KR102456031B1 - 생체 내 혈관 형성 능력을 갖는 중배엽 및/또는 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포를 생성시키기 위한 방법 - Google Patents
생체 내 혈관 형성 능력을 갖는 중배엽 및/또는 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포를 생성시키기 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 개시는 일반적으로 세포 및 조직 생물학 및 요법에서 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 다능성 줄기 세포를 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포 및/또는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포로 분화시키기 위한 시험관 내 방법이 제공된다. 개시된 중배엽 세포는 생체 내에서 혈관을 생성시키는데 사용될 수 있고/있거나, 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)로 시험관 내에서 추가로 분화될 수 있다. KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포 및 ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단이 제공된다. 본 발명의 개시의 세포 집단을 이용하기 위한 시험 제제 스크리닝 및 치료 방법이 제공된다.
Description
이전 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 8월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/372,907호의 이익을 청구하며, 상기 출원은 이의 전체내용이 기재된 것처럼 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 개시는 세포 및 조직 생물학의 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 개시는 생체 내에서 혈관을 형성할 수 있는 중배엽 세포 및/또는 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)로의 다능성 줄기 세포의 계통-특이적 분화에 관한 것이다.
내피 콜로니 형성 세포(ECFC)는 클론 증식 잠재성 및 고유한 생체 내 혈관 형성 능력을 갖는, 특히 제대혈에서 풍부한 드문 순환 내피 세포이다(Yoder, M.C. et al. Blood 109, 1801-1809 (2007); Ingram, D.A. et al. Blood 105, 2783-2786 (2005); Ingram, D.A. et al. Blood 104, 2752-2760 (2004); Critser, P.J. et al. Microvasc Res 80, 23-30 (2010); Au, P. et al. Blood 111, 1302-1305 (2008); Melero-Martin, J.M. et al. Circ Res 103, 194-202 (2008)). 제대혈 또는 공여자 골수 내에서 어떠한 유형의 세포가 ECFC를 발생시키는지는 이해되어 있지 않다. 배양된 일차 ECFC가 설치류 혈관 손상 모델에 정맥내 주사되는 경우, 이들은 혈관 손상 또는 조직 허혈 부위에 모집되어 혈관형성 반응의 개시를 조직화한다(Moubarik, C. et al. Stem Cell Rev 7, 208-220 (2011); Schwarz, T.M. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 32, e13-21 (2012); Saif, J. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30, 1897-1904 (2010)). 인간 ECFC는 심근경색증(Dubois, C. et al. J Am Coll Cardiol 55, 2232-2243 (2010); Schuh, A. et al. Basic Res Cardiol 103, 69-77 (2008)), 뇌졸중(Moubarik, C. et al. 2011), 허혈성 망막병증(Stitt, A.W. et al. Prog Retin Eye Res 30, 149-166 (2011); Medina, R.J. et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 51, 5906-5913 (2010)), 허혈성 사지 손상(Schwartz et al. 2012; Saif et al. 2010; Bouvard, C. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30, 1569-1575 (2010); Lee, J.H. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2013)) 후에 혈관 복구를 향상시키고, 혈류를 개선시키며, 노출된 혈관 세그먼트 또는 이식된 이식편을 접목시키고 재내피화(Stroncek, J.D. et al. Acta Biomater 8, 201-208 (2012))시키는 것으로 보고되어 왔다. 말초 동맥 질환(PAD) 및 중증 사지 허혈(CLI)을 갖는 대상체에서, 순환 또는 상주 ECFC는 복제 노화가 발생하기 쉬우며(즉, ECFC는 증식 잠재성이 결여될 수 있음), 이에 따라 이들을 자가 혈관 복구에 무력하게 만든다. 적어도 이들 이유로, 혈관 복구에 사용될 수 있는 ECFC 또는 다른 세포 유형의 대안적 공급원을 찾는 것이 바람직하다.
인간 다능성 줄기 세포(hPSC)는 사실상 무제한 자가-재생 능력 및 동물 신체에서 임의의 세포 유형으로 분화하는 능력을 나타낸다(Robbins, R.D. et al. Curr Opin Organ Transplant 15, 61-67 (2010); Broxmeyer, H.E. et al. Blood 117, 4773-4777 (2011); Lee, M.R. et al. Stem Cells 31, 666-681 (2013)). 본 발명자는 hPSC로부터 ECFC-유사 세포의 시험관 내 유도를 위한 방법을 이전에 결정하였으며, 여기서 ECFC-유사 세포는 생체 내에서 혈관을 형성할 수 있다(PCT/US2015/020008).
상기 결함 중 하나 이상을 완화시키고/시키거나 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 개시는 hPSC로부터 계통-특이적 중배엽 세포 및/또는 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)를 생성시키기 위한 방법에 관한 것으로 광범위하게 요약된다. 생체 내 혈관 형성 능력을 갖는 계통-특이적 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 집단으로 hPSC를 재현 가능하게 분화시키기 위한 프로토콜이 제공된다.
일 양태에서, 본 발명의 개시는 인간 다능성 줄기 세포로부터 인간 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단을 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다능성 줄기 세포(PSC)를 제공하고; 다능성 줄기 세포가 중배엽 분화를 겪도록 유도하고, 중배엽 유도는 i) 다능성 줄기 세포를 약 24시간 동안 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지에서 배양하고, ii) 단계 i)의 배지를 그 후 약 72시간 동안 약 24-48시간마다 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체하는 것을 포함하고; 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 중배엽 세포를 분리하는 것을 포함하며, 중배엽 세포의 분리는 iii) 중배엽 세포를 분류하여 KDR+NCAM+APLNR+ 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 분류는 SSEA5- KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 선택을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 중배엽 유도는 중배엽 유도를 겪는 세포와 Fc-NRP-1을 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 단계 ii)의 중배엽 분화 배지.
일 구현예에서, 중배엽 유도는 중배엽 유도를 겪는 세포와 하나 이상의 miRNA 억제제를 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 하나 이상의 miRNA 억제제는 PSC에 비해 SSEA5- KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포에서 감소된 발현을 나타내는 miRNA를 억제한다. 일 구현예에서, miRNA 억제제는 miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559, miR543, miR-361-3p, miR-30d-5p, miR-124-3p 및 miR-185-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA를 억제한다. 일 구현예에서, 중배엽 유도를 겪는 세포는 miR-221-3p, miR-1271-5p 및 miR-559의 miRNA 억제제 중 하나 이상, 바람직하게는 miR-221-3p와 접촉된다.
일 구현예에서, 중배엽 유도는 중배엽 유도를 겪는 세포와 하나 이상의 miRNA 모방체를 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 하나 이상의 miRNA 모방체는 PSC에 비해 SSEA5- KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포에서 증가된 발현을 나타내는 miRNA를 모방한다. 일 구현예에서, miRNA 모방체는 miR-330-5p, miR-145-5p, miT-214-3p 및 miR-497-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA를 모방한다. 일 구현예에서, 중배엽 유도를 겪는 세포는 miR-330-5p, miR-145-5p 및 miT-214-3p의 miRNA 모방체 중 하나 이상, 바람직하게는 miR-330-5p와 함께 배양된다. 일 구현예에서, 중배엽 유도는 중배엽 유도를 겪는 세포와 miR-214 모방체를 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 분리된 중배엽 세포는 포유동물에 이식되는 경우에 혈관을 형성하는 능력을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 방법은 분리된 중배엽 세포가 내피 분화를 겪도록 유도하고, 여기서 내피 유도는 약 6-8일 동안 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지에서 분리된 중배엽 세포를 배양하는 것을 포함하고; 내피 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 내피 콜로니 형성-유사(ECFC-유사) 세포를 분리시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 ECFC-유사 세포는 CD31+NRP-1+이고, 조약돌 형태를 나타낸다.
일 구현예에서, 분리된 ECFC-유사 세포는 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 발현 중 하나 이상을 추가 특징으로 한다.
일 구현예에서, 내피 유도 단계는 공동-배양 세포, 배아 몸체 형성 및 외인성 TGF-β 억제 중 하나 이상의 부재하에서 수행된다.
일 구현예에서, 분리된 ECFC-유사 세포는 공동-이식된 세포의 부재하에서 포유동물로 이식되는 경우에 혈관을 형성하는 능력을 갖는다.
일 양태에서, 인간 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단이 제공된다. 분리된 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 포유동물에 이식되는 경우에 혈관을 형성하는 능력을 갖고, 분리된 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 인간 다능성 줄기 세포로부터 시험관 내에서 유래되었다.
일 구현예에서, KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 SSEA5-이다. 일 구현예에서, KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 측판-배아외 중배엽 마커의 증가된 발현을 나타내고, 측판-배아외 중배엽 마커는 BMP4, WNT5A, NKX2-5 및 HAND1으로부터 선택된다. 일 구현예에서, KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 축 중배엽 마커, 축옆 중배엽 마커 및/또는 중간 중배엽 마커의 증가된 발현이 결여되어 있고, 축 중배엽 마커는 CHIRD 및 SHH로부터 선택되고, 축옆 중배엽 마커는 PAX1, MEOX1, 및 TCF15로부터 선택되고, 중간 중배엽 마커는 GOSR1, PAX2 및 PAX8로부터 선택된다.
일 양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 획득된 인간 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 획득된 인간 NRP-1+CD31+ 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)의 분리된 집단이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 제공된 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 제공된 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 개시의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 세포의 분리된 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는 이식을 필요로 하는 대상체에서 이식을 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 개시의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 세포 집단을 대상체에 제공하는 것을 포함하는 상피 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 개시의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 획득된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 개시의 또 다른 양태에서, 시험 제제를 세포 활성을 변형시키는 이의 능력에 대해 검사하는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
- 본원에 기재된 바와 같은 세포 집단의 세포 중 적어도 하나를 시험 제제에 노출시키고;
- 세포 성장 및 세포 생활력 중 하나 이상에 대해 시험 제제의 효과를 관찰하는 것을 포함한다.
특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 도면을 색상으로 포함한다. 색 도면을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원의 카피는 요청시 필요한 요금의 지불과 함께 관청에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 개시의 특징은 첨부된 도면을 참조로 하는 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다:
도 1a-1g는 4일(D4) KDR+ 중배엽 세포(KNA+ 중배엽)에서의 NCAM 및 APLNR 공동-발현 세포가 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 내피 세포를 발생시키는 것을 예시한다.
도 1a는 원-스텝, 2D, 혈청 및 영양세포-비함유 중배엽 계통 분화 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 1b는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 1c는 KDR+NCAM+APLNR+(K+N+A+), KDR+NCAM+APLNR-(K+N+A-), 및 KDR+NCAM-APLNR-(K+N-A-) 세포 분류 및 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포의 추가 분화 및 이의 출현의 검사를 위한 전략을 도시한다.
도 1d는 분화 8, 10 및 12일(3개의 가장 좌측의 패널)에서 NRP-1+CD31+ 세포의 출현에 대해 또 다른 9일(3 + 9일, 전체 12일) 동안 ECFC-유사 계통으로 추가로 분화된 분류된 K+N+A+, K+N+A- 및 K+N-A- 중배엽 서브셋의 검사를 도시하며; 12일 단층의 형태가 제시되고(좌측으로부터 4번째 패널), α-SMA 발현이 제시되고(좌측으로부터 5번째 패널); CD31 및 CD144 내피 마커의 발현이 제시된다(가장 우측의 패널).
도 1e는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-, K+N+A--, 및 K+N-A--중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포가 상이한 수준의 클론 증식 잠재성을 나타낸 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 1f는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-, K+N+A--, 및 K+N-A--중배엽-유래 NRP-1+CD31+에 의한 다양한 품질의 생체 내 인간 혈관 형성의 이미지를 도시한다.
도 1g는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-ECFC-유사 세포, K+N+A--EC, 및 K+N-A--EC가 다양한 양의 기능성 hCD31+ 혈관을 형성하는 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 2a-2c는 본원에 제공된 프로토콜을 이용하여 3-5일 동안 분화된 인간 iPS 세포가 중배엽 마커를 발현하고, 통상적인 내피 표면 마커 발현이 결여된 세포를 발생시키는 것을 예시한다.
도 2a는 APLNR+ 세포가 KDR+NCAM+ 중배엽 서브셋에서 발견되었으나, KDR-NCAM- 서브셋에서는 발견되지 않았음을 예시한다.
도 2b는 분화 3, 4, 및 5일에서의 KDR+ 세포의 수준을 도시한다.
도 2c는 4일 분화된 세포에서의 내피 마커(CD31, NRP-1 및 CD144) 발현의 수준을 도시한다.
도 3a-3b는 SSEA5 고갈 없이 분리된 D4 KNA+ 중배엽 세포의 직접 생체 내 분화가 확실한 인간 혈관을 형성하고, 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 생성한 것을 예시한다.
도 3a는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 3b는 분류된 APLNR- 중배엽 세포가 생체 내 이식 2개월 후에 기형종을 생성하고(좌측 패널), APLNR+ 중배엽 세포가 수반하는 내배엽-유래 세포 유사 유도체(우측 패널; 분홍색의 채워진 화살표)와 함께 숙주 뮤린 적혈구 세포(우측 패널; 청색의 빈 화살표)로 채워진 확실한 생체 내 인간 혈관을 형성한 것을 제시한다.
