CN116769710A - 一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，包括：提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，在第一培养条件下培养所述人诱导性多能干细胞，分化获得中胚层细胞亚群；在第二培养条件下培养所述中胚层细胞亚群，分化获得髓系细胞生成复合物；收集髓系细胞生成复合物亚群，经细胞筛网收获幼稚巨噬细胞，转入第三培养基中继续分化成熟后得到巨噬细胞。该制备方法能够高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的巨噬细胞，且分化所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞及其制备方法和应用。
背景技术
巨噬细胞(macrophage)是机体重要的免疫细胞之一，具有吞噬细菌、病毒和体内受损的细胞，抗原递呈和调节其它免疫细胞等多种功能。研究表明，巨噬细胞具有异质性和多样性，在体液免疫和细胞免疫中均发挥着不可替代的作用，在医学上更是有着广泛的应用潜力。然而，巨噬细胞在体外扩增能力较低，无法实现均一、稳定且大量的供给来源，大大限制了巨噬细胞临床应用的发展。
人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)是通过体细胞重编程得到类似胚胎干细胞特性的一种细胞。通过对hiPSCs的体外分化，人们也可以成功获得单克隆巨噬细胞。然而，现有利用hiPSCs诱导分化获得单克隆巨噬细胞的方法中仍存在培养工艺不易于放大、生产体系需要滋养层细胞、含有动物源成份、诱导效率较低、制备周期较长等不足。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的巨噬细胞的制备方法，所述制备方法能够在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的巨噬细胞，且分化所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于生产工艺放大和工业化生产巨噬细胞用于临床研究和治疗需求。
第一方面，本发明提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，在第一培养条件下培养所述人诱导性多能干细胞，分化获得中胚层细胞亚群，其中，所述第一培养条件含有第一培养基，所述第一培养基中包含Y-27632、BMP-4、SCF和VEGF165；
(2)在第二培养条件下培养所述中胚层细胞亚群，分化获得髓系细胞生成复合物亚群，其中，所述第二培养条件含有第二培养基，所述第二培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇、M-CSF和IL-3；
(3)收集所述髓系细胞生成复合物亚群，经细胞筛网收获幼稚巨噬细胞，转入第三培养基中继续分化成熟后得到巨噬细胞，其中，所述第三培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇和M-CSF。
本发明中，所述第一培养基不限于是人为配置的培养基，也可以是商品化的培养基。例如，所述第一培养基以Stem Cell Technologies公司生产的APEL培养基或LONZA公司生产的X-VIVO 15培养基为基础培养基。
可选地，所述第二培养基以免疫细胞无血清培养基为基础培养基。可选地，所述第二培养基不限于是人为配置的培养基，也可以是商品化的培养基。例如，所述第二培养基以LONZA公司生产的X-VIVO 15培养基为基础培养基。
可选地，所述第三培养基以免疫细胞无血清培养基为基础培养基。可选地，所述第三培养基不限于是人为配置的培养基，也可以是商品化的培养基。例如，所述第三培养基以LONZA公司生产的X-VIVO 15培养基为基础培养基。
本发明中，所述Y-27632(或Y-27632)是一种ROCK的选择性抑制剂，一种高效的、细胞可渗透的、可逆的、选择性的Rho相关蛋白激酶抑制剂。
其中，所述BMP-4为人骨形态发生蛋白-4。作为BMPs家族成员之一，BMP-4在促进骨组织再生修复方面发挥着重要作用。此外，BMP4也与诱导胚胎分化、指导神经干细胞分化、调节肿瘤生长侵袭以及一些心脑血管疾病密切相关。
其中，SCF为干细胞因子，也被称为c-kit配体(KL)，是细胞生长过程中重要的调节因子。
其中，所述VEGF165为血管内皮生长因子165，一种具有高度生物活性的功能性糖蛋白。
可选地，所述第一培养基中，所述Y-27632的浓度为1-10μM，所述BMP-4的浓度为1-100ng/mL，所述SCF的浓度为1-100ng/mL，所述VEGF165的浓度为1-100ng/mL。
可选地，所述第一培养基中，所述BMP-4、SCF和VEGF165的浓度比例为2:1:2。本发明中，在所述第一培养基中以2:1:2的浓度比例调加BMP-4、SCF和VEGF165，能够协同促进hiPSCs向中胚层分化。
本发明中，所述L-谷氨酰胺为是一种有机物，分子式为C5H10N2O3，分子量为146.15，白色粉末状。
其中，所述青霉素和所述链霉素是两种最为常见的药物，其中，所述青霉素通常可以起到杀菌的作用，而所述链霉素可以起到抑制细菌蛋白质合成的效果，两者一起联合使用可以达到抑制细菌生长的功效。
所述β-巯基乙醇在所述第二培养基中的作用是作为一种强还原剂，中和掉所述第二培养基中积累的氧自由基，这样可以使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而便于进行细胞增殖实验。
