CN109689858A - 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容通常涉及可用于细胞和组织生物学和治疗学的方法和组合物。特别地，提供了一种用于将多能干细胞分化成KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞和/或SSEA5‑KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的体外方法。公开的中胚层细胞可以用于在体内产生血管和/或在体外进一步分化成内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)。提供了纯化的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞和ECFC样细胞的人细胞群体。提供了用于使用本公开内容的细胞群体的测试剂筛选和治疗方法。
Description
先前申请的交叉引用
本申请要求于2016年8月10日提交的美国临时专利申请序列号62/372,907的权益，其通过引用并入本文，如同以其整体阐述一样。
公开内容的领域
本公开内容涉及细胞和组织生物学领域。更具体地，本公开内容涉及多能干细胞向可以在体内形成血管的中胚层细胞和/或内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的谱系特异性分化。
公开内容的背景
内皮集落形成细胞(ECFC)是罕见的循环内皮细胞，在脐带血中特别丰富，具有克隆增殖潜力和固有的体内血管形成能力(Yoder,M.C.等人.Blood 109,1801-1809(2007)；Ingram,D.A.等人.Blood 105,2783-2786(2005)；Ingram,D.A.等人.Blood 104,2752-2760(2004)；Critser,P.J.等人.Microvasc Res 80,23-30(2010)；Au,P.等人.Blood 111,1302-1305(2008)；Melero-Martin,J.M.等人.Circ Res 103,194-202(2008))。不理解的是，脐带血或供体骨髓中什么类型的细胞会产生ECFC。当培养的原代ECFC被静脉内注射到啮齿动物血管损伤模型中时，它们被募集到血管损伤或组织缺血的部位，以协调血管生成反应的启动(Moubarik,C.等人.Stem Cell Rev 7,208-220(2011)；Schwarz,T.M.等人.Arterioscler Thromb Vasc Biol 32,e13-21(2012)；Saif,J.等人.ArteriosclerThromb Vasc Biol 30,1897-1904(2010))。已经报道了，在心肌梗死(Dubois,C.等人.J AmColl Cardiol 55,2232-2243(2010)；Schuh,A.等人.Basic Res Cardiol 103,69-77(2008))、卒中(Moubarik,C.等人.2011)、缺血性视网膜病(Stitt,A.W.等人.Prog RetinEye Res 30,149-166(2011)；Medina,R.J.等人.Invest Ophthalmol Vis Sci 51,5906-5913(2010))、缺血性肢体损伤(Schwartz等人.2012；Saif等人.2010；Bouvard,C.等人.Arterioscler Thromb Vasc Biol 30,1569-1575(2010)；Lee,J.H.等人.ArteriosclerThromb Vasc Biol(2013))、以及移植和再内皮化剥除的血管区段或植入的移植物(Stroncek,J.D.等人.Acta Biomater 8,201-208(2012))后，人ECFC增强血管修复并改进血液流动。在患有外周动脉疾病(PAD)和严重肢体缺血(CLI)的受试者中，循环或驻留的ECFC可以变得易于复制衰老(即ECFC可以缺少增殖潜力)，因而使它们对自体血管修复无能为力。至少由于这些原因，合意的是找到可以用于血管修复的ECFC或其他细胞类型的替代来源。
人多能干细胞(hPSC)显示出几乎无限的自我更新能力和分化成动物体内的任何细胞类型的能力(Robbins,R.D.等人.Curr Opin Organ Transplant 15,61-67(2010)；Broxmeyer,H.E.等人.Blood 117,4773-4777(2011)；Lee,M.R.等人.Stem Cells 31,666-681(2013))。本发明人先前已经确定了用于从hPSC在体外衍生ECFC样细胞的方法，其中ECFC样细胞可以在体内形成血管(PCT/US2015/020008)。
合意的是减轻和/或消除一个或更多个上文的缺陷。
公开内容的概述
本公开内容被广泛地概述为涉及用于从hPSC产生谱系特异性中胚层细胞和/或内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的方法。提供了用于将hPSC可再现地分化成谱系特异性中胚层细胞和/或ECFC样细胞的群体的方案，所述谱系特异性中胚层细胞和/或ECFC样细胞具有体内血管形成能力。
在一个方面中，本公开内容提供了用于从人多能干细胞产生分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体的方法。所述方法包括提供多能干细胞(PSC)；诱导多能干细胞以经历中胚层分化，其中中胚层诱导包括：i)在包含激活素(activin)A、BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基中培养多能干细胞持续约24小时；和ii)此后约每24小时-48小时用包含BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基替换步骤i)的培养基，持续约72小时；以及从被诱导以经历分化的细胞中分离中胚层细胞，其中中胚层细胞的分离包括：iii)分选中胚层细胞以选择KDR+NCAM+APLNR+细胞。
在实施方案中，分选还包括选择SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞。
在实施方案中，中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的细胞与Fc-NRP-1接触。在实施方案中，步骤ii)的中胚层分化培养基。
在实施方案中，中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的细胞与一种或更多种miRNA抑制剂接触，其中一种或更多种miRNA抑制剂抑制在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞中呈现出相对于PSC降低的表达的miRNA。在实施方案中，miRNA抑制剂抑制选自由以下组成的组的miRNA：miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3p和miR-185-5p。在实施方案中，经历中胚层诱导的细胞与miR-221-3p、miR-1271-5p和miR-559，优选地miR-221-3p的miRNA抑制剂中的一种或更多种接触。
在实施方案中，中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的细胞与一种或更多种miRNA模拟物接触，其中一种或更多种miRNA模拟物模拟在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞中呈现出相对于PSC增加的表达的miRNA。在实施方案中，miRNA模拟物模拟选自由以下组成的组的miRNA：miR-330-5p、miR-145-5p、miT-214-3p和miR-497-5p。在实施方案中，经历中胚层诱导的细胞与miR-330-5p、miR-145-5p和miT-214-3p，优选地miR-330-5p的miRNA模拟物中的一种或更多种一起培养。在实施方案中，中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的细胞与miR-214模拟物接触。
在实施方案中，分离的中胚层细胞在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力。
在实施方案中，所述方法还包括：诱导分离的中胚层细胞经历内皮分化，其中内皮诱导包括：在包含BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基中培养分离的中胚层细胞持续约6天-8天；和从被诱导以经历内皮分化的细胞中分离内皮集落形成样(ECFC样)细胞，其中ECFC样细胞是CD31+NRP-1+，并且呈现出鹅卵石形态。
在实施方案中，分离的ECFC样细胞的特征还在于CD144+、KDR+和α-SMA-表达中的一种或更多种。
在实施方案中，内皮诱导步骤在不存在以下的一种或更多种的情况下进行：共培养细胞、拟胚体形成和外源TGF-β抑制。
在实施方案中，分离的ECFC样细胞在不存在共植入细胞的情况下在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力。
在一个方面中，提供了分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体。分离的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力，并且其中分离的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞在体外衍生自人多能干细胞。
在实施方案中，KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞是SSEA5-。在实施方案中，KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞相对于PSC呈现出一种或更多种侧板-胚外(lateral plate-extra-embryonic)中胚层标志物的增加的表达，其中侧板-胚外中胚层标志物选自BMP4、WNT5A、NKX2-5和HAND1。在实施方案中，KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞相对于PSC缺少一种或更多种轴向中胚层标志物、近轴中胚层标志物和/或中间中胚层标志物的增加的表达，其中轴向中胚层标志物选自CHIRD和SHH，近轴中胚层标志物选自PAX1、MEOX1和TCF15，并且中间中胚层标志物选自GOSR1、PAX2和PAX8。
在一个方面中，提供了根据本文提供的方法获得的分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体。
在一个方面中，提供了根据本文提供的方法获得的分离的人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的群体。
在一个方面中，提供了包含本文提供的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的药物组合物。
在一个方面中，提供了包含本文提供的内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的药物组合物。
在本公开内容的另一个方面中，提供了用于在有相应需要的受试者中移植的方法，所述方法包括向受试者提供如本文描述的分离的细胞的群体。