도 4a-4d는 기형종 또는 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 발생시키지 않으면서 확실한 인간 혈관을 형성한 D4 SSEA5 고갈된 KNA+ 중배엽 세포의 직접 생체 내 분화를 예시한다.
도 4a는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 4b는 SSEA5-KNA+ 세포에 의한 확실한 기능성 생체 내 혈관의 형성(청색 화살표, 좌측 패널) 및 SSEA5-KNA- 세포에 의한 확실한 기능성 생체 내 혈관의 부재(백색 화살표, 우측 패널)를 도시한다.
도 4c는 SSEA5-KNA+ 세포 및 SSEA5-KNA- 세포에 의한 기능성 혈관의 생체 내 형성을 예시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 4d는 SSEA5-KNA+ 세포의 이식 8일 후에 생체 내에서 형성된 NRP-1+CD31+ 혈관의 이미지를 도시한다.
도 5a-5c는 D4 SSEA5-고갈된 KNA+ 중배엽 세포가 측판/배아외 중배엽 세포에 통상적으로 농축된 전사물을 나타내고, 시험관 내 ECFC 분화시 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 세포의 향상된 형성을 나타내는 것을 예시한다.
도 5a는 SSEA5-KNA+ 세포 및 hiPSC에서의 측판-배아외 중배엽 마커, 축, 축옆 및 중간 중배엽 마커의 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 5b는 또 다른 8일(4 + 8, 전체 12일) 동안 ECFC 계통으로 추가로 분화된 분류된 SSEA5-KNA+ 세포를 도시하며; 12일에서, SSEA5-KNA+ 세포는 hiPSC로부터 유래(4일 분류 단계 없음)된 NRP-1+CD31+ 세포에 비해 3배 이상 더 많은 NRP-1+CD31+ 세포를 생성하였고(좌측 막대 그래프); SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터 유래된 NRP1+CD31+ 세포의 단층의 형태, α-SMA 발현의 결여(중간 패널); 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터 유래된 NRP1+CD31+ 세포에서의 CD31 및 CD144 내피 마커의 균일한 공동 발현(우측 패널)이 또한 제시된다.
도 5c는 hiPSC-ECFC-유사 세포, SSEA5-KNA+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포 및 SSEA5-KNA- 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포의 클론 증식 잠재성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 6a-6g는 Fc-NRP-1이 p130Cas/Pyk2 활성화를 통한 VEGF-KDR 신호전달을 매개하고, hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 6a는 내피 세포에서의 NRP-1, KDR, Fc-NRP-1, NRP-1-B 및 VEGF165 기능의 개략적 대표도를 도시한다.
도 6b는 KDR 인산화를 제시하는 웨스턴 블롯을 도시하고; KDR 인산화는 VEGF 자극된 그룹에서 관찰되었고, Fc-NRP-1 이량체 처리는 대조군 처리된 세포에 비해 KDR의 인산화를 증가시켰고; 감소된 인산화가 NRP-1-B 처리된 세포에서 관찰되었다.
도 6c는 p130Cas/Pyk2 인산화를 제시하는 웨스턴 블롯을 도시하며; NRP-1-B 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 이량체 처리된 세포에서 증가된 p130Cas/Pyk2 인산화가 관찰되었다.
도 6d는 hiPSC와 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 사이의 다양한 VEGF-A 아이소형에 대한 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 6e는 배양 배지에서 첨가된 VEGF165의 존재 또는 부재하에서 분화 2일 및 4일에서 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터의 VEGF 생성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 6f는 Fc-NRP-1 이량체의 존재하에서의 중배엽 계통 분화 프로토콜을 제시하는 개략도를 도시한다.
도 6g는 분화하는 hiPSC의 이량체 Fc-NRP-1 처리가 Fc-NRP-1 미처리 세포에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 생성에서 2배 초과의 증가를 야기한 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 7a-7e는 특이적 miRNA 모방체 및 억제제가 hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 생성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 7a는 hiPSC(Y-축에서 0으로 표시됨)에 비한 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA의 발현에서의 배수 변화를 도시한다.
도 7b는 중배엽 유도를 겪는 세포와 특정 miRNA 모방체 또는 억제제 또는 모방체 및 억제제 둘 모두(3m3i) 또는 모방체/억제제 대조군을 접촉시키는 것을 포함하는 중배엽 계통 분화 프로토콜을 제시하는 개략도를 도시한다.
도 7c는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 빈도를 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 7d는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA(x-축)의 상대 발현(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 7e는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA(x-축)의 상대 발현(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8a-8d는 miR-214-3p가 분화하는 hiPSC에서 CLDN6을 표적으로 하고, SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 8a는 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 miR-214(좌측) 및 이의 추정 표적 CLDN6(우측)의 상대 발현 수준(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8b는 miR-214가 중배엽 유도를 겪는 세포에서 과발현된 경우 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 및 GFP 리포터 대조군 벡터(y-축)의 생성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8c는 miR-214가 야생형(WT) CLND6의 발현을 직접 조절하는 것을 확인하는 루시페라제 리포터 검정의 결과를 도시한다.
도 8d는 hiPSC와 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 사이의 차별적 유전자 발현 분석의 결과를 도시한다.
본 발명의 개시의 특징은 첨부된 도면을 참조로 하는 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다:
도 1a-1g는 4일(D4) KDR+ 중배엽 세포(KNA+ 중배엽)에서의 NCAM 및 APLNR 공동-발현 세포가 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 내피 세포를 발생시키는 것을 예시한다.
도 1a는 원-스텝, 2D, 혈청 및 영양세포-비함유 중배엽 계통 분화 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 1b는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 1c는 KDR+NCAM+APLNR+(K+N+A+), KDR+NCAM+APLNR-(K+N+A-), 및 KDR+NCAM-APLNR-(K+N-A-) 세포 분류 및 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포의 추가 분화 및 이의 출현의 검사를 위한 전략을 도시한다.
도 1d는 분화 8, 10 및 12일(3개의 가장 좌측의 패널)에서 NRP-1+CD31+ 세포의 출현에 대해 또 다른 9일(3 + 9일, 전체 12일) 동안 ECFC-유사 계통으로 추가로 분화된 분류된 K+N+A+, K+N+A- 및 K+N-A- 중배엽 서브셋의 검사를 도시하며; 12일 단층의 형태가 제시되고(좌측으로부터 4번째 패널), α-SMA 발현이 제시되고(좌측으로부터 5번째 패널); CD31 및 CD144 내피 마커의 발현이 제시된다(가장 우측의 패널).
도 1e는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-, K+N+A--, 및 K+N-A--중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포가 상이한 수준의 클론 증식 잠재성을 나타낸 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 1f는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-, K+N+A--, 및 K+N-A--중배엽-유래 NRP-1+CD31+에 의한 다양한 품질의 생체 내 인간 혈관 형성의 이미지를 도시한다.
도 1g는 hiPSC-ECFC-유사 세포, K+N+A+-ECFC-유사 세포, K+N+A--EC, 및 K+N-A--EC가 다양한 양의 기능성 hCD31+ 혈관을 형성하는 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 2a-2c는 본원에 제공된 프로토콜을 이용하여 3-5일 동안 분화된 인간 iPS 세포가 중배엽 마커를 발현하고, 통상적인 내피 표면 마커 발현이 결여된 세포를 발생시키는 것을 예시한다.
도 2a는 APLNR+ 세포가 KDR+NCAM+ 중배엽 서브셋에서 발견되었으나, KDR-NCAM- 서브셋에서는 발견되지 않았음을 예시한다.
도 2b는 분화 3, 4, 및 5일에서의 KDR+ 세포의 수준을 도시한다.
도 2c는 4일 분화된 세포에서의 내피 마커(CD31, NRP-1 및 CD144) 발현의 수준을 도시한다.
도 3a-3b는 SSEA5 고갈 없이 분리된 D4 KNA+ 중배엽 세포의 직접 생체 내 분화가 확실한 인간 혈관을 형성하고, 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 생성한 것을 예시한다.
도 3a는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 3b는 분류된 APLNR- 중배엽 세포가 생체 내 이식 2개월 후에 기형종을 생성하고(좌측 패널), APLNR+ 중배엽 세포가 수반하는 내배엽-유래 세포 유사 유도체(우측 패널; 분홍색의 채워진 화살표)와 함께 숙주 뮤린 적혈구 세포(우측 패널; 청색의 빈 화살표)로 채워진 확실한 생체 내 인간 혈관을 형성한 것을 제시한다.
도 4a-4d는 기형종 또는 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 발생시키지 않으면서 확실한 인간 혈관을 형성한 D4 SSEA5 고갈된 KNA+ 중배엽 세포의 직접 생체 내 분화를 예시한다.
도 4a는 4일 분화된 hiPSC에 대한 분류 전략을 도시한다.
도 4b는 SSEA5-KNA+ 세포에 의한 확실한 기능성 생체 내 혈관의 형성(청색 화살표, 좌측 패널) 및 SSEA5-KNA- 세포에 의한 확실한 기능성 생체 내 혈관의 부재(백색 화살표, 우측 패널)를 도시한다.
도 4c는 SSEA5-KNA+ 세포 및 SSEA5-KNA- 세포에 의한 기능성 혈관의 생체 내 형성을 예시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 4d는 SSEA5-KNA+ 세포의 이식 8일 후에 생체 내에서 형성된 NRP-1+CD31+ 혈관의 이미지를 도시한다.
도 5a-5c는 D4 SSEA5-고갈된 KNA+ 중배엽 세포가 측판/배아외 중배엽 세포에 통상적으로 농축된 전사물을 나타내고, 시험관 내 ECFC 분화시 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 세포의 향상된 형성을 나타내는 것을 예시한다.
도 5a는 SSEA5-KNA+ 세포 및 hiPSC에서의 측판-배아외 중배엽 마커, 축, 축옆 및 중간 중배엽 마커의 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 5b는 또 다른 8일(4 + 8, 전체 12일) 동안 ECFC 계통으로 추가로 분화된 분류된 SSEA5-KNA+ 세포를 도시하며; 12일에서, SSEA5-KNA+ 세포는 hiPSC로부터 유래(4일 분류 단계 없음)된 NRP-1+CD31+ 세포에 비해 3배 이상 더 많은 NRP-1+CD31+ 세포를 생성하였고(좌측 막대 그래프); SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터 유래된 NRP1+CD31+ 세포의 단층의 형태, α-SMA 발현의 결여(중간 패널); 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터 유래된 NRP1+CD31+ 세포에서의 CD31 및 CD144 내피 마커의 균일한 공동 발현(우측 패널)이 또한 제시된다.
도 5c는 hiPSC-ECFC-유사 세포, SSEA5-KNA+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포 및 SSEA5-KNA- 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포의 클론 증식 잠재성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 6a-6g는 Fc-NRP-1이 p130Cas/Pyk2 활성화를 통한 VEGF-KDR 신호전달을 매개하고, hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 6a는 내피 세포에서의 NRP-1, KDR, Fc-NRP-1, NRP-1-B 및 VEGF165 기능의 개략적 대표도를 도시한다.
도 6b는 KDR 인산화를 제시하는 웨스턴 블롯을 도시하고; KDR 인산화는 VEGF 자극된 그룹에서 관찰되었고, Fc-NRP-1 이량체 처리는 대조군 처리된 세포에 비해 KDR의 인산화를 증가시켰고; 감소된 인산화가 NRP-1-B 처리된 세포에서 관찰되었다.
도 6c는 p130Cas/Pyk2 인산화를 제시하는 웨스턴 블롯을 도시하며; NRP-1-B 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 이량체 처리된 세포에서 증가된 p130Cas/Pyk2 인산화가 관찰되었다.
도 6d는 hiPSC와 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 사이의 다양한 VEGF-A 아이소형에 대한 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 6e는 배양 배지에서 첨가된 VEGF165의 존재 또는 부재하에서 분화 2일 및 4일에서 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터의 VEGF 생성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 6f는 Fc-NRP-1 이량체의 존재하에서의 중배엽 계통 분화 프로토콜을 제시하는 개략도를 도시한다.
도 6g는 분화하는 hiPSC의 이량체 Fc-NRP-1 처리가 Fc-NRP-1 미처리 세포에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 생성에서 2배 초과의 증가를 야기한 것을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 7a-7e는 특이적 miRNA 모방체 및 억제제가 hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 생성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 7a는 hiPSC(Y-축에서 0으로 표시됨)에 비한 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA의 발현에서의 배수 변화를 도시한다.
도 7b는 중배엽 유도를 겪는 세포와 특정 miRNA 모방체 또는 억제제 또는 모방체 및 억제제 둘 모두(3m3i) 또는 모방체/억제제 대조군을 접촉시키는 것을 포함하는 중배엽 계통 분화 프로토콜을 제시하는 개략도를 도시한다.
도 7c는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 빈도를 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 7d는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA(x-축)의 상대 발현(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 7e는 도 7b의 프로토콜을 이용하여 획득된 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 다양한 miRNA(x-축)의 상대 발현(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8a-8d는 miR-214-3p가 분화하는 hiPSC에서 CLDN6을 표적으로 하고, SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시키는 것을 예시한다.
