확장된 후대를 그룹당 각각 6개의 NSG 마우스에 이식하였다. 마우스로부터의 골수 흡입물을 이식 후 2주째에 유동 세포분석에 의해 생착에 대해 분석하였다. 노치 1 및 노치 2 항체의 조합은 델타, IgG, 또는 노치 2 항체 단독보다 유의적으로 더 높은 수준의 사람 생착을 가능하도록 하였다(2개의 제대 혈액 단위에 대해 각각 p=0.0024 및 p=0.0225 단위).

다른 적용에서, 이들 방법은 생체내에서 기원한 배아 조혈 줄기 세포에 적용하였다. 제1의 HSC는 AGM(대동맥 생식융기 중신: Aorta-Gonad-Mesonephros) 영역에서 발달 동안 생성되며 내피(VE-Cadherin) 및 조혈(CD45) 마커를 동시-발현한다. 배양물 속에서 쥐 AGM-기원한 CD45+/VE-Cadherin+ 세포로부터 HSC/후대를 단기간 확장시키고 장기간 재증식시킬 수 있는 고정화된 리간드 Delta1(2.5㎍/ml), 레트로넥틴 5㎍/ml, rmSCF, rhIL6, rhFLT3L(모두 100 ng/ml에서), rhTPO (20 ng/ml), 및 소 분자 TGF-β 억제(10μM)의 조합을 사용하는 조건을 측정하였다. 플라스틱 표면에 고정된 노치 1 또는 노치 2 수용체에 특이한 단클론 항체는 이 배양 시스템애서 델타 1을 대체할 수 있으며, 이식 검정에서 골수 및 림프구 생착할 수 있는 세포를 생성하는 것은 본원에 나타나 있다. 더욱이, 예비 실험에서, 고정화된 MN2 항체를 사용한 노치 2-특이적인 파라로그 활성화는 (A) 5일이 배양 기간 후에 보다 많은 수의 LSK-SLAM(Scal+c-kit+CD150+CD48-F480-Gr1-) 세포를 생성하며 (B) 고정화된 노치 리간드 델타 1^ext-IgG와 비교하여 향상된 2주 및 6주 말초 혈액 생착을 생성한다. 따라서, 노치 파라로그-특이적인 활성화는 배아 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포와 같은 신규 공급원으로부터 HSC를 확장하는데 있어서 적용을 가질 수 있는 배아 공급원으로부터 다중계통 HSC를 확장시키는 능력을 추가로 향상시킬 수 있다.

도 4. 특이적인 노치 항체에서 AGM-기원한 CD45+/VE-Cadherin+ 세포는 LSK-SLAM 세포의 생성 및 다중계통 생착을 발휘한다. A. 2.5㎍/ml에서의 델타 1^ext-IgG, 2.5㎍/ml에서의 HulgG 및 나타낸 양의 노치 1[HMN1-12 (MN1)] 또는 노치 2 항체[HMN2-35 (MN2)]에 대한 고정화된 모노클로날 항체(Bio legend)에서 5일 배양 후 생성된 유동 세포분석기 분석에 의해 다수의 LSK-SLAM(Scal+c-kit+CD150+CD48-Gr1-F480-) 세포. 세포 수는 출발하는 도입량의 CD45+/VE-Cadherin+ 세포의 AGM 1 당량당으로 나타내며 오차 바아는 분석된 3개의 웰의 표준 편차를 나타낸다. B-D. 패널 A에서 배양되고 3X10⁴개의 구조 CD45.1 골수 세포와 함께 마우스당 0.5 AGM 당량의 출발하는 세포(CD45.2)에서 이식된 세포의 2 및 6주의 말초 혈액 생착. 분석된 각각의 마우스에 대해 말초 혈액에서 총 CD45+ 세포의 퍼센트로서 공여체 생착(CD45.2), 공여체 골수 생착(Gr1 및/또는 F480), 및 공여체 B 림프구(CD19)/T 림프구(CD3) 생착의 %를 나타낸다.

도 5 및 도 6은 추가의 데이타를 제공한다.

도 3 및 7. 도 7은 IL-3 (10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)와 함께 스템스판 속에서 14일 동안 배양시킨 2개의 별개의 단위(실험 409) 또는 2개의 단위의 혼주물(실험 414)로부터의 제대 혈액 CD34+ 세포를 나타낸다. 세포를 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml, 또는 대조군 IgG와 조합된 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 Delta1(2.5㎍/ml), 항-사람 노치 2(클론 MHN2-25, 0.5㎍/ml, 실험 409), 항-사람 노치 1(클론 MHN1-519, 0.02㎍/ml, 실험 414) 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml의 존재하에 성장시켰다.