在本公开内容的另一个方面中，提供了治疗需要上皮修复的受试者的方法，所述方法包括向受试者提供治疗有效量的如本文描述的细胞的群体。
在本公开内容的另一个方面中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含通过如本文描述的方法获得的中胚层细胞和/或ECFC样细胞。
在本公开内容的另一个方面中，提供了检查测试剂用于修饰细胞活性的能力的方法，所述方法包括：
-将如本文描述的细胞的群体的至少一个细胞暴露于测试剂；和
-观察测试剂对细胞生长和细胞存活力中的一种或更多种的影响。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
在以下其中参考所附附图的详细描述中，本公开内容的特征将变得更加明显，在附图中：
图1A-图1G图示出了在第4天(D4)KDR+中胚层细胞(KNA+中胚层)内的NCAM和APLNR共表达细胞产生具有ECFC能力的NRP-1+CD31+内皮细胞。
图1A描绘了一步式、2D、血清和无饲养物的中胚层谱系分化方案的示意图。
图1B描绘了用于第4天分化的hiPSC的分选策略。
图1C描绘了用于分选KDR+NCAM+APLNR+(K+N+A+)细胞、KDR+NCAM+APLNR-(K+N+A-)细胞和KDR+NCAM-APLNR-(K+N-A-)细胞并进一步分化和检查NRP-1+CD31+ECFC样细胞的出现的策略。
图1D描绘了分选的K+N+A+、K+N+A-和K+N-A-中胚层子集的检查，该子集进一步向ECFC样谱系分化持续另外的9天(3天+9天，总共12天)，在分化的第8天、第10天和第12天出现NRP-1+CD31+细胞(三个最左侧的图)；示出了第12天单层的形态(从左侧第四个图)，示出了α-SMA表达(从左侧第五个图)；并且示出了CD31和CD144内皮标志物的表达(最右侧的图)。
图1E描绘了示出hiPSC-ECFC样细胞，K+N+A+-、K+N+A--和K+N-A--中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞呈现出不同水平的克隆增殖潜力的柱状图。
图1F描绘了hiPSC-ECFC样细胞，K+N+A+-、K+N+A--和K+N-A--中胚层来源的NRP-1+CD31+的体内人血管形成的各种质量的图像。
图1G描绘了示出hiPSC-ECFC样细胞、K+N+A+-ECFC样细胞、K+N+A--EC和K+N-A--EC形成各种量的功能性hCD31+血管的柱状图。
图2A-图2C图示出了使用本文提供的方案分化持续3天-5天的人iPS细胞产生表达中胚层标志物且缺少典型的内皮表面标志物表达的细胞。
图2A图示出了在KDR+NCAM+中胚层子集中发现APLNR+细胞，但在KDR-NCAM-子集中未发现APLNR+细胞。
图2B描绘了在分化的第3天、第4天和第5天KDR+细胞的水平。
图2C描绘了在第4天分化的细胞中内皮标志物(CD31、NRP-1和CD144)表达的水平。
图3A-图3B图示出了在没有SSEA5耗竭的情况下，分离的D4KNA+中胚层细胞的直接体内分化形成了稳健的人血管，并且产生了内胚层来源的细胞样衍生物。
图3A描绘了用于第4天分化的hiPSC的分选策略。
图3B示出了分选的APLNR-中胚层细胞在体内植入2个月后产生畸胎瘤(左图)，并且APLNR+中胚层细胞形成填充有鼠宿主红细胞的稳健的体内人血管(右图；蓝色空心箭头)伴随着内胚层来源的细胞样衍生物(右图；粉色实心箭头)。
图4A-图4D图示出了D4SSEA5耗竭的KNA+中胚层细胞的直接体内分化形成了稳健的人血管，而不产生畸胎瘤或内胚层来源的细胞样衍生物。
图4A描绘了用于第4天分化的hiPSC的分选策略。
图4B描述了由SSEA5-KNA+细胞形成稳健的功能性体内血管(蓝色箭头，左图)并且不存在SSEA5-KNA-细胞形成的稳健的功能性体内血管(白色箭头，右图)。
图4C描绘了图示由SSEA5-KNA+细胞和SSEA5-KNA-细胞在体内形成功能性血管的柱状图。
图4D描绘了在植入SSEA5-KNA+细胞后8天在体内形成的NRP-1+CD31+血管的图像。
图5A-图5C图示了D4SSEA5耗竭的KNA+中胚层细胞显示出典型地富集在侧板/胚外中胚层细胞中的转录物，并且在体外ECFC分化后呈现出具有ECFC能力的NRP-1+CD31+细胞的增强的形成。
图5A描绘了SSEA5-KNA+细胞和hiPSC中的侧板-胚外中胚层标志物、轴向中胚层标志物、近轴中胚层标志物和中间中胚层标志物的基因表达分析。
图5B描绘了分选的SSEA5-KNA+细胞，其进一步向ECFC谱系分化持续另外的8天(4+8，总共12天)；在第12天，SSEA5-KNA+细胞产生与衍生自hiPSC(没有第4天的分选步骤)的NRP-1+CD31+细胞相比≥3倍更多的NRP-1+CD31+细胞(左侧柱状图)；源自SSEA5-KNA+中胚层细胞的NRP1+CD31+细胞的单层的形态缺少α-SMA表达(中图)；并且还示出了CD31和CD144内皮标志物(右图)在源自自SSEA5-KNA+中胚层细胞的NRP1+CD31+细胞中均匀共表达。
图5C描绘了示出hiPSC-ECFC样细胞、SSEA5-KNA+中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞和SSEA5-KNA-中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞的克隆增殖潜力的柱状图。
图6A-图6G图示出了Fc-NRP-1通过p130Cas/Pyk2激活介导VEGF-KDR信号传导，并且增强由hiPSC形成SSEA5-KNA+中胚层细胞。
图6A描绘了内皮细胞中NRP-1、KDR、Fc-NRP-1、NRP-1-B和VEGF165功能的示意图。
图6B描绘了示出KDR磷酸化的蛋白印迹；在VEGF刺激的组中观察到KDR磷酸化，并且与对照处理的细胞相比，Fc-NRP-1二聚体处理增加KDR的磷酸化；在NRP-1-B处理的细胞中观察到降低的磷酸化。
图6C描绘了示出p130Cas/Pyk2磷酸化的蛋白印迹；与NRP-1-B处理的细胞相比，在Fc-NRP-1二聚体处理的细胞中观察到增加的p130Cas/Pyk2磷酸化。
图6D描绘了在hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞之间的各种VEGF-A同种型的基因表达分析。
图6E描绘了示出在培养基中存在或不存在添加的VEGF165的情况下，在分化的第2天和第4天从hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞的VEGF产生的柱状图。
图6F描绘了示出在Fc-NRP-1二聚体的存在下中胚层谱系分化方案的示意图。
图6G描绘了示出与Fc-NRP-1未处理的细胞相比，分化hiPSC的二聚体Fc-NRP-1处理导致SSEA5-KNA+中胚层细胞的产生多于2倍的增加的柱状图。
图7A-图7E图示出了特定的miRNA模拟物和抑制剂增强来自hiPSC的SSEA5-KNA+中胚层产生。
图7A描绘了相对于hiPSC(Y轴上由0指示)，在第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中各种miRNA的表达的倍数变化。
图7B描绘了示出中胚层谱系分化方案的示意图，该中胚层谱系分化方案涉及使经历中胚层诱导的细胞与特定的miRNA模拟物或抑制剂或模拟物和抑制剂两者(3m3i)或模拟物/抑制剂对照接触。
图7C描绘了示出使用图7B的方案获得的第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞的频率的柱状图。
图7D描绘了示出使用图7B的方案获得的第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中各种miRNA(x轴)的相对表达(y轴)的柱状图。
图7E描绘了示出使用图7B的方案获得的第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中各种miRNA(x轴)的相对表达(y轴)的柱状图。
图8A-图8D图示出了miR-214-3p靶向分化的hiPSC中的CLDN6并且增强SSEA5-KNA+中胚层细胞的形成。
图8A描绘了示出miR-214(左侧)及其推定的靶CLDN6(右侧)在hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞中的相对表达水平(y轴)的柱状图。
图8B描绘了示出当miR-214在经历中胚层诱导的细胞中过表达时SSEA5-KNA+中胚层细胞和GFP报道对照载体(vector)的产生(y轴)的柱状图。
图8C描绘了荧光素酶报道测定的结果，该结果证实miR-214直接调节野生型(WT)CLND6的表达。
图8D描绘了hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞之间的差异基因表达分析的结果。
公开内容的详述
本公开内容通常涉及用于将多能细胞(诸如例如，人胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)(统称为人多能干细胞(hPSC))在体外分化成谱系特异性中胚层细胞，并且任选地，进一步将谱系特异性中胚层细胞分化成内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的方法。出乎意料地，本发明人已经发现使用本文提供的方法产生和分离的中胚层细胞可以在体内产生血管。在本文提供的方法的各种实施方案中，在不存在共培养细胞和/或共植入细胞的情况下，产生的ECFC样细胞还可以在体内生长成血管。
I：定义
如本说明书中使用的某些术语的定义在下文提供。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与由本公开内容所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。
如本文使用的，“多能细胞”指的是具有分化成任何细胞类型的潜力的细胞，所述任何细胞类型例如三个胚层：内胚层、中胚层或外胚层中的任一个的细胞。
如本文使用的，“胚胎干细胞”、“ES细胞”或“ESC”指的是源自早期胚胎的多能干细胞。
如本文使用的，“诱导的多能干细胞”、“iPS细胞”或“iPSC”指的是一种多能干细胞的类型，其通过将一种或更多种重编程因子引入到非多能细胞中或使非多能细胞与一种或更多种重编程的因子接触，而由所述非多能细胞制备，所述非多能细胞诸如，例如成体体细胞或终末分化的细胞，诸如例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等等。
如本文使用的，“中胚层分化培养基”指的是支持和/或增强多能细胞分化成中胚层谱系的细胞的任何营养培养基。
如本文使用的，“中胚层”指的是在早期胚胎中三个主要胚层的中间层(其他两层为外胚层和内胚层)。存在中胚层的四种组分或类别，包括轴向中胚层、近轴中胚层、中间中胚层和侧板/胚外中胚层。中胚层包括“中胚层细胞(mesoderm cell)”，也被称为“中胚层的细胞(mesodermal cell)”。
如本文使用的，“miRNA模拟物”指的是被设计成“模拟”天然/内源miRNA活性的双链RNA寡核苷酸。miRNA模拟物补充内源微RNA活性，以发现单独的微RNA的功能作用。
如本文使用的，“miRNA抑制剂”指的是被设计成“抑制”天然/内源miRNA活性的单链RNA寡核苷酸。miRNA抑制剂抑制内源miRNA的功能，增加靶基因的表达，并且减弱表型的呈现。