도 8a는 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서의 miR-214(좌측) 및 이의 추정 표적 CLDN6(우측)의 상대 발현 수준(y-축)을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8b는 miR-214가 중배엽 유도를 겪는 세포에서 과발현된 경우 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 및 GFP 리포터 대조군 벡터(y-축)의 생성을 제시하는 막대 차트를 도시한다.
도 8c는 miR-214가 야생형(WT) CLND6의 발현을 직접 조절하는 것을 확인하는 루시페라제 리포터 검정의 결과를 도시한다.
도 8d는 hiPSC와 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 사이의 차별적 유전자 발현 분석의 결과를 도시한다.
본 발명의 개시는 일반적으로, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)(집합적으로, 인간 다능성 줄기 세포(hPSC))와 같은 다능성 세포의 계통-특이적 중배엽 세포로의 시험관 내 분화, 및 선택적으로 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)로의 계통-특이적 중배엽 세포의 추가 분화를 위한 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 발명자는 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성되고 분리된 중배엽 세포가 생체 내에서 혈관을 발생시킬 수 있음을 발견하였다. 본원에 제공된 방법의 다양한 구현예에서, 생성된 ECFC-유사 세포는 공동-배양 및/또는 공동-이식 세포의 부재하에서 생체 내에서 혈관으로 추가로 성장될 수 있다.
I: 정의
본 명세서에서 사용되는 특정 용어의 정의가 하기에 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명의 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 "다능성 세포"는 임의의 세포 유형, 예를 들어, 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 3개의 배엽층 중 어느 하나의 세포로 분화하는 잠재성을 갖는 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "배아 줄기 세포", "ES 세포" 또는 "ESC"는 초기 배아로부터 유래된 다능성 줄기 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "유도된 다능성 줄기 세포," "iPS 세포" 또는 "iPSC"는 비-다능성 세포에 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입하거나 이를 비-다능성 세포와 접촉시킴에 의해 비-다능성 세포, 예를 들어, 성체 체세포, 또는 최종 분화 세포, 예를 들어, 섬유모세포, 조혈 세포, 근세포, 신경세포, 표피 세포 등으로부터 제조된 다능성 줄기 세포의 유형을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "중배엽 분화 배지"는 중배엽 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 지지하고/거나 향상시키는 임의의 영양 배지를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "중배엽"은 초기 배아에서 3개의 주요 배엽층의 중간(나머지 2개 층은 외배엽 및 내배엽이 됨)을 나타낸다. 축 중배엽, 축옆 중배엽, 중간 중배엽 및 측판/배아외 중배엽을 포함하여 4개 성분 또는 부류의 중배엽이 존재한다. 중배엽은 "중배엽성 세포"로도 언급되는 "중배엽 세포"를 포함한다.
본원에서 사용되는 "miRNA 모방체"는 자연/내인성 miRNA 활성을 "모방"하도록 고안된 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. miRNA는 개별적 마이크로RNA의 기능적 역할을 발견하기 위해 내인성 마이크로RNA 활성을 보완한다.
본원에서 사용되는 "miRNA 억제제"는 자연/내인성 miRNA 활성을 "억제"하도록 고안된 단일-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. miRNA 억제제는 내인성 miRNA의 기능을 억제하고, 표적 유전자의 발현을 증가시키고, 표현형의 표현을 약화시킨다.
본원에서 사용되는 "내피 분화 배지"는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 지지하고/거나 향상시키는 임의의 영양 배지를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "내피 성장 배지"는 내피 계통의 세포를 유지시키기에 적합한 임의의 배지를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "내피 콜로니 형성 세포" 및 "ECFC"는 단일 세포로부터 내피 콜로니를 증식시키고 형성시키는 잠재성을 나타내고, 공동-이식되거나 공동-배양된 세포의 부재하에서 생체 내에서 혈관을 형성하는 능력을 갖는 혈액에서 발견되는 일차 내피 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "제대혈 ECFC" 및 "CB-ECFC"는 제대혈로부터 유래되는 일차 ECFC를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "내피 콜로니 형성 세포-유사 세포" 및 "ECFC-유사 세포"는 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)로부터 시험관 내에서 생성되는 비-일차 내피 세포를 나타낸다. ECFC-유사 세포는 단일 세포로부터 내피 콜로니를 증식시키고 형성하는 잠재성을 적어도 포함하는 ECFC의 다양한 특징을 가지며, 공동-이식되거나 공동-배양된 세포의 부재하에서 생체 내에서 혈관을 형성하는 능력을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "증식 잠재성" 및 "증식성 잠재성"은 적절한 성장 촉진 신호가 제공되는 경우에 세포가 분열하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "높은 증식 잠재성", "높은 증식성 잠재성" 및 "HPP"는 14일 세포 배양에서 약 2000개 초과의 세포로 분열하는 단일 세포의 능력을 나타낸다. 바람직하게는, HPP 세포는 자가-보충하는 능력을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 HPP-ECFC-유사 세포는 자가-보충하는 능력을 가지며, 이는 HPP-ECFC-유사 세포가 시험관 내에서 재플레이팅되는 경우 이차 HPP-ECFC-유사 콜로니 내에서 하나 이상의 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시킬 수 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, HPP-ECFC-유사 세포는 또한 시험관 내에서 재플레이팅되는 경우 이차 HPP-ECFC-유사 콜로니 내에서 하나 이상의 LPP-ECFC-유사 세포 및 ECFC-유사 세포 클러스터를 발생시키는 능력을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "낮은 증식 잠재성", "낮은 증식성 잠재성" 및 "LPP"는 14일 세포 배양에서 약 51-2000개 세포로 분열하는 단일 세포의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, LPP-ECFC-유사 세포는 또한 ECFC-유사 세포 클러스터를 발생시키는 능력을 가질 수 있다. 그러나, LPP-ECFC-유사 세포는 이차 LPP-ECFC-유사 세포 또는 HPP-ECFC-유사 세포를 발생시키는 능력을 갖지 않는다.
II:
다능성
세포를 중배엽 세포로 분화시키는 방법.
일 양태에서, 본원에 제공된 방법은 하기의 적어도 3개의 단계를 포함한다:
A. 다능성 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계;
B. 다능성 줄기 세포가 중배엽 분화를 겪도록 유도하는 단계로서, 중배엽 유도가 i) 다능성 줄기 세포를 약 24시간 동안 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지에서 배양하고, ii) 단계 i)의 배지를 그 후 약 72시간 동안 약 24-48시간마다 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체하는 것을 포함하는, 단계; 및
C. 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 중배엽 세포를 분리하는 단계로서, 중배엽 세포의 분리가 i) 중배엽 세포를 분류하여 KDR+NCAM+APLNR+ 세포에 대해 선택하는 것을 포함하는, 단계.
다양한 구현예에서, 상기 방법은 하기 추가 단계 중 하나 이상을 포함한다:
D. 중배엽 세포를 분류하여 SSEA5- KDR+NCAM+APLNR+ 세포에 대해 선택하는 단계;
E. Fc-NRP-1과 함께 중배엽 유도를 겪는 세포를 배양하는 단계;
F. 하나 이상의 miRNA 억제제, 하나 이상의 miRNA 모방체, 또는 이들의 조합물과 함께 중배엽 유도를 겪는 세포를 배양하는 단계;
G. 분리된 중배엽 세포의 내피 계통의 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
H. 내피 계통의 분화된 세포로부터 ECFC-유사 세포를 분리하는 단계.
상기 언급된 방법의 각각의 단계는 본원의 하기에 추가로 기재된다.
A. 다능성 줄기 세포 배양
일 양태에서, 시험관 내에서 다능성 세포로부터 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 분리된 집단을 생성하는 방법이 제공된다. 본 발명의 개시의 방법에 사용하기 적합한 다능성 세포는 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 다능성 세포의 한 유형은 주머니배의 내세포집단으로부터 유래된 배아 줄기(ES) 세포이다. 마우스, 레서스(rhesus) 원숭이, 비단 마모셋(common marmoset), 및 인간과 같은 다양한 유형의 ES 세포를 획득하는 방법은 널리 공지되어 있다. 본 방법에 사용되는 ES 세포의 공급원은, 예를 들어, 하나 이상의 확립된 ES 세포주일 수 있다. 다양한 ES 세포주가 공지되어 있고, 이들의 성장 및 증식을 위한 조건이 정의되었다. 실제로 임의의 ES 세포 또는 ES 세포주가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 일 구현예에서, 다능성 세포는 재프로그래밍 체세포에 의해 유래되는 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포이다. 유도된 다능성 줄기 세포는 다양한 공지된 방법에 의해 획득되었다. 실제로 임의의 iPS 세포 또는 세포주가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 다른 구현예에서, 다능성 세포는 체세포 핵 전달에 의해 유래된 배아 줄기 세포이고, 여기서 공여체 핵은 방추-비함유 난모세포로 수송된다. 핵 전달에 의해 줄기 세포를 생성하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 체세포 핵 전달에 의해 유래되는 실제로 임의의 ES 세포 또는 세포주가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다.
일 구현예에서, 다능성 세포는 다능성 세포를 미분화된 상태로 유지하기에 적합한 조건 하에 배양된다. 시험관 내에서 다능성 세포를, 즉 미분화된 상태로 유지하는 방법은 널리 공지되어 있다. 일 구현예에서, 다능성 세포는 다능성 세포를 미분화된 상태로 유지하기에 적합한 조건 하에서 약 2일 동안 배양된다. 예를 들어, 하기 실시예에서, hES 및 hiPS 세포는 10 cm2 조직 배양 접시의 Matrigel™ 상의 mTeSR1 완전 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 약 2일 동안 유지되었다.
다능성 세포를 배양하고/하거나 유지하기 위한 추가적인 및/또는 대안적인 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 기본 배양 배지로서, TeSR, mTeSR1 알파.MEM, BME, BGJb, CMRL 1066, DMEM, 이글(Eagle) MEM, 피셔 배지(Fischer's media), 글라스고우(Glasgow) MEM, Ham, IMDM, 개선된 MEM 아연 옵션(Zinc Option), 배지 199 및 RPMI 1640 중 어느 하나, 또는 이들의 조합물이 다능성 세포를 배양하고/거나 유지하는데 이용될 수 있다.
사용되는 다능성 세포 배양 배지는 혈청을 함유할 수 있거나, 혈청-비함유일 수 있다. 혈청-비함유는 처리되지 않거나 정제되지 않은 혈청을 포함하지 않는 배지를 나타낸다. 혈청-비함유 배지는 정제된 혈액-유래 성분 또는 동물 조직-유래 성분, 예를 들어, 성장 인자를 포함할 수 있다. 사용되는 다능성 세포 배지는 혈청에 대한 하나 이상의 대용물, 예를 들어, 넉아웃 혈청 대체물(knockout Serum Replacement; KSR), 화학적으로-정의된 지질 농축물(Gibco) 또는 글루타맥스(Gibco)를 함유할 수 있다.
다능성 세포를 분할하거나 계대하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서, 다능성 세포를 플레이팅한 후에, 배지를 2, 3, 및 4일에 교환하고, 세포를 5일에 계대하였다. 일반적으로, 배양 용기가 가득차면(즉, 70-100% 컨플루언스), 용기의 세포 덩어리가 분리에 적합한 임의의 방법에 의해 응집된 세포 또는 단일 세포로 분할되고, 응집된 세포 또는 단일 세포는 계대를 위해 새로운 배양 용기로 옮겨진다. 세포 "계대배양" 또는 "분할"은 세포 생존을 유지하고, 연장된 기간 동안 세포를 시험관 내에서 성장시키는 널리 공지된 기술이다.
B. 다능성 세포의 중배엽 세포로의 유도된 분화.
개시된 방법의 일 양태에서, 시험관내 다능성 세포는 "중배엽 유도"의 단계로도 언급되는 중배엽 분화를 겪도록 유도된다. 중배엽 계통의 세포로 다능성 세포의 분화를 유도하기 위한 배양 조건을 포함하는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 본원에 제공된 프로토콜에서, 다능성 세포의 분화를 화학적으로 정의된 배지에서 유도하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Stemline II 혈청-비함유 조혈 증식 배지가 기본 중배엽 분화 배지로서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 프로토콜에서, 다양한 성장 인자를 이용하여 중배엽 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진한다. 예를 들어, 액티빈 A, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF-2) 및 골 형태형성 단백질 4(BMP-4)가 화학적으로 정의된 분화 배지에 포함되어 중배엽 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 유도한다.
본원에 제공된 프로토콜의 일 구현예에서, 기본 배양 배지(예를 들어, mTeSR1)에서 배양 2일(-D2) 후에, 세포를 유효량의 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지와 24시간 동안 접촉시킴에 의해 중배엽 계통으로의 다능성 세포의 분화가 유도되었다. 분화 24시간 후에, 상기 중배엽 분화 배지를 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체함에 의해 액티빈 A가 배양액으로부터 제거되었다. 본 발명자에게 "유효량"이라 함은 중배엽 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진하기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지의 추가 대체는 약 3일 동안(즉, D4까지) 1-2일마다 수행될 수 있다.