10,000개 세포의 확장된 후대를 그룹당 각각 5마리(실험 414) 또는 6마리(실험 409) NSG 마우스내로 이식하였다. 골수 흡입물을 총 사람(CD45), 림프구(CD 19) 및 골수에 대해 이식 후 2주(실험 둘 다) 및 이식 후 8주(실험 414)에 대해 유동 세포분석으로 분석하였다. 골수를 수거하고 실험 409에 대해 이식 후 10주째에 수거하여 분석하였다.

도 8a 및 8b 및 도 9a, 9b 및 9c는 추가의 데이타를 제공한다.

7.2 실시예 2

개개의 노치 파라로그의 세포내 도메인(ICD)에서 정량적 차이는 계통 측정에 영향을 미치지 않는다. 계통 측정이 노치 신호 강도에 있어서 정량적 차이에 의해 영향받는 모델의 추가의 진전에 대한 단계로서, 노치 1 또는 노치 2의 신호전달 능력에 있어서 정량적 차이를 평가하여 이들이 세포 사멸 측정에 영향을 받는지를 측정하였다. 이러한 차이를 평가하기 위해, 전체 노치 2-ICD에 대한 게놈성 암호화 영역이 노치 1 유전자자리(N1¹² ^/ ¹²)로 교환되고 노치 1-ICD가 노치 2 유전자자리(N2^21/21)로 교환된 마우스를 사용하였다(Liu Z, Chen S, Boyle S, Zhu Y, Zhang A, Piwnica-Worms DR, 등 Dev Cell. 2013; 25(6):585-98). 노치 1이 아닌, 노치 2가 기관생성에 필수적인 역할을 하는 신장 발달의 연구에서, 발달은 N2^21/21　마우스에 있어 일반적임이 발견되었으며, 이는 교환된 노치 1-ICD가 작용성이며 노치 2-ICD와 비교할 수 있을 만큼 수행하였음을 나타낸다. 조혈과 관련하여, 상기 결과는 N1¹² ^/12 및 N2^21/21 마우스가 생체내 및 시험관내 모두에서 한배 대조군 새끼와 유사하게 T, B, 및 골수 세포 구성원을 생성할 수 있었음을 나타내었다(도 10). 당해 결과는 계통 측정에 있어서 노치 신호전달의 본 발명자들의 정량적 모델을 입증한다.

7.3 실시예 3

고정화된 파라로그-특이적인 항체에 의해 중재된 노치 활성하는 고정화된 Delta1 리간드와 비교하여 신속한 재생 세포에 있어서 유의적인 증가를 생성한다. 노치 파라로그 발현에 있어서 동적인 변화는 쥐 조혈을 동반한다. 노치 2는 새로이 분리된 LSK-SLAM(계통-Scal+Kit+CD150+CD48-) 및 LSK 세포의 표면에서 우세한 노치 수용체인 반면, 노치 1은 HSPC 혼주물을 이용하여 T 세포에 대한 분화를 촉진하는 조건인, 고 밀도의 Delta1과 함께 배양 후 우세해진다(데이타는 나타내지 않음). 세포-표면 발현에 있어서 이러한 이동의 결과로서, 파라로그-특이적인 항체를 사용한 개개 수용체의 선택적인 활성화가 노치 활성화를 제한할 수 있고 고정화된 Delta1과 비교하여 재생하는 세포의 생체외 생성을 향상시킬 수 있다. 쥐 골수 골수 LSK-SLAM 세포를 고정화된 Delta1 또는 노치 2 세포외 도메인에 대한 고정화된 활성화 항체와 함께 배양하여 제한 희석 이식 검정에서 사용하였다. Delta1과 비교하여, 항체-선택적인 노치 2 활성화는 이식 6주 후 3.6배 더 높은 빈도의 재생하는 세포를 생성하였다(시험한 최대 세포 투여량에서 계통 재생에 대한 L-calc p=0.02). 이들 연구는 노치 파라로그-특이적인 항체가 노치 리간드보다 더 큰 정도까지 재생하는 세포의 생체외 생성을 향상시켰음을 나타내었다.