所述M-CSF为巨噬细胞集落刺激因子，也称为集落刺激因子1(CSF1)，是由成骨细胞分泌的细胞因子。它是造血生长因子，参与单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞的增殖、分化和存活。
其中，IL-3为白介素3，又称细胞介素-3，是白细胞介素家族重要成员之一。它是由T淋巴细胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
可选地，所述第二培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-10mM，所述青霉素和链霉素的质量体积浓度为1％，所述β-巯基乙醇的质量体积浓度为0.1-0.5％、所述M-CSF的浓度为20-100ng/mL，所述IL-3的浓度为10-100ng/mL。
可选地，所述第一培养条件的培养时间为3-5天，且所述第一培养基每天更换总体积的50-80％，细胞培养方式为悬浮培养，并置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，旋转速度为30-100转/分钟。
其中，所述第一培养基每天更换总体积的50-80％是指用占总体积50-80％的新鲜第一培养基进行更换。例如，所述第一培养条件的培养时间可以为4天，且所述第一培养基每天更换总体积的75％。
可选地，所述第二培养条件的培养时间为9-17天，且所述第二培养基每隔5-8天更换一次，细胞培养方式为悬浮培养，并置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，旋转速度为30-100转/分钟。
例如，所述第二培养条件的培养时间为14天，且所述第二培养基每隔6天或7天更换一次。
可选地，所述细胞培养可以在培养箱进行，也可以在其他适宜细胞生长的环境进行。可选地，所述培养箱是恒温培养箱；所述恒温培养箱的温度为37℃，所述恒温培养箱内的CO2的体积浓度为5％。
可选地，所述人诱导性多能干细胞单细胞悬液的细胞接种密度为1.0-1.5×105个/mL。本发明中，适宜细胞接种密度更加有利于细胞在培养条件下的诱导分化。
可选地，所述第一培养基中还包含bFGF和IL-3中的一种或两种。进一步地，可选地，所述第一培养基中还包含bFGF和IL-3，所述bFGF的浓度为5-50ng/mL，所述IL-3的浓度为1-100ng/mL。
可选地，所述细胞筛网的孔径大小为50-100μm。可选地，所述细胞筛网的孔径大小为50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。
本申请中，所述细胞筛网可以快速过滤获得制备得到幼稚巨噬细胞，细胞经成熟后获得巨噬细胞。
可选地，所述经细胞筛网后得到所述幼稚巨噬细胞转入第三培养基中继续培养7天，分化成熟后得到巨噬细胞。其中，所述巨噬细胞呈成纤维细胞样。
可选地，所述幼稚巨噬细胞置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。
可选地，所述第三培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-10mM，所述青霉素和链霉素的质量体积浓度为1％，所述β-巯基乙醇的质量体积浓度为0.1-0.5％和所述M-CSF的浓度为50-150ng/mL。
进一步地，可选地，所述第三培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-10mM，所述青霉素和链霉素的质量体积浓度为1％，所述β-巯基乙醇的质量体积浓度为0.1-0.5％和所述M-CSF的浓度为80-150ng/mL。
本发明中，全面细胞培养都是在细胞培养皿中进行的。所述细胞培养皿可以但不限于是孔板、培养瓶和培养盘中的一种或多种。优选地，所述培养器皿可以为超低吸附的6孔板、96孔板、10cm细胞培养皿及环形细胞培养皿中的至少一种。所述培养器皿置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上，旋转速度可以为30-100转/分钟。
本发明中，若无特别说明，所标注的浓度皆为终浓度，百分比皆为体积的百分比。
本发明第一方面所提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的巨噬细胞的制备方法，所述制备方法能够高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的巨噬细胞，且所述从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞能够表现出稳定的吞噬活性。
第二方面，本发明还提供了一种从本发明第一方面所述的方法制备得到的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞，所述巨噬细胞具备吞噬活性。
其中，所述巨噬细胞具有纯度好、活率高，拥有完善的吞噬细胞功能，能够表现出稳定的吞噬活性。通过细胞吞噬作用检测试剂可以侧面具体展现出被检测的巨噬细胞的吞噬活性。例如，利用一些特异性染料偶联物，如新型pH敏感性pHrodoTM Green染料偶联物和pHrodoTM Red染料偶联物，或是pHrodoTM Green E.coli BioParticlesTM偶联物等现有商品化试剂，可提供快且准确的吞噬性能测试结果。
可选地，所述巨噬细胞的CD14表达量为90.0-99.9％，CD45表达量为95.0-99.9％，CD11B表达量为95.0-99.9％。
本发明第二方面提供的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞，具有纯度好、活率高、功能完善的特点，能够表现出稳定的吞噬活性，可广泛应用于体外巨噬细胞各种临床测试，具有深远的研究意义。