액티빈 A는 다중 경로를 통해 세포 분화를 활성화시키는 것으로 공지된 TGF-B 상과의 구성원이다. 액티빈-A는 중배엽 선별(specification)의 활성화를 촉진하지만, 내피 선별 및 후속 내피 증폭에는 중요하지 않다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 액티빈 A를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 액티빈 A를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
골 형태형성 단백질-4(BMP-4)는 성인 골수(BM)에서 발현되고, 조혈 전구 세포의 증식 및 분화 잠재성을 조절하는데 관여하는 배쪽 중배엽 유도인자이다. 추가로, BMP-4는 인간 태아, 신생아, 및 성인 조혈 전구 세포에서의 초기 조혈 세포 발생을 조절할 수 있다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 BMP-4를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 BMP-4를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 배아 순환계 형성 및 혈관형성에 관여하는 신호전달 단백질이다. 시험관 내에서, VEGF는 내피 세포 유사분열유도 및 세포 이동을 자극할 수 있다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 VEGF를 약 5-50 ng/mL의 농도로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 VEGF를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 VEGF165를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
bFGF 또는 FGF-2로도 언급되는 염기성 섬유모세포 성장 인자는 사지 및 신경계 발생, 상처 치유, 및 종양 성장을 포함하는 다양한 생물학적 과정과 관련되어 있다. bFGF는 인간 배아 줄기 세포의 영양세포-독립적 성장을 지지하는데 사용되어 왔다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 FGF-2를 약 5-25 ng/mL의 농도로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 중배엽 분화 배지는 FGF-2를 약 10ng/mL의 농도로 포함한다.
본원에 개시된 방법은, 예를 들어, OP9 간질 세포와 같은 지지 세포와의 공동-배양을 필요로 하지 않고, 배아 몸체(EB) 형성을 필요로 하지 않고, 외인성 TGF-β 억제를 필요로 하지 않는다.
C. KDR
+
NCAM
+
APLNR
+
(KNA
+
) 중배엽 세포 분리
일 양태에서, KDR+NCAM+APLNR+ 세포는 중배엽 분화를 겪도록 유도된 세포의 집단으로부터 선택되고 분리된다. 하나 이상의 특정 분자 마커를 갖는 세포를 선택하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 형광-활성화 세포 분류, 또는 자기-활성화 세포 분류를 포함하는 흐름세포측정법에 의한 다양한 전사물의 발현을 기초로 하여 선택될 수 있다.
일 구현예에서, KDR+NCAM+APLNR+ 세포는 분화 4일에 본원에 기재된 바와 같은 중배엽 분화를 겪는 세포의 집단으로부터 선택된다. 바람직한 일 구현예에서, KDR+ 세포는 중배엽 분화를 겪는 세포의 집단 및 이후 선택된 KDR+ 세포로부터 선택되고, NCAM+APLNR+ 세포가 선택되어, KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 집단이 생성된다.
하기 실시예에서, 중배엽 세포가 분화 4일 후에 수확되고, 단일 세포 현탁액으로 제조되었다. 세포가 계수되고, KDR, NCAM 및 APLNR에 대한 항-인간 항체를 이용한 항체 염색을 위해 제조되었다. KDR+NCAM+APLNR+ 세포가 게이팅/선택되고, 흐름세포측정법을 이용하여 분류되었다.
본원에서 확인된 중배엽 서브셋은 인간 중배엽의 공지된 서브셋과 일치하는 유전자 생성물을 나타낸다. 이들 특정 중배엽 서브셋은 인간 ECFC를 발생시키는 것으로 이전에 언급된 적이 없다.
일 구현예에서, 선택된 세포는 생체 내 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다. 이러한 결과는 예기치 않은 것이었다. 특정 유형의 중배엽은 초기 인간 발달에서 발현되며, 혈관모세포 세포(내피 세포로 추가로 분화하는 첫번째 중배엽-유래 세포)를 발생시키는 세포는 배아외/측판 중배엽으로부터 유래되는 것으로 예상된다. 따라서, 당업자는 중배엽 세포가 특정 장소에서 특정 시간에 분화하여 혈관형성을 통해 첫번째 혈관을 형성할 것을 예측할 것이다. 당업자는 적어도 성체 마우스에 존재하는 중배엽 세포가 없으므로(이들은 배아형성 동안 이미 계통 운명에 전념되었고, 이제 이들의 특정 계통 자손에 의해서만 표현됨), 중배엽 세포가 성체 면역결핍 마우스에서 ECFC를 발생시키고, 인간 혈관을 형성하는 능력을 나타내는지 예측하지 못한다.
D. SSEA5
-
KDR
+
NCAM
+
APLNR
+
세포의 선택
일 구현예에서, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포는 분화 4일에 본원에 기재된 바와 같은 중배엽 분화를 겪는 세포의 집단으로부터 선택된다. 바람직한 일 구현예에서, SSEA5-KDR+ 세포는 중배엽 분화를 겪는 세포의 집단 및 이후 선택된 SSEA5-KDR+ 세포로부터 선택되고, NCAM+APLNR+ 세포가 선택되어, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 집단이 생성된다.
본 발명자는 SSEA5 항체를 이용한 4일 분화된 세포의 음성 선택이 4일 분화된 세포로부터 분화되지 않거나 부분적으로 분화된 hiPSC 혼합물의 확인 및 이후의 제거를 가능하게 함을 발견하였다. 이는 동일한 동물에서 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포 및 KDR+NCAM+APLNR+ 세포(SSEA5에 대한 음성 선택 없음)의 생체 내 이식을 수행함으로써 달성되었다. 하나의 복부쪽에 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포를 투여하였고, 동일한 동물의 다른 복부쪽에 KDR+NCAM+APLNR+ 세포를 투여하였다. 이식된 KDR+NCAM+APLNR+ 세포는 혈관 및 내배엽 유도체를 형성한 반면, 이식된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포는 혈관을 형성하였고, 내배엽 및/또는 기형종을 형성하지 않았다. 따라서, 본원에 제공된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 한 장점은 이들이 내배엽 유도체의 형성 없이 생체 내에서 선택적 ECFC 혈관 형성을 달성하기 위해 사용될 수 있다는 점이다.
E. Fc-NRP-1을 이용한 중배엽 유도
본 발명자는 중배엽 유도를 겪는 세포에서 KDR 신호전달을 자극하는 것이 중배엽 생성을 증가시킬 수 있다고 생각하였다. 본원에 제공된 프로토콜의 일 구현예에서, 액티빈-A 함유 배지에서의 분화 24시간 후, 중배엽 분화 배지가 유효량의 Fc-NRP-1, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체되었다. 본 발명자에게 "유효량"이라 함은 중배엽 계통의 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진하기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 Fc-NRP-1, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지의 추가 대체는, 예를 들어, 약 3일 동안(즉, D4까지) 1-2일마다 수행될 수 있다. 본 발명자는 중배엽 유도 프로토콜로의 Fc-NRP-1의 첨가가 중배엽 생성을 개선시킨 것을 발견하였다. 이러한 결과는 적어도 NRP-1(Fc-NRP-1은 NRP-1에 대한 대용물로 작용함) 및 VEGF165(Fc-NRP1 또는 내인성 NRP-1에 결합하는 리간드)가 중배엽 유도를 겪는 세포에서 발현되지 않으므로 놀라운 일이다. KDR 신호전달을 활성화시키는 것으로 공지된 다른 분자는 VEGF165 및 NRP-1이다. 그러나, 본 발명자의 연구는 이들 분자 중 어느 것도 4일 중배엽 분화를 겪는 세포에서 내인성으로 발현되지 않음을 제시한다. KDR 신호전달을 활성화시킴으로써 중배엽 형성을 향상시킬 수 있는 가용성 분자(배양 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있음)의 본 발명자의 확인이 ECFC 중배엽 세포의 생성을 증가시키는데 유리하다.
F. miRNA 억제제 및/또는 모방체를 이용한 중배엽 유도.
본원에 제공된 프로토콜의 일 구현예에서, 중배엽 분화를 겪도록 유도된 세포는 하나 이상의 miRNA 억제제, 모방체, 또는 이들의 조합물에 노출된다. 본 발명자는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포에서 하향조절되는 miRNA의 한 세트(miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559, miR-543, miR-361-3p, miR-30d-5p, miR-124-3p 및 miR-185-5p) 및 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포에서 상향조절되는 것으로 확인된 miRNA의 한 세트(miR-330-5p, miR-145-5p, miR-214-3p 및 miR-497-5p)를 확인하였다. 본 발명자는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포에서 상향조절되는 특정 miRNA를 모방하는 하나 이상의 제제를 이용한 중배엽 유도를 겪는 세포의 형질감염이 PSC로부터 생성되는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 빈도를 증가시키는 것을 발견하였다. 본 발명자는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포에서 하향조절되는 것으로 확인된 특정 miRNA를 억제하는 하나 이상의 제제를 이용한 중배엽 유도를 겪는 세포의 형질감염이 PSC로부터 생성되는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 빈도를 증가시키는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 특정 miRNA 모방체 및 억제제의 조합물을 이용한 중배엽 유도를 겪는 세포의 형질감염이 PSC로부터 생성되는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포의 빈도를 증가시키는 것을 발견하였다.
본원에 제공된 프로토콜의 일 구현예에서, 기본 배양 배지에서 배양 2일(-D2) 후에, 세포를 유효량의 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지와 24시간 동안 접촉시킴에 의해 중배엽 계통으로의 다능성 세포의 분화가 유도되었다. 이러한 처음 24시간 동안(즉, D0에서), 세포는 i) 3개의 miRNA 모방체; ii) 3개의 miRNA 억제제; iii) 3개의 miRNA 모방체 및 3개의 miRNA 억제제; 또는 iv) 대조군의 4개 처리 중 하나로 형질감염되었다. 24시간의 분화 후에, 상기 중배엽 분화 배지를 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체함에 의해 액티빈 A가 배양액으로부터 제거되었다. 세포는 중배엽 유도 2일째에 다시 동일 처리로 형질감염되었다. 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지의 추가 대체는 약 3일 동안(즉, D4까지) 1-2일마다 수행될 수 있다. 4일째에, 세포가 상기 기재된 바와 같이 분류되고 분리되었다.
G. 내피 계통의 세포로의 분리된 중배엽 세포의 유도된 분화.
개시된 방법의 일 양태에서, 분리된 중배엽 세포는 내피 분화를 겪도록 유도된다. 내피 계통의 세포로 중배엽 세포의 분화를 유도하기 위한 배양 조건을 포함하는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜에서, 내피 세포의 분화를 화학적으로 정의된 배지에서 유도하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Stemline II 혈청-비함유 조혈 증식 배지가 기본 내피 분화 배지로서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜에서, 다양한 성장 인자를 이용하여 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 다능성 세포의 세포의 분화를 촉진한다. 예를 들어, VEGF, FGF-2 및 BMP-4가 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 분리된 중배엽 세포의 분화를 유도하기 위해 화학적으로 정의된 분화 배지에 포함된다.
본원에 제공된 ECFC-유사 세포 프로토콜의 일 구현예에서, 분리된 중배엽 세포는 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지와 함께 배양된다. 본 발명자에게 "유효량"이라 함은 ECFC-유사 세포를 포함하는 내피 계통의 세포로의 분리된 중배엽 세포의 분화를 촉진하기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지의 추가 대체는 1-2일마다 수행될 수 있다.
본원에 개시된 방법은, 예를 들어, OP9 간질 세포와 같은 지지 세포와의 공동-배양을 필요로 하지 않고, 배아 몸체(EB) 형성을 필요로 하지 않고, 외인성 TGF-β 억제를 필요로 하지 않는다.
H. 분화된 내피 세포로부터의 ECFC-유사 세포 분리.
본원에 개시된 방법의 일 구현예에서, 내피 분화를 겪는 세포의 집단으로부터 CD31+NRP-1+ 세포가 선택되고 분리된다. 예를 들어, 일 구현예에서, CD31+NRP-1+ 세포는 분화 10, 11 또는 12일에 본원에 기재된 바와 같이 내피 분화를 겪는 세포의 집단으로부터 선택된다. 바람직한 일 구현예에서, CD31+NRP-1+ 세포는 분화 12일에 내피 분화를 겪는 세포의 집단으로부터 선택된다. 본 발명자는 내피 분화를 겪는 세포의 12일 집단이 다른 분화일에 존재하는 세포 집단에 비해 더 높은 백분율의 NRP-1+ 세포를 함유하는 것을 발견하였다.
하기 실시예에서, 부착성 EC가 분화 12일 후에 수확되고, 단일 세포 현탁액으로 제조되었다. 세포가 계수되고, 항-인간 CD31, CD144 및 NRP-1을 이용한 항체 염색을 위해 제조되었다. CD31+CD144+NRP-1+ 세포가 흐름세포측정법을 이용하여 분류되고 선택되었다.
일 구현예에서, 선택된 세포는 ECFC를 포함하는 EC에 전형적인 조약돌 형태를 나타낸다.
일 구현예에서, 선택된 세포는 ECFC에 전형적인 공동-배양 및/또는 공동-이식 세포의 부재하에서 생체 내 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다.