쥐 LSK-SLAM 세포와는 대조적으로, 새로이 분리된 제대 혈액(CB) CD34⁺　세포는 노치 1 및 노치 2 둘 다를 발현한다(도 11). 사람 노치 1 또는 노치 2의 세포외 도메인에 대해 특이적인 고정화된 항체와 함께 2주 동안 배양된 CB CD34⁺　세포(MHN1-519 및 MHN2-25, 참고: www.Biolegend.com; Haraguchi K, Suzuki T, Koyama N, Kumano K, Nakahara F, Matsumoto A, 등 J Immunol. 2009;182(10):6168-78)는 재생하는 세포가 이미 발표된 최적 투여량의 고정화된 Delta1보다 잔존하는 거의 성숙하지 않은 CD34⁺　세포 소세트인, CD34⁺　및 CD34⁺CD90^lo　세포를 실질적으로 보다 더 재생적으로 생성하였다(Delaney C, Varnum-Finney B, Aoyama K, Brashem-Stein C, Bernstein ID. Blood. 2005;106(8):2693-9; Delaney C, Heimfeld S, Brashem-Stein C, Voorhies H, Manger RL, Bernstein ID. Nat Med. 2010;16(2):232-6; CD90^lo　cells were those cells expressing low amounts of CD90, as determined by a gated cut-off amount defined previously in Majeti R, Park CY, Weissman IL. Cell Stem Cell 2007; 1: 635-645)(데이타는 나타내지 않음). 가장 중요하게도, 고정화된 Delta1과 비교하여, CD34⁺CD90^lo　세포 생성을 극대화하는 농도의 고정화된 항-노치 1 또는 항-노치 2 항체(각각 MHN1-519 및 MHN2-25)와 함께 배양된 CD34⁺　세포는 NOD-scid IL2Rgamma 널(null)(NSG) 마우스에서 유의적으로 보다 신속한 재생(2-3주) 활성을 유도하였다(도 12; p-값 MHN1-519 =0.0286, p-값 MHN2-25=0.0460). 전체적으로, 이들 데이타는 생체외 유도된 HSPC를 증가시킴으로써 치료학적 적용을 위해 신속하게 재생하는 세포의 생성을 향상시키는 파라로그-특이적인 노치 활성화의 용도를 지적한다.

7.4 실시예 4

파라로그 특이적인 노치 항체는 리간드-유도된 활성화에 영향받지 않는 노치 수용체를 활성화시킨다 . 개개 수용체 항체가 생착가능한 HSPC의 확장을 유도하는데 있어서 리간드보다 더 효과적인 이유에 촉점을 맞추는 제1 단계로서, CB CD34+ 세포가 고정화된 Delta1, 항-노치 1 또는 항-노치 2 항체에 의한 4시간 노치 활성화 후 표적 유전자 Hes1의 확장을 즉시 유도하는 능력에 있어서 차이를 나타내는지를 시험하였다. 리간드에 포함된 EGF 도메인을 포함하는, 이들 각각의 아미노 말단 단편에 대해 발생한 항-노치 1 항체(MHN1-519) 또는 항-노치 2 항체(MHN2-25)(둘 다 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)를 비교하였으며, 항-노치 1 및 항-노치 2 항체는 가용성인 경우 노치 활성을 억제하고 고정화된 경우 활성화시키는 것으로 알려진, 이들의 유사한 막근처(juxtamembrane) 음성 조절 영역(Negative Regulatory Region: NRR)(이후에 각각 NRR-N1 및 NRR-N2로 언급되는 항체)에 대해 발생하였다(personal communication C. Siebel, Genentech; Wu Y, Cain-Horn C, Choy L, Hagenbeek TJ, de Leon GP, Chen Y, 등 Nature. 2010;464(7291):1052-7)(도 13). 도 14에 나타낸 바와 같이, MHN1-519를 사용한 유도는 Delta1보다도 2 내지 3배 더 큰 Hes1 발현을 가져왔다. 대조적으로, MHN2-25는 시험한 보다 적은 투여량에서 Delta1보다 대략 2배 더 큰 Hes1 발현을 생성하였지만 보다 높은 투여량에서 Delta1과 동일하였다. 비교시, NRR-N1 및 NRR-N2는 Hes1 발현을 유도하는데 있어서 각각의 EGF 항체보다 효과적이지 않았다.