第三方面，本发明还提供了一种由本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
可选地，其中，所述恶性肿瘤可以但不限于包括肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性脑胶质瘤、骨肉瘤中的一种或多种。
本发明中，所述应用可以但不限于为检测试剂盒、靶向药物载体或是在药物筛选模型中的应用。
本发明第三方面的所述应用中，通过采用本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞，由于所述制备方法的高效，以及制备得到的巨噬细胞具有纯度好、活率高、功能完善的特点，可以极大地丰富基于本发明提供的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的应用范围，具有极大的研究和临床应用价值。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明
图1为本发明一实施例提供的从人诱导性多能干细胞分化得到的巨噬细胞的制备方法流程图；
图2为本发明一实施例提供的从人诱导性多能干细胞分化得到的巨噬细胞的实际细胞培养装置图；
图3为本发明实施例提供制备方法中第2天至第25天的细胞生长状况图(100×)；
图4为本发明实施例提供的制备方法得到的巨噬细胞表面标志分子的流式分析图；
图5为本发明实施例提供免疫荧光检测hiPSC-M在在4℃和37℃下的吞噬潜能评估；
图6为本发明实施例提供的流式检测在4℃和37℃下巨噬细胞有效吞噬情况；
图7为本发明实施例提供的转录组分析细胞全部测得表达的基因数据图；
图8为本发明实施例提供的转录组分析中各组样品细胞基因表达数据相关性分析表；
图9为本发明实施例提供的转录组分析中各组样品细胞多能性相关基因数据热图(heatmap)；
图10为本发明实施例提供的转录组分析中各组样品细胞天然免疫系统相关基因数据热图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
如图1所述，本发明一实施方式中，提供了一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：
S01、提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，在第一培养条件下培养所述人诱导性多能干细胞，分化获得中胚层细胞亚群，其中，所述第一培养条件含有第一培养基，所述第一培养基中包含Y-27632、BMP-4、SCF和VEGF165；
S02、在第二培养条件下培养所述中胚层细胞亚群，分化获得髓系细胞生成复合物亚群，其中，所述第二培养条件含有第二培养基，所述第二培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇、M-CSF和IL-3；
S03、收集所述髓系细胞生成复合物亚群，经细胞筛网收获幼稚巨噬细胞，转入第三培养基中继续分化成熟后得到巨噬细胞，其中，所述第三培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇和M-CSF。
其中，所述S01中，所述hiPSCs可以是商品化的细胞系，也可以是由供体细胞诱导而来，所述供体细胞可以但不限于包括绒毛细胞、成纤维细胞、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞、尿液细胞、皮肤细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，hiPSCs可以来源于得自具有独特遗传背景的个体的体细胞或者其它祖代细胞。例如，hiPSCs可以由来自具有疾病病状的个体、具有高风险的疾病病状的个体和/或具有低风险的疾病病状的个体的细胞生产。如本文所述由具有不同遗传背景的个体生产的细胞或由其活体外分化的细胞可以用于研究疾病病状(诸如恶性肿瘤)的机理以及用于识别治疗靶标。
可选地，人诱导性多能干细胞单细胞悬液通过复苏hiPSCs获得。所述复苏hiPSCs的过程包括：将hiPSCs复苏后重悬于含10μM Y-27632的完全培养基中，计数后取适量细胞放入经包被后的培养皿中培养，每天更换mTeSR完全培养基保持其未分化状态，待细胞融合达70％-80％时，用温和细胞解离试剂将细胞解离成单个细胞，得到hiPSCs细胞悬液。
可选地，所述完全培养基可以但不限于为mTeSRTM1培养基。
可选地，所述细胞解离试剂为GCDR温和细胞解离试剂。
可选地，所述经包被后的培养皿是指经重组人层黏连蛋白521(rhLaminin-521)基质胶包被后的培养皿。
可选地，从S01中诱导所述人诱导性多能干细胞开始分化，至S03中分化成熟后得到所述巨噬细胞的制备过程中，各阶段细胞培养均无需滋养层细胞，且培养过程中使用的细胞培养皿未经基质包被。
本发明所述制备方法中，从诱导人诱导性多能干细胞开始分化时，整个制备过程中细胞均是悬浮状态下完成的，分化所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于生产工艺放大和工业化生产巨噬细胞用于临床研究和治疗需求。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法。