如本文使用的，“内皮分化培养基”指的是支持和/或增强多能细胞分化成内皮谱系的细胞的任何营养培养基。
如本文使用的，“内皮生长培养基”指的是适合于维持内皮谱系的细胞的任何培养基。
如本文使用的，“内皮集落形成细胞”和“ECFC”指的是在血液中发现的原代内皮细胞，其显示出从单个细胞增殖和形成内皮集落的潜力，并且在不存在共植入细胞或共培养细胞的情况下具有在体内形成血管的能力。
如本文使用的，“脐带血ECFC”和“CB-ECFC”指的是源自脐带血的原代ECFC。
如本文使用的，“内皮集落形成细胞样细胞”和“ECFC样细胞”指的是在体外由人多能干细胞(hPSC)产生的非原代内皮细胞。ECFC样细胞具有ECFC的各种特性，至少包括从单个细胞增殖和形成内皮集落的潜力，并且在不存在共植入细胞或共培养细胞的情况下具有在体内形成血管的能力。
如本文使用的，术语“增殖潜力(proliferation potential)”和“增殖的潜力(proliferative potential)”指的是当提供适当的生长促进信号时细胞分裂的能力。
如本文使用的，术语“高增殖潜力”、“高增殖的潜力”和“HPP”指的是单个细胞在14天细胞培养中分裂成多于约2000个细胞的能力。优选地，HPP细胞具有自我补充的能力。例如，本文提供的HPP-ECFC样细胞具有自我补充的能力，这意味着HPP-ECFC样细胞可以在体外再次铺板时在二级HPP-ECFC样集落内产生一种或更多种HPP-ECFC样细胞。在一些实施方案中，HPP-ECFC样细胞还可以具有在体外再次铺板时在二级HPP-ECFC样集落内产生一种或更多种LPP-ECFC样细胞簇和ECFC样细胞簇的能力。
如本文使用的，术语“低增殖潜力”、“低增殖的潜力”和“LPP”指的是单个细胞在14天细胞培养中分裂成约51个-2000个细胞的能力。在一些实施方案中，LPP-ECFC样细胞还可以具有产生ECFC样细胞簇的能力。然而，LPP-ECFC样细胞不具有产生二级LPP-ECFC样细胞或HPP-ECFC样细胞的能力。
II：将多能细胞分化成中胚层细胞的方法。
在一个方面中，本文提供的方法涉及至少三个步骤：
A.提供多能干细胞(PSC)；
B.诱导多能干细胞以经历中胚层分化，其中中胚层诱导包括：i)在包含激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基中培养多能干细胞持续约24小时；和ii)此后约每24小时-48小时用包含BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基替换步骤i)的培养基，持续约72小时；和
C.从被诱导以经历分化的细胞中分离中胚层细胞，其中中胚层细胞的分离包括：i)分选中胚层细胞以选择KDR+NCAM+APLNR+细胞。
在各种实施方案中，所述方法包括以下另外的步骤中的一个或更多个：
D.分选中胚层细胞以选择SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞。
E.将经历中胚层诱导的细胞与Fc-NRP-1一起培养；
F.将经历中胚层诱导的细胞与一种或更多种miRNA抑制剂、一种或更多种miRNA模拟物或其组合一起培养；
G.诱导分离的中胚层细胞分化成内皮谱系的细胞；和
H.从分化的内皮谱系的细胞中分离ECFC样细胞。
上述方法中的每个步骤还在本文的下文中被描述。
A.多能干细胞培养
在一个方面中，提供了用于在体外从多能细胞产生分离的中胚层细胞和/或ECFC样细胞的群体的方法。适合于在本公开内容的方法中使用的多能细胞可以从多种来源获得。例如，合适的多能细胞的一种类型是源自囊胚的内细胞团的胚胎干(ES)细胞。用于获得各种类型的ES细胞的方法是熟知的，所述ES细胞例如小鼠的、恒河猴的、普通狨猴的和人类的。在该方法中使用的ES细胞的来源可以是例如一个或更多个已建立的ES细胞系。各种ES细胞系是已知的，并且用于它们的生长和增殖的条件已经被定义。本文预期，几乎任何ES细胞或ES细胞系可以用于本文公开的方法。在一个实施方案中，多能细胞是通过重编程体细胞衍生的诱导的多能干(iPS)细胞。诱导的多能干细胞已经通过各种已知的方法获得。本文预期，几乎任何iPS细胞或细胞系可以用于本文公开的方法。在其他实施方案中，多能细胞是通过体细胞核转移衍生的胚胎干细胞，在体细胞核转移中供体核被转移到无梭形卵母细胞中。用于通过核转移产生干细胞的各种方法是已知的。本文预期，通过体细胞核转移衍生的几乎任何ES细胞或细胞系可以用于本文公开的方法。
在一个实施方案中，多能细胞在适合于将多能细胞维持在未分化状态的条件下被培养。用于将多能细胞在体外维持即在未分化状态的方法是熟知的。在一个实施方案中，多能细胞在适合于将多能细胞维持在未分化状态的条件下被培养持续约两天。例如，在下文的实施例中，hES细胞和hiPS细胞在37℃和5％CO2下被维持在10cm2组织培养皿中的MatrigelTM上、mTeSR1完全培养基中持续约两天。
可以使用用于培养和/或维持多能细胞的另外的和/或可选择的方法。例如，作为基础培养基，TeSR、mTeSR1αMEM、BME、BGJb、CMRL 1066、DMEM、Eagle MEM、Fischer培养基、Glasgow MEM、Ham、IMDM、改进的MEM Zinc Option、培养基199和RPMI 1640或其组合中的任一种可以用于培养和/或维持多能细胞。
使用的多能细胞培养基可以含有血清，或者它可以是无血清的。无血清指的是不包含未加工的或未纯化的血清的培养基。无血清培养基可以包括纯化的血液来源的组分或动物组织来源的组分，诸如例如生长因子。使用的多能细胞培养基可以含有一种或更多种血清的替代物，诸如例如敲除血清替代物(KSR)、化学上确定的脂质浓缩物(Gibco)或glutamax(Gibco)。
用于分裂或传代多能细胞的方法是熟知的。例如，在下文的实施例中，在将多能细胞铺板后，在第2天、第3天和第4天更换培养基，并且在第5天传代细胞。通常，在培养容器填充有(即，70％-100％汇合)后，通过任何适合于解离的方法将容器中的细胞团分裂成聚集的细胞或单个细胞，并且将聚集的细胞或单个细胞转移到新的培养容器中用于传代。细胞“传代”或“分裂”是一种熟知的技术，用于保持细胞存活并在体外使细胞生长持续延长的时间段。
B.多能细胞定向分化成中胚层细胞。
在公开的方法的一个方面中，体外多能细胞被诱导以经历中胚层分化，也被称为“中胚层诱导”的步骤。用于诱导多能细胞分化成中胚层谱系的细胞的各种方法，包括培养条件，是本领域已知的。在本文提供的方案中，优选的是在化学上确定的培养基中诱导多能细胞的分化。例如，Stemline II无血清造血扩增培养基可以用作基础中胚层分化培养基。在本文提供的方案中，各种生长因子用于促进多能细胞分化成中胚层谱系的细胞。例如，激活素A、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和骨形态发生蛋白4(BMP-4)被包含在化学上确定的分化培养基中，以诱导多能细胞分化成中胚层谱系的细胞。
在本文提供的方案的一个实施方案中，在基础培养基(例如mTeSR1)中培养2天(-D2)后，通过使细胞与包含有效量的激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基接触持续24小时，多能细胞的分化被引导向中胚层谱系。在分化24小时后，通过将中胚层分化培养基替换为包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基，从培养物中去除激活素A。所谓“有效量”，我们意指有效促进多能细胞分化成中胚层谱系的细胞的量。包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基的进一步替换可以每1天-2天进行持续约3天(即至D4)。
激活素A是TGF-B超家族的成员，已知它经由多种途径激活细胞分化。激活素A促进中胚层特化的激活，但对内皮特化和随后的内皮扩增不是关键的。在一个实施方案中，中胚层分化培养基包含约5ng/mL-25ng/mL的浓度的激活素A。在一个优选的实施方案中，中胚层分化培养基包含约10ng/mL的浓度的激活素A。
骨形态发生蛋白-4(BMP-4)是一种腹侧中胚层诱导物，其在成人骨髓(BM)中表达并且参与调节造血祖细胞的增殖和分化潜力。此外，BMP-4可以调节人胎儿、新生儿和成人造血祖细胞中的早期造血细胞发育。在一个实施方案中，中胚层分化培养基包含约5ng/mL-25ng/mL的浓度的BMP-4。在一个优选的实施方案中，中胚层分化培养基包含约10ng/mL的浓度的BMP-4。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种参与胚胎循环系统形成和血管生成的信号传导蛋白。在体外，VEGF可以刺激内皮细胞有丝分裂和细胞迁移。在一个实施方案中，中胚层分化培养基包含约5ng/mL-50ng/mL的浓度的VEGF。在一个优选的实施方案中，中胚层分化培养基包含约10ng/mL的浓度的VEGF。在一个特别优选的实施方案中，中胚层分化培养基包含约10ng/mL的浓度的VEGF165。
碱性成纤维细胞生长因子，也被称为bFGF或FGF-2，参与了多种生物过程，包括肢体和神经系统发育、伤口愈合和肿瘤生长。bFGF已经被用于支持人胚胎干细胞独立于饲养物的生长。在一个实施方案中，中胚层分化培养基包含约5ng/mL-25ng/mL的浓度的FGF-2。在一个优选的实施方案中，中胚层分化培养基包含约10ng/mL的浓度的FGF-2。
本文公开的方法不需要与支持细胞诸如例如OP9基质细胞共培养，不需要拟胚体(EB)形成并且不需要外源TGF-β抑制。
C.分离KDR+NCAM+APLNR+(KNA+)中胚层细胞
在一个方面中，KDR+NCAM+APLNR+细胞被从诱导以经历中胚层分化的细胞的群体选择和分离。用于选择具有一个或更多个特定的分子标志物的细胞的方法是本领域已知的。例如，细胞可以基于通过流式细胞术的各种转录物的表达来选择，包括荧光激活的细胞分选或磁激活的细胞分选。
在一个实施方案中，KDR+NCAM+APLNR+细胞被从如本文描述的经历中胚层分化的细胞的群体，在分化的第4天选择。在一个优选的实施方案中，KDR+细胞被从经历中胚层分化的细胞的群体选择，并且然后从所选择的KDR+细胞中，选择NCAM+APLNR+细胞，从而产生KDR+NCAM+APLNR+细胞的群体。
在下文的实施例中，中胚层细胞在分化4天后收获并且制成单细胞悬浮液。将细胞计数，并且准备用于用针对KDR、NCAM和APLNR的抗人抗体的抗体染色。使用流式细胞术对KDR+NCAM+APLNR+细胞进行门控/选择和分选。
本文中鉴定的中胚层子集显示出与已知的人中胚层的子集一致的基因产物。这些特定的中胚层子集先前没有被注意到会产生人ECFC。
在一个实施方案中，所选择的细胞具有在体内血管形成的能力。该结果是预料不到的。特定类型的中胚层在早期人类发育中表达，并且预测产生成血管细胞(进一步分化成内皮细胞的第一种中胚层来源的细胞)的那些细胞源自胚外/侧板中胚层。因此，技术人员预测中胚层细胞将在特定的时间在特定的位置分化，以经由血管生成形成第一血管。技术人员不会预测中胚层细胞将显示出在成年免疫缺陷小鼠中产生ECFC和形成人血管的能力，至少是因为不存在在成年小鼠中存在的中胚层细胞(它们在胚胎发生期间已经决定了谱系命运，并且现在仅由它们特化的谱系后代来表示)。
D.SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞的选择