추가의 연구는 작용제 활성화 잠재능에 있어서 관찰된 차이가 보다 원시인 CD34⁺CD90^lo　HSPC 소세트에 있어서 노치와 상호작용하는 Delta1 및 MHN1-519 또는 MHN2-25의 차등적인 능력을 반영한다. 새로이 분리된 CB CD34⁺CD90^lo　및 CD34⁺CD90^-　세포를 Delta1, MHN1-519 또는 대조군 IgG와 함께 4시간 동안 항온처리하고 Hes1 발현을 qPCR로 측정하였다. CD34⁺CD90^-　세포와 비교하여, MHN1-519에 대한 CD34⁺CD90^lo　집단의 노출 후 보다 큰 노치 활성화의 경향성이 Delta1에 대한 노출과 비교하여 관찰되었다(도 15a). 이들 데이타는 CD34⁺CD90^lo　세포에 있어서 리간드 결합 검정의 결과와 관련되어 있으며, 여기서 MHN1-519 및 MHN2-25는 이들 각각의 파라로그에 결합할 수 있는 반면, Delta1은 결합을 거의 나타내지 않거나 결합하지 않는다(데이타는 나타내지 않음). 사이토킨과의 배양에 의한 이들 세포의 분화에 이어서, 동일한 수준의 노치 활성화가 Hes1 발현에 의해 측정된 것으로서 고정화된 Delta1 또는 MHN1-519를 사용하여 발견되었다(도 15b). 이와 함께, 이들 연구는 MHN1-519 및 MHN2-25가 Delta1 결합 및 활성화에 초기에 영향받지 않는 수용체에 결합하는 이들의 능력으로 인하여 CD34⁺CD90^lo　세포를 생성하는데 보다 효과적임을 제안한다.

노치 수용체의 트랜스-발현된 리간드 활성화를 억제할 수 있는 하나의 기전은 내인성으로 발현된 리간드에 의해 중재된 시스-억제(cis-inhibition)이다. 최근의 연구는 시스-발현된 리간드가 트랜스로 결합된 리간드와 같이 동일한 노치 수용체 인터페이스(interface)와 상호작용할 수 있음을 나타낸다(Luca VC, Jude KM, Pierce NW, Nachury MV, Fischer S, Garcia KC. Science. 2015;347(6224):847-53). 노치 항체 작용제는 항체-수용체 인터페이스가 리간드-수용체 인터페이스로부터 명백하므로 시스-발현된 리간드와 관련하여 이들의 인접한 수용체의 활성화를 유도할 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위하여 Jurkat 세포에서 교차-블록 검정(cross-blocking assay)을 활용하였다. Delta1의 첨가는 myc-태그된Delta1의 결합을 차단하였지만, MHN1-519의 결합은 차단하지 않았음이 밝혀졌다(도 16). 이들 연구는 MHN1-519가 Delta1의 부위와는 명백한 노치 1 상의 에피토프에 결합함을 제안한다. 리간드 결합에 포함된 EGF-유사 반복체 11 및 12를 포함하는, 노치 1 EGF-유사 반복체 7-14를 포함한 폴리펩타이드는 노치1에 대한 Delta1의 결합을 억제하였지만 MHN1-519과 노치 1의 상호작용을 변경시키지 않았으며(데이타는 나타내지 않음), 작용제 항체 및 리간드 상호작용 인터페이스가 유일하다는 추가의 증거를 제공한다. 또한, MHN1-519 항체를 생성하는데 사용된 면역원은 노치 1 EGF-유사 반복체 1-13을 포함하므로, 단순한 추출은 항체 에피토프가 리간드 결합 부위에 대해 N-말단인 노치 1 막-근접한 EGF-유사 반복체 1-6 속에 잔류함을 제안한다.

항체가 달리 시스-억제된 리간드를 활성화시키는지를 측정하기 위하여, 노치1 변이체를 발현하는 CHO-K1 세포내에서 앞서 개발한 노치 리포터 시스템을 사용하였으며, 상기 노치l의 ICD는 UAS-구동된 YFP 리포터와 함께 효모 Gal4로 대체한다. 당해 시스템을 사용하여, 외인성 Delta1에 의한 노치 수용체 자극은 YFP의 축적을 가져옴이 밝혀졌다(Sprinzak D, Lakhanpal A, Lebon L, Santat LA, Fontes ME, Anderson GA, 등 Nature. 2010;465(7294):86-90). 그러나, 안정하게 통합된 테트라사이클린 유도성 Delta1 유전자의 동시-발현은 시스-억제를 유도하면서 트랜스-리간드에 의한 노치의 활성화를 예방하고, YFP 축적을 감소시킨다. 따라서, 이들 세포는 시스 억제 및 노치 활성화의 분석을 위한 유효 모델을 제공한다. 당해 시스템을 사용하여, MHN1-519 및 Delta1 둘 다는 시스-리간드의 부재하에서 외인성으로 발현된 경우 투여량 의존적인 방식으로 YFP를 유도할 수 있음이 관찰되었다(도 17). 시스-발현된 리간드의 유도시 앞서 나타낸 바와 같이, 트랜스-델타는 노치를 활성화시킬 수 없다. 그러나, MHN1-519를 사용하여 발현시키는 경우, 노치 1은 시스-리간드 상태와 상관없이 신호를 제공할 수 있다. 이와 함께, 이들 데이타는 MHN1-519가 Delta1으로부터 먼 노치 1 인터페이스를 통해, 리간드 시스-억제로 인해 일반적으로 영향을 미치지 않는 노치 수용체를 활성화시킬 수 있음을 제안한다.