III. 분리된 세포 집단
분리된 중배엽 세포 집단
일 구현예에서, 인간 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단이 제공된다. 일 구현예에서, 제공된 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 정제된 인간 세포 집단이 본원에 개시된 hPSC로부터 중배엽 세포를 생성시키기 위한 시험관 내 방법을 이용하여 생성된다. 상기 집단의 분리된 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 ECFC를 발생시키는 능력 및 생체 내에서의 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다. 일 구현예에서, 상기 집단의 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 측판-배아외 중배엽 마커(예를 들어, BMP4, WNT5A, NKX2-5 및/또는 HAND1)의 증가된 발현을 추가 특징으로 한다. 일 구현예에서, 상기 집단의 KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 축 중배엽 마커(예를 들어, CHIRD 및/또는 SHH), 축옆 중배엽 마커(예를 들어, PAX1, MEOX1, 및 TCF15) 및/또는 중간 중배엽 마커(예를 들어, GOSR1, PAX2 및 PAX8)의 증가된 발현의 결여를 추가 특징으로 한다.
일 구현예에서, 인간 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단이 제공된다. 일 구현예에서, 제공된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 정제된 인간 세포 집단이 본원에 개시된 hPSC로부터 중배엽 세포를 생성시키기 위한 시험관 내 방법을 이용하여 생성된다. 상기 집단의 분리된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 생체 내에서의 ECFC 형성 및 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다. 일 구현예에서, 상기 집단의 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 측판-배아외 중배엽 마커(예를 들어, BMP4, WNT5A, NKX2-5 및/또는 HAND1)의 증가된 발현을 추가 특징으로 한다. 일 구현예에서, 상기 집단의 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포는 PSC에 비해 하나 이상의 축 중배엽 마커(예를 들어, CHIRD 및/또는 SHH), 축옆 중배엽 마커(예를 들어, PAX1, MEOX1, 및 TCF15) 및/또는 중간 중배엽 마커(예를 들어, GOSR1, PAX2 및 PAX8)의 증가된 발현의 결여를 추가 특징으로 한다.
바람직한 일 구현예에서, 분리된 중배엽 세포 집단은 실질적으로 순수하다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 4일에서 전체 살아 있는 세포의 28%는 KDR+NCAM+APLNR+이다. 일 구현예에서, 중배엽 분화 4일에서 전체 살아 있는 세포의 18%는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+이다.
분리된 ECFC-유사 세포 집단
일 구현예에서, 인간 NRP-1+/CD31+ ECFC-유사 세포의 분리된 집단이 제공된다. 일 구현예에서, 제공된 NRP-1+/CD31+ ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단이 본원에 개시된 hPSC로부터 ECFC-유사 세포를 생성시키기 위한 시험관 내 방법을 이용하여 생성된다.
하기 실시예에서, 본원에 개시된 방법은 중배엽 세포의 분리된 서브셋으로부터 NRP-1+ 및 CD31+ ECFC-유사 세포의 정제된 인간 세포 집단을 생성시키기 위해 이용된다. 상기 집단의 분리된 ECFC-유사 세포는 조약돌 형태를 나타내고, 공동-배양 및/또는 공동-이식 세포 없이 생체 내에서 혈관 형성에 대한 능력을 갖는다. 일 구현예에서, 상기 집단의 ECFC-유사 세포는 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 중 하나 이상을 추가 특징으로 한다.
일 구현예에서, 분리된 중배엽 세포로부터 생성된 집단 내의 ECFC-유사 세포의 적어도 일부는 본 발명자의 이전의 hPSC-ECFC-유사 세포 프로토콜을 이용하여 시험관 내에서 생성된 ECFC의 증식 잠재성과 유사한 높은 증식 잠재성을 갖는다.
바람직한 일 구현예에서, 분리된 ECFC-유사 세포 집단은 실질적으로 순수하다.
본원의 실시예에서, 개시된 중배엽 세포로부터 생성된 ECFC-유사 세포 집단 내의 세포는 지지 세포의 부재하에서도 포유동물에 생체 내 이식되는 경우 혈관을 형성할 수 있다.
생체 내 혈관 형성을 측정하기 위한 다양한 기술이 공지되어 있고 이용될 수 있다.
외인성 지지 세포의 부재하에서 생체 내에서 혈관을 형성하는 능력은 본원에 개시된 방법을 이용하여 생성된 세포가 ECFC라는 하나의 지표이다.
IV. 본원에 개시된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 용도
이전에 기재된 공지된 중배엽 세포주 및 다른 공지된 분리된 중배엽 세포와 대조적으로, 본원에 개시된 방법을 이용하여 생성된 중배엽 세포는 시험관 내에서 생성될 수 있고, 하기 기재되는 바와 같이 다양한 임상 적용을 위해 생체 내에서 혈관 조직을 형성시키는데 사용될 수 있다.
일차 세포인 ECFC와 대조적으로, 본원에 개시된 방법을 이용하여 생성된 ECFC-유사 세포는 하기 기재되는 바와 같이 다양한 임상 적용에 유용할 수 있는 부피로 시험관 내에서 생성될 수 있다.
A. 요법
일 양태에서, 세포 이식, 세포 보충, 및/또는 세포 또는 조직 대체에 적합한 방법, 세포 및 조성물이 본원에 제공된다. 상기 방법은 본원에 제공된 방법에 따라 유래된 치료적 유효량의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 제공하여, 대상체에 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명자에게 "치료적 유효량"이라 함은 상피 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하기에 효과적인 양을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상피 복구는 혈관 상피 복구이다. 본원에 제공된 세포 및/또는 조성물은 의도하는 조직 부위로 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포가 이식되거나 이동하고, 기능적 결손 부위, 예를 들어, 혈관을 재구성하거나 재생시키는 것을 허용하는 방식으로 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 받기에 적합한 대상체는 다양한 종류의 내피 기능장애 및/또는 손상을 갖는 대상체를 포함한다. 예를 들어, 심혈관 질환, 심근경색증, 심장 뇌졸중, 또는 말초 동맥 질환(PAD)을 갖는 대상체가 본 발명의 개시의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 받기에 적합한 대상체일 수 있다. 폐 또는 신장 질환 또는 손상을 갖는 대상체가 본 발명의 개시의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 받기에 적합한 대상체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 중증 사지 허혈(CLI)이 발생한 PAD 환자가 본 발명의 개시의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용한 요법을 받기에 적합한 대상체일 수 있다.
일 구현예에서, 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 인간 투여에 적합한 약학적 조성물의 형태로 대상체에 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 완충제, 또는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 생착 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 촉진하는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하거나, 이와 함께 대상체에 제공될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 또한 이식된 세포의 생존 및/또는 생착을 촉진하고/하거나, 혈관형성을 촉진하고/하거나, 세포외 또는 사이질 매트릭스의 조성을 조절하고/하거나, 이식 부위로 다른 세포 유형을 동원하는 하나 이상의 성장 인자 또는 사이토카인(예를 들어, 혈관형성 사이토카인)을 포함하거나, 이들과 함께 대상체에 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 적당한 멸균성 및 안정성을 제공하는 표준 방법에 따라 제형화되고, 생성되고, 저장될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 적절한 혈류가 부족한 조직에 직접 주입될 수 있다(의사에 의해 결정됨). 일 구현예에서, 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 콜라겐, 섬유결합소, 또는 합성 물질로 구성된 매트릭스에 현탁될 수 있고, 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 이러한 젤라틴성 현탁액은 적절한 혈류가 부족한 조직에 직접 주입될 수 있다. 조직에 주입되는 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 농도는, 예를 들어, 약 10,000 내지 약 100,000개 세포/전달 비히클 또는 매트릭스 물질의 마이크로리터로 다양할 수 있다. 일부 조직에서, 세포는 적절한 혈류의 회복에 의해 한 차례에 거쳐 전달될 수 있는 반면, 다른 조직들은 적절한 혈류를 구제하기 위해 시간 경과에 따라 다수의 주입과 순차적인 주입을 필요로 할 수 있다.
중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 대상체에 투여한 후에, 요망되는 경우, 치료 방법의 효과가 평가될 수 있고, 필요 또는 요구에 따라 치료는 반복될 수 있다. 치료 효능은, 예를 들어, 흉터 조직이 차지하는 면적의 감소, 흉터 조직의 재혈관화, 협심증의 빈도 및 중증도; 발생압, 수축기압, 확장말기압, 대상체 이동성 및/또는 삶의 질에서의 개선과 같은 당 분야에 공지된 임상적으로 허용되는 기준에 의해 모니터링될 수 있다.
ECFC 세포는 저산소증 및 신생혈관증식(neovascularization)로부터 눈을 구제할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용하여, 예를 들어, 미숙아 망막병증, 당뇨 망막병증, 중심 정맥 폐색, 또는 황반 변성과 같은 저산소증 및 신생혈관증식이 발생하는 다양한 안질환을 치료하는 것이 본원에서 고려된다.
혈관 스텐트 내부의 적어도 일부 및 선택적으로 스텐트 배치 동안 내피 세포가 벗겨진 혈관의 임의의 부위를 코팅하기 위해 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포가 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 이러한 경우에, 정맥내 주입된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 스텐트가 배치된 혈관 부위의 재협착 및/또는 혈병 형성을 방지하기 위해 손상 부위에 결합하여 혈관을 재내피화할 것이다.
혈류의 협착 및 차단 부위를 갖는 환자의 동맥으로 이식편으로서 인간 정맥(복재 또는 제대)의 배치는 후속 협착 및 차단된 혈류의 높은 발생률을 갖는 것이 공지되어 있다. 이는 생체 내에서 혈관 재형성의 과정에서 초기에 혈관 내피 세포의 손실과 관련된다. 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 이식된 이식편을 재-내피화하고, 환자에서 혈관의 기능을 보존하기 위해 상기 환자의 혈관계에 정맥내 주입될 수 있는 것으로 고려된다.
B. 시험 제제 스크리닝
본원에 개시된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포 및 그로부터 발생한 임의의 조직의 특징에 영향을 주는 인자(예를 들어, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경 조건(예를 들어, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 약학적 화합물과 같은 시험 제제는 내피 건강 및/또는 복구에 대한 이들의 효과를 결정하기 위해 본 발명의 개시의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 내피 세포에 대한 약리적 효과를 갖도록 설계되거나, 다른 효과를 갖도록 설계된 화합물이 내피 세포에 대한 의도치 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 스크리닝이 수행될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원의 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포는 시험 제제 스크리닝에 특히 유용한데, 그 이유는 적어도 이들이 배양된 다능성 세포로부터 시험관 내 분화되기 때문이다. 대조적으로, CB-ECFC는 환자 혈액으로부터 획득된 일차 세포이며, 이전에 공지된 분리된 중배엽 세포는 생체 내 혈관 형성 능력을 갖지 않는다. 시험 제제 화합물을 스크리닝하는 다양한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 본원에 개시된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포와 함께 이용될 수 있다.
예를 들어, 시험 제제의 활성을 스크리닝하는 것은 i) 본원에 개시된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 단독으로 또는 다른 제제와 함께 시험 제제와 조합시키고; ii) 미처리된 세포 또는 대조 제제로 처리된 세포에 비해 시험 제제에 기인할 수 있는 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 형태, 분자 표현형, 및/또는 기능적 활성에서의 변화를 결정하고; iii) 시험 제제의 효과와 관찰된 변화를 관련시키는 것을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포에 대한 시험 제제의 세포독성은 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포 생활력, 생존, 형태, 및 분자 표현형 및/또는 수용체 중 하나 이상에 대해 작용제가 갖는 효과에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포 기능은 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포의 표현형 또는 활성을 관찰하기 위한 표준 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양액 또는 생체 내에서 분자 발현, 수용체 결합 중 하나 이상이 본원에 개시된 중배엽 및/또는 ECFC-유사 세포를 이용하여 평가될 수 있다.
C. 키트
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 세포와 함께 사용하기 위한 키트가 고려된다. 일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 밀봉된 바이알 내에 본원에 기재된 바와 같은 분화 및/또는 성장 배지를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 세포, 예를 들어, 다능성 세포, 중배엽 세포 및/또는 ECFC-유사 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 miRNA 모방체, 하나 이상의 miRNA 억제제, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 Fc-NRP-1을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 다능성 세포로부터 중배엽 세포를 생성시키기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 다능성 세포로부터 ECFC-유사 세포를 생성시키기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 적합한 용기 및 패키징 재료 내에 본 발명의 개시와 함께 사용하기 위한 다양한 시약을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 적합한 용기 및 패키징 재료 내에 본 발명의 개시와 함께 사용하기 위한 하나 이상의 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명의 개시는 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 충분히 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
hPSC의 배양: 인간 배아 줄기 세포(hES) 세포주 H9(Thomson et al., 1998 Science; 282:1145-1147) 및 섬유모세포-유래 인간 iPS 세포주(DF19-9-11T)(Yu et al. 2009 Science 324:797-801)를 WiCell Research institute(Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다. hES 및 hiPSC 둘 모두를 10 cm2 조직 배양 접시의 마트리겔(Matrigel) 상의 mTeSR1 완전 배지(Stem Cell Technologies)에 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 세포를 플레이팅한 후에, 배지를 2, 3, 및 4일에 교환하였다. 세포를 5일에 계대배양하였다. 배지를 흡인하고, 4-5 mL의 디스파제(2 mg/mL, Gibco) 함유 배지를 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 3-5분 동안 또는 콜로니의 가장자리가 플레이트로부터 들릴 때까지 인큐베이션하였다. 디스파제 함유 배지를 플레이트로부터 흡인하고, 세포를 DMEM-F12(Gibco)로 가볍게 3회 세척하여 임의의 잔여량의 효소를 제거하였다. 이후, 신선한 배지를 이용하여 플레이트로부터 강력한 세척을 이용하고 5 mL 일회용 피펫으로 스크레이핑하여 거품이 생기지 않도록 조심하면서 콜로니를 수집하였다. 이후, 수집된 콜로니를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 mTeSR1 완전 배지에 재현탁시켰다. 계대 전에, 10 cm2 조직 배양 접시를 마트리겔로 30분 동안 코팅하였다. 부착되지 않은 마트리겔을 조직 배양 접시로부터 제거하고, 7 mL의 mTeSR1 완전 배지를 접시에 첨가하였다. mTeSR1 배지에 균일하게 분포된 콜로니를 각각의 플레이트에 첨가하였다. 이후, 세포를 임의의 소용돌이를 피하면서 접시 내에 여러 번의 좌우 쉐이킹 모션을 이용하여 스프레딩하였다. 배양물을 이전에 기재된 바와 같이 기형종 형성 검정(Broxmeyer et al., 2011 Blood; 117:4773-4777)을 수행함으로써 성장 품질 및 형태에 대해 검사하였다.