在一个实施方案中，SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞被从如本文描述的经历中胚层分化的细胞的群体，在分化的第4天选择。在一个优选的实施方案中，SSEA5-KDR+细胞被从经历中胚层分化的细胞的群体选择，并且然后从所选择的SSEA5-KDR+细胞中，选择NCAM+APLNR+细胞，从而产生SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞的群体。
本发明人发现，用SSEA5抗体阴性选择第4天分化的细胞允许从第4天分化的细胞中识别和随后去除未分化的或部分分化的hiPSC混合物。这是通过在同一动物中在体内进行SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞和KDR+NCAM+APLNR+细胞(不存在对SSEA5的阴性选择)的植入来实现的。一个腹侧接受SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞，并且同一动物的另一个腹侧接受KDR+NCAM+APLNR+细胞。植入的KDR+NCAM+APLNR+细胞形成血管和内胚层衍生物，而植入的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞形成血管，并且不形成内胚层和/或畸胎瘤。因此，本文提供的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的一个优点是，它们可以用于在体内实现选择性的ECFC血管形成，而不形成内胚层衍生物。
E.用Fc-NRP-1的中胚层诱导
本发明人预期，刺激经历中胚层诱导的细胞中的KDR信号可以增加中胚层产生。在本文提供的方案的一个实施方案中，在含激活素-A的培养基中分化24小时后，将中胚层分化培养基用包含有效量的Fc-NRP-1、BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基替换。所谓“有效量”，我们意指有效促进多能细胞分化成中胚层谱系的细胞的量。包含有效量的Fc-NRP-1、BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基的进一步替换可以例如每1天-2天进行持续约3天(即至D4)。本发明人发现，将Fc-NRP-添加到中胚层诱导方案中改进了中胚层产生。此结果是令人惊讶的，至少是因为NRP-1(Fc-NRP-1充当NRP-1的替代物)和VEGF165(结合至Fc-NRP1或内源NRP-1的配体)未在经历中胚层诱导的细胞中表达。已知激活KDR信号的其他分子是VEGF165和NRP-1。然而，本发明人的研究示出，这些分子中没有一个在经历4天中胚层分化的细胞中内源性地表达。本发明人鉴定的一种可以激活KDR信号从而增强中胚层形成的可溶性分子(其可以用于补充培养基)有利于增加ECFC中胚层细胞的产生。
F.用miRNA抑制剂和/或模拟物的中胚层诱导。
在本文提供的方案的一个实施方案中，被诱导以经历中胚层分化的细胞被暴露于一种或更多种miRNA抑制剂、模拟物或其组合。本发明人已经鉴定了一组在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞中下调的miRNA(miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR-543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3p和miR-185-5p)，和一组在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞中被鉴定为上调的miRNA(miR-330-5p、miR-145-5p、miR-214-3p和miR-497-5p)。本发明人已经发现，用一种或更多种模拟在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞中上调的特定的miRNA的剂转染经历中胚层诱导的细胞增加了由PSC产生的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞的频率。本发明人已经发现，用一种或更多种抑制在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞中被识别为下调的特定的miRNA的剂转染经历中胚层诱导的细胞增加了由PSC产生的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞的频率。本发明人还已经发现，用特定的miRNA模拟物和抑制剂的组合转染经历中胚层诱导的细胞增加了由PSC产生的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞的频率。
在本文提供的方案的一个实施方案中，在基础培养基中培养2天(-D2)后，通过使细胞与包含有效量的激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基接触持续24小时，多能细胞的分化被引导向中胚层谱系。在此第一个24小时(即D0)期间，将细胞用4种处理之一转染：i)3种miRNA模拟物；ii)3种miRNA抑制剂；iii)3种miRNA模拟物和3种miRNA抑制剂；或iv)对照。在分化24小时后，通过将中胚层分化培养基用包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基替换，从培养物中去除激活素A。在中胚层诱导的第2天，将细胞用相同的处理再次转染。包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基的进一步替换可以每1天-2天进行持续约3天(即至D4)。在第4天，将细胞分选和分离，如上文描述的。
G.分离的中胚层细胞定向分化成内皮谱系的细胞。
在所公开的方法的一个方面中，分离的中胚层细胞被诱导以经历内皮分化。用于诱导中胚层细胞分化成内皮谱系的细胞的各种方法，包括培养条件，是本领域已知的。在本文提供的ECFC样细胞方案中，优选的是在化学上确定的培养基中诱导内皮细胞的分化。例如，Stemline II无血清造血扩增培养基可以用作基础内皮分化培养基。在本文提供的ECFC样细胞方案中，各种生长因子用于促进多能细胞分化成内皮谱系的细胞，包括ECFC样细胞。例如，VEGF、FGF-2和BMP-4被包含在化学上确定的分化培养基中，以诱导分离的中胚层细胞分化成内皮谱系的细胞，包括ECFC样细胞。
在本文提供的ECFC样细胞方案的一个实施方案中，分离的中胚层细胞用包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基培养。所谓“有效量”，我们意指有效促进分离的中胚层细胞分化成内皮谱系的细胞，包括ECFC样细胞的量。包含有效量的BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基的进一步替换可以每1天-2天进行。
本文公开的方法不需要与支持细胞诸如例如OP9基质细胞共培养，不需要拟胚体(EB)形成并且不需要外源TGF-β抑制。
H.从分化的内皮细胞分离ECFC样细胞
在本文公开的方法的一个实施方案中，CD31+NRP-1+细胞被从经历内皮分化的细胞的群体选择和分离。例如，在一个实施方案中，CD31+NRP-1+细胞从如本文描述的经历内皮分化的细胞的群体，在分化的第10天、第11天或第12天选择。在一个优选的实施方案中，CD31+NRP-1+细胞从经历内皮分化的细胞的群体，在分化的第12天选择。本发明人已经发现，第12天的经历内皮分化的细胞的群体相对于在分化的其他天存在的细胞群体包含更高百分比的NRP-1+细胞。
在下文的实施例中，在分化12天后收获贴壁EC并将其制成单个细胞悬浮液。将细胞计数，并且准备用于用抗人CD31、CD144和NRP-1的抗体染色。使用流式细胞术对CD31+CD144+NRP-1+细胞进行分选和选择。
在一个实施方案中，所选择的细胞呈现出鹅卵石形态，这是EC(包括ECFC)的典型特征。
在一个实施方案中，所选择的细胞在不存在共培养细胞和/或共植入细胞的情况下具有在体内血管形成的能力，这是ECFC的典型特征。
III.分离的细胞群体
分离的中胚层细胞群体
在一个实施方案中，提供了分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体。在一个实施方案中，所提供的纯化的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的人细胞群体是使用用于从本文公开的hPSC产生中胚层细胞的体外方法产生的。分离的群体的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞具有产生ECFC的能力和在体内血管形成的能力。在一个实施方案中，群体的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的特征还在于相对于PSC，一种或更多种侧板-胚外中胚层标志物(例如BMP4、WNT5A、NKX2-5和/或HAND1)的增加的表达。在一个实施方案中，群体的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的特征还在于相对于PSC，缺少一种或更多种轴向中胚层标志物(例如CHIRD和/或SHH)、近轴中胚层标志物(例如PAX1、MEOX1和TCF15)和/或中间中胚层标志物(例如GOSR1、PAX2和PAX8)的增加的表达。
在一个实施方案中，提供了分离的人SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体。在一个实施方案中，所提供的纯化的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的人细胞群体是使用用于从本文公开的hPSC产生中胚层细胞的体外方法产生的。分离的群体的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞具有在体内ECFC形成和血管形成的能力。在一个实施方案中，群体的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的特征还在于一种或更多种侧板-胚外中胚层标志物(例如BMP4、WNT5A、NKX2-5和/或HAND1)相对于PSC，的增加的表达。在一个实施方案中，群体的SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的特征还在于相对于PSC，缺少一种或更多种轴向中胚层标志物(例如CHIRD和/或SHH)、近轴中胚层标志物(例如PAX1、MEOX1和TCF15)和/或中间中胚层标志物(例如GOSR1、PAX2和PAX8)的增加的表达。
在一个优选的实施方案中，分离的中胚层细胞群体基本上是纯的。在一个实施方案中，在中胚层分化的第4天总活细胞的28％是KDR+NCAM+APLNR+。在一个实施方案中，在中胚层分化的第4天总活细胞的18％是SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+。
分离的ECFC样细胞群体
在一个实施方案中，提供了分离的人NRP-1+/CD31+ECFC样细胞的群体。在一个实施方案中，所提供的纯化的NRP-1+/CD31+ECFC样细胞的人细胞群体是使用用于从本文公开的hPSC产生ECFC样细胞的体外方法产生的。
在下文的实施例中，本文公开的方法用于从分离的中胚层细胞的子集产生纯化的NRP-1+和CD31+ECFC样细胞的人细胞群体。分离的群体的ECFC样细胞呈现出鹅卵石形态，并且具有在体内血管形成的能力，而无需共培养细胞和/或共植入细胞。在一个实施方案中，群体的ECFC样细胞的特征还在于CD144+、KDR+和α-SMA-中的一种或更多种。