내인성 리간드 발현에 의한 시스-억제가 본 연구자들의 사람 CB 연구의 우수성을 설명할 가능성을 평가하기 위하여, CB CD34⁺CD90^lo　세포가 원형(DLL1, DLL3, DLL4, JAG1 및 JAG2) 또는 비-원형 (DLK1 및 DLK2) 리간드를 발현하는지를 정량적 RT-PCR 및 FACS 분석으로 측정하였다. PCR 평가는 Jag2, D111, D114 및 Dlk1의 발현을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). FACS 분석을 사용하여, Jag2의 세포-표면 발현을 재생 세포를 함유하는 것으로 알려진 원시 CD34⁺ CD90^lo　상에서 확인하였지만, CD34⁺CD90^-　소세트 상에서는 확인하지 않았다(데이타는 나타내지 않음).

MHN1-519 및 MHN2-25를 사용하여, 노치 1 및 노치 2의 세포 표면 발현을 고정화된 Delta1에서 2주 확장 전 및 동안에 CB 기원한 CD34⁺　세포에 대해 평가하였다(도 18). 새로이 분류된 CB CD34⁺　세포는 비교적 동일한 양의 노치 1 및 노치 2를 발현하지만, 배양시 시간은 세포 표면 발현에서 동적인 변화를 나타내며, 노치 1은 지속적으로 증가하고 노치 2는 감소한 후 일정하게 남았다.

7.5 실시예 5

파라로그 특이적인 노치 1 항체는 Delta보다 더 높은 수의 림프구 전구 세포를 생산한다. 2개의 별개의 단위로부터 제대 혈액 CD34⁺　세포를 7일 동안 스템스판 속에서 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)와 함께 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) 고정화된 대조군 IgG (ii) 고정화된 Delta1, 0.5, 2.5 또는 10㎍/ml), 또는 (iii) 고정화된 항-사람 노치 1 항체((0.02, 0.1, 0.5 or 2.5㎍/ml, 클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함))의 존재하에서 성장시켰다. 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)인, CD34⁺ /CD38^-/CD7⁺집단을 유동 세포분석으로 분석하였다. 결과는 도 19에 나타낸다. 항-노치 1 항체와 함께 세포의 성장은 보다 Delta1보다 더 높은 수의 CLP를 생산하였다.

7.6 실시예 6

고정화된 노치 1 항체와 함께 배양된 제대 혈액 CD34 ⁺ 　세포는 NSG 마우스내로 이식되는 경우 T 세포 생착을 생성한다. 2개의 단위의 혼주물로부터의 제대 혈액 CD34⁺세포를 IL-3(10 ng/ml), IL-6, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드(모두 50 ng/ml)가 들어있는 스템스판 속에서 14일 동안 배양하였다. 세포를 고정화된 레트로넥틴 5㎍/ml 및 (i) Delta1 2.5㎍/ml, (ii) 대조군 IgG, (iii) 항-사람 노치 1 항체 0.02㎍/ml(클론 MHN1-519 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)), 또는 (iv) 항-사람 노치 2 0.5㎍/ml(클론 MHN2-25, (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함))과 합해진 항-사람 노치 1 0.02㎍/ml의 존재하에서 성장시켰다.

배양 14일째에, 10,000개의 세포의 확장된 후대를 그룹당 각각 5마리의 NSG 마우스내로 이식하였다. 18주 후, 골수를 수거하고 총 사람 생착(CD45 퍼센트, 도 20a) 및 사람 T 세포 생착(CD3 퍼센트, 도 20b)를 유동 세포분석으로 평가하였다. 항-노치 1 항체와 함께 배양한 세포를 5마리의 마우스 중 4마리에서 T 세포를 성장시켰다. 사람 T 세포(CD3⁺)는 항-노치 1 항체와 함께 배양된 세포를 제공받은 마우스에서만 형성하였으며(도 20b), 이는 보다 높은 노치 신호가 T 세포 계통에 대한 분화를 유도하기에 충분한 세포의 부위를 유도하며 이들이 CD3⁺　T 세포로 성숙하는 융선으로 이주하여 이 속에서 생착하는 세포를 생성함을 제안한다.