중배엽 세포로의 hPSC의 유도된 분화: mTeSR1 배지에서의 배양 2일(-D2) 후에, FGF-2, VEGF165, 및 BMP4(10 ng/mL)의 존재 하에 액티빈 A(10 ng/mL)를 첨가하여 중배엽 계통으로 24시간 동안 배양물을 유도하였다. 다음 날(D1), 액티빈-A 함유 배지를 제거하고, FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D)를 함유하는 8 mL의 Stemline II 완전 배지(Sigma)로 대체하였다. 배지를 3일에 8 ml의 신선한 Stemline II 분화 배지로 대체하였다. 4일에, KNA + 중배엽 세포 또는 SSEA5 - KNA + 중배엽 세포에 대한 흐름세포측정법에 의한 분류를 위해 세포를 수집하였다.
ECFC -유사 세포를 포함하는 EC 계통으로의 KNA + 중배엽 세포 또는 SSEA5 -KNA+ 중배엽 세포의 유도된 분화: 4일에 분류된 중배엽 세포(KDR+NCAM+APLNR+ 또는 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+)를 FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D)를 함유하는 8 mL의 Stemline II 완전 배지(Sigma)로 추가로 배양하였고, 6, 8, 10 및 12일에 대체하였다. 10일에 그리고 그 후에 배지를 10 mL의 Stemline II 분화 배지로 교환하였다.
흐름세포측정법: 분화한 지 12일 후에, 부착 세포를 TrypleE를 이용하여 수집하고, EGM-2 배지에서 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 세포를 계수하고, 세포 현탁액의 분취액을 항체 염색을 위해 제조하였다. FcR 차단 시약(Miltyni Biotech)을 첨가하여 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 항-인간 CD31(CD31-FITC, BD Pharmingen으로부터의 클론 WM59), CD144(CD144-PE, ebioscience로부터의 클론 16B1) 및 NRP-1(NRP-1-APC, Miltenyi Biotech로부터의 클론 AD5-176) 항체를 사용 전에 적정된 농도로 사용하였다. 프로피듐 요오다이드(PI, Sigma)를 사멸 세포 염색을 위해 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 표면 항원의 흐름세포측정 검출 및 세포 분류를 각각 LSR II 및 FACS Aria(Becton Dickinson) 상에서 수행하였다. 제대혈 유래 ECFC를 이용한 단일 양성 대조군에 의해 보상이 설정되었다. 표적화된 세포 집단의 게이팅은 각 형광 컬러에 대한 FMO(fluorescent minus one) 대조군에 기반하여 결정되었다.
분류된 세포의 세포 배양: CD31+, CD144+ 또는 KDR+ 및 NRP-1+ 분류된 세포를 300 X g에서 5분 동안 원심분리한 후, 50% EGM-2 및 50% 완전 Stemline II 분화 배지에 재현탁시켰다. 분류된 집단으로부터 ECFC를 생성하기 위해, 웰 당 2500개 세포를 래트 꼬리 타입 I 콜라겐-코팅된 12웰 플레이트에 시딩하였다. 2일 후에, 배지를 흡인하고, EGM-2의 세 부분 및 분화 배지의 한 부분을 배양액에 첨가하였다. ECFC 콜로니는 빽빽한 부착 세포로 나타났고, 7일에 조약돌 형태를 나타내었다. 가끔, 클로닝 실린더를 이용하여 이종성 세포 집단으로부터 ECFC 콜로니를 분리하였다. 이전에 기재된 바와 같이 내피 세포 클러스터의 클로닝을 수행하여 매우 증식성인 내피 세포의 순수한 집단을 분리하였다(Yoder et al., 2007; Ingram et al., 2005). 이전에 기재된 바와 같이, cm2 당 10,000개 세포를 시딩 밀도로서 플레이팅함에 의해 컨플루언트 ECFC를 계대하고, 격일로 배지를 교환하면서 ECFC를 완전 내피 성장 배지(콜라겐 코팅된 플레이트 및 cEGM-2 배지)에 유지시켰다.
면역화학: ECFC를 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정시키고, PBS에서 0.1%(v/v) TritonX-100으로 5분 동안 투과시켰다. 10%(v/v) 염소 혈청으로 30분 동안 차단한 후, 세포를 하기 일차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다: 항-CD31(Santa Cruz), 항-CD144(ebioscience), 항-NRP-1(Santa Cruz) 및 항-a-SMA, (Chemicon). 세포를 PBS로 세척한 후, Alexa-488 또는 Alexa-565(Molecular Probe)와 컨쥬게이션된 이차 항체와 인큐베이션하고, 2 g/ml DAPI(Sigma-Aldrich)에 의한 대조염색 후에 공초점 현미경에 의해 가시화하였다. 공초점 이미지를 Olympus uplanSApo 60xW/1.2NA/eus를 대물렌즈로서 이용한 Olympus FV1000 mpE 공초점 현미경으로 획득하였다. 모든 이미지를 실온에서 개별 10μ 두께 섹션을 지닌 Z-스택으로서 촬영하였고, 이미지를 FV10-ASW 3.0 뷰어를 이용하여 분석하였다.
마우스: 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 이용에 대한 지침에 따라 수행되었고, 인디애나 의과 대학(Indiana University School of Medicine)에 있는 동물 실험 윤리 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다(IACUC 프로토콜 # 10850). 수컷 및 암컷 둘 모두의 6-12주령 NOD/SCID 마우스(T- 및 B-세포 결핍, 손상된 보체)를 모든 동물 연구에 이용하였다. NOD-SCID 마우스를 인디애나 대학 실험 동물 자원 센터(LARC)에서의 특이적-병원체-비함유 조건 하에 유지시켰다. 통계적으로 유의한 결과를 얻기 위해 필요한 동물의 최소 수를 결정하기 위해 이러한 동물 모델을 이용한 종래 연구를 이용하였다(Yoder et al., 2007). 종래 연구에서 이식된 10개 매트릭스 중 8개(한 마리의 동물이 2개의 매트릭스를 수용함)가 숙주 혈관계와 접합되고, 기능성 혈관을 지닌 그 8개 매트릭스(4마리 동물)가 통계적 유의성을 위해 각 그룹에 필요한 것으로 나타났다(Yoder et al., 2007). 각각의 실험 그룹에 샘플 및 동물을 할당하는 동안 무작위 방법은 사용하지 않았다. 또한, 연구자들은 실험 동안 및 결과를 평가할 때 두 경우 모두에 그룹 할당에 대해 맹검되지 않았다.
생체내 이식/혈관 형성 검정(기능 검정을 포함함): 돼지 피부 타입 I 콜라겐을 이용하여 이전에 기재된 바와 같이 3차원(3D) 소구획식 콜라겐 매트릭스를 생성하였다(Critser et al., 2010). 간단히 말해, 얼음-냉각된 돼지 피부 콜라겐 용액을 0.01N HCL에서 10% v/v 인간 혈소판 용해질과 함께 혼합시킴에 의해 타입 1 콜라겐 젤 혼합물을 제조하고, 포스페이트 완충된 염수 및 0.1N NaOH로 중화시켜 중성 pH(7.4)를 달성하였다. 중화된 젤 혼합물(약 1.5 mg/mL)을 5% CO2에서 37℃로 가온시킴에 의해 중합반응을 유도하기 전에 얼음 위에 유지시켰다. KNA+ 중배엽 세포 또는 SSEA-KNA+ 중배엽 세포 또는 SSEA-KNA+-유래 NRP-1+CD31+ ECFC를 4백만 개 세포/콜라겐 ml의 최종 농도로 콜라겐 혼합물에 첨가하였다. 콜라겐 혼합물(250 μL) 함유 세포 현탁액을 48-웰 조직 배양 접시에 첨가하고, 중합시켜 CO2 인큐베이터에서 37℃로 30분 동안 인큐베이션시킴에 의해 젤을 형성하였다. 이후, 젤에 37℃로 5% CO2에서 500 μl의 배양 배지를 30분 동안 입혔다. 1시간의 생체 외 3D 배양 후, 소구획식 젤을 이전에 기재된 바와 같이 6 내지 12주령 NOD/SCID 마우스의 옆구리(숙주 혈관계와 근접한 전방 복부벽의 뭉툭하게 절개된 피하 주머니)에 이식하였다{Yoder, 2007 #71}. 콜라겐 젤을 이식하기 위한 수술 절차는 마취 및 산소의 지속적인 공급 하에 수행하였다. 절개를 봉합하고, 마우스의 회복을 모니터링하였다. 이식한 지 여러 날 후, 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 인도적으로 희생된 동물에서 접목부를 절제함에 의해 겔을 회수하였다. 이전에 기재된 바와 같이 마우스 적혈구 세포로 관류된 인간 내피-라이닝된 혈관에 대해 젤을 검사하기 위해 H&E 및 항-인간 CD31(및 NRP-1) 염색을 이용하여 공초점 형광 영상화 및 면역조직화학을 수행하였다. Spot-KE 디지털 카메라(Diagnostic Instruments)가 부착된 Leica DM 4000B 현미경(Leica Microsystems)을 이용하여 hCD31+ 혈관을 각 체외이식편으로부터 이미지화하였다. 기능성 혈관을 이들이 적어도 1개의 마우스 적혈구를 함유한 경우에만 계수하였다. Olympus-FV-1000 MPE 도립 공초점/2P 시스템을 이용하여 NRP-1+CD31+ 혈관을 검사하였다.
유전자 및 miRNA 발현 분석: 역전사효소(RT) 반응을 GeneAmp PCR 9700 Thermocycler(Applied Biosystems)에서 수행하였다. mRNA RT 반응을 Transcriptor Univessal cDNA Master(Roche)를 이용하여 수행하였다. cDNA를 생성시키기 위해 특정 관심 miRNA에 대해 특정 miRNA 프라이머를 사용하였다. 주형 또는 프라이머가 없는 RT 반응을 대조군으로 이용하였다. 유전자 및 miRNA 발현 수준을 ABI 7300 RT-PCR System(Applied Biosytems)을 이용하여 정량하였다. mRNA에 대한 정량적 PCR을 FastStart Universal SYBR green master(Rox)(Roche)를 이용하여 수행하였다. miRNA 및 mRNA에 대한 특정 프라이머가 있거나 없는 비교 실시간 PCR을 삼중으로 수행하였다. mRNA 반응을 10분 동안 95℃ 후, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40주기로 수행하였다. miRNA 반응을 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40주기로 수행하였다. 상대 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다(Lee et al., 2013).
ECFC 단일 세포 증식 검정: KNA + 또는 SSEA5 - KNA + 중배엽 세포-유래 ECFC를 단일 세포 검정에 적용하여 클론원성 증식 잠재성을 평가하였다. 간단히, 내피 세포를 trypLE Express(Invitrogen)로 처리하여 단일 세포 현탁액을 획득하였다. 세포 계수 및 연속 희석을 수행하여 96-웰 배양 플레이트의 개별적 웰에 웰 당 0.68개의 세포의 농도를 검사하였다. 웰을 웰 당 단일 세포의 존재를 보장하기 위해 플레이팅 다음날 시험하였다. 배양 배지를 4, 8, 및 12일에 교환하였다. 배양 14일에, 세포를 Sytox 시약(Invitrogen)으로 염색하고, 각각의 웰을 형광 현미경을 이용하여 세포의 수를 정량하기 위해 검사하였다. 2개 이상의 세포를 함유하는 웰을 10x CP-ACHROMAT/0.12 NA 대물렌즈를 갖는 Zeiss Axiovert 25 CFL 도립 현미경을 이용하여 10x 배율로 형광 현미경 하에서 증식에 대해 양성으로 확인하였다. 2-50, 51-500, 501-2000 및 2001 이상의 내피 세포 수를 갖는 웰을 이전에 기재된 바와 같이 내피 세포 클러스터(ECC), 낮은 증식 잠재성 ECFC(LPP) 및 높은 증식 잠재성 ECFC(HPP)로 표지하였다(Yoder et al., 2007; Ingram et al., 2005).