将hiPSCs复苏后重悬于含10μM Y-27632的mTeSR完全培养基中，计数后取适量细胞放入rhLaminin-521包被的培养皿中培养，每天更换mTeSR完全培养基保持其未分化状态，待细胞融合达70～80％时用温和细胞解离试剂(GCDR)将细胞解离成单个细胞，收集细胞悬液300×g离心5min后弃上清，取添加了Y-27632(10μM)、BMP(50ng/mL)、SCF(25ng/mL)、VEGF165(50ng/mL)的APEL培养基(第一培养基)重悬细胞，计数后以1.5×105cells/mL的密度将细胞放入超低吸附6孔板进行悬浮培养，培养体积为2mL/孔。将超低吸附6孔板放在速率为30-100rmp的旋转摇床上，并在37℃，5％CO2培养箱培养4天，隔天更换75％的培养基。培养至day4后，每孔更换3mL的第二培养基，第二培养基以X-VIVO15培养基为基础培养基，添加有2mM L-谷氨酰胺、1％双抗、0.2％β-巯基乙醇、50ng/mL的M-CSF、25ng/mL的IL-3。每隔6-7天更换3mL第二培养基，到第18天时，取细胞培养液并通过70μm的细胞筛网收获幼稚巨噬细胞，300×g离心5min后使用第三培养基重悬，其中第三培养基以X-VIVO15培养基为基础培养基，并添加有2mM L-谷氨酰胺、1％双抗、0.2％β-巯基乙醇、100ng/mL的M-CSF。细胞取样计数后以1.20-1.40×105cells/cm2的密度将细胞进行重新接种至6孔板中继续培养7天，每孔放入2.5mL培养基，每隔4天更换50％的第三培养基。培养7天后收获细胞进行流式检测及使用pHrodoTM Green E.coli BioParticlesTM进行吞噬实验。
在如图2所述的细胞诱导分化培养的实际装置图下培养，hiPSCs分化为巨噬细胞过程中各阶段的细胞状况如图3所示，诱导第2天，细胞形成拟胚体的球状结构，诱导第4天后，细胞球出现囊状结构。进入造血髓系分化阶段，细胞球囊状结构继续增大，培养至第11天时有单细胞游离出来。培养至第18天后，为了进一步成熟/维持巨噬细胞，新鲜收获的hiPSC来源的幼稚巨噬细胞需重新接种并用第三培养基培养，在接种后24小时内，巨噬细胞黏附在平板上，培养7天后(第25天)细胞呈成纤维细胞样，获得成熟的巨噬细胞。
为了评估本发明所描述的上述方法制备的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞效果，进行如下效果实施例，其中，若无特别说明，本发明各实施例、中使用的试剂均为市面上常规商品化试剂，清洗、接种等实验操作步骤也为本领域常规实验操作步骤。
实施例2hiPSC分化得到的巨噬细胞表面标志分子的流式分析
取终末分化的hiPSC来源的巨噬细胞，吸弃培养液后用PBS洗涤细胞，每孔加入1mL的TrypLETM Express酶37℃消化3-5min后，加入1×PBS溶液，收集细胞悬液至50mL离心管中，300g离心5min，弃上清加入DPBS重悬细胞沉淀，取样计数后分装至EP管中，5×105个细胞/mL/管，每管加入1μL Fixable ability Stain 700中室温孵育10min，离心弃上清后使用BD stain buffer洗涤1次，离心后加入100μL的BD stain buffer重悬细胞沉淀，在细胞悬液中加入1-2μL的FcR blocking reagent，4℃封闭20min后再加入抗体CD14、CD11B、CD45，在4℃避光孵育45min。抗体孵育完成后使用BD stain buffer洗涤2次。加入200μL BDstain buffer重悬细胞，在BECKMAN流式细胞仪上机分析。流式结果如图4所示，诱导的hiPSC-M细胞能表达巨噬细胞的相关标志物，图4中的(a)、(b)分别对应空白对照及同型对照的流式结果，图4中的(c)、(d)和(e)分别显示出CD14表达量为90.27％，CD45表达量为99.84％，CD11B表达量为98.90％。
实施例3验证hiPSC分化得到的巨噬细胞的吞噬活性
取1.0-2.0×105个细胞接种至2块24孔板中，每孔加入500μL的RPMI1640完全培养基，过夜培养后将其中一块24孔板放入4℃培养箱中预冷15min，两块板每孔加入10μL的pHrodo Red E.coli BioParticles，避光500×g离心3min，两块板分别放置在37℃及4℃中孵育2-4h，荧光显微镜下观察细胞的吞噬情况，并收集细胞进行流式检测hiPSC-M的吞噬潜能。其中阳性对照细胞为PMA诱导单核细胞(U937细胞)分化为巨噬细胞，阴性对照则使用无吞噬作用的293T细胞。
hiPSC分化得到的巨噬细胞(hiPSC-M)的吞噬潜能评估如图5所示，空白对照组在4℃及37℃都无荧光，说明293T细胞无吞噬作用，阳性对照细胞及hiPSC-M细胞在4℃时只有少量细胞有荧光，而在37℃时细胞内部都有明显可见的荧光，说明hiPSC-M细胞在37℃能够有效地吞噬pHrodo BioParticles。而进行流式检测结果显示超过90％的hiPSC-M细胞能对pHrodo BioParticles进行有效吞噬，如图6所示，图6中(a)和图6中(b)分别为hiPSC-M细胞在4℃和37℃下的流式检测结果。本发明提供的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，在实验过程中提供的培养基配比、各因子浓度和各实验步骤下，各因子的协同作用达到最佳，能够在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的巨噬细胞，且分化所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于生产工艺放大和工业化生产巨噬细胞。
实施例4iPSC分化得到的巨噬细胞的转录组分析