在一个实施方案中，从分离的中胚层细胞产生的群体中的至少一些ECFC样细胞具有高增殖潜力，该高增殖潜力与使用本发明人先前的hPSC-ECFC样细胞方案在体外产生的ECFC的增殖潜力类似。
在一个优选的实施方案中，分离的ECFC样细胞群体基本上是纯的。
在本文的实施例中，由所公开的中胚层细胞产生的ECFC样细胞群体中的细胞当在体内被植入到哺乳动物中时，甚至在不存在支持细胞的情况下，可以形成血管。
用于测量体内血管形成的各种技术是已知的并且可以被使用。
在不存在外源支持细胞的情况下在体内形成血管的能力是使用本文公开的方法产生的细胞为ECFC的一个指标。
IV.本文公开的中胚层细胞和/或ECFC样细胞的用途
与先前描述的已知的中胚层细胞系和其他已知的分离的中胚层细胞相比，使用本文公开的方法产生的中胚层细胞可以在体外产生，并且用于在体内形成血管组织，用于各种临床应用，如下文描述的。
与为原代细胞的ECFC相比，使用本文公开的方法产生的ECFC样细胞可以在体外以可以用于各种临床应用的体积产生，如下文描述的。
A.疗法
在一个方面中，本文提供了适合于细胞移植、细胞补充和/或细胞或组织替代的方法、细胞和组合物。方法可以包括向有相应需要的受试者提供治疗有效量的根据本文提供的方法衍生的中胚层细胞和/或ECFC样细胞，由此提供中胚层细胞和/或ECFC样细胞治疗受试者。所谓“治疗有效量”，我们意指有效治疗需要上皮修复的受试者的量。在优选的实施方案中，上皮修复是血管上皮修复。本文提供的细胞和/或组合物可以以允许中胚层细胞和/或ECFC样细胞移植或迁移到预期的组织部位，并重构或再生功能缺陷区域(诸如例如血管)的方式被施用至受试者。
适合于使用本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞接受疗法的受试者包括具有内皮功能障碍和/或各种各样的损伤的那些受试者。例如，具有心血管疾病、心肌梗死、心卒中或外周动脉疾病(PAD)的受试者可以是用于使用本公开内容的中胚层细胞和/或ECFC样细胞接受疗法的合适的受试者。具有肺或肾脏疾病或损伤的受试者可以是用于使用本公开内容的中胚层细胞和/或ECFC样细胞接受疗法的合适的受试者。在优选的实施方案中，发展为严重肢体缺血(CLI)的PAD患者可以是用于使用本公开内容的中胚层细胞和/或ECFC样细胞接受疗法的合适的受试者。
在一个实施方案中，中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以以适合于人类施用的药物组合物的形式被提供给受试者。例如，组合物可以包含一种或更多种药学上可接受的载体、缓冲剂或赋形剂。组合物还可以包含一种或更多种促进中胚层细胞和/或ECFC样细胞移植的成分或为受试者提供一种或更多种促进中胚层细胞和/或ECFC样细胞移植的成分。例如，药物组合物还可以包含一种或更多种生长因子或细胞因子(例如，血管生成细胞因子)或为受试者提供一种或更多种生长因子或细胞因子(例如，血管生成细胞因子)，其促进移植细胞的存活和/或移植，促进血管生成，调节细胞外或组织间隙基质的组成，和/或向移植部位募集其他细胞类型。
在一个实施方案中，药物组合物可以根据提供适当的无菌性和稳定性的标准方法来配制、生产和储存。
例如，在一个实施方案中，本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以被直接注射到缺少足够的血液流动的组织中(如由医师确定的)。在一个实施方案中，本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以悬浮在包含胶原、纤连蛋白或合成材料的基质中，并且中胚层细胞和/或ECFC样细胞的该凝胶状悬浮液可以被直接注射到缺少足够的血液流动的组织中。被注射到组织中的中胚层细胞和/或ECFC样细胞的浓度可以变化，例如从约10,000个细胞/微升至约100,000个细胞/微升的递送媒介物或基质材料。在一些组织中，细胞可以在单一时机被递送，恢复足够的血液流动，而其他组织可能需要多次注射和随时间的顺序注射以拯救足够的血液流动。
在将中胚层细胞和/或ECFC样细胞施用至受试者后，如果期望的话，可以评价治疗方法的效果，并且治疗可以根据需要或需求来重复。疗法效果可以通过本领域已知的临床公认的标准来监测，诸如例如，由疤痕组织占据的区域的减少、疤痕组织的血运重建、心绞痛的频率和严重程度；发育压力、收缩压、末期舒张压、受试者活动性和/或生活质量的改进。
ECFC细胞可以拯救眼睛免受低氧和新血管生成。因此，本文预期本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞被用于治疗其中发生低氧和新血管生成的各种眼部疾病，诸如例如早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、中心静脉闭塞或黄斑变性。
还预期，本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以用于包被血管支架内部的至少一部分和任选地在支架放置期间内皮细胞变得被剥除的血管的任何区域。在该情况下，静脉内注射的中胚层细胞和/或ECFC样细胞将结合至损伤的区域，并且使血管再内皮化，以防止血块形成和/或其中放置支架的血管区域的再狭窄。
已知的是，将人类静脉(隐静脉或脐静脉)作为移植物放置到具有狭窄和血液流动阻塞的区域的患者的动脉中，具有随后的狭窄和阻断的血液流动的高发生率。这与在体内血管重塑过程中早期的血管内皮细胞的损失有关。本文预期，本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以被静脉内注射到这样的患者的脉管系统中，以便将植入的移植物再内皮化并保留患者内的血管的功能。
B.测试剂筛选
本文公开的中胚层细胞和/或ECFC样细胞可以用于筛选影响中胚层细胞和/或ECFC样细胞以及由此发育的任何组织的特性的因素(诸如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或环境条件(诸如培养条件或操作)。在一个实施方案中，测试剂，诸如例如药物化合物可以使用本公开内容的中胚层细胞和/或ECFC样细胞来筛选，以确定它们对内皮健康和/或修复的影响。例如，可以进行筛选，这是因为该化合物被设计成对内皮细胞具有药理作用，或者因为被设计成在其他地方具有作用的化合物可以对内皮细胞具有非预期的副作用。在各种实施方案中，本文的中胚层细胞和/或ECFC样细胞特别地可用于测试剂筛选，至少是因为它们在体外从培养的多能细胞中分化。相反，CB-ECFC是从患者血液获得的原代细胞，并且先前已知的分离的中胚层细胞不具有在体内血管形成的能力。筛选测试剂化合物的各种方法是本领域已知的，并且可以与本文公开的中胚层细胞和/或ECFC样细胞一起使用。
例如，筛选测试剂的活性可以包括：i)将本文公开的中胚层细胞和/或ECFC样细胞与单独的或与其他剂组合的测试剂组合；ii)确定相对于未处理的细胞或用对照剂处理的细胞，可以归因于测试剂的中胚层细胞和/或ECFC样细胞的形态、分子表型和/或功能活性的变化；以及iii)将测试剂的效果与观察到的变化相关联。
在一个实施方案中，测试剂对本文提供的中胚层细胞和/或ECFC样细胞的细胞毒性可以通过该剂对中胚层细胞和/或ECFC样细胞的存活力、存活、形态和分子表型和/或受体中的一种或更多种的影响来确定。
在一个实施方案中，中胚层细胞和/或ECFC样细胞的功能可以使用标准测定来评估，以观察中胚层细胞和/或ECFC样细胞的表型或活性。例如，在细胞培养物或体内的分子表达、受体结合中的一种或更多种可以使用本文公开的中胚层细胞和/或ECFC样细胞来评估。
C.试剂盒
在一个实施方案中，预期了用于与本文公开的方法和细胞一起使用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可以包括在一个或更多个密封小瓶中的如本文描述的分化培养基和/或生长培养基。在一个实施方案中，试剂盒可以包括一种或更多种细胞，诸如如本文公开的多能细胞、中胚层细胞和/或ECFC样细胞。在一个实施方案中，试剂盒可以包括一种或更多种miRNA模拟物、一种或更多种miRNA抑制剂或其组合。在一个实施方案中，试剂盒可以包括Fc-NRP-1。在一个实施方案中，试剂盒可以包括用于从多能细胞产生中胚层细胞的使用说明。在一个实施方案中，试剂盒可以包括用于从多能细胞产生ECFC样细胞的使用说明。在一个实施方案中，试剂盒可以包括在合适的容器和包装材料中的用于与本公开内容一起使用的各种试剂。在一个实施方案中，试剂盒可以包括在合适的容器和包装材料中的用于与本公开内容一起使用的一种或更多种对照。
在考虑了以下非限制性实施例后将更全面地理解本公开内容。
实施例
实施例1：材料与方法
hPSC的培养：人胚胎干细胞(hES)细胞系H9(Thomson等人,1998 Science；282:1145-1147)和成纤维细胞衍生的人iPS细胞系(DF19-9-11T)(Yu等人.2009 Science 324:797-801)购自WiCell Research institute(Madison,Wisconsin)。将hES和hiPSC两者在37℃和5％CO2下维持在10cm2组织培养皿中的Matrigel上、mTeSR1完全培养基(Stem CellTechnologies)中。在将细胞铺板后，在第2天、第3天和第4天更换培养基。细胞在第5天传代。将培养基吸出，并且将含有4mL-5mL的分解酶(2mg/mL，Gibco)的培养基添加到板中，并在37℃孵育持续3分钟-5分钟，或直到集落的边缘已经从板升起。将含有分解酶的培养基从板吸出，并且将细胞用DMEM-F12(Gibco)轻轻地洗涤3次，以去除任何残余量的酶。然后利用新鲜培养基使用强力洗涤从板收集集落，并且用5mL一次性移液器刮擦，小心以避免气泡。然后将收集的集落以300x g离心持续5分钟。将上清液吸出，并且将沉淀物重悬于mTeSR1完全培养基中。在传代前，将10cm2组织培养皿用Matrigel包被持续30分钟。将未附着的Matrigel从组织培养皿中去除，并且将7mL的mTeSR1完全培养基添加到培养皿中。将均匀地分布在mTeSR1培养基中的集落添加到每个板中。然后，使用多个左右振荡运动将细胞分散在培养皿中，同时避免任何旋转。检查培养物的生长质量和形态，并且通过如先前描述的进行畸胎瘤形成测定(Broxmeyer等人,2011Blood；117:4773-4777)。
hPSC定向分化成中胚层细胞：在mTeSR1培养基中培养2天(-D2)后，经由在FGF-2、VEGF165和BMP4(10ng/mL)的存在下，添加激活素A(10ng/mL)，将培养物引导向中胚层谱系，持续24小时。在接下来的一天(D1)，将含激活素-A的培养基去除，并且用8mL的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)的Stemline II完全培养基(Sigma)替换。在第3天，将培养基用8ml的新鲜的Stemline II分化培养基替换。在第4天，收集细胞用于通过流式细胞术分选KNA+中胚层细胞或SSEA5-KNA+中胚层细胞。
KNA+中胚层细胞或SSEA5-KNA+中胚层细胞定向分化成EC谱系，包括ECFC样细胞：在第4天，将分选的中胚层细胞(KDR+NCAM+APLNR+或SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+)用8mL的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)的Stemline II完全培养基(Sigma)进一步培养，将该Stemline II完全培养基在第6天、第8天、第10天和第12天替换。在第10天并且在此后，将培养基用10mL的Stemline II分化培养基更换。