웨스턴 블롯 분석: 세포를 용해 완충액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 각각 1μg/ml의 아프로티닌 및 류펩틴)에 재현탁시킨 후, 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션시켜 세포 용해질을 제조하였다. 불용성 성분을 12,000 X g에서 15분 동안의 원심분리에 의해 제거하였다. 단백질 농도를 단백질 검정 키트(Bio-rad)에 의해 결정하였다. 단백질을 4-20% Tris-글리신 미니젤 상에서 전기영동에 의해 분리시킨 후, immobilon-FL PVDF 막(Millipore)으로 옮겼다. 차단 완충액에 의해 1시간 동안 실온에서 비특이적 결합을 차단하고, Odyssey 차단 완충액에서 포스포-PYK2(1:1,000; Cell Signaling) 및 포스포-p130Cas(1:1,000; Cell Signaling)에 대한 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 블롯을 0.1% Tween20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 항-토끼 항체(1:10,000; LI-COR)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 면역반응성 밴드를 Odyssey 적외선 이미저(LI-COR)를 이용하여 검출하였다.
Fc - NRP -1 처리 검정: mTeSR1 배지에서의 hiPSC 클럼프의 배양 2일(-D2) 후에, FGF-2, VEGF165, 및 BMP4(10 ng/mL)의 존재 하에 액티빈 A(10 ng/mL)를 첨가하여 중배엽 계통으로 24시간 동안 배양물을 유도하였다. 다음 날(D1), 액티빈-A 함유 배지를 제거하고, FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D) 및 500 ng/mL의 Fc-NRP-1(R&D)을 함유하는 8 mL의 Stemline II 완전 배지(Sigma)로 대체하였다. 3일째에 배지를 FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D) 및 500 ng/mL의 Fc-NRP-1(R&D)을 함유하는 8 mL의 신선한 Stemline II 분화 배지로 대체하였다. 4일에, SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에 대한 흐름세포측정법에 의한 분류를 위해 세포를 수집하였다.
miRNA 마이크로어레이 및 RNA 서열 분석: 전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen)을 이용하여 샘플로부터 분리시키고, RNA 품질을 이전에 기재된 바와 같이 검사하였다(Ginsberg et al., 2012, Cell 151:559-575). miRNA 마이크로어레이의 경우, miRNome miRNA PCR 어레이 플레이트, miScript II 역전사 반응 키트, 및 miScript SYBR Green PCR 키트(모두 Qiagen)를 이용하여 miRBase Release 16에 주석이 달린 바와 같은 인간 miRNA 유전체(miRNome)에서 1008개의 가장 풍부하게 발현되고 최적으로 특성규명된 miRNA 서열의 발현 프로파일을 검사하였다. RNA-seq 분석을 위해, RNA 서열 라이브러리를 1 μg의 고품질 전체 RNA를 이용하여 생성시키고, 시퀀싱을 이전에 기재된 바와 같이 Illumina HiSeq2000 시퀀서를 이용하여 수행하였다(Ginsberg et al., 2012). 생성된 서열 판독을 디폴트 파라미터를 갖는 TopHat를 이용하여 인간 유전체(hg18)로 맵핑하였고, RefSeq(June 2010) 전사물 수준(FPKM)을 CuffLinks를 이용하여 정량하였다.
miRNA 모방체 /억제제 처리 검정: mTeSR1 배지에서의 hiPSC의 단일 세포 현탁액의 배양 1일(-D2) 후에, FGF-2, VEGF165, 및 BMP4(10 ng/mL) 및 2.5 μg의 모방체 또는 억제제/100,000개의 시딩된 세포/6웰 플레이트의 웰(GE Dharacon)의 존재 하에 액티빈 A(10 ng/mL)를 첨가하여 중배엽 계통으로 24시간 동안 배양물을 유도하였다. 다음 날(D1), 액티빈-A 및 miRNA 모방체 또는 억제제 함유 배지를 제거하고, FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D)를 함유하는 2 mL의 Stemline II 완전 배지(Sigma)로 대체하였다. 2일째에 배지를 FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D) 및 2.5 μg의 모방체 또는 억제제를 함유하는 2 mL의 신선한 Stemline II 분화 배지로 대체하였다. 3일째에 배지를 FGF-2(Stemgent), VEGF165(R&D) 및 BMP4(R&D)를 함유하는 2 mL의 신선한 Stemline II 분화 배지로 대체하였다. 4일에, SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에 대한 흐름세포측정법에 의한 분류를 위해 세포를 수집하였다.
통계 분석: 모든 실험을 3중으로 3회 이상 수행하였고, 데이터는 통계 비교를 위해 평균 값 ± SD로 표현된다. 통계적으로 유의한 결과를 획득하는데 필요한 샘플 크기를 계산하기 위해 95% 신뢰 구간을 갖는 분석력을 이용하였다. 본 발명자가 사용한 샘플링 수는 정규 분포를 발생시켰다. 양측 스튜던츠 t-검정(two tailed student’s t-test) 또는 일원 ANOVA-터키 사후 검정 다중 비교 검정(one way ANOVA-Tukey post-hoc test Multiple Comparison Test)으로 차이의 유의성을 평가하였다.
실시예 2:
도 1a-1g를 이제 참조하여, 4일(D4) KDR+ 중배엽 세포(KNA+ 중배엽) 내의 NCAM 및 APLNR 공동-발현 세포는 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 내피 세포를 발생시켰다.
mTeSR1에서 배양된 인간 PSC를 2D, 혈청 및 영양세포 비함유 조건하에서 중배엽 세포로 분화하도록 유도하였다. PSC를 24시간 동안(즉, D0-D1) FGF-2(10ng/mL), BMP4(20 ng/mL), VEGF165(10 ng/mL) 및 액티빈-A(10 ng/mL)를 갖는 Stemline-II 배지에서 배양하였다(도 1a). D1에, 세포 배양 배지를 FGF-2(10ng/mL), BMP4(20 ng/mL), VEGF165(10 ng/mL)를 갖는 Stemline-II 배지로 대체하였다. 이러한 대체 배지를 3일 동안(즉, D1-D4) 중배엽 유도를 겪는 세포를 배양하는데 사용하였다.
4일에, 중배엽 세포로 분화하도록 유도된 세포를 분류하였다(도 1b). KDR+ 세포를 NCAM 및 APLNR 발현을 위해 게이팅하였다. KDR+NCAM+APLNR+(K+N+A+, 본원에서 KNA+로도 언급됨) 및 KDR+NCAM+APLNR-(K+N+A-) KDR+NCAM-APLNR-(K+N-A-) 세포를 NRP-1+CD31+ ECFC-유사 세포의 추가 분화 및 이의 출현에 대한 검사를 위해 분류하였다(도 1c). 다양한 분화일에 NRP-1+CD31+ 세포의 출현에 대해 검사하기 위해 분류된 K+N+A+, K+N+A- 및 K+N-A- 중배엽 서브셋을 또 다른 9일 동안(3 + 9, 전체 12일) ECFC 계통으로 추가로 분화시켰다(도 1d). 12일에, K+N+A+ 중배엽 분획은 균일한 조약돌 형태의 내피 단층을 형성하고, CD31 및 CD144 내피 마커에 대한 균일한 공동-발현을 나타내고, α-SMA 발현이 완전히 결여된 NRP1+CD31+ 세포를 발생시켰고(도 1d의 상단 패널), 이는 안정적인 ECFC-유사 표현형을 암시한다. 그러나, 다른 2개의 서브셋(즉, K+N+A- (도 1d의 중간 패널) 및 K+N-A- (도 1d의 하단 패널))으로부터 분리된 세포는 적절한 NRP-1 발현이 결여되었고, 이종성 세포 단일층을 형성하였고, CD144에 대한 발현을 나타내었으나, CD31 및 CD144 내피 마커에 대한 균일한 공동-발현이 결여되었고, 비-내피 마커 α-SMA에 대한 발현을 나타내었으며, 이는 안정적인 ECFC 표현형의 완전한 결여를 암시한다. K+N+A+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포는 2-50개 세포의 클러스터로부터 hiPSC-ECFC-유사 세포의 것과 유사한 2001개 초과의 콜로니에 이르는 콜로니 계층을 갖는 높은 클론 증식 잠재성을 나타내었다(도 1e). 그러나, 다른 2개의 서브셋(즉, K+N+A- 및 K+N-A-)으로부터 분리된 세포는 높은 클론 증식 잠재성을 나타내는데 실패하였다. K+N+A+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포는 hiPSC-ECFC-유사 세포(도 1f, 상단 좌측 패널)에 의해 성성된 것과 유사한 숙주 뮤린 적혈구 세포(도 1f, 상단 우측 패널; 화살표는 혈관을 나타냄)로 채워진 확실한 생체 내 인간 혈관을 생성하였다. 그러나, 다른 2개의 서브셋(즉, K+N+A- 및 K+N-A-)으로부터 분리된 세포는 숙주 뮤린 적혈구 세포로 채워진 확실한 생체 내 인간 혈관을 생성하는데 실패하였다(도 1f, 하단 좌측 및 우측 패널 각각; 화살표는 hCD31+ 기능성 혈관을 나타냄). 유사하게, 기능성 hCD31+ 혈관이 K+N+A+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포 hiPSC-ECFC-유사 세포에 의해 생성되었으나, K+N+A- 또는 K+N-A- 중배엽 세포에 의해 생성되지 않았다(도 1g).
도 2a-2c를 이제 참조하여, 상기 배양 프로토콜을 이용하여 분화 3-5일 후에 인간 iPS 세포는 중배엽 마커를 발현하고, 통상적인 내피세포 표면 마커 발현이 결여된 세포를 발생시킨다. APLNR+ 세포는 KDR+NCAM+ 중배엽 서브셋에서만 발견되었고, KDR-NCAM- 서브셋에서는 부재하였고(도 2a), KDR+ 세포는 3 및 4일에 가장 높은 수준으로 발견되었고, 시간 경과에 따라 감소하였다(도 2b). 통상적인 내피 마커(CD31, NRP-1 및 CD144) 발현은 임의의 4일 분화된 세포에서 발견되지 않았다(도 2c).
이제 도 3a-3b를 참조하여, SSEA5+ 세포에 대한 선택 없이 분리된 4일 KNA+ 중배엽 세포의 직접 생체 내 분화는 확실한 인간 혈관을 형성하였으나, 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 또한 생성하였다.
KDR+ 세포를 NCAM 및 APLNR 발현에 대해 게이팅하였다. APLNR+ 및 APLNR- 중배엽 세포를 추가의 직접 생체 내 이식 및 검사를 위해 분류하였다(도 3a). 분류된 APLNR- 중배엽 세포는 생체 내 이식 2개월 후에 기형종을 생성하였다(도 3b, 좌측 패널). APLNR+ 중배엽 서브셋(도 3b, 우측 패널)은 수반하는 내배엽-유래 세포 유사 유도체(분홍색의 채워진 화살표)와 함께 숙주 뮤린 적혈구 세포(청색의 빈 화살표)로 채워진 확실한 생체 내 인간 혈관을 형성하였다.
도 4a-4d를 이제 참조하여, D4 SSEA5 고갈된 KNA+ 중배엽 세포(즉, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+, SSEA5-KNA+로도 언급됨)의 직접 생체 내 분화는 기형종 또는 내배엽-유래 세포-유사 유도체를 발생시키지 않으면서 확실한 인간 혈관을 형성하였다.
4일 분화된 hiPSC를 SSEA5 및 KDR 발현에 대해 먼저 게이팅하였다(도 4a, 좌측). SSEA5-KDR+ 세포를 NCAM 및 APLNR 발현에 대해 게이팅하였다(도 4a, 우측). SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+(SSEA5-KNA+) 및 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR-(SSEA5-KNA-) 세포를 추가 분석을 위해 분류하였다. SSEA5-KNA+ 세포는 확실한 기능성 생체 내 혈관을 형성하였고(도 4b, 청색 화살표, 좌측 패널), SSEA5-KNA- 세포는 확실한 생체 내 혈관을 형성하는데 실패하였다(도 4b, 백색 화살표, 우측 패널). 유사하게, 기능성 hCD31+ 혈관이 SSEA5-KNA+ 세포에 의해 생성되었으나, SSEA5-KNA- 세포에 의해서는 생성되지 않았다(도 4c). 생체 내 이식되는 경우, SSEA5-KNA+ 세포는 이식 후 8일만큼 초기에 NRP-1+CD31+ ECFC 혈관을 형성하였다(도 4d).
도 5a-5c를 이제 참조하여, 4일 SSEA5 고갈 KNA+ 중배엽 세포는 측판/배아외 중배엽 세포에 통상적으로 농축된 전사물을 나타내었고, 시험관 내 ECFC 분화시 ECFC 적격성을 갖는 NRP-1+CD31+ 세포의 향상된 형성을 나타내었다.