取终末分化的hiPSC来源的成熟巨噬细胞(iPSC-M细胞)，吸弃培养液后用PBS洗涤细胞，每孔加入1mL的TrypLETM Express酶37℃消化3-5min后，加入1×PBS溶液，用移液枪吹下贴壁的细胞，将细胞连同PBS溶液一起收集到Nuclease-free的螺纹旋盖的EP管中，300-500×g离心5分钟，弃上清，离心收集的细胞沉淀直接液氮速冻后，转移至-80℃低温保存并送检，进行转录组分析。实验中还包含对hiPSC和人外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PBMC-M)在同等条件下测试作为对照组。
结果见图7、图8、图9和图10所示。其中，从图7和图8中数据可以看出，两批次独次实验获得的hiPSC-M分别对应hiPSC-M-1和hiPSC-M-2，两组的转录组高度一致(Pearson值0.994)，表明本发明提供的从hiPSC分化为巨噬细胞的制备方法技术稳定性高。同时，hiPSC-M的转录组和hiPSC的转录组差异较大，hiPSC-M的转录组更接近PBMC-M的转录组。从图9中可以看出，hiPSC高表达的细胞多能性相关基因在hiPSC-M和PBMC-M中均低表达。hiPSC-M和PBMC-M均高表达天然免疫系统相关基因，而hiPSC低表达天然免疫系统相关基因，参见图10。数据表明，本发明制备得到的巨噬细胞同人外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PBCM-M)基本一致，由该制备方法制得的巨噬细胞也能广泛用于巨噬细胞的相关研究，该制备方法易于生产工艺放大和工业化生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，在第一培养条件下培养所述人诱导性多能干细胞，分化获得中胚层细胞亚群，其中，所述第一培养条件含有第一培养基，所述第一培养基中包含Y-27632、BMP-4、SCF和VEGF165；
(2)在第二培养条件下培养所述中胚层细胞亚群，分化获得髓系细胞生成复合物亚群，其中，所述第二培养条件含有第二培养基，所述第二培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇、M-CSF和IL-3；
(3)收集所述髓系细胞生成复合物亚群，经细胞筛网收获幼稚巨噬细胞，转入第三培养基中继续分化成熟后得到巨噬细胞，其中，所述第三培养基中包含L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、β-巯基乙醇和M-CSF。
2.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基中，所述Y-27632的浓度为1-10μM，所述BMP-4的浓度为1-100ng/mL，所述SCF的浓度为1-100ng/mL，所述VEGF165的浓度为1-100ng/mL。
3.如权利要求2所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基中，所述BMP-4、SCF和VEGF165的浓度比例为2:1:2。
4.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养条件的培养时间为3-5天，且所述第一培养基每天更换总体积的50-80％，细胞培养方式为悬浮培养，并置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，旋转速度为30-100转/分钟。
5.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第二培养条件的培养时间为9-17天，且所述第二培养基每隔5-8天更换一次，细胞培养方式为悬浮培养，并置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，旋转速度为30-100转/分钟。
6.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第二培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-10mM，所述青霉素和链霉素的质量体积浓度为1％，所述β-巯基乙醇的质量体积浓度为0.1-0.5％、所述M-CSF的浓度为20-100ng/mL，所述IL-3的浓度为10-100ng/mL。
7.如权利要求1或2所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基中还可包含bFGF和IL-3，所述bFGF的浓度为5-50ng/mL，所述IL-3的浓度为1-100ng/mL。
8.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述第三培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-10mM，所述青霉素和链霉素的质量体积浓度为1％，所述β-巯基乙醇的质量体积浓度为0.1-0.5％和所述M-CSF的浓度为50-150ng/mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞具备吞噬活性。
10.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的或如权利要9任一项所述的从人诱导性多能干细胞分化的巨噬细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190211304A1 (en) * | 2016-08-10 | 2019-07-11 | Indiana University Research And Technology Corporation | Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity |
| KR20200099218A (ko) * | 2019-02-13 | 2020-08-24 | (주) 넥셀 | 제１형 혈우병의 세포치료를 위한 고증식성 혈관내피세포 분화방법 및 용도 |
| US20200399602A1 (en) * | 2018-01-18 | 2020-12-24 | Agency For Science, Technology And Research | Method for Differentiation of Human Pluripotent Stem Cell Lines in Suspension Culture |
| US20210128611A1 (en) * | 2016-07-25 | 2021-05-06 | Cellular Approaches, Inc. | Autologous and allogenic macrophages and monocytes for use in therapeutic methods |
| CN113832104A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-24 | 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 | 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法 |
| CN113874494A (zh) * | 2019-05-28 | 2021-12-31 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 产生单核细胞祖细胞的方法 |
-
2023
- 2023-01-28 CN CN202310091028.XA patent/CN116769710A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210128611A1 (en) * | 2016-07-25 | 2021-05-06 | Cellular Approaches, Inc. | Autologous and allogenic macrophages and monocytes for use in therapeutic methods |
| US20190211304A1 (en) * | 2016-08-10 | 2019-07-11 | Indiana University Research And Technology Corporation | Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity |
| US20200399602A1 (en) * | 2018-01-18 | 2020-12-24 | Agency For Science, Technology And Research | Method for Differentiation of Human Pluripotent Stem Cell Lines in Suspension Culture |
| KR20200099218A (ko) * | 2019-02-13 | 2020-08-24 | (주) 넥셀 | 제１형 혈우병의 세포치료를 위한 고증식성 혈관내피세포 분화방법 및 용도 |
| CN113874494A (zh) * | 2019-05-28 | 2021-12-31 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 产生单核细胞祖细胞的方法 |
| US20220298490A1 (en) * | 2019-05-28 | 2022-09-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method to generate monocytic progenitor cells |
| CN113832104A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-12-24 | 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 | 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| SOMAYEH POUYANFARD 等: ""Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Ameliorate Liver Fibrosis"", 《STEM CELLS》, vol. 39, no. 12, pages 1702 - 1706 * |
| 宋学坤著: "《生物信息学和医学大数据研究前沿》", 31 December 2022, 西安交通大学出版社, pages: 95 - 96 * |
| 李文华等主编: "《高原分子医学》", 31 December 2011, 复旦大学出版社, pages: 76 * |
| 杨昕淳等: ""诱导多能干细胞向巨噬细胞分化研究进展"", 《生物工程学报》, vol. 37, no. 11, pages 4001 - 4014 * |
| 薛社普主编: "《医学细胞生物学》", 31 March 2019, 中国协和医科大学出版社, pages: 219 - 220 * |
| 马庆生主编: "《生物学大辞典》", 31 January 1999, 广西科学技术出版社, pages: 458 - 459 * |
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