流式细胞术：在分化后第12天，使用TrypleE收获贴壁细胞，并且将其在EGM-2培养基中制成单细胞悬浮液。将细胞计数并且制备细胞悬浮液的等分试样用于抗体染色。添加FcR封闭试剂(Miltyni Biotech)以防止抗体的非特异性结合。使用抗人CD31(CD31-FITC，来自BD Pharmingen的克隆WM59)、CD144(CD144-PE，来自ebioscience的克隆16B1)和NRP-1(NRP-1-APC，来自Miltenyi Biotech的克隆AD5-176)抗体，其浓度在使用前滴定。将碘化丙啶(PI，Sigma)添加到细胞悬浮液中用于死细胞染色。细胞表面抗原的流式细胞术检测和细胞分选分别在LSR II和FACS Aria(Becton Dickinson)上进行。补偿由使用脐带血来源的ECFC的单一阳性对照来设置。靶向细胞群体的门控是基于用于每种荧光颜色的荧光减一(fluorescent minus one,FMO)对照来确定的。
分选细胞的细胞培养：将CD31+、CD144+或KDR+和NRP-1+分选细胞以300X g离心持续5分钟，然后再悬浮于50％EGM-2和50％完全Stemline II分化培养基中。为了从分选的群体产生ECFC，将每孔2500个细胞接种在大鼠尾I型胶原包被的12孔板上。在2天后，将培养基吸出，并且将三份的EGM-2和一份的分化培养基添加到培养物中。ECFC集落似乎为紧密的贴壁细胞，并且在第7天呈现出鹅卵石形态。不时地，使用克隆柱从异质细胞群体分离ECFC集落。如先前描述的，进行内皮细胞簇的克隆以分离纯的高度增殖内皮细胞的群体(Yoder等人,2007；Ingram等人,2005)。将汇合的ECFC通过每cm2铺板10,000个细胞作为接种密度来传代，并且将ECFC维持在完全内皮生长培养基(胶原包被的板和cEGM-2培养基)中，其中培养基如先前描述的每隔一天更换(Yoder等人,2007；Ingram等人,2005)。
免疫化学：将ECFC用4％(w/v)多聚甲醛固定持续30分钟，并且用在PBS中的0.1％(v/v)TritonX-100透化持续5分钟。在用10％(v/v)山羊血清封闭持续30min后，将细胞与以下的一级抗体在4℃孵育过夜：抗-CD31(Santa Cruz)、抗-CD144(ebioscience)、抗-NRP-1(Santa Cruz)和抗α-SMA(Chemicon)。将细胞用PBS洗涤，然后与缀合有Alexa-488或Alexa-565(Molecular Probe)的二级抗体一起孵育，并且在用2g/ml DAPI(Sigma-Aldrich)复染后通过共聚焦显微镜可视化。共聚焦图像用Olympus FV1000mpE共聚焦显微镜使用OlympusuplanSApo 60xW/1.2NA/eus物镜来获得。在室温，所有图像被拍摄为Z堆栈，具有单独的10μm厚的切片，并且使用FV10-ASW 3.0查看器分析图像。
小鼠：所有动物程序根据实验室动物护理和使用指南(the Guidelines for theCare and Use of Laboratory Animals)进行，并且由印第安纳大学医学院(IndianaUniversity School of Medicine)的机构动物护理和使用委员会(the InstitutionalAnimal Care and Use Committees)(IACUC)(IACUC协议#10850)批准。使用6周-12周龄的雄性和雌性NOD/SCID小鼠(T-细胞和B-细胞缺陷，受损的补体)用于所有动物研究。将NOD-SCID小鼠在印第安纳大学实验动物资源中心(Indiana University Laboratory AnimalResource Center)(LARC)维持在无特异性病原体的条件下。先前使用该动物模型的工作用于确定获得统计学显著的结果所需要的动物的最小数目(Yoder等人,2007)。先前的研究已经示出，10种基质(一只动物接受两种基质)中有8种植入具有宿主脉管系统的融合物(inosculate)，并且对于统计学显著性，每组需要8种具有功能性血管的基质(4只动物)(Yoder等人,2007)。在向每个实验组分配样品和动物时，不使用随机化的方法。此外，在实验期间和在获取结果两者时研究人员都不是对组分配不知情的。
体内植入/血管形成测定(包括功能测定)：如先前描述的，使用猪皮肤I型胶原用于产生三维(3D)细胞化胶原基质(Critser等人,2010)。简言之，1型胶原凝胶混合物通过以下来制备：将冰冷的猪皮肤胶原溶液、10％v/v人血小板裂解物在0.01N HCL中一起混合，并且用磷酸盐缓冲盐水和0.1N NaOH中和以实现中性pH(7.4)。在通过在37℃，在5％CO2中加温诱导聚合之前，将中和的凝胶混合物(～1.5mg/mL)保持在冰上。将KNA+中胚层细胞或SSEA-KNA+中胚层细胞或SSEA-KNA+来源的NRP-1+CD31+ECFC添加到胶原混合物中至400万个细胞/ml胶原的最终浓度。将含有细胞悬浮液的胶原混合物(250μL)添加到48孔组织培养皿中，并且允许通过在37℃在CO2培养箱中孵育持续30分钟来聚合以形成凝胶。然后在37℃在5％CO2中用500μl的培养基覆盖凝胶持续30min。在离体3D培养1小时后，将细胞化的凝胶植入到如先前描述的6周龄至12周龄的NOD/SCID小鼠的侧面(一个直接解剖的前腹壁皮下软袋，紧密接近宿主脉管系统){Yoder,2007#71}。植入胶原凝胶的外科手术在麻醉和持续供应氧气下进行。缝合切口，并且监测小鼠的恢复。在植入后不同天，通过切除动物中的移植物来回收凝胶，这些动物已经按照批准的IACUC方案被人道地处死。共聚焦荧光成像和免疫组织化学如先前描述的使用H&E和抗人CD31(和NRP-1)染色来进行以检查灌注有小鼠红细胞的人内皮系血管的凝胶。使用附带Spot-KE数字照相机(Diagnostic Instruments)的Leica DM 4000B显微镜(Leica Microsystems)从每个外植体成像hCD31+血管。只有当功能性血管含有至少一个小鼠红细胞时，将功能性血管计数。使用Olympus-FV-1000MPE倒置共聚焦/2P系统检查NRP-1+CD31+血管。
基因和miRNA表达分析：逆转录酶(RT)反应在GeneAmp PCR 9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。mRNA RT反应使用Transcriptor Univessal cDNA Master(Roche)进行。使用对感兴的趣特定miRNA特异性的miRNA引物来产生cDNA。使用没有模板或引物的RT反应作为对照。使用ABI 7300 RT-PCR系统(Applied Biosytems)来定量基因和miRNA表达水平。使用FastStart Universal SYBR green master(Rox)(Roche)进行mRNA的定量PCR。一式三份地进行具有或不具有对miRNA和mRNA的特异性引物的比较实时PCR。mRNA反应在95℃进行持续10min，随后进行在95℃持续15s，和60℃持续1min的40个循环。miRNA反应通过95℃持续15s，和60℃持续1min的40个循环进行。相对表达水平使用比较Ct方法来计算(Lee等人,2013)。
ECFC单细胞增殖测定：KNA+或SSEA5-KNA+中胚层细胞来源的ECFC经历单细胞测定，以评价克隆增殖潜力。简言之，将内皮细胞用trypLE Express(Invitrogen)处理以获得单细胞悬浮液。进行细胞计数和连续稀释，以获得在96孔培养板的单独的孔中每孔0.68个细胞的浓度。在铺板后的第二天检查孔，以确保每孔单个细胞的存在。在第4天、第8天和第12天更换培养基。在培养的第14天，将细胞用Sytox试剂(Invitrogen)染色，并且使用荧光显微镜检查每个孔以定量细胞的数目。使用具有10×CP-ACHROMAT/0.12NA物镜的ZeissAxiovert 25CFL倒置显微镜，在10倍放大的荧光显微镜下，将含有两种或更多种细胞的这些孔鉴定为用于增殖的阳性。如先前描述的，将具有2-50、51-500、501-2000和≥2001的内皮细胞计数的孔标记为内皮细胞簇(ECC)、低增殖潜力ECFC(LPP)和高增殖潜力ECFC(HPP)(Yoder等人,2007；Ingram等人,2005)。
蛋白印迹分析：通过将细胞重悬于裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、150mMNaCl、10％甘油、1％Triton X-100、2mM EDTA、1mM Na3VO4、各1μg/ml的抑肽酶和亮肽素)中，随后在冰上孵育持续20min来制备细胞裂解物。不溶性组分通过以12,000Xg离心持续15min来去除。蛋白质浓度用蛋白质测定试剂盒(Bio-rad)来确定。蛋白质在4％-20％Tris-甘氨酸微凝胶上通过电泳分离，并且然后转移到immobilon-FL PVDF膜(Millipore)上。在室温用封闭缓冲液封闭非特异性结合持续1小时，并且在4℃与针对在Odyssey封闭缓冲液中的磷-PYK2(1:1,000；Cell Signalling)和磷-p130Cas(1:1,000；Cell Signalling)的一级抗体一起孵育过夜。印迹用含有0.1％吐温20的PBS洗涤，随后在室温与抗兔抗体(1:10,000；LI-COR)孵育持续1小时。免疫反应条带使用Odyssey红外成像仪(LI-COR)来检测。
Fc-NRP-1治疗测定：在mTeSR1培养基中培养hiPSC团块2天(-D2)后，经由在FGF-2、VEGF165和BMP4(10ng/mL)的存在下，添加激活素A(10ng/mL)将培养物引导向中胚层谱系，持续24小时。在接下来的一天(D1)，将含激活素-A的培养基去除，并且用8mL的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)以及500ng/mL的Fc-NRP-1(R&D)的Stemline II完全培养基(Sigma)替换。在第3天，将培养基用8ml的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)以及500ng/mL的Fc-NRP-1(R&D)的新鲜Stemline II分化培养基替换。在第4天，收集细胞用于通过流式细胞术分选SSEA5-KNA+中胚层细胞。
miRNA微阵列和RNA序列分析：使用Trizol试剂(Invitrogen)从样品中分离总RNA，并且如先前描述的检查RNA质量(Ginsberg等人,2012,Cell 151:559-575)。对于miRNA微阵列，使用miRNome miRNA PCR阵列板、miScript II逆转录反应试剂盒和miScript SYBRGreen PCR试剂盒(均来自Qiagen)来检查在人miRNA基因组(miRNome)中1008个表达最丰富的并且最具特征的miRNA序列的表达谱，如在miRBaseRelease 16中注释的。对于RNA-seq分析，使用1μg的高质量的总RNA生成RNA序列文库，并且使用Illumina HiSeq2000测序仪进行测序，如先前描述的(Ginsberg等人,2012)。使用TopHat利用缺省参数将产生的序列读段映射到人类基因组(hg18)，并且使用CuffLinks定量RefSeq(2010年6月)转录物水平(FPKM)。