달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합체 DNA의 통상의 기술을 사용할 수 있다. 이들 방법은 다음의 공보에 기술되어 있다: 참고: 예를 들면, Sambrook, 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989); F. M. Ausubel, 등 eds., Current Protocols in Molecular Biology, (1987); the series Methods IN Enzymology (Academic Press, Inc.); M. MacPherson, 등, PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); MacPherson 등, eds. PCR 2: Practical Approach, (1995); Harlow and Lane, eds. Antibodies, A Laboratory Manual, (1988); 및 R. I. Freshney, ed. Animal Cell Culture (1987).

당해 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 구현예는 이의 특수한 기술된 요소, 단계, 원료 또는 성분으로 필수적으로 이루어지거나 이루어진다. 본원에 사용된 것으로서, 전이 용어 "포함하다"는 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 주요한 양으로도, 명시되지 않은 요소, 단계, 원료 또는 성분을 포함하도록 한다. 전이 어구 "로 이루어진"은 규정되지 않은 어떠한 요소, 단계, 원료 또는 성분도 제외한다. 전이 어구 "로 필수적으로 이루어진"은 규정된 요소, 단계, 원료 또는 성분에 대한 구현예의 영역 및 당해 구현예에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 구현예의 영역을 제한한다. 본원에 사용된 것으로서, 물질은 HSPC의 확장 또는 생착에 있어서 통계적으로 유의적인 감소를 유발할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 분자량, 반응 조건, 등과 같은 원료의 양, 특성을 나타내는 모든 수는 용어 "약"에 의해 모든 예에서 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 설정된 수치적 매개변수는 본 발명에 이해 수득되는 것으로 고려되는 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 및 청구범위의 영역에 대해 동일한 원칙의 적용을 제한하려는 시도로서가 아닌, 각각의 수치적 매개변수는 적어도 보고된 유의적인 숫자의 수의 측면에서 및 통상의 어림하기 기술을 적용함으로써 제한되어야 한다. 추가의 명확성이 요구되는 경우, 용어 "약"은 기술된 수치 또는 범위와 함께 사용되는 경우, 당해 분야의 숙련가에 의해 이에 대해 합리적으로 추정된 의미를 갖는데, 즉, 어느 정도는 기술된 값의 ±20%의 범위; 기술된 값의 ±19%의 범위; 기술된 값의 ±18%의 범위; 기술된 값의 ±17%의 범위; 기술된 값의 ±16%의 범위; 기술된 값의 ±15%의 범위; 기술된 값의 ±14%의 범위; 기술된 값의 ±13%의 범위; 기술된 값의 ±12%의 범위; 기술된 값의 ±11%의 범위; 기술된 값의 ±10%의 범위; 기술된 값의 ±9%의 범위; 기술된 값의 ±8%의 범위; 기술된 값의 ±7%의 범위; 기술된 값의 ±6%의 범위; 기술된 값의 ±5%의 범위; 기술된 값의 ±4%의 범위; 기술된 값의 ±3%의 범위; 기술된 값의 ±2%의 범위; 또는 기술된 값의 ±1%의 범위 이내 까지 기술된 값 또는 범위의 이상 또는 미만을 나타낸다.

본 발명의 광의의 범위를 설정한 수치 범위 및 매개변수가 조사치라고 해도, 구체적인 실시예에 설정된 수치는 가능한 한 정밀한 것으로 보고되어 있다. 그러나, 어떠한 수치도 고유하게는 이들 각각의 시험 매개변수에서 발견된 표준 편차로부터 필수적으로 생성되는 특정의 오차를 포함한다.

본 발명을 기술하는데 있어서(특히 다음의 청구범위와 관련하여) 사용된 단수 용어("a", "an", "the") 및 유사한 참조는 본원에서 달리 나타내거나 내용에 의해 명확하게 부정되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 고려되어야 한다. 본원의 수치의 범위의 인용은 개별적으로 상기 범위내에 속하는 각각의 별개의 값을 언급하는 단축된 방법으로서 제공하는 것으로 단지 의도된다. 본원에 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개개 값은 이것이 본원에 개별적으로 인용되었던 바와 같이 명세서내로 혼입된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 내용에서 달리 명확하게 부정되지 않는 한 어떠한 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 어떠한 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들면, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 명확하게 하기 위한 것이며 달리 청구한 본 발명의 영역으로 한정하는 것을 내포하지 않는다. 본 명세서에서 언어는 본 발명의 실시에 필수적인 어떠한 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 고려해야 한다.