유전자 발현 분석은 SSEA5-KNA+ 세포가 hiPSC에 비해 측판-배아외 중배엽 마커를 과발현하고, 축, 축옆 및 중간 중배엽 마커의 발현이 결여된 것을 나타내었다(도 5a). 분류된 SSEA5-KNA+ 세포를 또 다른 8일 동안(4 + 8, 전체 12일) ECFC-유사 계통으로 추가로 분화시켰다. 12일째에, SSEA5-KNA+ 세포는 ECFC-유사 계통으로 분화(즉, 분화 4일에 SSEA5-KNA+ 중배엽 서브셋을 분리함이 없이 12일 분화)하도록 유도된 hiPSC로부터 생성된 NRP-1+CD31+ 세포에 비해 3배 이상 더 많은 NRP-1+CD31+ 세포를 생성시켰다(도 5b; 좌측 패널, 막대 그래프). SSEA5-KNA+ 중배엽 세포로부터 유래된 NRP1+CD31+ 세포는 균일한 조약돌 형태의 내피 단일층을 형성하였고(도 5b, 좌측 중간 패널), CD31 및 CD144 내피 마커에 대한 균일한 공동-발현을 나타내었고(도 5b, 우측 패널), α-SMA 발현이 완전히 결여되었으며(도 5b, 우측 중간 패널), 이는 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포가 안정적인 ECFC-유사 표현형으로 분화할 수 있음을 암시한다. SSEA5-KNA+ 중배엽-유래 NRP-1+CD31+ 세포는 2-50개 세포의 클러스터로부터 hiPSC-ECFC의 것과 유사한 2001개 초과의 콜로니에 이르는 콜로니 계층을 갖는 높은 클론 증식 잠재성을 나타내었다(도 5c). 그러나, SSEA5-KNA- 중배엽 서브셋으로부터 분리된 세포는 높은 클론 증식 잠재성을 나타내는데 실패하였다(도 5c).
도 6a-6g를 이제 참조하여, 본 발명자는 Fc-NRP-1이 p130Cas/Pyk2 활성화를 통한 VEGF-KDR 신호전달을 매개하고, hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시키는 것을 발견하였다.
내피 세포에서의 NRP-1, KDR, Fc-NRP-1, NRP-1-B 및 VEGF165 기능이 도 6a에 제시된다. 간단히, NRP-1은 VEGF165 공동-수용체로 기능하고, VEGF165를 이의 수용체(KDR)로 가져온다. Fc-NRP-1은 막 NRP-1에 대한 대용물로 작용하고, VEGF165에 결합하고 이를 KDR로 가져온다. 대조적으로, NRP-1-B 차단 항체는 NRP-1의 VEGF165 결합 부위에 선택적으로 결합하여 NRP-1으로의 VEGF165의 결합을 특이적으로 차단한다.
KDR 및 p130Cas/Pyk2 인산화의 시험을 웨스턴 블로팅으로 수행하였다(도 6b 및 6c). KDR 인산화가 VEGF 자극된 그룹에서 관찰되었고, Fc-NRP-1 이량체 처리는 대조군 처리된 세포에 비해 KDR의 인산화를 증가시켰다. 그러나, NRP-1-B 처리된 세포에서 감소된 인산화가 관찰되었다. 유사하게, NRP-1-B 처리된 세포에 비해 Fc-NRP-1 이량체 처리된 세포에서 증가된 p130Cas/Pyk2 인산화가 관찰되었다.
hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 VEGF-A 아이소형의 유전자 발현을 조사하였다. VEGF-A 아이소형은 hiPSC와 비교하여 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 상향 조절되지 않았다(도 6d 및 6e).
Fc-NRP-1 이량체 및 성장 인자의 존재하에서 중배엽 유도를 겪는 세포를 배양하는 것을 포함하는 중배엽 계통 분화 프로토콜이 도 6f에 제시된다. 분화하는 hiPSC로의 이량체 Fc-NRP-1 처리는 Fc-NRP-1-미처리 세포에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 생성에서 2배 초과의 증가를 야기하였다(도 6g).
도 7a-7e를 이제 참조하여, 특이적 miRNA 모방체 miRNA 억제제 및 이들의 조합물은 hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 생성을 향상시킨다.
SSEA5-KNA+ 중배엽 형성과 관련된 miRNA 및 이의 추정 전사 인자 표적을 확인하기 위해, 본 발명자는 0일 미분화 hiPSC 및 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 miRNA 마이크로어레이 및 RNA-seq 분석을 수행하였다(도 7a). miRNA 및 mRNA 전사물의 발현의 본 발명의 분석은 hiPSC로부터의 SSEA5-KNA+ 중배엽 형성과 관련된 전사 인자를 잠재적으로 조절하는 공개되고 검증된 표적을 갖는 12개의 miR(miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559, miR-543, miR-361-3p, miR-30d-5p, miR-124-3p, miR-185-5p, miR-330-5p, miR-145-5p, miR-214-3p 및 miR-497-5p)을 나타내었다. 이들 12개의 후보 miRNA 중에서, 본 발명자는 8개의 miRNA(miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559, miR-543, miR-361-3p, miR-30d-5p, miR-124-3p 및 miR-185-5p)가 0일 미분화 hiPSC에 비해 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되고, 4개의 miRNA(miR-330-5p, miR-145-5p, miR-214-3p 및 miR-497-5p)가 0일 미분화 hiPSC에 비해 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 더 높은 수준으로 발현된 것을 발견하였다.
중배엽 계통 분화에 대해 확인된 miRNA를 모방하고/하거나 억제하는 효과를 결정하기 위해, 본 발명자는 특정 miRNA 모방체, miRNA 억제제, 모방체 및 억제제 둘 모두(3m3i), 또는 모방체/억제제 대조군의 존재하에서 hiPSC로부터 중배엽 생성을 유도하기 위한 프로토콜을 개발하였다(도 7b). 3개의 miRNA에 대한 특정 모방체(miR-330-5p, miR-145-5p 및 miR-214-3p), 3개의 miRNA에 대한 특정 억제제(miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559) 또는 조합된 3개의 모방체 및 3개의 억제제의 첨가는 대조군에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 빈도를 증가시켰다(도 7c). 이들 특정 모방체, 억제제, 또는 3m3i의 첨가는 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되는 것으로 확인(본 발명의 miRNA 어레이 분석에서 확인)된 대부분의 miRNA 의 발현을 감소시켰다(도 7d). 이들 특정 모방체, 억제제 또는 3m3i의 첨가는 4일 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 확인(본 발명의 miRNA 어레이 분석에서 확인)된 일부 miRNA의 발현을 증가시켰다(도 7e).
도 8a-8d를 이제 참조하여, miR-214-3p는 분화하는 hiPSC에서 CLDN6을 표적으로 하고, SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 형성을 향상시킨다.
miR-214 및 이의 추정 표적 CLDN6의 발현을 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 분석하였다. 본 발명자는 miR-214 및 CLDN6이 각각 hiPSC 및 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 역 발현 상관관계를 나타내는 것을 발견하였다(도 8a). miR-214는 hiPSC에 비해 SSEA5-KNA+ 세포에서 고도로 발현되고(도 8a, 좌측 막대), CLDN6은 hiPSC에 비해 SSEA5-KNA+ 세포에서 더 낮은 수준으로 발현된다(도 8a, 우측 막대). 분화하는 hiPSC에서의 miR-214의 과발현은 GFP 리포터 대조군 벡터에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포의 생성에서 2배 초과의 증가를 야기하였다(도 8b). 루시페라제 리포터 검정은 miR-214가 야생형(WT) CLND6의 발현을 직접 조절하는 것을 확인하였다(도 8c). hiPSC와 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포 사이의 차별적 유전자 발현 분석은 SSEA5-KNA+ 중배엽에서 감소된 12개의 검증된 miR-214 표적 중에서 CLND6이 가장 하향 조절된 유전자 중 하나인 것을 나타내었다(도 8d). 예를 들어, CLDN6은 hiPSC에서 측정된 수준에 비해 SSEA5-KNA+ 중배엽 세포에서 단지 4%만 발현된다.
비록 본 발명의 개시가 구체적인 특정 구현예를 참조하여 기재되었으나, 이의 다양한 변형이 여기에 첨부된 청구범위에 개요된 본 발명의 개시의 목적 및 범위를 벗어나지 않으며 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 제공된 임의의 실시예는 단지 본 발명의 개시를 예시하기 위한 목적으로 포함되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 개시를 제한하려는 것이 아니다. 본원에 제공된 임의의 도면은 단지 본 발명의 개시의 다양한 양태를 예시하기 위한 것이며, 일정한 비례로 그려지거나 어떠한 방식으로든 본 발명의 개시를 제한하려는 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 종래 기술의 개시는 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
Claims (27)
- 인간 다능성 줄기 세포로부터 인간 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
- 다능성 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계;
- 상기 다능성 줄기 세포가 중배엽 분화를 겪도록 유도하는 단계로서, 상기 중배엽 유도가,
i) 상기 다능성 줄기 세포를 약 24시간 동안 액티빈 A, BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지에서 배양하고;
ii) 단계 i)의 배지를 그 후 약 72시간 동안 약 24-48시간마다 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 중배엽 분화 배지로 대체하는 것을, 포함하는 단계; 및
- 분화를 겪도록 유도된 상기 세포로부터 상기 중배엽 세포를 분리하는 단계로서, 상기 중배엽 세포의 분리가,
iii) 상기 중배엽 세포를 분류하여 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 세포에 대해 선택하는, 단계를 포함하는, 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 중배엽 유도가 중배엽 유도를 겪는 세포와 Fc-NRP-1을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, Fc-NRP-1이 단계 ii)의 중배엽 분화 배지에 첨가되는 방법.
- 제1항에 있어서, 중배엽 유도가 중배엽 유도를 겪는 세포와 적어도 하나의 miRNA 억제제를 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 상기 miRNA 억제제가 PSC에 비해 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포에서 감소된 발현을 나타내는 miRNA를 억제하는 방법.
- 제5항에 있어서, miRNA 억제제가 miR-221-3p, miR-1271-5p, miR-559, miR543, miR-361-3p, miR-30d-5p, miR-124-3p 및 miR-185-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 방법.
- 제5항에 있어서, 중배엽 유도를 겪는 세포가 miR-221-3p, miR-1271-5p 및 miR-559로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 miRNA 억제제와 접촉되는 방법.
- 제1항에 있어서, 중배엽 유도가 중배엽 유도를 겪는 세포와 적어도 하나의 miRNA 모방체를 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 상기 적어도 하나의 miRNA 모방체가 PSC에 비해 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포에서 증가된 발현을 나타내는 miRNA를 모방하는 방법.
- 제8항에 있어서, miRNA 모방체가 miR-330-5p, miR-145-5p, miT-214-3p 및 miR-497-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA를 모방하는 방법.
- 제7항에 있어서, 중배엽 유도를 겪는 세포가 miR-330-5p, miR-145-5p 및 miT-214-3p로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 모방체와 함께 배양되는 방법.
- 제1항에 있어서, 중배엽 유도가 중배엽 유도를 겪는 세포와 miR-214 모방체를 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 분리된 중배엽 세포가 내피 분화를 겪도록 유도하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 내피 유도가,
- 약 6-8일 동안 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 포함하는 내피 분화 배지에서 상기 분리된 중배엽 세포를 배양하고;
- 내피 분화를 겪도록 유도된 세포로부터 내피 콜로니 형성-유사(ECFC-유사) 세포를 분리시키는 것을 포함하고, 상기 ECFC-유사 세포가 CD31+NRP-1+이고 조약돌 형태를 나타내는, 방법. - 제12항에 있어서, 분리된 ECFC-유사 세포가 CD144+, KDR+ 및 α-SMA- 발현 중 적어도 하나를 추가 특징으로 하는 방법.
- 인간 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단으로서, 상기 분리된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 포유동물에 이식되는 경우에 혈관을 형성하는 능력을 갖고, 상기 분리된 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 인간 다능성 줄기 세포로부터 시험관 내에서 유래된 것인, 인간 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단.
- 삭제
- 삭제
- 제14항에 있어서, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 PSC에 비해 적어도 하나의 측판-배아외 중배엽 마커의 증가된 발현을 나타내고, 상기 측판-배아외 중배엽 마커가 BMP4, WNT5A, NKX2-5 및 HAND1으로부터 선택되는 분리된 집단.
- 제17항에 있어서, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 PSC에 비해 적어도 하나의 축 중배엽 마커의 증가된 발현이 결여되어 있고, 상기 축 중배엽 마커가 CHIRD 및 SHH로부터 선택되는 분리된 집단.
- 제1항의 방법에 따라 획득된 인간 SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포의 분리된 집단.
- 제12항의 방법에 따라 획득된 인간 NRP-1+CD31+ 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포(ECFC-유사 세포)의 분리된 집단.
- 제5항에 있어서, 중배엽 유도를 겪는 세포가 miR-221-3p를 억제하는 miRNA 억제제와 접촉되는 방법.
- 제7항에 있어서, 중배엽 유도를 겪는 세포가 miRNA 모방체 miR-330-5p와 함께 배양되는 방법.
- 제17항에 있어서, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 PSC에 비해 적어도 하나의 축옆 중배엽 마커의 증가된 발현이 결여되어 있고, 상기 축옆 중배엽 마커가 PAX1, MEOX1, 및 TCF15로부터 선택되는 분리된 집단.
- 제17항에 있어서, SSEA5-KDR+NCAM+APLNR+ 중배엽 세포가 PSC에 비해 적어도 하나의 중간 중배엽 마커의 증가된 발현이 결여되어 있고, 상기 중간 중배엽 마커가 GOSR1, PAX2 및 PAX8로부터 선택되는 분리된 집단.
- 삭제
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