miRNA模拟物/抑制剂治疗测定：在mTeSR1培养基中培养hiPSC的单细胞悬浮液1天(-D1)后，经由在FGF-2、VEGF165和BMP4(10ng/mL)以及2.5μg模拟物或抑制剂/100,000个接种的细胞/6孔板的孔(GE Dharacon)的存在下，添加激活素A(10ng/mL)，将培养物引导向中胚层谱系，持续24小时。在接下来的一天(D1)，将包含激活素-A和miRNA模拟物或抑制剂的培养基去除，并且用2mL的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)的Stemline II完全培养基(Sigma)替换。在第2天，将培养基用2ml的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)以及2.5μg模拟物或抑制剂的新鲜Stemline II分化培养基替换。在第3天，将培养基用2ml的包含FGF-2(Stemgent)、VEGF165(R&D)和BMP4(R&D)的新鲜Stemline II分化培养基替换。在第4天，收集细胞用于通过流式细胞术分选SSEA5-KNA+中胚层细胞。
统计分析：所有实验一式三份地进行≥3次，并且将数据表示为平均值±SD，用于统计比较。具有95％置信区间的分析能力用于计算获得统计学显著的结果所需要的样品尺寸。我们使用的取样数目给出正常分布。差异的显著性通过双尾学生t检验或单向ANOVA-Tukey事后检验多重比较检验来评估。
实施例2：
现在参考图1A-图1G，在第4天(D4)KDR+中胚层细胞(KNA+中胚层)内的NCAM和APLNR共表达细胞产生具有ECFC能力的NRP-1+CD31+内皮细胞。
在2D、血清和无饲养物条件下，将在mTeSR1中培养的人PSC诱导分化成中胚层细胞。将PSC在具有FGF-2(10ng/mL)、BMP4(20ng/mL)、VEGF165(10ng/mL)和激活素-A(10ng/mL)的Stemline-II培养基中培养持续24小时(即从D0至D1)(图1A)。在D1，将细胞培养基用具有FGF-2(10ng/mL)、BMP4(20ng/mL)、VEGF165(10ng/mL)的Stemline-II培养基替换。该替换培养基用于培养经历中胚层诱导的细胞持续3天(即从D1至D4)。
在第4天，分选被诱导以分化成中胚层细胞的细胞(图1B)。将KDR+细胞进行对NCAM和APLNR表达的门控。将KDR+NCAM+APLNR+(K+N+A+，在本文中也被称为KNA+)和KDR+NCAM+APLNR-(K+N+A-)、KDR+NCAM-APLNR-(K+N-A-)细胞分选用于进一步分化和检查NRP-1+CD31+ECFC样细胞的出现(图1C)。将分选的K+N+A+、K+N+A-和K+N-A-中胚层子集进一步向ECFC谱系分化持续另外的9天(3+9，总共12天)，以检查在分化的不同天NRP-1+CD31+细胞的出现(图1D)。在第12天，K+N+A+中胚层级分产生NRP1+CD31+细胞，其形成同质鹅卵石内皮单层，显示出CD31和CD144内皮标志物的均匀共表达，并且完全缺少α-SMA表达(图1D的上图)，这表明稳定的ECFC样表型。然而，从其他两个子集(即K+N+A-(图1D的中图)和K+N-A-(图1D的下图))分离的细胞缺少足够的NRP-1表达，形成异质细胞单层，显示出CD144的表达，但缺乏CD31和CD144内皮标志物的均匀共表达，并且呈现出非内皮标志物α-SMA的表达，这表明完全缺乏稳定的ECFC表型。K+N+A+中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞呈现出高克隆增殖潜力，其中集落的层次在从2个-50个细胞簇直到>2001的集落的范围内，这与hiPSC-ECFC样细胞类似(图1E)。然而，从其他两个子集(即K+N+A-和K+N-A-)分离的细胞未能呈现出高克隆增殖潜力。K+N+A+中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞产生了填充有鼠宿主红细胞的稳健的体内人血管(图1F，右上图；箭头指向血管)，这与由hiPSC-ECFC样细胞产生的那些血管类似(图1F，左上图)。然而，从其他两个子集(即K+N+A-和K+N-A-)分离的细胞未能产生填充有鼠宿主红细胞的稳健的体内人血管(图1F，分别为左下图和右下图；箭头指向hCD31+功能性血管)。类似地，功能性hCD31+血管由K+N+A+中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞和hiPSC-ECFC样细胞产生，但不由K+N+A-或K+N-A-中胚层细胞产生(图1G)。
现在参考图2A-图2C，使用上文的培养方案分化3天-5天后，人iPS细胞产生表达中胚层标志物且缺少典型的内皮表面表达的细胞。APLNR+细胞仅在KDR+NCAM+中胚层子集中发现且不存在于KDR-NCAM-子集中(图2A)，并且KDR+细胞在第3天和第4天以最高水平发现并随时间减少(图2B)。在任何第4天分化的细胞中未发现典型的内皮标志物(CD31、NRP-1和CD144)表达(图2C)。
现在参考图3A-图3B，在没有针对SSEA5+细胞选择的情况下分离的第4天KNA+中胚层细胞的直接体内分化形成了稳健的人血管，但也产生了内胚层来源的细胞样衍生物。
将KDR+细胞进行对NCAM和APLNR表达的门控。将APLNR+和APLNR-中胚层细胞分选用于进一步直接体内植入和检查(图3A)。分选的APLNR-中胚层细胞在体内植入2个月后产生畸胎瘤(图3B，左图)。APLNR+中胚层子集(图3B，右图)在体内形成填充有鼠宿主红细胞的稳健的人血管(蓝色空心箭头)伴随着内胚层来源的细胞样衍生物(粉色实心箭头)。
现在参考图4A-图4D，D4SSEA5耗竭的KNA+中胚层细胞(即，SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+，也被称为SSEA5-KNA+)的直接体内分化形成了稳健的人血管，而不产生畸胎瘤或内胚层来源的细胞样衍生物。
将第4天分化的hiPSC首先进行对SSEA5和KDR表达的门控(图4A，左图)。将SSEA5-KDR+细胞进行对NCAM和APLNR表达的门控(图4A，右图)。将SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+(SSEA5-KNA+)细胞和SSEA5-KDR+NCAM+APLNR-(SSEA5-KNA-)细胞分选以用于进一步分析。SSEA5-KNA+细胞形成稳健的功能性体内血管(图4B，蓝色箭头，左图)，SSEA5-KNA-细胞未能形成稳健的体内血管(图4B，白色箭头，右图)。类似地，功能性hCD31+血管由SSEA5-KNA+细胞产生，而不由SSEA5-KNA-细胞产生(图4C)。当被植入到体内时，SSEA5-KNA+细胞早在植入后8天形成NRP-1+CD31+ECFC血管(图4D)。
现在参考图5A-图5C，第4天SSEA5耗竭的KNA+中胚层细胞显示出典型地富集在侧板/胚外中胚层细胞中的转录物，并且在体外ECFC分化后呈现出具有ECFC能力的NRP-1+CD31+细胞的增强的形成。
基因表达分析揭示，SSEA5-KNA+细胞相对于hiPSC过表达侧板-胚外中胚层标志物，并且缺少轴向中胚层标志物、近轴中胚层标志物和中间中胚层标志物的表达(图5A)。将分选的SSEA5-KNA+细胞进一步向ECFC样谱系分化持续另外的8天(4+8，总共12天)。在第12天，SSEA5-KNA+细胞产生与由被诱导以分化成ECFC样谱系的hiPSC(即12天分化，但在分化的第4天没有分离SSEA5-KNA+中胚层子集)产生的NRP-1+CD31+细胞相比≥3倍更多的NRP-1+CD31+细胞(图5B；左图，柱状图)。源自自SSEA5-KNA+中胚层细胞的NRP1+CD31+细胞形成同质鹅卵石内皮单层(图5B，左中图)，显示出CD31和CD144内皮标志物的均匀共表达(图5B，右图)，并且完全缺乏α-SMA表达(图5B，右中图)，这表明SSEA5-KNA+中胚层细胞能够分化成稳定的ECFC样表型。SSEA5-KNA+中胚层来源的NRP-1+CD31+细胞呈现出高克隆增殖潜力，其中集落的层次在从2个-50个细胞簇直到>2001的集落的范围内，这与hiPSC-ECFC类似(图5C)。然而，从SSEA5-KNA-中胚层子集分离的细胞未能呈现出高克隆增殖潜力(图5C)。
现在参考图6A-图6G，本发明人发现Fc-NRP-1通过p130Cas/Pyk2激活介导VEGF-KDR信号传导，并且增强由hiPSC形成SSEA5-KNA+中胚层细胞。
内皮细胞中的NRP-1、KDR、Fc-NRP-1、NRP-1-B和VEGF165功能如图6A中示出的。简言之，NRP-1起VEGF165共同受体的作用，并且将VEGF165带到其受体(KDR)。Fc-NRP-1充当膜NRP-1的替代物，并且将VEGF165结合至KDR并将VEGF165带到KDR。相反，NRP-1-B阻断抗体选择性地结合至NRP-1的VEGF165结合位点，从而特异性阻断VEGF165与NRP-1的结合。
KDR和p130Cas/Pyk2磷酸化的检查通过蛋白印迹进行(图6B和图6C)。在VEGF刺激的组中观察到KDR磷酸化，并且与对照处理的细胞相比，Fc-NRP-1二聚体处理增加了KDR的磷酸化。然而，在NRP-1-B处理的细胞中观察到降低的磷酸化。类似地，与NRP-1-B处理的细胞相比，在Fc-NRP-1二聚体处理的细胞中观察到增加的p130Cas/Pyk2磷酸化。
研究了VEGF-A同种型在hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞中的基因表达。与hiPSC相比，VEGF-A同种型在SSEA5-KNA+中胚层细胞中没有上调(图6D和图6E)。
涉及在Fc-NRP-1二聚体和生长因子的存在下培养经历中胚层诱导的细胞的中胚层谱系分化方案在图6F中示出。与Fc-NRP-1未处理的细胞相比，分化hiPSC的二聚体Fc-NRP-1处理引起SSEA5-KNA+中胚层细胞的产生的多于2倍的增加。
现在参考图7A-图7E，特异性miRNA模拟物、miRNA抑制剂及其组合增强了由hiPSC的SSEA5-KNA+中胚层形成。
为了鉴定与SSEA5-KNA+中胚层形成相关的miRNA及其推定的转录因子靶，我们进行了第0天未分化的hiPSC和第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞的miRNA微阵列和RNA-seq分析(图7A)。我们对miRNA和mRNA转录物的表达的分析揭示了12种具有公开和验证的靶的miR(miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR-543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3p、miR-185-5p、miR-330-5p、miR-145-5p、miR-214-3p和miR-497-5p)，它们潜在地调节与由hiPSC的SSEA5-KNA+中胚层形成相关的转录因子。在这12种候选物miRNA中，我们发现8种miRNA(miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR-543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3p和miR-185-5p)在第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中以比第0天未分化的hiPSC更低的水平表达，并且四种miRNA(miR-330-5p、miR-145-5p、miR-214-3p和miR-497-5p)在第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中以比第0天未分化的hiPSC更高的水平表达。