본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 각각의 그룹 구성원은 본원에 발견된 그룹의 다른 구성원 또는 다른 요소와의 어떠한 조합 또는 개별적으로 언급되거나 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹 속에 포함되거나, 이로부터 결실될 수 있는 것으로 기대된다. 이러한 어떤 포함 또는 결실이 일어나는 경우, 명세서는 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마르쿠시 그룹(Markush group)으로 쓰여진 기술을 충족하도록 변형된 그룹을 함유하는 것으로 고려된다.

본 발명을 수행하기 위해 본 발명자에게 공되된 가장 우수한 방식을 포함하는, 본 발명의 특정의 구현예가 본원에 기술되어 있다. 물론, 이들 기술된 구현예의 변형은 앞서의 설명의 판독시 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 발명자는 당해 분야의 숙련가가 이러한 변형을 적절하게 사용함을 예측하며, 발명자들은 본원에 구체적으로 기술된 것보다 달리 본 발명을 실시할 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 것으로서 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 이의 모든 가능한 변형 내에서 상술한 요소의 어떠한 조합도 본원에서 달리 나타내지 않거나 내용에 의해 달리 명확하게 포함되지 않는 한 본 발명에 포함된다.

또한, 다수의 참고가 당해 명세서 전체에서 특허 및 인쇄된 공보에 대해 이루어져 왔다. 상기 인용된 참고문헌 및 인쇄된 공보 각각은 이들의 특별한 인용된 기술에 대한 참고로서 본원에 개별적으로 포함된다.

마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 구현예들은 본 발명의 원리의 예증적인 것이다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 영역내에 있다. 따라서, 예로서, 그러나 제한하지 않고, 본 발명의 대안의 구조가 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 나타내고 기술된 바와 같은 정밀한 것에 한정되지 않는다.

본원에 나타낸 특수사항은 단지 본 발명의 바람직한 구현예의 예증적 논의의 목적을 위해서 및 예로서 존재하며 가장 유용한 것으로 여겨지고 본 발명의 다양한 구현예의 원리 및 개념 국면의 설명을 용이하게 이해하는 것을 제공하기 위해 나타낸다. 이와 관련하여, 본 발명, 당해 분야의 숙련가에게 본 발명의 수개의 형태가 실제 구현될 수 있는 방법을 명확하도록 하게 하기 위한 도면 및/또는 실시예를 취한 상세한 설명의 근본적인 이해에 필요한 것 보다 더 상세하게 본 발명의 구조적인 세부사항을 나타내기 위한 시도는 이루어지지 않는다.

본 개시내용에서 사용된 정의 및 설명은 다음의 실시예에서 명확하게 및 분형하게 수정되지 않는 한 또는 상기 의미의 적용이 어떠한 구조도 무의미하게 또는 필수적으로 의미없도록 하는 경우에 어떠한 장래의 구성을 조절하는 것으로 의미되거나 의도된다. 상기 용어의 구조가 의미없어지거나 필수적으로 무의미하게 되는 경우에, 상기 정의는 웹스터 사전(Webster's Dictionary), 3판 또는 옥스퍼드 생물학 및 분자생물학 사전(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)과 같이, 당해 분야의 통상의 기술자에에 공지된 사전으로부터 취해져야 한다.

특허, 특허원, 및 공보와 같은 다양한 참고문헌이 본원에 인용되어 있으며, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims

조혈 줄기/전구체 세포를 확장시키는 방법으로서,
(a) (i) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그(paralog)-특이적 작용제, (ii) 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 또는 (iii) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그-특이적 작용제, 및 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제를 포함하는 하나 이상의 노치 작용제, 및
(b) 성장 인자
의 존재하에서 상기 조혈 줄기/전구체 세포를 배양하고,
이로써 확장된 조혈 줄기/전구체 세포 집단을 생산하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 전에 및/또는 그 동안에 상기 조혈 줄기/전구체 세포에 의해 노치 1 및/또는 노치 2 발현을 검출하는 것을 추가로 포함하며,
여기서 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제는 노치 1이 상기 검출 단계에서 검출되는 경우에 상기 배양 단계에 사용되고/거나,
여기서 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제는 노치 2가 상기 검출 단계에서 검출되는 경우에 상기 배양 단계에 사용되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양은 (a)(i) 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제, (ii) 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 또는 (iii) 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제 및 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 및 (b) 상기 성장 인자의 존재하에서 배양되지 않은 조혈 줄기/전구체 세포가 증식을 중지하고 분화 또는 사멸하는 기간을 초과하는 동안 이루어지는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양이 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제 및 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 존재하에서 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양이 (i) 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제의 존재, 그러나 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 부재하에서 수행되거나 또는 (ii) 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 존재, 그러나 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제의 부재하에서 수행되는, 방법.
조혈 줄기/전구체 세포를 확장시키는 방법으로서,
(a) (i) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 1을 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그-특이적 작용제, (ii) 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 2를 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 또는 (iii) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 1을 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그-특이적 작용제, 및 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 2를 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제를 포함하는 하나 이상의 노치 작용제, 및
(b) 성장 인자
의 존재하에서 상기 조혈 줄기/전구체 세포를 배양하며,
여기서 상기 노치 1 활성화 및/또는 상기 노치 2 활성화는 노치 리간드의 내인성 발현에 의해 유발되는 시스-억제(cis-inhibition)를 극복하고,
이로써 확장된 조혈 줄기/전구체 세포 집단을 생산하는 것을 포함하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제 및/또는 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 상기 항원-결합 단편이 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 일본쇄 Fv 단편(scFv)으로부터 선택되는, 방법.
조혈 줄기/전구체 세포를 확장시키는 방법으로서,
(a) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그-특이적 작용제,
(b) 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 및
(c) 성장 인자
의 존재하에서 상기 조혈 줄기/전구체 세포를 배양하고,
이로써 확장된 조혈 줄기/전구체 세포 집단을 생산하는 것을 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 배양 전에 및/또는 그 동안에 상기 조혈 줄기/전구체 세포에 의해 노치 1 발현을 검출하고; 상기 검출에 기초하여 상기 배양물 중 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제의 양을 보정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기/전구체 세포가 제대 혈액, 골수, 태반 혈액, 와톤 젤리(Wharton's jelly), 태아 혈액, 또는 신생아 혈액으로부터 수득되는, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 동안 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제가 0.1㎍/ml 내지 50㎍/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 동안 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제가 0.005㎍/ml 내지 30㎍/ml의 농도로 존재하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 인자가 인터루킨-3(IL-3); 인터루킨-6(IL-6); 트롬보포이에틴(TPO); 줄기 세포 인자(SCF) 및 Flt-3 리간드인, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 기간이 7일 내지 6주인, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제 및/또는 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제가 제1의 고체 상에 고정되거나, 또는
상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제가 제1의 고체 상에 고정되고 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제가 제2의 고체 상에 고정되는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 제1의 고체 상이 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면 또는 비드(bead)인, 방법.
제16항에 있어서, (i) 상기 제1의 고체 상이 조직 배양 디쉬 또는 플라스크의 표면이고 제2의 고체 상이 비드이거나, 또는 (ii) 제1의 고체 상이 비드이고 제2의 고체 상이 조직 배양 디쉬 또는 플라스크인, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기/전구체 세포가 (i) 조혈 줄기 세포, (ii) 조혈 전구체 세포, 또는 (iii) 조혈 줄기 및 전구체 세포인, 방법.
제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 흉선에 이주하여 성숙한 T 세포를 생성할 수 있는 조기 T 세포 줄기/전구체를 추가로 생산하는, 방법.
조혈 줄기/전구체 세포를 확장시키는 방법으로서,
(a) 노치 1의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 1을 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 1 파라로그-특이적 작용제,
(b) 노치 2의 세포외 EGF 반복 도메인에 특이적으로 결합하고 노치 2를 활성화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 노치 2 파라로그-특이적 작용제, 및
(c) 성장 인자
의 존재하에서 상기 조혈 줄기/전구체 세포를 배양하며,
여기서 상기 노치 1 활성화 및 상기 노치 2 활성화는 노치 리간드의 내인성 발현에 의해 유발되는 시스-억제를 극복하고,
이로써 확장된 조혈 줄기/전구체 세포 집단을 생산하는 것을 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 배양 전에 및/또는 그 동안에 상기 조혈 줄기/전구체 세포에 의해 노치 2 발현을 검출하고; 상기 검출에 기초하여 상기 배양물 중 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 양을 보정하는 것을 추가로 포함하거나, 또는
상기 배양 전에 및/또는 그 동안에 상기 조혈 줄기/전구체 세포에 의해 노치 1 발현 및 노치 2 발현을 검출하고; 상기 검출에 기초하여 상기 배양물 중 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제의 양 및 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 양을 보정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제8항 또는 제20항에 있어서, 상기 노치 1 파라로그-특이적 작용제 및 상기 노치 2 파라로그-특이적 작용제의 상기 항원-결합 단편이 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 일본쇄 Fv 단편(scFv)으로부터 선택되는, 방법.
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