为了确定模拟和/或抑制所鉴定的miRNA对中胚层谱系分化的影响，我们开发了一种方案，用于在特异性miRNA模拟物、miRNA抑制剂、模拟物和抑制剂两者(3m3i)、或模拟物/抑制剂对照的存在下，诱导由hiPSC的中胚层产生(图7B)。与对照相比，添加3种miRNA(miR-330-5p、miR-145-5p和miR-214-3p)的特异性模拟物、3种miRNA(miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559)的特异性抑制剂或组合的3种模拟物和3种抑制剂增加了SSEA5-KNA+中胚层细胞的频率(图7C)。添加这些特异性模拟物、抑制剂或3m3i降低了(在我们的miRNA阵列分析中)被鉴定为在第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中以较低的水平表达的大多数miRNA的表达(图7D)。添加这些特异性模拟物、抑制剂或3m3i增加了(在我们的miRNA阵列分析中)被鉴定为在第4天SSEA5-KNA+中胚层细胞中以较高的水平表达的一些miRNA的表达(图7E)。
现在参考图8A-图8D，miR-214-3p靶向分化的hiPSC中的CLDN6并且增强SSEA5-KNA+中胚层细胞的形成。
在hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞中分析miR-214及其推定的靶CLDN6的表达。我们发现miR-214和CLDN6分别在hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞中呈现出反向表达相关性(图8A)。miR-214在SSEA5-KNA+细胞中比在hiPSC中高表达(图8A，左侧柱)，并且CLDN6在SSEA5-KNA+细胞中比在hiPSC中以更低的水平表达(图8A，右侧柱)。与GFP报道对照载体相比，miR-214在分化的hiPSC中的过表达引起的SSEA5-KNA+中胚层细胞的产生的多于2倍的增加(图8B)。荧光素酶报道测定证实miR-214直接调节野生型(WT)CLND6的表达(图8C)。hiPSC和SSEA5-KNA+中胚层细胞之间的差异基因表达分析揭示，CLND6是在SSEA5-KNA+中胚层中减少的12个验证的miR-214靶中下调最大的基因之一(图8D)。例如，与在hiPSC中测量的水平相比，CLDN6在SSEA5-KNA+中胚层细胞中仅以4％表达。
虽然已经参考某些特定的实施方案描述了本公开内容，但其各种修改对于本领域技术人员将是明显的，而不偏离所附权利要求中概述的本公开内容的目的和范围。本文提供的任何实施例仅被包括用于说明本公开内容的目的，并且不意图以任何方式限制本公开内容。本文提供的任何附图仅用于说明本公开内容的各个方面的目的，并且不意图在按比例绘制或以任何方式限制本公开内容。本文引用的所有现有技术的公开内容通过引用以其整体并入本文。
Claims (27)
1.一种用于从人多能干细胞产生分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体的方法，所述方法包括：
-提供多能干细胞(PSC)；
-诱导所述多能干细胞以经历中胚层分化，其中中胚层诱导包括：
i)在包含激活素A、BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基中培养所述多能干细胞持续约24小时；和
ii)此后约每24小时-48小时用包含BMP-4、VEGF和FGF-2的中胚层分化培养基替换步骤i)的所述培养基，持续约72小时；和
-从被诱导以经历分化的细胞中分离中胚层细胞，其中中胚层细胞的所述分离包括：
iii)分选所述中胚层细胞以选择KDR+NCAM+APLNR+细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分选还包括选择SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的所述细胞与Fc-NRP-1接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述Fc-NRP-1被添加到步骤ii)的所述中胚层分化培养基中。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的所述细胞与一种或更多种miRNA抑制剂接触，其中所述一种或更多种miRNA抑制剂抑制在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞中呈现出相对于PSC降低的表达的miRNA。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述miRNA抑制剂抑制选自由以下组成的组的miRNA：miR-221-3p、miR-1271-5p、miR-559、miR543、miR-361-3p、miR-30d-5p、miR-124-3p和miR-185-5p。
7.如权利要求5所述的方法，其中经历中胚层诱导的所述细胞与miR-221-3p、miR-1271-5p和miR-559，优选地miR-221-3p的miRNA抑制剂中的一种或更多种接触。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的所述细胞与一种或更多种miRNA模拟物接触，其中所述一种或更多种miRNA模拟物模拟在SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞中呈现出相对于PSC增加的表达的miRNA。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述miRNA模拟物模拟选自由以下组成的组的miRNA：miR-330-5p、miR-145-5p、miT-214-3p和miR-497-5p。
10.如权利要求7所述的方法，其中经历中胚层诱导的所述细胞与miR-330-5p、miR-145-5p和miT-214-3p，优选地miR-330-5p的miRNA模拟物中的一种或更多种一起培养。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导还包括使经历中胚层诱导的所述细胞与miR-214模拟物接触。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分离的中胚层细胞在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，还包括：诱导所述分离的中胚层细胞以经历内皮分化，其中内皮诱导包括：
-在包含BMP-4、VEGF和FGF-2的内皮分化培养基中培养所述分离的中胚层细胞持续约6天-8天；和
-从被诱导以经历内皮分化的所述细胞中分离内皮集落形成样(ECFC样)细胞，其中所述ECFC样细胞是CD31+NRP-1+并且呈现出鹅卵石形态。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述分离的ECFC样细胞的特征还在于CD144+、KDR+和α-SMA-表达中的一种或更多种。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述内皮诱导步骤在不存在以下的一种或更多种情况下进行：共培养细胞、拟胚体形成和外源TGF-β抑制。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述分离的ECFC样细胞在不存在共植入细胞的情况下在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力。
17.一种分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体，其中分离的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞在被植入到哺乳动物中时具有形成血管的能力，并且其中所述分离的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞在体外衍生自人多能干细胞。
18.如权利要求17所述的分离的群体，其中所述KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞是SSEA5-。
19.如权利要求17或18所述的分离的群体，其中所述KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞呈现出一种或更多种侧板-胚外中胚层标志物相对于PSC的增加的表达，其中所述侧板-胚外中胚层标志物选自BMP4、WNT5A、NKX2-5和HAND1。
20.如权利要求19所述的分离的群体，其中所述KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞相对于PSC缺少一种或更多种轴向中胚层标志物、近轴中胚层标志物和/或中间中胚层标志物的增加的表达，其中所述轴向中胚层标志物选自CHIRD和SHH，所述近轴中胚层标志物选自PAX1、MEOX1和TCF15，并且所述中间中胚层标志物选自GOSR1、PAX2和PAX8。
21.一种分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体，所述分离的人KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞的群体根据权利要求1-12中任一项所述的方法获得。
22.一种分离的人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的群体，所述分离的人NRP-1+CD31+内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)的群体根据权利要求13至16中任一项所述的方法获得。
23.一种药物组合物，包含权利要求17至21中任一项所述的KDR+NCAM+APLNR+中胚层细胞。
24.一种药物组合物，包含权利要求22所述的内皮集落形成细胞样细胞(ECFC样细胞)。
25.一种检查测试剂用于修饰细胞活性的能力的方法，所述方法包括：
-将权利要求17至21中任一项所述的细胞的群体的至少一个细胞暴露于测试剂；和
-观察所述测试剂对细胞生长和细胞存活力中的一种或更多种的影响。
26.一种用于在有相应需要的受试者中移植的方法，所述方法包括：
-向所述受试者提供权利要求17至22中任一项所述的分离的细胞的群体。
27.一种治疗需要上皮修复的受试者的方法，所述方法包括：
-向所述受试者提供治疗有效量的根据权利要求17至22中任一项所述的细胞的群体。
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Legal Events
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| REG | Reference to a national code |
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